solanum lycopersicum et al -...
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1. Introducción
El tomate Solanum lycopersicum (Spooner et al., 2005) es una especie de origen
subtropical y una de las más cultivadas a nivel mundial. La mayor superficie es cultivada
al aire libre en la época estival y para extender la temporada de cultivos se utilizan
invernaderos (Rick, 1995).
Para tener un desarrollo óptimo, el tomate requiere de temperaturas moderadas en la
mayoría de sus etapas. Esta característica limita las estaciones en las cuales el tomate
puede ser cultivado al aire libre, tanto para consumo fresco como para el proceso
industrial (CORFO, 1986).
El contar con una variedad de tomate que presente resistencia a las bajas temperaturas
permitiría ampliar la distribución geográfica y la temporada de producción en cultivos, lo
que significaría una reducción de los costos energéticos en los invernaderos (Venema et
al., 2000).
Se han estudiado especies silvestres del género Solanum provenientes de elevadas
altitudes, las cuales presentan características de tolerancia al frío en distintas etapas
fenológicas. La especie que más se ha utilizado es Solanum habrochaites que crece en la
Cordillera de los Andes en Perú a altitudes de 3.300 m (Vallejos, 1979). Patterson et al.
(1978) describen la capacidad que tienen algunas accesiones de S. habrochaites para
germinar y desarrollarse a bajas temperaturas.
A través de métodos de retrocruzas asistidas por marcadores moleculares se ha obtenido
líneas casi isogénicas provenientes de la cruza entre Solanum lycopersicum cv E6203 y
Solanum habrochaites accesión LA1777 (Monforte y Tanksley, 2000). Estas líneas casi
isogénicas contienen una porción de S. habrochaites en el trasfondo genético de S.
lycopersicum. Las NILs y BCRIL se han utilizado para identificar y verificar la presencia de
QTL que permiten tolerancia al frío (Oyanedel, 2000).
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Las NILs presentan sólo una introgresión del padre donante, y se sabe que los genes de
interés están ligados o interactúan con otros, y en muchos casos arrastran características
indeseables de baja aptitud agronómica que son necesarias eliminar. Uno de los objetivos
de esta investigación es eliminar el arrastre por ligamiento, para lo cual se debe analizar
la segregación de los marcadores moleculares en la generación F3 derivada de la cruza
entre la NIL LA3957 y NIL LA3921 con el padre recurrente S. lycopersicum cv. E6203, a
fin de seleccionar e incrementar sub-NILs que posean una introgresión menor a 10 cM.
Un segundo objetivo es analizar la segregación de los marcadores a fin de poder
determinar si los QTLs son capaces de conferir tolerancia al frío durante el crecimiento
vegetativo y a partir de ello poder establecer si existe una asociación entre el genotipo y
fenotipo de las plantas estudiadas.
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2. Revisión Bibliográfica
2.1 Caracterización de la especie.
El tomate Solanum lycopersicum L. es una especie dicotiledónea perteneciente a la
familia Solanáceas (Spooner et al., 2005). El origen del género se sitúa en parte de la
región andina de América Central (Esquinas-Alcázar y Nuez, 1995).
Chamarro (1995) indica que esta especie posee crecimiento simpodial, en el cual el tallo
forma cinco hojas antes que la yema principal se transforme en inflorescencia. Además el
crecimiento puede ser determinado e indeterminado. El primero de ellos, tiene los tallos
terminados en ramillete floral con un período limitado de floración y son usados
principalmente para cultivo industrial al aire libre. Las variedades con crecimiento
indeterminado producen inflorescencias de forma continua y son cultivadas en
invernadero y usadas principalmente para consumo fresco (Kinet y Peet, 1997).
2.1.1 Requerimientos térmicos de la especie.
El tomate es sensible a las bajas temperaturas durante varios estados de desarrollo,
incluyendo la germinación de las semillas, etapas tempranas y tardías del crecimiento
vegetativo y la reproducción (Foolad y Lind, 1998).
La temperatura mínima del suelo para la etapa de germinación es de 10°C, mientras que
la óptima se encuentra entre 20 y 30°C (Escaff et al., 2005). Según Jones (1998) las
temperaturas entre 21-29,5°C de día y de noche entre 18,5-21°C, permiten un óptimo
crecimiento de la planta de tomate.
La polinización es otra etapa crítica que necesita temperaturas específicas, ya que para
que sea efectiva requiere de 13-24°C en el día y 15,5-30°C en la noche (Jones, 1998).
Luego, para que la formación del fruto sea rápida y alcance su maduración requiere de
temperaturas entre 24 a 28°C (CORFO, 1986).
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2.1.2 Efectos del frío sobre la planta.
2.1.2.1 Efectos morfológicos
Se han descrito varios efectos de las temperaturas frías en tomate. Kamps et al. (1987)
indica que las temperaturas sub-óptimas producen una reducción del vigor, baja
producción, incremento en la temporada de crecimiento, deformación y caída de sus
hojas. Temperaturas entre 0 y 5°C producen la muerte de la planta. Con temperaturas
menores a 10ºC ocurre una inhibición de la floración (Wolf et al., 1986).
A la vez, el tiempo de germinación se ve afectado, ya que aumenta progresivamente
cuando las temperaturas bajan de 15 a 10ºC, mientras que bajo los 10ºC es inhibida (Wolf
et al., 1986). Por otro lado, si los cotiledones están totalmente expandidos y tienen una
breve exposición a bajas temperaturas (10-16ºC) causan un retraso en el crecimiento
vegetativo (Wolf et al., 1986).
La temperatura óptima para el desarrollo del polen, la germinación y el desarrollo del tubo
polínico es de 21ºC, estos procesos se ven retardados al superar o disminuir esta
temperatura. En la polinización y en la fecundación se provocan serios problemas con
temperaturas bajo los 10ºC (Nuez, 1995a).
2.1.2.2 Efectos fisiológicos
A nivel fisiológico, la exposición al estrés por frío causa una reducción de los índices de
fluorescencia de la clorofila (Fp:Fo: índice de la fluorescencia inicial de la clorofila) y la
conductancia estomática (Walker et al., 1991). Al mismo tiempo, es afectada la tasa de
crecimiento, respiración y se activa la senescencia y abscisión (Tadeo, 2000).
El estrés por frío ocasiona daño de las membranas plasmáticas. Tadeo (2000) señala que
dicho estrés provoca pérdida de selectividad, ya que modifica la micro-viscosidad o fluidez
de las membranas. La composición en ácidos grasos de la membrana, glicerolípidos
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(glicolípidos y fosfolípidos), determina la transición entre las dos fases en las que pueden
encontrarse los lípidos en la membrana: la de líquido cristalino (poco viscosa o muy fluída)
y la de gel (muy viscosa y poco fluída).
También se han estudiado los niveles de producción de oxígeno activo, que en especies
de tomate cultivado expuestas al frío, es producido en exceso causando daños a nivel
celular. Walker et al. (1991) encontraron que en S. habrochaites existe una regulación de
la cadena transportadora de electrones, permitiendo prevenir la alta producción de
oxígeno activo al interior del cloroplasto, previniendo con ello el daño del fotosistema II.
La exposición a temperaturas menores a 12ºC además afecta la exportación de
asimilados de las hojas, retrasando el crecimiento de las plantas (Nuez, 1995b).
Owens (1996), determinó que otro de los efectos de la exposición a bajas temperaturas,
es la reducción de la tasa de fotosíntesis, lo que conduce a una absorción de luz excesiva
que supera la capacidad de los foto-sistemas, con lo cual la planta no es capaz de disipar
la energía recibida en exceso, llegando con esto a la oxidación de moléculas importantes,
particularmente lípidos (Kraus, 1988).
2.2 Fuentes de resistencia al frío
Se han estudiado parientes silvestres del tomate cultivado que poseen características de
tolerancia al frío. Esto se debe a que crecen en condiciones de grandes altitudes, donde
las temperaturas a las que se exponen son bajas. Wolf et al. (1986) estudio la tolerancia
al frío en especies silvestres colectadas a 3000 m de altura. Dentro de las especies que
pueden crecer a esa altitud están Solanum habrochaites, Solanum chilense y Solanum
lycopersicoides.
