Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293

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Tesis de Posgrado

Sobre el aislamiento de proteínasSobre el aislamiento de proteínasde subproductos de semilla dede subproductos de semilla de

girasolgirasol

Rucci, Alberto Osvaldo

1972

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

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Cita tipo APA:Rucci, Alberto Osvaldo. (1972). Sobre el aislamiento de proteínas de subproductos de semilla degirasol. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1397_Rucci.pdf

Cita tipo Chicago:Rucci, Alberto Osvaldo. "Sobre el aislamiento de proteínas de subproductos de semilla degirasol". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de BuenosAires. 1972. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1397_Rucci.pdf

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IKIVELSZLAJ LS BÏEHOS AIRES

FACLLTAL DE CZSNQIAS EXACTAS Y NATURALES

"SCBRE E; AIZLAHIENTO JE PKvÏE:NÉS LE SUBPFCSUSTCS

DE SEMILLA DE GIKASOL'

’1'3"97=

ALBERTO OSVALDO RUCCI

Tesis presentada para optar al título

de Doctor en Ciencias Químicas

1972

Agradezco también;

- A1 Dr. Pedro Cattáneo, por sus valiosos conseJos y elconstante estímulo prestado.

- A1 Dr. Juan C. Sanahuja y a su equipo de trabajo de laCátedra de Bromatología y Nutrición Experimental. Fa.cultad de Farmacia y Bioquímica, U.B.A., por el aporte

que sus ensayos y determinaciones biológicas signifiqgron para este trabago.

- A la firma "Molinos Río de la Plata“ S.R.L. el haber

proporcionado los productos de partida. motivo de esteestudio.

- A nis compañeros y demás personal de la Cátedra de 3:2natología, por su sincera y cordial amistad.

A mis padres

A ni esposa

1)

2V

V3

V4

5)

PARTE I

INTRODUCCION

Sobre los 'concentrados' y l'aislados" proteinicos de semillasde oleaginosas para le alimentación humana.

Proteinas de semilla de girasol - Valor nutritivo.

Compuestospolifenólicos que ocurren en la semilla de girasol Caracteristicas.

Recientes estudios sobre 'concentrados' proteinicos de semillade girasol - Ensayos de inocuidad.

Aislamiento de proteinas a partir de harina de semilla de gin;S01 - Antecedentes.

1) Sobre los'Égpcoguéigg¿* ï;“dLsiad05‘ 25o: inic05 ¿e senillase

de9...9.1ea¿9.0.9.2.3E5523.33- ..-..

En la actual hindi, ¿pr'onüiuáomsate 100 millones de tg

neladas de semillas da «¿segmaogaay«¿aivmientes a unos 60 ¡1113¡ICS de toneladas (14.?-3‘;.m:32

2

glir. Noobstante, los problemas qua se presentan para aumentar sigairicativamemte la predicción de alimentos proteinicos son conplejessno sólo lo son de producción, elaboración” distribución y consumo.sino también de economía y a aptabiliiad. Cono los alimentos de granaceptación ricos en proteinas (sarna. pescado, huevos. leche) son enLa ¡ayoría de los paíaes en dnsa;rc11u. especialmente escasos y costosos. se continúa concvdignaopríüridad al incremento de fuente:Enoconvencionales" de Iroteings para la nutrición ¿el hombre,

Evidentemene. los prügranas de dGSarrollo difiercn ssgún las condiciones especificaa de cada pais. La situación se rqule Im?bien en 1M- :¿s359225,(1) (2) (3) (5). en los quese señala que, atendienno a ¿a3 cantidades disponibles y a1 costo.las 'tortas“ de Hemilias ¿e oleaginosas parecen ser una: de las míailportantos Pumntesde proteinas que se puedan desarrollar en elnclcnto actualn

Debido a que el aceite extraído, y en el caso de 1a gg¡illa de algodóntanbién la fibra. cubrenparte del costo. esta:tortas son 1a fuente mas económica de proteinas en el ¡ando y es pgsible que continúan siéndwlo.