Distintos ecotipos de Solanum han sido estudiados debido a la resistencia que presentan
al frío. Venema et al. (1999) estudiaron cinco especies; dentro de las cuales estaban, S.
pimpinellifolium que crece en la costa del Perú desde 0-300 m sobre el nivel del mar
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(m.s.n.m), S. peruvianum a 2400 m s.n.m, S. chilense a 3200 m s.m.n. Los autores
establecieron un ranking con respecto a la tolerancia que tenían al frío en orden
ascendente S. lycopesicum < S. habrochaites < S. chilense < S. pimpinellifolium < S.
peruvianum.
Patterson et al. (1978) también utilizaron material colectado en Perú desde la costa hasta
altitudes cercanas a 3300 m; describieron que S. habrochaites a diferencia del tomate
cultivado, era capaz de germinar normalmente a 6-7ºC. La resistencia que presenta tiene
la cualidad que es manifestada en distintas etapas de desarrollo, incluyendo la
germinación, emergencia y crecimiento vegetativo (Wolf et al., 1986).
La importante fuente de material silvestre encontrada ha llevado a la creación de bancos
de germoplasma, en los cuales se encuentran especies como Solanum habrochaites, S.
peruvianum, S. pimpinellifolium, S. parviflorum y S. lycopersicum var cerasiforme (De
Verna y Patterson, 1991), permitiendo tener el material genético necesario para
desarrollar variedades mejoradas con resistencia al frío.
2.3 Mecanismos de resistencia al frío
Venema et al. (1999) estudiaron la capacidad de las plantas de Solanum de crecer y
desarrollarse, durante y después de una exposición a temperaturas entre 0-12ºC. Las
especies del género Solanum originadas de ambientes de montaña resultaron menos
dañadas que las de bajas altitudes. Por ejemplo, expusieron plantas 14 días a
temperaturas de 10°C, obteniendo un mayor crecimiento durante el período de frío en S.
habrochaites. Durante un período de siete días de recuperación a 25/20°C encontraron
grandes diferencias en la capacidad de recuperar el índice relativo de crecimiento de los
brotes. Después de la exposición al frío, con un 39% de índice relativo de crecimiento en
S. lycopesicum y un 62-92 % en las especies silvestres.
En estudios comparativos respecto a la actividad de los cloroplastos entre el tomate
cultivado (S. lycopersicum) y S. habrochaites de elevadas altitudes, este último presenta
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una menor disminución de la actividad de los cloroplastos al exponerse a bajas
temperaturas (Smillie y Nott, 1979). También fueron determinadas mayores tasas de
elongación foliar (Raison y Brown, 1989) y la tasa de fotosíntesis era rápidamente
recuperada cuando las plantas eran expuestas al frío (Yakir et al., 1986).
Otro factor ambiental que agudiza la respuesta al estrés por bajas temperaturas es una
baja humedad relativa, puesto que el frío reduce la capacidad de las raíces para absorber
agua y bloquea la función de las estomas (Tadeo, 2000).
2.4 Estrategias para incorporar resistencia al frío
2.4.1 Transgenia
La transgenia corresponde a la incorporación de material genético desde otras especies a
través de varias técnicas entre una de ellas el uso de Agrobacterium tumefaciens que
contiene el plásmido Ti. A partir de éste se construyen plásmidos quiméricos que
contienen la región Ti y uno o más genes que se desea incorporar en la planta. También
se incluye en el plásmido información genética que es necesaria para que se exprese el
gen de interés, que se transmite a las próximas generaciones de forma normal a través de
la semilla (Nuez et al., 2000).
Hsieh et al. (2002) intentaron mejorar la tolerancia de plantas de tomate cultivado al frío, a
través del uso de un vector que contenía un elemento de respuesta de Arabidopis a la
deshidratación (C-repeat/dehydration CBF1). Los autores evaluaron la supervivencia,
índice de la fluorescencia de la clorofila y el alargamiento radical. Como resultado del
ensayo encontró que las plantas transgénicas presentaban mayor resistencia que sus
parientes no transformados.
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2.4.2 Fusión de cloroplastos
Otro de los métodos es llamado cybridization realizada a través de cloroplastos, ya que
poseen material genético que controla muchas características, principalmente la captación
de luz en el proceso de fotosíntesis. En este caso, antes de que ocurra la fusión se
elimina un núcleo por irradiación, con lo cual la célula quedará con el núcleo que tiene la
información de interés y todos los organelos. A partir de ésto se podrían traspasar
organelos que tienen mayor eficiencia en el proceso de fotosíntesis (Monckeberg, 1988)
Venema et al. (2000) usaron cybridos de tomate para estudiar la resistencia de estos al
frío, ya que presentaban material proveniente de S. habrochaites. Como conclusión se
determinó que este método no era una herramienta efectiva para transferir la tolerancia
del tomate a las bajas temperaturas.
2.4.3 Retrocruzas
Métodos tradicionales
La retrocruza es uno de los métodos más utilizado para la mejora de variedades, esta
consiste en sucesivas cruzas con el padre donador hasta que el carácter a mejorar sea
seleccionado (Allard, 1999). En tomate se tiene una excelente variedad que es
susceptible al frío y otra que tiene resistencia conferida por cierto gen; a través del
cruzamiento sexual se podría incorporar el gen de interés. Para recuperar el fenotipo del
padre cultivado y susceptible al frío se deben realizar sucesivas cruzas con el padre
susceptible (Nuez et al., 2000).
En ocasiones, los genes que desean introgresar no son de la misma especie. Por
ejemplo, en tomate muchos de los genes de interés corresponden a especies que están
relacionadas con el género Solanum (Nuez et al., 2000). El mecanismo por el cual se
realiza la incorporación de genes se llama variación extraespecifica. El problema de este
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método es que al realizar el cruzamiento de distintas especies se enfrentan a barreras
precigóticas y postcigóticas (Nuez et al., 2000).
Una de las combinaciones entre especies en las cuales no es fácil la hibridación es
Solanum peruvianum, ya que el polen del tomate cultivado no puede crecer en él, a
diferencia del polen de S. peruvianum que puede crecer en el tomate cultivado,
permitiendo el desarrollo de híbridos interespecificos, transfiriéndose los genes de interés
(Nuez et al., 2000).
Método tradicional asistido por marcadores moleculares
El método tradicional de retrocruzas es un proceso que requiere un arduo trabajo de
selección. Actualmente este método es apoyado por el uso de marcadores moleculares
que permiten acortar las generaciones necesarias para llegar a una selección (Pérez de la
Vega y García, 2000).
Los marcadores de ADN son los más utilizados hoy en día en los programas de mejora,
ya que permiten marcar o señalar el locus que controla la diferencia fenotípica y/o marcar
otro locus próximo que controle algún carácter de interés. Además, permiten seleccionar
aquellos individuos que poseen el gen de interés, y que presente una mayor proporción
del genoma recurrente, reduciendo el número de generaciones necesarias para
desarrollar variedades (Nuez et al., 2000). Según Martín (2002), las ventajas principales
son que permiten cubrir todo el genoma, no son influenciables por el ambiente y no
presentan interacciones intergénicas.
Dentro de los marcadores moleculares utilizados están los SSR (Simple Sequence
Repeats) o microsatélites que basan su amplificación en el uso de cebadores largos que
tienen una zona que ha sido previamente secuenciada. Otros marcadores utilizados son
CAPS o Cleaved Amplified Polymorphic Sequences, que se comportan como marcadores
codominantes y que requieren del uso de enzimas de restricción (Martín, 2000).
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Para realizar esta técnica se requiere de la amplificación del material genético, la cual es
realizada a través de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polimerase Chain
Reaction o PCR), la cual permite producir en laboratorio múltiples copias de un fragmento
de ADN específico a través del uso de la enzima ADN polimerasa (Hopp et al., 2005).
El análisis de los marcadores moleculares se realiza a través de electroforesis que es una
técnica analítica de separación de macromoléculas. La separación ocurre por la diferente
movilidad que presentan las macromoléculas cargadas al ser sometidas a campo
eléctrico. Los ácidos nucleicos son macromoléculas que están cargadas negativamente.
(Hopp et al., 2005). En este proceso se llevan a cabo electroforesis en geles de
poliacrilamida la cual es un gel químicamente inerte, de propiedades uniformes, insoluble
en agua, y que permiten una buena visualización de las bandas durante un tiempo
prolongado (Hopp et al., 2005).
2.4.4 Introgresión de genes de resistencia al frío en tomate.
Especies silvestres del género Solanum son una importante fuente de genes que
permitirían conferir tolerancia al frío en el tomate cultivado. Uno de los problemas es que
la mayoría de los caracteres de interés agronómico son de herencia compleja, es decir
son controlados por varios genes que presentan interacciones entre ellos y con el
ambiente dificultando la predicción del fenotipo en base al genotipo, llamados caracteres
cuantitativos (Martín, 2002). La tolerancia al frío es un carácter cuantitativo, lo que
representa una alta complejidad de poder ser transferido a especies de tomate (Foolad et
al., 1998).
Gracias a la identificación de loci de caracteres cuantitativos – quantitative trait loci -
(QTL), asociados a la construcción de mapas de alta densidad, se ha podido identificar
regiones específicas que producen variación continua de la expresión de los caracteres.
Esto ayudado por los marcadores moleculares de ADN, permite que los QTL puedan ser
rápidamente reconocidos y seleccionados, eludiendo el efecto ambiental (Nuez et al.,
2000).
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En este caso, la especie que se ha usado para introgresar en el trasfondo genético de
Solanum lycopersicum corresponde a Solanum habrochaites, debido a que presenta una
alta ínter-fertilidad, permitiendo así, una mejor obtención de híbridos interespecificos
(Rick, 1979). Al trabajar con éstos, la cantidad de material indeseado producida es alta,
requiriendo de sucesivas retrocruzas con el material receptor a fin de recuperar las
características agronómicas deseables (Nuez et al., 2000).
A través del desarrollo de líneas casi-isogénicas (NILs), por sucesivas generaciones de
retrocruzas y selección asistida por marcadores moleculares, se ha llegado a líneas casi
idénticas a S. lycopersicum, a excepción de un solo fragmento incluido en unos pocos loci
(Schneider, 2005), correspondiente en este caso a un fragmento de S. habrochaites
(accesión LA1777) (Monforte y Tanksley, 2000). A fin de aislar el carácter de interés, se
realizan sucesivas retrocruzas con el parental recurrente (Pérez de la Vega y García,
2000), que en este caso corresponde a S. lycopersicum cv. E6203.
Goodstal et al. (2005) a través de estudios de NILs derivadas de la retrocruzas entre S.
lycopersicum y S. habrochaites, demostraron que estas poseían una mayor capacidad de
tolerancia al frío al estudiar los niveles de turgencia radicular tras exposición a bajas
temperaturas. El QTL para esta característica se encontraba situado en el cromosoma 9.
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3. Materiales y métodos
Los ensayos se realizaron en el Laboratorio de Fitogénetica Molecular “Dr. Otto Zöllner”,
ubicado en la Facultad de Agronomía de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso.
Las líneas utilizadas en el estudio corresponden a las NILs (Nearly Isogenic Lines)
LA3957 y LA3921, las cuales poseen una introgresión desde Solanum habrochaites f.
typicum accesión LA1777 generado a través de retrocruzas con Solanum lycopersicum cv
E6203 (Monforte y Tanksley, 2000).
3.1 Preparación del material vegetal
Los plantines se desarrollaron en la plantinera Agrinset Ltda. En el estado de 2 a 3 hojas
verdaderas se tomó una porción de hoja, para el proceso de extracción de ADN (Ver la
sección 3.2.2). Entre noviembre del 2006 y febrero 2007 fueron transplantadas a campo
para incremento y la semilla se cosechó entre diciembre del 2006 y marzo del año 2007.
3.2 Estudio del genotipo
3.2.1 Marcadores moleculares
El material analizado corresponde a la generación F3: NIL, derivada de la cruza inicial entre
Solanum lycopersicum y Solanum habrochaites accessión LA1777, desarrollado según la
metodología descrita en la Figura 1.
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Figura 1: Metodología de obtención de generaciones de NILs provenientes de la cruza entre S. habrochaites (LA1777) y S. lycopersicon (cv. E6203) La hibridación de la NIL LA3957 y NIL LA3921 con el parental recurrente (cv. E6203) se
realizó en octubre del año 2003 dando origen a la generación F1: NIL. La semilla se obtuvo
en febrero del año 2004, las cuales fueron sembradas y transplantadas a macetas en
invernadero en junio del año 2004. Posteriormente las plantas se trasladaron al aire libre
en septiembre del año 2004. La semilla de la generación F2: NIL se cosechó en marzo del
año 2005. La generación F3: NIL de la línea LA3957 cultivada en invernadero se obtuvo en
diciembre del año 2006. Por su parte la generación F3: NIL de la línea LA3921 fue
trasladada a campo entre octubre–diciembre del año 2006 y su semilla cosechada en
enero del 2007.
Mediante el uso de marcadores moleculares se analizaron cada generación. La
generación F1: NIL se analizó entre junio y septiembre del año 2004 a fin de corroborar que
la progenie fuese heterocigoto (HL) para ambas líneas. El análisis de la generación F2: NIL
de la línea LA3957 fue en febrero del año 2006 con una población de 420 plantas; de la
línea LA3921 fueron analizadas 122 plantas en noviembre del año 2005. En el período
enero-marzo del año 2007 se analizó una población de la línea LA3957 formada por 40
sub-NILs y 170 candidatas a sub-NILs de la generación F3: NIL. Para la generación F3: NIL
de la línea LA3921 se analizó una población de 45 sub-NIL y 191 candidatas a sub-NILs.
Solanum habr ochait es 1777 X S. lycoper sicum cv E6203
NILs X S. lycoper sicum cv E6203
F1
F2
F3
Selección sub-NILs
Generación a t r abaj ar
Selección de hibr idos r eales asist ida por
m ar cador es m olecular es
I dent if icación de clases genot ipicas par a cada
loci
X
X
X
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Se utilizaron marcadores moleculares CAPS y SSR para la línea LA3957 (Introgresión en
el cromosoma 9). Para la línea LA3921 (Introgresión en el cromosoma 2) sólo se usaron
SSR. Los marcadores usados se muestran en la Figura 2.
Figura 2: Mapa de ubicación de marcadores moleculares para la sub-región del cromosoma 9 y 2 de tomate. Fuente: Cornell University, 2007.
Los partidores de los marcadores moleculares se indican en los Cuadros 1 y 2.
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Cuadro 1: Secuencias de partidores forward y reverse para marcadores en el cromosoma 9 de tomate. Marcador Tipo Partidores Enzima
restricción Fuente
SSR70 SSR F: TTT-AGG-GTG-TCT-GTG-GGT-CC R: GGA-GTG-CGC-AGA-GGA-TAG-AG
-------------- --------------
Cornell University 2007
SSR73 SSR F: TGG-GAA-GAT-CCT-GAT-GAT-GG R: TTC-CCT-TTC-CTC-TGG-ACT-CA
-------------- --------------
Cornell University 2007
T1670 CAPS F: ATT-CAA-GTG-GAA-CCA-ATA-CAT-GG R: ATT-CAT-GCA-GCA-CTT-GGA-ATA-TC
Hinf I Goodstal et al., 2005
T1617 CAPS F: GTG-AAC-TCT-ACA-ACA-GAG-CCA-AAC R: GTT-TTC-CTC-TCT-CCA-TTA-CCA-CCA-TTG
Hae III Goodstal et al., 2005
T532 CAPS F: AAG-GTT-AAC-CAA-ATC-GGT-AGT-GTG R: AGT-CTG-CTT-GTT-ATT-TCA-CCA-AGG
Hinf I Goodstal et al., 2005
Cuadro 2: Secuencias de partidores forward y reverse para marcadores en el cromosoma 2 de tomate.