Normalmente. tanto en los países en desarrollo comoen

los desarrollados, 1a población no consumelos alimentos por su v31er nutritivo. Su elección se basa en el precio, en el gusto o enairis características que estime Bfisaceptables.

Al parecer, Las “cunveütraáos' de senillas de oltagingsas producidos hasta lA fecha, nu ¿Lampresatisfacen plenamente ggtos raquisitos sagfin la opinién ¿e persomagaxyerinentadms en canpaflks llevadas a ccbu en regioaes en dmsarrollc. La ¿ificultad tigne que ver can la beca acápïac¿én ¿us ¿e dispensa 1a población en

generale El poteac;a; ¡ep eaextado por las "cencentrüdos“ protein;

cos de semillas de oleaginosas y el relativamente escaso apwove

chaniento del mismopor la población necesitada. dispone a la continuación de trabajos sobre el particular, en el sentido de mejovrar su aceptacion y modificar la tecnología de los alimentos.

Los “concentrados' o sus proteinas aisladas. si bien noson atractivos “per se’, tienen propiedades funcionales capaces demodificar en gran medida la textura y otras caracteristicas de losalimentos pudiendo producir cambios Favorables. La adición de ta

les “concentrados” proteínicos puede también incresentar el atrastivo, a 1a vez que el valor nutricional, de dietas o alimentos tradicionales.

Cierto número de preparados experimentales a base deproteina de soya 'hilada', imitan la textura. apariencia y saborde una variedad de alimentos cárnicos. Algunos de este tipo sevenden corrientenente en los Estados Unidos de Norteanerica. Las

harinas de soya y los 'granulados' ('grits') puedenhallarse actualnente en productos de horneado, en carnes procesadas y entasgdas, en alimentos para infantes y para el desayuno. Los "aislados"de proteina de soya. a su vez. en productos de panaderia. postres.bebidas y alimentos dietéticos. El desarrollo las significativo eneste aspecto, ocurrido en estos últinos años, se debe.a la versatilidad de los productos 'texturizados' de proteina de soya. que lespermiten innumerables aplicaciones (5) (6).

El Comité Asesor sobre ¿a Aplicación gg ¿a Ciencia y¿a Tecnologia al Desarrollo (l). señaló hace un tie-po. que si sepudiera dar a las proteínas de semillas de oleaginosas las propigdades bioquínicas del gluten de trigo, podría persuadirse a la igdustria panadera a incorporar tales “concentrados” en el pan. aúncuando sn precio fuese mas elevado que el fabricado con harina detrigo. Tal conocimientocontribuiría a negorar otros productos ali

nenticios básicos ( pastas, tortillas, etc.) que se consumenenpaises en desarrollo. Todoel rango de productos de selilla dealgodón. desde harinas a "aislados" proteinicos. fueron entonces

ensayados por el American Institute gg Daking (USA)(7) en Pone!laciones para masas, panes. etc. Niveles relativa-ente bajos del"concentrado" (hasta un 31).'en presencia de 30 partes por millónde KBr03, produjeron buenos panes al ser incorporados en lugar dela harina de trigo. Mayoresniveles (10%). necesitaban la adición

de 60 partes por millón de [Br03 para legrar caracteristicas satisfactorias. Los panes preparados con 101 Y aún con niveles desustitución del 15%del ’aislado' proteico, sin la adición de[Br03 , permitieron obtener panes de alto contenido en proteinasy excelentes cualidades.

Hace pocos meses, en la Universidad gg Kansas (USA),se preparó una mezcla de 100 partes de harina de trigo y 12 partesde harina de soya, aditionadas con 0,5 partes de un enulsificante(estearoil 2-1actüato de socio)

la forma de granos 'simulados' (8).En productos comopastas, se ha logrado aumentar la

firmeza de fideos sometidos a largos periodos de cocción. con lamejora simultanea de su calidad nutricional, al sustituir partede la semolina ( en niveles del 12; 17 y 251)pon harina de soya (9).