Marcador Tipo Partidores SSR356 SSR F: ACCATCGAGGCTGCATAAAG
R: AACCATCCACTGCCTCAATC SSR605 SSR F: TGGCCGGCTTCTAGAAATAA
R: TGAAATCACCCGTGACCTTT SSR103 SSR F: CCAACTGGATGACCTTTGTG
R: GTCCAGTGTTTCCAAAGGGA SSR5 SSR F: TGGCCGGCTTCTAGAAATAA
R: TGAAATCACCCGTGACCTTT SSR50 SSR F: TGGCCGGCTTCTAGAAATAA
R: TGAAATCACCCGTGACCTTT SSR26 SSR F: CGCCTATCGATACCACCACT
R: ATTGATCCGTTTGGTTCTGC SSR331 SSR F:CGCCTATCGATACCACCACT
R: ATTGATCCGTTTGGTTCTGC SSR580 SSR F:AACTCATCCTTTCTCTTCCCTT
R: CCACATGAAAGCATGCAAAG Fuente: Cornell University 2007
3.2.2 Extracción de ADN
La extracción de muestras de ADN se realizó a partir de hojas de 10 plantas de cada línea
genética. Se extrajeron en promedio 2 a 3 hojas cercanas al ápice de crecimiento, las
cuales se conservaron en hielo.
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Se utilizó el método de extracción de Doyle (Doyle and Doyle, 1987). Las muestras fueron
conservadas en nitrógeno líquido, luego maceradas a fin de romper las membranas
celulares, y resuspendidas en buffer de extracción Doyle, permitiendo la solubilización de
las membranas lipoproteícas y desnaturalización de las proteínas (detergentes CTAB y
SDS). El ADN se mantiene protegido de compuestos secundarios con EDTA y β-
mercaptoetanol. Posteriormente suceden varios ciclos de lavado, centrifugación y
resuspensión, obteniéndose un pellet de ADN, que se almacenó en agua libre de
nucleasa.
La dilución del pellet se realizó en una proporción de 5:1 en tubos Eppendorf con 80 µl de
agua libre de nucleasas y 20 µl de ADN.
3.2.3 Condiciones de PCR
Para la amplificación del material genético, se utilizó la Reacción en Cadena de la
Polimerasa o PCR. Para ello se preparó un mix el cual se mezcló con el ADN. El mix
utilizado se especifica en el Cuadro 3.
Cuadro 3: Mix utilizado para la reacción de PCR en los marcadores SSR de las
NILs de tomate trabajadas.
Reactivos Cantidad por muestra
H2O 17.5 µl
Buffer 10x 2.5 µl
MgCl2 0.75 µl
dNTPs 1 µl
Partidor Forward 1 µl
Partidor Reverse 1 µl
Taq 0,5U 0.2 µl
DNA 1 µl
La amplificación se realizó en un termociclador programado con los siguientes parámetros
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Denaturación inicial 94ºC x 1 min
35 ciclos de:
Denaturación 94ºC x 1 min
Alineamiento 58ºC x 1 min
Extensión 72ºC x 1 min
Extensión final 72ºC x 10 min
Para los marcadores CAPS se usó el mix que se describe en el Cuadro 4.
Cuadro 4: Mix utilizado para la reacción de PCR marcadores CAPS T1670-T1617 y T532 de las NILs de tomate trabajadas.
Reactivos Cantidad por muestra
H2O 5.5 µl
Buffer 10x/Mg 1 µl
dNTPs 0.5 µl
Partidor Forward 1 µl
Partidor Reverse 1 µl
Taq 0,5U 0.1 µl
DNA 1 µl
Las consignas del programa del termociclador para los marcadores CAPS fueron las
siguientes:
Denaturación inicial 94ºC x 2 min
35 ciclos de:
Denaturación 94ºC x 45 seg
Alineamiento 58ºC x 45 seg
Extensión 72ºC x 1 min
Extensión final 72ºC x 10 min
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Al terminar el PCR para CAPS las muestras fueron incubadas durante 2 horas a 37ºC. A
cada muestra se le incorporó el mix indicado en el Cuadro 5.
Cuadro 5: Mix utilizado para la digestión con enzimas de restricción de las muestras obtenidas del PCR de CAPS de las NILs de tomate trabajadas.
Marcador Mix (10µl)
T1670 -T532 2 µl Buffer H
8 µl H2O destilada
0.2 µl enzima de restricción Hinf I
T1617 2 µl Buffer M
8 µl H2O destilada
0.2 µl enzima de restricción Hae III
3.2.4 Condiciones de electroforesis
a) Electroforesis en geles de agarosa:
Se preparó la matriz para correr el gel de agarosa al 2% diluido en buffer TAE 1X.
Posteriormente se cargó con buffer de tinción y se pusieron en los bolsillos de agarosa las
muestras de PCR o de digestión con enzimas de restricción. Luego el gel se puso en una
cámara de electroforesis horizontal sumergida con 15cm de buffer TAE 1X. La
electroforesis se desarrolló durante una hora a 100 W.
Posteriormente se tiñó con Bromuro de Etidio durante 15 min y se leyó el resultado en una
máquina transiluminadora de rayos UV, permitiendo detectar si existía o no amplificación.
Una vez verificada la amplificación se continúo con el proceso descrito en la sección
siguiente.
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b) Electroforesis en gel de poliacrilamida:
Se mezcló 70 µl de acrilamida filtrada, 80 µl de TEMED y 200 µl APS.; se vertió en los
vidrios. Luego de 2 h de gelificación se montó en la cámara de electroforesis vertical.
Luego de una denaturación a 95ºC por 10 min se cargó 5 µl de muestra en cada pocillo
corriendo durante 2 h a 75 V. En la cámara de electroforesis se usó buffer TBE 1X.
Se realizó el desmontaje y revelado de los geles con tinción en plata y revelado en
carbonato (Hopp et al., 2000). Luego del secado se digitalizó una imagen del gel mediante
scanner para corroborar la presencia de individuos homocigotos para S. lycopersicum
(LL), homocigotos para S. habrochaites (HH) y heterocigotos (LH), para cada QTLs
(Figura 3).
Figura 3: Gel que muestra los tres genotipos posibles en la línea LA3957 y su progenie F3: NIL. En las dos primeras columnas se indica el código del genotipo de los parentales y en las siguientes la conformación alélica de la progenie, marcador T1670.
cv.E6203 LL LA3957
HH LH LH LH LH LH LHLLSin
Reacción
1 2 3 4 5 6 7 8
20
Selección de sub-NIL
A fin de realizar una selección de las plantas para el ensayo de crecimiento se trabajò
sobre el mapa construido a partir de la generación F2:NIL (ver sección 3.2), para la NIL
LA3957 constituida por 412 individuos. Se seleccionaron sub-NILs las cuales poseían sólo
una introgresión del padre donante (S. habrochaites).
En el caso del cromosoma 2 se trabajó sobre la generación F3:NIL, (ver sección 3.2),
seleccionando a partir de 191 plantas candidatas a sub-NILs. El criterio de selección se
basó en aquellas plantas que presentaban la menor introgresión del homocigoto HH
(correspondiente a Solanum habrochaites) y heterocigotos (HL) en su trasfondo genético.
3.3. Ensayo de crecimiento vegetativo
3.3.1 Condición de cultivo
La preparación del material se llevó a cabo según lo descrito en la sección 3.1.1 a
excepción de la extracción de ADN. Para el ensayo de crecimiento vegetativo realizado
entre marzo y julio del año 2007 se utilizaron 30 semillas de cada línea genética
seleccionada, las cuales fueron pregerminadas durante un día a 25ºC. Al alcanzar las
plantas el estado de 2 a 3 hojas verdaderas en promedio, fueron trasladadas a la Facultad
de Agronomía. En este lugar se transplantaron 10 ejemplares de cada genotipo a
contenedores de 500 ml con un sustrato Sunshine Nº 3 (turba, vermiculita, piedra caliza,
yeso agrícola y agente humectante), el cual fue regado con una solución de urea de 2 g/l.
Luego las macetas fueron llevadas al Laboratorio de Fitogenética donde se sometieron a
aclimatación en una cámara bioclimática con intensidad lumínica de 450 µmoles fotones
m-2s-1 y temperatura de 18/25ºC (temperatura día/noche) con 14 h diarias de iluminación
durante una semana.
21
3.3.2 Material vegetal
Se utilizó la NIL LA3957 (Figura 4) tiene la introgresión en el cromosoma 9, en esta región
fue identificado un QTL cercano al locus TG366. Este QTL dominante permitiría el
incremento de la materia seca durante el estrés por frío. También se evaluó la NIL
LA3921 (Figura 4) posee una introgresión en el cromosoma 2, en esta región fue
identificado un QTL cercano al locus TG169. Este QTL recesivo incrementaría la
acumulación de materia seca durante el estrés por frío (Oyanedel, 2000).
a b
Mapa cromosoma NIL LA3957
30cM
TG254
TG223CD32ATG291
TG390
CT198
CT112
Mapa cromosoma NIL LA3921
30cM
TG33
CT140
TG554
TG353
CT9
TG620
Figura 4: Mapa genético de las NILs LA3957 (a) LA3921 (b). En color negro se indica la introgresión de S. habrochaites en el trasfondo de S. lycopersicum (Monforte y Tanksley, 2000).
22
3.4 Parámetros analizados
3.4.1 Evaluación del crecimiento vegetativo en líneas LA3957 y LA3921 y sus respectivas
Sub-NILs putativas:
Se utilizaron 10 plantas de cada selección. Las plantas se mantuvieron a temperaturas
promedio de 8/4,5 ºC (+/- 1°C) con 14 h de día/ 10 h de noche por 21 días, con
mediciones a los días 0, 7,14 y 21.
• Experimento 1: Este contó con nueve tratamientos (líneas genéticas). El padre
recurrente cv. E6203, NIL LA3957 y sub-NILs LA3957-29, LA3957-137, LA3957-
94, LA3957-323. Además la NIL LA3921 y sus sub-NILs putativas LA3921-42-16,
LA3921-69 (ver sección 4.1)
• Experimento 2: Este contó con nueve tratamientos: cv E6203, NIL LA3957 y sub-
NILs, LA3957-137, LA3957-94, LA3957-323. Además de la línea LA3921 y sus
sub-NILs putativas LA3921-141-26, LA3921-5-5, LA3921 -141-3 (ver sección 4.1)
Los parámetros evaluados durante la exposición a bajas temperaturas fueron el índice de
plastocrón y área foliar.
3.4.1.1 Determinación de Índice de plastocrón (IP)
El IP se determinó según la siguiente fórmula (Miltau et al., 1985):
PI= n + (log Ln – log r)
(log. LN – log. Ln+1)
23
Donde:
r: Longitud de referencia de 20 mm
n: Nº serial de la hoja más larga que la longitud de referencia.
N+1: Nº serial de la hoja más corta de 20 mm
3.4.1.2 Determinación de área foliar
El área foliar se determinó en base a lo descrito por Swartz y Klaring (2001), para lo cual
se midió el ancho máximo de la hoja, tomando en cuenta un factor específico para las
plantas de tomate. La fórmula que se utilizó para su determinación es la siguiente:
AF = 0.203*(AH) 1.674
Donde:
AF: área foliar (cm2)
AH: ancho de hoja (cm)
3.4.1.3 Determinación de Tasa Relativa de Crecimiento (TRC)
Para la estimación del IP y del AF se utilizó la tasa relativa de crecimiento (TRC), la cual
fue determinada como la diferencia entre el día cero y el día 21.
TRC = Dif (día 21-día 0) x 100%
Día 21
24
3.5 Análisis estadístico
Se utilizó un diseño completamente al azar (DCA). La unidad experimental fue una planta
de tomate en una maceta. Se utilizaron 10 repeticiones para cada tratamiento. Los
tratamientos correspondieron a las líneas genéticas en estudio, LA3921 y LA3957 con sus
correspondientes sub-NILs putativas.
A fin de corroborar los supuestos de normalidad se realizó el test de Anderson-Darling.
El análisis estadístico se llevó a cabo en MINITAB 13, realizando ANDEVA. El análisis de
los datos del Experimento 1 se realizó con comparaciones de medias con el test de Tukey
al 5%.
En el caso del Experimento 2 los datos no presentaron una distribución normal, por lo cual
se utilizó el test no paramétrico de Kruskall-Wallis.
25
4. Resultados y discusión
4.1 Análisis con marcadores moleculares
• Análisis de marcadores en generación F1: NIL
Mediante el uso de marcadores se analizaron individuos de las líneas LA3957 y LA3921
de la generación F1: NIL a fin de corroborar que las plantas fuerón resultado del cruzamiento
de las NILs LA3957 y LA3921 con S. lycopersicum (LL), es decir que su genotipo es
heterocigoto (HL) Figura 5.
Figura 5: Gel de poliacrilamida generación F1: NIL. Los carriles 1 al 8 corresponden a genotipo (HL) de plantas individuales resultado de la hibridación. Además 7 individuos de la línea LA3957 y 2 individuos del cv. E6203. El análisis se realizó con el marcador SSR70.
• Análisis de marcadores generación F2:NIL
De las 420 plantas de la generación F2: NIL de la línea LA3957 se seleccionaron 4 sub-NILs
las cuales presentaban en su trasfondo genético una sola introgresión homocigota del
padre donante S. habrochaites (HH) y la mayor parte de su trasfondo homocigoto para S.
lycopersicum (LL), a excepción de la sub-NILs LA3957-29 en la cual su mapa no pudo ser
completado. El genotipo de las sub-NILs se presenta en la Cuadro 6. Además se
detectaron 91 individuos recombinantes de los cuales se seleccionaron 17 líneas
candidatas a Sub-NILs las cuales presentaban en su trasfondo genético la menor
introgresión del homocigoto HH y heterocigoto HL Cuadro 7. Esta selección fue realizada
para reducir el tamaño de la introgresión.
1 2 3 4 5 6 7 8 LA3957 cv. E6203
26
Cuadro 6: Plantas de tomate seleccionadas como sub-NILs en generación F2: NIL
cromosoma 9.
Nº Planta T1670 T532 SSR73 T1617 SSR702994
137323
Solanum lycopersicum (LL)Solanum habrochaeites (HH)Sin reacción
Cuadro 7: Plantas de tomate seleccionadas como candidatas a sub-NILs generación F2: NIL
cromosoma 9 Nº Planta T1670 T532 SSR73 T1617 SSR70
51 EE EE69 EE EE EE70 EE EE EE EE77 EE EE98 EE EE EE EE
122 EE EE EE152 EE EE167 EE EE EE EE169 EE240 EE EE299 EE301 EE EE EE EE308 EE322 EE EE EE359 EE EE413 EE414 EE
Solanum lycopersicum (LL)Solanum habrochaeites (HH)Heterocigoto (LH)
Del análisis realizado a la generación F2: NIL de la línea LA3921 se encontró una sub-NIL
correspondiente a LA3921-66 (Cuadro 8). Además se encontraron 32 individuos
recombinantes para la sub-región (Cuadro 9).
Cuadro 8: Genotipo de tomate de la línea seleccionada como sub-NIL en generación F2: NIL
cromosoma 2. Planta SSR356 SSR605 SSR103 SSR5 SSR50 SSR26 SSR331 SSR580
66 EE EE EE EE EE EE EE
Solanum lycopersicum (LL)Solanum habrochaeites (HH)
27
Cuadro 9: Genotipo de plantas de tomate candidatas a sub-NILs en generación F2: NIL
cromosoma 2.
Planta SSR356 SSR605 SSR103 SSR5 SSR50 SSR26 SSR331 SSR58057914151925303436394245484950515960616269858795
107128133141144148157162
Solanum lycopersicum (LL)Solanum habrochaeites (HH)Heterocigotos (LH)Sin reacción
Análisis de marcadores en generación F3: NIL
El trabajo correspondió a la comparación de las sub-NILs putativas con sus parentales
(LA1777 y cv. E6203), a través de presencia o ausencia de bandas. Los SSR permiten
detectar un solo locus, indicando que los individuos heterocigotos presentan patrones
simples de dos bandas siendo cada una de estas heredada de uno de sus progenitores,
en tanto los individuos homocigotos mostrarán sólo una (García-Mas et al., 2000). Con
estos marcadores, se determinó si en el trasfondo genético de cada uno de los individuos
era correspondientemente homocigotos para S. lycopersicum (LL), S. habrochaites (HH) o
heterocigoto (HL) conteniendo información de ambos padres.
El análisis con marcadores para el cromosoma 9 se realizó a 10 plantas de cada sub-NIL
correspondiente a la generación F3: NIL, a fin de poder corroborar la presencia de la
introgresión. Los resultados se presentan en la Figura 6.