El uso de "concentrados" proteinicos de semilla: deoleaginosas en alimentos y leche para lactantes ofrece un campomuypropicio para la investigación y el desarrollo tecnológico.Nosólo porque los productos de esta clase deben llegar directamente a la parte de la población que mas los necesita (los niños ), sino también porque el éxito logrado en paises comoIndia,

China e Indonesia, indica que pueden resultar aceptables y econgmicamenteelaborables en otros países en desarrollo.

Los sustitutos de la leche forman un importante gru

po de productos a base de proteinas de semillas de oleaginosas.Hace unos pocos años, la India, a causa de la escasez

de leche en polvo desCremada en el mercado mundial, y a falta de

intercambio de ese producto con el exterior. se vió en la necesidad de desarrollar leche "vegetal" preparada con el 'aislado'proteínico de semilla de mani y una mezcla de dextrina y maltosa.Actualmente, en tres de sus principales ciudades se comercializaun producto l'mezcla" con leche animal. La relación de eficienciaproteica (REP)del producto es 2,9 comparadocon el valor 3.0 de

la leche en polvo. ( Se usa una relación de 50%leche animal y50%del preparado vegetal antes mencionado).

Tambiénse han desarrollado bebidas de leche ¡altea

da, total o parcialmente basadas en proteinas vegetales, con Cog

Ch

tos inferiores al de la leche awimaï y 4} ¿icanca du la poblaciónu

ude bajos ingresos (10;,

Existe hay día una gran oynwiun ¿ad para usar producntos de sintesis y sustitutos en 1a formulación de alimentos. Estosintervienen en el logro y mentenimiento de ciertas ventAJas tecnológicas. Otra razón para usarlos pued? eutar e. el propósito deobtener determinadas propiedades fisicas o para eliminar sustan.cias tóxicas o antinutricianales, EECVüm#nTü?e? vaïor nutritivo

o mejorar la estabil dad de un pfüñd?ïü; ÜÉHFTEJNFÜ'EHe} producto

debe tener atractivo iÜMQÜiúÏÜp¿ e q? ““¿n¿m;ü9* y ls forma mas

rápida de alcanzzrlou La ¿ r wtcreu;3n ¿Tfífiïa del suple'wnento en el allmentï '4“ o :¿a¿:¿aru; ¿.n que Éüte Lamhifisus caracteristmcaï: 7P Í‘4üïmvdfiï Ámwa¿a? ruda»

cido por 1a propaïeu; a: huïhui ¿4357 por la vi; üúüCüClOñfll(11).

7-353 9: ' Y . 'Ïu " ¿iÏf':_-T*'-Zi."nm

tando a 103 "CÜÑCHRLJP a 'd; 3510:” coma gram

ductos sir dir. -¿_¿E que Eïlüm

ten recursa'sP Ó?hï” , Pgïa kira?los apetecibles. un “>Lü'enLraflgu*

proteina de plasman: ' ¿'72 :'_1.33145

corporaron en alimenta '.; “u

de]. 'flavor" rESOÏ.Vlf*ï‘.-11 4-3. 3:.v'ol>1.r:r:=,.a tu) --'_:¡-’;.>r':‘.=¿

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tituyentes principaleu es_2imílmrv los Élfiïlntos productos obranidos de las sen lllfi Gmflleñgingguü puaóan diferir marcadamenm

te en las caracterlrclrvs sus cowgantztas ladiViduales, proteicos y no proteicrsr Üadaproduct; proteico de nleaginosn dew

berá , entonces, ser examinadoan lo referente a sus caracterigticas funcionales básifiafi. a los Eines de su mayor aprovechaniqgto en productos alimenticios (7).

Es obvia,pueq, la necesidad ¿e desarrollar suplenegtos proteínicos de una Cúliddd excelcnte, si se desea luchar costra la nalnutrición proteicafi Mejor calidad, por supuesto, no ggrantiza consumoni :amyocc solución a los múltiples aspectos deeste problema. Se congldera convenienïe que los suplementos deográn contener alrededor ¿el ?01 ¿e una proteina de alta calidad ydigestibilidad. La mencr cant dad de auplemento proteinicc per mnitirá incluir en la Farmulación,ingredientes que anartaa nejgres características organoaépiicas9 ¿a? comotanbién aunantar elcontenido calórico de ¿a nlflmá (13).