28
5cM
T1670
T532 SSR73
T1617
SSR70
Solanum lycopersicum (EE)Solanum habrochaites (HH)Sin reacción
Sub-NIL LA3957-29
5cM
T1670
T532 SSR73
T1617
SSR70
Sub-NIL LA3957-94
5cM
T1670
T532 SSR73
T1617
SSR70
Sub-NIL LA3957-137
5cM
T1670
T532 SSR73
T1617
SSR70
Sub-NIL LA3957-323
Figura 6: Mapa del genotipo de sub-NILs de tomate analizadas en la generación F3: NIL.
Algunas de las reacciones no fueron exitosas, tras reiterados intentos, por lo cual no fue
posible identificar todos los loci existentes en la sub-región.
29
Al analizar el genotipo de las sub-NILs se observó en dos de ellas un cambio en la
posición de la introgresión respecto a la generación F2: NIL (Cuadro 10). Se ha descrito la
existencia de transposones, los cuales corresponden a secuencias discretas en el
genoma que son móviles y serían la mayor causa de variación entre generaciones (Lewin,
1997). Yañez et al. (1998) encontraron en el genoma de Solanum chilense cuatro familias
de retrotransposones los cuales han demostrado que son activos.
Cuadro 10: Comparación de introgresión entre generación F2: NIL y F3: NIL para sub-NILs LA3957-94 y LA3957-137.
Nº Planta Generación T1670 T532 SSR73 T1617 SSR7094 F294 F3
137 F2137 F3
Solanum lycopersicum (LL)Solanum habrochaeites (HH)
En tanto en la sub-NILs LA3957-29 la introgresión no fue encontrada . El material genético
aún puede estar segregando y la introgresión no estaba fijada en las plantas analizadas
en la generación F3: NIL, para lo cual sería necesario ampliar el número de plantas a las
cuales se les realice el análisis (Figura 7). Esto podría deberse a la recombinación de
material genético o crossing over, en la que se produce gran variabilidad de la información
genética en los descendientes (Klug y Cummings, 1999) pudiendo haberse perdido la
introgresión.
30
a b
5cM
T1670
T532 SSR73
T1617
SSR70
Solanum lycopersicum (EE)Solanum habrochaites (HH)Sin reacción
Sub-NIL LA3957-29 F2
5cM
T1670
T532 SSR73
T1617
SSR70
Sub-NIL LA3957-29 F3
Figura 7: Mapa de cromosoma sub-NIL LA3957-29 F2: NIL(a) y sub-NIL LA3957-29
F3: NIL (b)
Al analizar 170 plantas F3:NIL derivadas de la cruza entre LA3957 y cv. E6203, se encontró
sub-NILs putativas. Las sub-NILs poseen en su trasfondo genético una introgresión de S.
habrochaites menor a 10 cM y que la mayor parte de su transfondo corresponde a S.
lycopersicum (Cuadro 11).
Cuadro 11: Selección de candidatas a sub-NILs tras análisis de generación F3: NIL línea LA3957.
Nº Planta T1670 T532 SSR73 T1617 SSR704147070696977
322
Solanum lycopersicum (LL)Solanum habrochaeites (HH)Sin reacción
En la línea LA3921 (introgresión cromosoma 2) se seleccionaron siete individuos
homocigotos (Cuadro 12 a) a fin de tener cubierta toda la zona de introgresión. Por su
parte en dos individuos la introgresión se ha reducido a una distancia de 22 cM, pudiendo
31
ser candidatas a sub-NIL (Cuadro 12 b). Además la sub-NILs LA3921-66 presenta una
condición aún de heterocigosis (Cuadro 12 c), siendo que la introgresión aún no se ha
fijado requiriendo de más generaciones para encontrar sub-NILs putativas. Esta pérdida
de la introgresión en las plantas analizadas puede deberse al efecto de azar en la
recombinación o crossing over, en la cual se produce gran variación en los descendientes
(Klug y Cummings, 1999).
Cuadro 12 a: Selección de individuos homocigotos para la zona de introgresión.
Planta SSR356 SSR605 SSR103 SSR5 SSR50 SSR26 SSR331 SSR580141-3
141-265-5
30-1634-860-37-6
Solanum lycopersicum (EE)Solanum habrochaeites (HH)Heterocigotos Sin reacción
Cuadro 12 b: Genotipo de los individuos en los cuales la introgresión se ha reducido a un sólo locus.
Planta SSR356 SSR605 SSR103 SSR5 SSR50 SSR26 SSR331 SSR58034-8 EE EE EE EE EE34-16 EE EE EE EE
Solanum lycopersicum (LL)Solanum habrochaeites (HH)Heterocigotos (LH)Sin reacción
Cuadro 12 c: genotipo de LA3921-66 F3: NIL Planta SSR356 SSR605 SSR103 SSR5 SSR50 SSR26 SSR331 SSR580
66-2 EE EE EE EE EE EE EE EE
Solanum lycopersicum (EE)
32
4.2 Crecimiento Vegetativo
4.2.1 Determinación del índice de plastocrón:
Experimento 1
Al analizar la tasa de crecimiento relativo (TRC) del IP tras la exposición a las bajas
temperaturas (9/4° C día/noche) se obtuvo diferencias significativas para las líneas
LA3957, LA3921 y la sub-NIL LA3957-323. La sub-NIL LA3957-323 tuvo un crecimiento
en 1.8 veces superior a su parental LA3957 y una vez superior a la línea LA3921 (Cuadro
13). Saldías (2006) encontró que la línea LA3957 presentaba para los tiempos de
medición un IP levemente mayor que su control isogénico (cv. E6203) durante el período
de exposición a bajas temperaturas. También encontró que la línea LA3921 presentaba
una diferencia de IP en 1.05 veces respecto del control.
Cuadro 13: Tasa relativa de crecimiento del índice de plastocrón (IP) en NILs y sub-NILs de tomate y su control isogénico (E6203), en tratamiento de régimen de temperaturas a 9/4°C día/noche.
Letras iguales indican que no se detectó diferencias significativas entre las medias. Test
de Tukey (α =0.05)
Estudios de estrés por frío realizados por Wolf et al. (1986) indican que plantas de tomate
con introgresiones de ecotipos de montaña de S. habrochaites, poseen un índice del
plastocrón (IP) mayor que el tomate cultivado. A la vez, las plantas expuestas por un
Tratamiento TRC IP 0-21 LA3957-323 26,92 a
LA3921 25,48 a LA3957-137 23,97 ab LA3957-29 20,71 ab
LA3921-42-14 20,48 ab LA3921-69-19 19,70 ab
LA3957-94 19,47 ab E6203 18,74 ab LA3957 14,90 b
33
tiempo prolongado a condiciones adversas de temperatura, generan lesiones de forma
progresiva que involucran daños a nivel celular en cloroplastos, retículos, mitocondrias y
vacuolas, lo que provoca un desequilibrio general en las plantas, que se traduce en un
menor desarrollo vegetativo de ellas, como por ejemplo un descenso en la tasa de
producción de hojas (Kratsch y Wise, 2000).
Experimento 2:
En este ensayo no se encontraron diferencias significativas entre las líneas genéticas y su
control isogénico (Cuadro 14).
Cuadro 14: Tasa relativa de crecimiento del Índice de Plastocrón (IP) en NILs y sub-NILs de tomate y su control isogénico (cv. E6203), en tratamiento de régimen de temperaturas a 9/4°.
NS: Indica que no existen diferencias significativas (P>0.05)
Las plantas en este ensayo resultaron más dañadas que en el ensayo uno, ya que hubo
una falla en el sistema de control de temperatura de la cámara de crecimiento. En la
semana 3 se presentó un día con 1 h de temperaturas entre -1 y 2 °C. Algunos de los
daños que pudieron registrarse fue la marchitez total de algunas plantas, lo cual se podría
explicar por que las bajas temperaturas afectan la conductancia hidráulica de las raíces,
presentando las plantas sensibilidad al estrés por agua (Goodstal et al., 2005). Además
según Tadeo (2000), cuando las raíces pierden la capacidad para absorber agua se
Tratamiento TRC IP 0-21 LA3957-94 5,443NS
LA3921 4,216 E6203 4,152
LA3921-5-5 2,915 LA3957-323 2,863
LA3921-141-26 2,713 LA3921-141-3 1,932
LA3957 1,814 LA3957-137 1,703
34
bloquea la función de los estomas, lo que podría explicar el estado en que las plantas
terminaron al final de este ensayo.
4.2.2 Área foliar:
El área foliar se estimó según lo propuesto por Schwarz y Kläring (2001), ya que este
método permite determinar el área foliar de una forma no destructiva, pudiendo realizar
mediciones en forma repetitiva en el tiempo.
Al realizar el análisis estadístico de ambos ensayos de TRC del Área Foliar en NILs y sub-
NILs de tomate, no fue posible encontrar diferencias significativas entre los genotipos
(Cuadros 15 y 16).
Cuadro 15: Ensayo 1: Tasa relativa de crecimiento del Área Foliar (AF) en NILs y sub- NILs de tomate y su control isogénico (cv.E6203), en régimen de temperatura a 9/4°C, para la TRC entre días 0 y 21.
Tratamiento TRC IP 0-21 LA3921 25,458NS
LA3957-29 25,412 LA3921-69-19 23,177 LA3957-323 22,499
E6203 21,886 LA3957 21,37
LA3957-137 20,315 LA3957-94 19,806
LA3921-42-14 18,864 NS: Indica que no existen diferencias significativas (P>0.05)
35
Cuadro 16: Ensayo 2: Tasa relativa de crecimiento del Área Foliar (AF) en NILs y sub- NILs de tomate y su control isogénico (cv.E6203), en tratamiento de régimen de temperaturas a 9/4°C, para la TRC entre días 0 y 21.
Tratamiento TRC AF IP 0-21 LA3921 24,06NS
LA3921-141-3 23,54 E6203 20,98 LA3957 18,29
LA3921-5-5 17,81 LA3957-137 16,75 LA3957-323 16,09 LA3957-94 14,96
LA3921-141-26 12,2 NS: Indica que no existen diferencias significativas (P>0.05)
Miltau et al. (1985), al realizar un ensayo con temperaturas de 12°C y 6°C (día/noche),
obtuvieron que plantas de S. habrochaites presentan una superficie fotosintética mayor en
comparación con S. lycopersicum. Ello hace suponer que las líneas con introgresiones de
parientes silvestres deberían presentar mayores TRC de área foliar, lo que no pudo ser
establecido en esta investigación. Por su parte Escalona (2003), en ensayos con seis
líneas equivalentes a las usadas en esta investigación, encontró que la línea LA3952
presentó un incremento de 17,9% en su AF respecto del cultivar E6203. Vázquez (2006)
encontró que a temperaturas de 9/4°C día/noche la línea LA3921 presentó un 77% más
de peso seco que el control E6203 y a su vez 1,2 veces superior a la línea LA3957.
El crecimiento vegetativo representa la integración de factores tales como condición
fisiológica de la planta y su respuesta frente a condiciones ambientales. En este caso, el
estrés por bajas temperaturas genera un menor desarrollo vegetativo, lo que supone la
posible inducción de genes involucrados en la resistencia al frío ubicados en distintos
cromosomas de las líneas genéticas (Vallejos y Tanskley, 1983). Esto no pudo ser
demostrado en estos ensayos ya que no fueron encontradas diferencias significativas
entre las líneas potencialmente tolerantes al frío y el tomate cultivado.
36
Uno de los motivos de la ausencia de características de resistencia al frío podrían estar
explicados ya que Oyanedel (2000) y Oyanedel et al. (2000) encontraron una baja
varianza fenotípica que explican los QTLs, con valores R2 menores a 10% en los ensayos
realizados. También podría deberse a una expresión de la resistencia en etapas
fenológicas no estudiadas. Por último, el tamaño muestral utilizado (n=10) fue muy
pequeño para corroborar la expresión de la introgresión, por lo cual se propone
aumentarlo en estudios futuros.
37
5. Conclusiones
Mediante el uso de marcadores moleculares en el cromosoma 9 se desarrolló sub-NILs
las cuales presentaban una introgresión menor a 10 cM. Por su parte en el cromosoma 2
sólo se encontraron candidatas a sub-NILs en las cuales es necesario reducir el tamaño
de la introgresión en posteriores generaciones F4: NIL.
No se pudo comprobar la resistencia al frío en las líneas genéticas estudiadas. Al analizar
los datos respecto a los parámetros de crecimiento como el índice de plastocrón y el área
foliar expresado en su tasa relativa de crecimiento no se pudo verificar la presencia de los
QTLs para conferir resistencia al frío en las líneas del cromosoma 9 y 2.
38
6. Literatura citada
Allard, R. 1999. Principles of plant breeding. 254 p. John Wiley & Sons, Inc. Toronto.
Canada.
Chamarro, J. 1995. Situación anatomía y fisiología de la planta. p. 43-91. In: F. Nuez,
(ed.).. El cultivo del tomate. Ediciones Mundi-Prensa, Madrid, España.
Cornell University. 2007. Solanaceae Genomics Network (SGN). University Cornell,
USA. Available at http://www.sgn.cornell.edu/. Accessed 24 August 2007.
Corporación de Fomento de la Producción. 1986. Monografías hortícolas: tomate, arveja,
brócoli y zanahoria. 99 p. Santiago, Chile.
De Verna, J., and A. Patterson. 1991. Genetics of Lycopersicon. p 21-38. In: G. Kallo (ed.)
Genetic improvement of tomato. Springer-Verlag, Berlin, Germany.
Doyle , J., and J.L. Doyle. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities and
fresh leaf tissue. Phytochem. Bull. 19: 11-15.
Escaff, M., P. Gil, R. Ferreyra, P. Estay, A. Bruna, P. Maldonado, y C. Barrera. 2005.
Cultivo del tomate bajo invernadero. 79 p. Boletín INIA, N° 128, La Cruz, Chile.
Escalona, C. 2003. Evaluación del contenido endógeno de ABA (ácido abscísico) y
parámetros vegetativos en líneas de tomate con resistencia al frío. 49 p. Taller de
Licenciatura. Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, Facultad de Agronomía,
Quillota, Chile.
Esquinas-Alcázar, J. y F. Nuez. 1995. Situación taxonómica, domesticación y difusión del
tomate. In: F. Nuez (ed.). El cultivo del tomate. Ediciones Mundi-Prensa, Madrid,
España.
39
Foolad, M.R., F.Q. Chen, and G.Y. Lin. 1998. RFLP mapping of QTLs conferring cold
tolerance during seed germination in an interspecific cross of tomato. Molecular Breeding
4: 519-529.
García-Mas J., E. Graziano, M.J. Aranzana, A. Monforte, M. Oliver, J. Ballester, M.A.
Viruel y P. Arús. 2000. Marcadores de ADN: Concepto, tipos, protocolo. p 91-151 In: F.
Nuez y J.M. Carrillo (eds.). Los Marcadores Genéticos en la Mejora Vegetal. Editorial
U.P.V., Valencia, España.
Goodstal J.F., G. R. Kohler, L.B. Randall, A.J. Bloom, and D.A. ST Clair. 2005. A major
QTL introgressed from wild Lycopersicon hirsutum confers chilling tolerane to cultivated
tomato (Lycopersicon esculentum). Theor. Appl. Genet. 111: 898-905
Hsieh T.H, J.T. Lee, P. T. Yang, L. H. Chiu, and Charng, Y.C. 2002. Heterology
expression of the Arabidopis C-repeat/Dehydration response Element Binding Factor 1
Gene Confers Elevated Tolerance to Chilling and Oxidative Stresses in Transgenic
tomato. Plant Physiol. 129: 1086-1094.
Hopp E., J. P. Ortíz, L. Ferreyra, F. Espinoza, y E. J. Martínez. 2005. Curso de postgrado:
Utilización de Marcadores Moleculares en Estudios de Genética Vegetal. 93 p.
Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Agrarias, Corrientes, Argentina.
Jones, J.B. 1998. Tomato Plant Culture: The field, greenhouse and home garden. 224 p.
CRC Press, Boca Ratón, USA.
Kamps, T., T. Isleib, R. Herner, and K. Sink. 1987. Evaluation of Techniques to Measure
Chilling Injury in Tomato. HortScience 22(6): 1309-1312.