Finalmente, 15 suylementacíon es y será una ayuda nscesaria para aprovechar en el Freaente y ea el futuro el mayornúmero de fuentes dLspïfliblÉS de ¿lumentüs para la hunonicaó. enuna forma lo más racional posible (1439

2) .____P1‘°teínas92 ._._seml._la512 islas: ___mt€.-i_t.2-;-22«

La búsqueda continua de nuevastisfacer las crecientes

oleaginosas para saexigencias del consumode aceites en los

Estados Unidos de Norteamérlca. llevé ¿ ucntralizar la atenciónen el girasol ( Helianthuk ggpus L. }. EJ aceite extraido de su

senilla resultó de color ligero y de buena estabilidad. Variosinvestigadores señalaron a las semillas descascaradas cono prgductos de sabor dulce y elevado valor nutricional. Los trabajosde Mitchell y gol. (15) hicieron referencia al elevado valor dedigestibilidad ( 94,3 1) y al valor biológico de la proteina( 64,5 ) de la harina de senilla de girasol, obtenida a travesdel procediniento de extracción con solvente, conducido a tenperatura no superior a los 75°.

Por esa nisna época, Egg! y Almguist (16) en base alos resultados obtenidos con animales de experimentación, la s5ñalaron como"una Puente completa de aminoácidos para el creciniento de pollos jóvenes, cuando eran alinentados a un nivel del201. de proteina en la dieta".

21925 y Rolling (17) proveyeron tanbien datos sobredigestibilidad 'in vitro" y el análisis de aminoácidosde proteinasde semilla de girasol, mostrando por comparación con las proteinasde levaduras, su menor contenido en lisina, pero mayor riqueza encistina más netionina. Prácticamente al mismoresultado llegaronEEGinnis y gol. (18) al señalar a la lisina comoprincipal aningácido deficiente en las proteinas de harina de girasol. no requiriendo en cambio suplementación adicional de netionina la dietasuninistrada a pollos en crecimiento.

Milner, Hubbard y ¿125 (19) han examinado la compas;ción quimica y el contenido en aceite de 28 nuestras de semillade girasol, comprendiendo4 variedades cosechadas en 7 localidades diferentes. Sus resultados mostraron para la semilla un ¿noito de contenido en proteinas ( Nx 6,25 ) de 18 a 211 y de 27 a31% para el aceite. Cuandolas cáscaras, que constituían del 39al 46% de la semilla, fueron elininadas, los valores del conte

nido en proteínas me ¿{tgïfigentre 47 Y 53 i. Lau ¿asadas) mostraron u;v» filïiïíïfifix 6.25 ).

Las p:1m«r¿..¿¿

de semilla de girasuï ¡Euiü2Wn Fflz¡n\r:.Osborne y Cameeli (*ü} gripef1¿un fl.*_,:teina aislada por Extract;5} üüÉLUC“ua ¿ügieüksw en niïïégfno de alrededor del 18,2 k (¿a toas se fitnffi&5 y cenizasÏrDe sus estudios de Fraiwíï i; ¿rra ¡Tvifiífü ¿CQÜÏHTPTLHque “e;las abundante proteído de ia sam.ï a ia ü rnasuatia ¿a un¿

simple globulina". 5‘49. 11'?‘i;!3t>.1';2;=‘; y: ,' ,4¿sui-fran¿{6:¿2331:

oscuro, que atribuyeron a la rïaüen“i .na “üïïüfiflá qua 33?esa época se conocía coma “¿Cíüü ny: ; E.nñ lemoverlu

extrajeron la harina con etanol i a _¡¿y; a Gi w 75' y ofituw;firon una proteina que contenía 15“6 fi ¡e nvtPégenú, “prábticaxenvte libre de materia coiurante“.