Kinet, J.M and M. Peet. 1997. Tomato. pp 207-259. In: H. C, Wien (ed.). The
physiology of vegetable crops. CAB International. Wallingford, UK.
40
Klug, W., y M. Cummings. 1999. Conceptos de Genética. 814 p. Ediciones Prentice Hall.
Madrid, España.
Kraus, GH. 1988. Photoinhibition of photosynthesis. And evaluation of damaging and
protective mechanisms. Physiologia Plantarum 74: 566-574.
Kratsch, H. A. and R.R Wise. 2000. The ultrastructure of chilling stress. Plant, Cell and
Environment 23:337-350
Litlle, MT y F. Jackson. 1989. Métodos estadísticos para la investigación en la
agricultura. 270 p. Editorial Trillas, México D.F., México.
Lewin, B. 1997. Transposons. p 563-589. In: Genes. Oxford University Press and Cell.
New York, USA.
Martín, A. 2002. Los Marcadores Genéticos en la Mejora Vegetal. p. 39-60. In: Nuez et al
(eds.). Genómica y Mejora Vegetal. Ediciones Mundi-Prensa. Sevilla, España.
Miltau, O., D. Zamir, and J. Rudich. 1985. Growth Rates of Lycopersicon Species at Low
Temperatures. Z. Pflanzezuchtg 96: 193-199.
Monforte, A and S.D. Tankley. 2000. Development of a set of near isogenic and
backcross recombinant inbred lines containing most of the Lycopersicon hirsutum genome
in a Lycopersicon esculentum background. A toll for gene mapping and gene discovery.
Genome 43: 803-813.
Monckeberg, F., E. Agosín, M. Perretta, M. Rossemblatt, E. Spencer, A. Valenzuela, y L.
Valladares. 1988. “La revolución de la Bioingeniería”. 199 p. Publicaciones
Mediterráneo, Santiago, Chile
41
Nuez, F. 1995a. Anatomía y Fisiología de la planta. p. 44-91. In F. Nuez (ed.). El cultivo
del tomate. Editorial Mundi-Prensa, Madrid, España.
Nuez, F. 1995b. Desarrollo de nuevos cultivares. p. 625-669. In F. Nuez (ed.). El cultivo
del tomate. Editorial Mundi-Prensa, Madrid, España.
Nuez, F., J.M. Carrillo, y A.M. De Ron. 2000. Introducción. p. 3-22 In: F. Nuez y J.M.
Carrillo (eds.). Los Marcadores Genéticos en la Mejora Vegetal. Editorial U.P.V.,
Valencia, España.
Oyanedel, E. 2000. Quantitative trait loci analysis of chilling tolerance in tomato. 140 p.
Ph. D. diss. Cornell University, Ithaca, N.Y. USA.
Oyanedel, E., D.W. Wolfe, T.G. Owens, A.J. Monforte, and S.D. Tanksley. 2000.
Quantitative trait loci analysis of photoinhibition under chilling stress in tomato. Acta
Horticulturae 521: 227- 232.
Owens, T.G. 1996. Processing of excitation energy by antenna pigments. p. 1-23. In: N.
Baker (ed.). Photosynthesisand the Environment. Kluwer Academic Publishers,
Dordrecht, Holanda.
Patterson, B.D, R. Paull, R and RM.Smillie. 1978. Chilling resistance in Lycopersicon
hirsutum Humb. et Bonpl., a wild tomato with a wide altitudinal distribution. Australian
Journal Plant Physiology 5: 609-617
Pérez de la Vega, M y P. García. 2000. Análisis de la variación genética en las
poblaciones. p. 409-512 In F. Nuez, y J.M. Carrillo (eds.). Los Marcadores Genéticos en
la Mejora Vegetal. Editorial U.P. V., Valencia, España.
42
Picó, B, y J.J. Ruiz. 2000. Clonación Posicional y Mapeo Comparativo. p 441-512 In: F.
Nuez, y J.M. Carrillo (eds.). Los Marcadores Genéticos en la Mejora Vegetal. Editorial
U.P.V., Valencia, España.
Raison, J., and M. Brown. 1989. Sensitivity of altitudinal ecotypes of the wild tomato
Lycopersicon hirsutum to chilling injury. Plant Physiology 91: 1471-1475.
Rick, C.M. 1979. Potential improvement of tomatoes by controlled introgression of genes
from wild species. p. 167-173. In: AC. Zeven, and M. A. Harten (eds.). Proceedings of
the Conference on Broadening Genetic Base Crops. Pudoc, Wagenigen, Netherlands.
Rick, C.M. 1995. Tomato Lycopersicon esculentum (Solanaceae). p 452-457. In: N. W.
Simmons (ed.). Evolution of Crop Plants. Longman, London, England
Saldías, J. 2006. Evaluación del crecimiento vegetativo y ABA en plantas de tomate
sometidas a estrés por enfriamiento. 48 p. Taller de Licenciatura. Pontificia Universidad
Católica de Valparaíso, Facultad de Agronomía, Quillota, Chile.
Schneider, K. 2005. Part I: Mapping Populations and Principles of Genetic Mapping. p 3-
19. In: K. Meksem, and G. Kahl (eds). The Handbook of Plant Genome Mapping.
WILEY-VCH, Weiheim, Germany.
Smillie, R., y R Nott. 1979. Assay of chilling injury in wild and domestic tomatoes based
on photosystem activity of the chilled leaves. Plant Physiol 63: 796-801.
Spooner DM., IE. Peralta and S. Knapp. 2005. Comparison of AFLPs with other markers
for phylogenetic inference in wild tomatoes [Solanum L. section Lycopersicon (Mill.)
Wettst.]. Taxon 54 (1):43-61.
Swartz, D., and H. Klaring. 2001. Allometry to estimate leaf area of tomato. Journal of
Plant Nutrition 24:1291-1309.
43
Tadeo, F. 2000. Fisiología de las plantas y el estrés. p 481-498. In: J. Azcon-Bieto, y M.
Talón (eds.). Fundamentos de Fisiología Vegetal. Mcgraw-Hill, Madrid,España.
Vallejos, C.E. 1979. Genetic diversity of plants for response to low temperatures and its
potencial use in crop plants. p 473-489. In: J.M Lyons, D. Gram., and J.K. Raison (eds).
Low temperature stress in crop plants. Academy Press, London , England.
Vallejos C.E, y S.D. Tanksley. 1983. Segregation of isozime markers and cold tolerance
in a interspecific backcross of tomato. Theor. Appl. Genet. 66: 241-247.
Vásquez, B. 2006. Efectos del estrés por enfriamiento sobre el contenido de clorofila y la
fotoinhibición en tomate. 35 p. Taller de Licenciatura. Ing. Agr. Pontificia Universidad
Católica de Valparaíso, Facultad de Agronomía, Quillota, Chile.
Venema, J., F. Posthumus, M. De Vries, and P. Van Hasselt. 1999. Differential response
of domestic and wild Lycopersicon species to chilling under low light: growth, carbohydrate
content, photosynthesis and xanthophyll cycle. Physiologia Plantarum 105:81-88.
Venema, J., M. Eekhof. and P. Van Hasselt. 2000. Analysis of low-temperature tolerance
of a tomato (Lycopersicon esculentum) cybrid with choloroplasts from a more chilling-
tolerant L. Hirsutum accession. Annals of Botany 85(6): 799-807.
Walker, M.A., B.D. Mckersie, and K.P. Pauls. 1991. Effects of chilling on the biochemical
and functional properties of thylacoid membranes. Plant Physiology 97: 663-669
Wolf, S., D., Yakir, M.A. Stevens, and J. Rudich. 1986. Cold temperature tolerance of wild
tomato species. Journal of the American Society for Horticultural Science 111: 960-964.
Yakir, D., J. Rudich, and B. Bravdo . 1986. Adaptation to chilling: photosynhtetic
characteristcs of the cultivated tomato and a high altitude wild species. Plant, Cell and
Environment 9 (6): 477-484.
44
Yañez M., I. Verdugo, M. Rodríguez, S. Prats, and S. Ruiz Lara. 1998. Highly
heterogeneous families of Ty1/copia retrotransposons in the Lycopersicon chilense
genome. Gene 222: 223-228.