Estudios poster ovas {20; idantiÉicaron al ¿cuponernte causante del color coma ácida sao +gén to, descrspto comwsi

depsido de los ácidos caïniac y gtín o». yffiïlp v 3€13?n {El}habian dado la fórmula estructura} 3:1‘ uy áfiüñ clorogén1c& separado de 1a barata. señalando qua s: ÏmDVltfi wn Las pianmoa aww

ria la de un tíansportadqr de hidrngwnu, Pfiïavcn qup de la cam-npleta oxidación de dicho áCLdG,¡eau tába ua produtia ¿e reacciónlezcla intensamente coloreado, debzda BbflLÉïüfiFüïüe fenómencs dtpolinnrización.

En vista de una prabvbie exp¿n*1ón En Ïa cuscfifia 3%?

girasol, Smith (22) dacidié estudiar a fu du ÑÏ aíslanieniú ñasus proteinas por el métqda de ¿xt1¿:r;¿1 ¿ica iua a ireuípíiá-w

lO

ción en medio ácido, y examinar el producto aislado a los finesde su utilización industrial.

El análisis de la semilla reveló un tenor en nitrógeno de 3.4 1 y 5,1 i para la semilla descascarada, conteniendotodo el aceite. La eliminación de este último fué ensayada condiferentes solventes ( éter de petróleo p. eb. 30-60°; etanol95 1 en caliente y a temperatura ambiente; éter de petróleo seguido por etanol 70 X y éter de petróleo seguido por ¡etanol a2soluto ) sobre semilla descascarada. Los niveles de nitrógeno enlas harinas resultantes ( materiales total o parcialmente desgrgsados ) oscilaron entre 7,9 y 11,9 1, correspondiendo el mayorvalor a 1a harina agotada por éter de petróleo seguido de ¡etanoly el lenor a 1a extraída por etanol 95 i a temperatura ambiente( alto porcentaje de lípidos remanentes ). Conlos productos delolienda de semilla descascarada y desgrasada con éter de petróleo y con alcohol por separado, (harinas), estudió la dispersióny precipitación del material nitrogenado a distintos valores depH. Encontré que menos del 20 1 del nitrógeno total de 1a harinase dispersaba entre pH 3.0 y 7,0 , pero prácticamente el 100 1de dispersión ocurría a pH 10,0 ó superiores. La harina agotadapor etanol quedóparcialmente desnaturalizada y resultó más dicultosa de dispersar. Señaló que la presencia de clorogénico en1a harina l'retardaba" la dispersión de las proteinas. El máximorendimiento de proteina precipitada, fue del 31.8 X. sobre han;na extraída con solvente ( éter de petróleo ) y totalmente descascarada. Si el rendimiento estuviese referido a una harina igdustrial ( subproducto de elevado contenido en fibra ), serialucho más bajo. La proteina que habia extraido con alcali, teniacolor oscuro. predominandoel color verde, atribuido a la preseacia de ácido clorogénico. La remociónde este último la inten-

11

ta a través de numerosossolventes orgánicos corrientes, sin llegar a resultados satisfactorios. El etanol 70 x o el ¡etanol ca.absoluto lo extraian lentamente y fueron más efectivos que losotros solventes ensayados, pero desnaturalizaban severanente laproteina. La proteina extraída por álcali y precipitada en nedio

ácido dió un valor de nitrógeno de aproximadamente 16.4 1 ( en bgse libre de humedady cenizas ), resultando de intenso color verde. y la preparada a partir_de la harina agotada previamente por¡etanol seguida por extracción salina y diálisis registró un nivelde 18,7 1 de nitrógeno ( en base libre de humedady cenizas ). ptssentando un color pardo ligero. De sus ensayos surgieron conclusignes interesantes. Entre ellas, neneionadaanterior-ente, señalóque el "retraso" en la extracción acuosa de proteinas se debia a

la presencia del ácido clorogenico. el que a su vez se ponia en evidencia en la harina por el brillante color amarillo ¡ero-o. desarrgllado al agregar la solución de NaOH.Ese color calbiaba al verdecuando era expuesto al aire o a la acción de agentes quimicos 011dantes. La velocidad de oxidación o cambio de color variaba con el

pH de la dispersión acuosa: a pH 9,0 el color verde aparecia en 8 a10 minutos: a pH 11,5 , cambiaba directanente al pardo intenso. La

aparición del color podia ser prevenida por la incorporación deagentes reductores tales comosales ditiónicas. pero 'retornariaparciallente después de la eliminación por lavado del reductor. yexposición de la proteina al aire”.

Asoció los resultados de los ensayos de dispersión dela harina a distintos pH, comoindicativos de una reacción entre 1aproteina y el acido clorogénico en el rango de pH entre 3.0 a 7,0( formación de un compuesto insoluble ), mientras que a pH 10.0 ómayoresocurriría fácil disociación ( concordante con la reacción

12

negativa de 'taninos vegetales" con proteinas, en la región alca

lina ) (20). En este último caso, la remoción del ácido clorogenico seria posible,de encontrarse un solvente del mismo. innisciblecon el agua, para efectuar un tipo de extracción liquido - liquido,a ese valor de pH.

Asi. el problema permanecía todavia. señalando que hnata que hasta que no se encontrase un camino para la destrucción o

extracción del ácido clorogenico. la proteina de la semilla de girasol. en razón de su color intensdfi no podria competir en el me;cado frente a otras proteinas industriales (22).

En una comunicación posterior. ¿oubert (23). hace unarevisión del problema de la completa eliminación del ácido clorogénico a partir de la harina de semilla totalmente descascarada ysostiene haberla logrado por repetidas extracciones con una mezcla

etanol - agua ( 1:1 ) a temperatura ambiente, seguidas por lavado

acuoso en frio y repetidos lavados de la harina con acetona. dejando secar a1 aire. Todo ello, señala, probablemente con muypocadesnaturalización de las proteinas, a las que aisló con soluciónsalina ( NaCl 10 1 ), Eraccionándolas luego con solución de sulfato

anónico a distintas concentraciones. No emergen de esta comunicación valores de rendimientos, ni indicación especial del color delas proteinas (aunque al ser extraídas con solución salina - pHaproximadamente 6,5 —no ocurren cambios de color ). fuera de los

datos necesarios para determinar los pesos moleculares de las mignas, obtenidas por fraccionamiento. De cualquier nodo. evidentemente, tal procedimiento no seria de aplicación industrial.

Frente a los inconvenientes planteados y teniendo en

cuenta que la harina de semilla de girasol descascarada. ofrecía

13

posibilidades directas de uso en mezclas con otras fuentes proteinicas ( por estar libre aquélla de principios tóxicos ), con destinoal consumo humano, se abandonaron temporariamente los intentos de

eliminación del ácido clorogenico y en consecuencia el aislamientode las proteinas a partir de harinas y tortas de semilla de gira —501 o

En vista de la escasa información existente hasta ese IQmento, concerniente al valor nutritivo de las harinas y tortas remanentes de la separación del aceite, Morrison y gol. (24) (25) plgnearon el estudio de los posibles efectos que los métodos industriales de obtención tendrian sobre las mismas. La interpretación desus experiencias puso de manifiesto que la composición quimica y elvalor nutritivo son afectados por las temperaturas utilizadas. enel sentido de que las harinas de mayorvalor nutritivo correspondena las sometidas a menores temperaturas en su preparación.

Bandemary 21323 (26) realizaron la determinación de 1acomposición en aminoácidos de 1a harina de extracción de la semillade girasol ( entre otras semillas ), mediante cromatografía de intercambio iónico realizada sobre el hidrolizado de las proteinas.Señalaron pequeñas perdidas para 1a mayoria de los aminoácidos,principalmente en los de caracter basico, frente a las condicionesde tratamiento usadas en 1a elaboración corriente de aceites de semillas con propósitos alimentarios.

3) Compuestospolifiególicos gue ocurren .53 ¿a semilla gs girasolCaracteristicas.

Por esa epoca, el acido clorogenico y compuestos rela

14

cionados continuaban atrayendo la atención, desde que ocurren anplianente distriïuidos entre las plantas superiores, y en algunoscasos en niveles sorprendentemente áltÜSe Unarazón adicional pa

ra sostener este interés residía en el entonces reciente descubniliento de un gran númerode dépsidos relacionados.

Sondheimer (27) publicó una excelente revisión y dis—

cusión sobre aislamiento, caracterización. biosintesis y propiedá¿es biológicas de esas Sustancias señalando que el ácido clorogenico, junto con otros cafeoilderivados daban coloración amarillowverdosa a pH superiores a 7.0 . cambiando lentamente al pardo enpresencia de aire.

Por su parte, Inggahamy 92533 (28) en sus estudiossobre autoxidación de ácido clorogénico en el brovning' enzimatico de frutas. hallaron que las velocidades iniciales de oxidgción dentro de un ámbito de pH de 7.49 a 8,74 resultaban directanente pr0porcionales a 1a concentración del ácido y a 1a pre

sión pancial de 02 y variaban inversamente con la actividad delión hidrógeno.

El ácido clorogenico no parece tener acción farmacológica pronunciada, aunque se ha sugerido que seria el principalcomponentealergénico al cual serian sensibles los trabajadoresque operan con Ciertos vegetales ( vainas de castor. café y naranjas ). E1 papel fie los ácidos clorogenicos en enfermedades deplantas y su influencia en la resistencia a las mismas, ha sidoun tópico muy diSCUtLdO. En numerosas plantas, Frecuentemente, ainfecciones fúngicas o virósicas corresponde un increlento en laconcentración de polifenoles, independientementede si la variedad vegetal es o no resistente o susceptible. Lo que parece sercorrelacionabln, es la velocidad con la cual los polifenoles seacumulan en el tejida infectado, estando la relación de resia —

¿5

tencia aaoaínc2 ;*2 r¿:; -, if 232.32 a eLlü, rn

especies resisï tu" ..‘95 .“-'z':' .Zú.parece 56.9

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dan tener act;v.¿ vacï&¿xc;tu;i-a. a {LVÉTÓEACAy Eungispátícz ¿Ébiles, las quincnas producidas dgx'uïa La oxidaczón exh1ben un ma-

yor grado de lflÏÍHÑÍZÜU.

Taati.n Sá EA7¿“s=u t7=ñancia qua una ng qu: lá :¿z

dación ha avanzada basxa el estajn 4* algmantos pardoa, las propia”dades mencionades áïïú“Íafi ¿Levu¿uax :ïflphtïg de la e:¿p¿ .nterae wdia de quinonas (¿7).

En ¿lginaa tayidus va eaai a, partzcalarnante Semillaseel contenido en á 1¿\@ Clurúgénilza aa elevadog y la posibLliúad de

que esos fenoles accuañen CQfiOsanta c135 d: TESürVücon¿u¿o a una

serie de estudis: o“: “oq Sïfaïdn 1; v«;¿mcaómde sus niveles durag

te el estacionacu 5. '»r 2222*vo ¿ue durnytc .5 garninación de las 5%m:3us ¿a 31'3firj «n aa Jüïurliad a 21*. 1>5 HJYQ

1)}les de ácidos ï c=u sus ¿í*“t;'a. *va ts primare; A as,alcanzando 3.ute-gi

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bo por g¿¿;¿ 3" 'xifig fin ¿Cldüs (intagéniCUy químico en la gn- '1H ;. s¿?¿ï01, {igtránáu 1a Conversifndel clorogázicg e ,mü¿mrfiwrüu.ü.1 ¿#Eibe i ¿a nuestraun trataaxmttc 1ra” :w- wm Las ïünáenidas

11: . i PCSPGCIiVGÑFHXCfi.»en ácidos clara:

extraíüen ¿É 14 con etanol . í¿ ¡“RÏ&MLQILU¿e

1€?

. e J v1»a. 9la Pepa a la ÍñmfifiïüíiLa ¿y ¡p ¿o üfl.ü V horas destruyó el 12 1

del contenido en ácido teorngeni a Qw;thímenït presente. A 100°

y 135° ( POT e] ;';.:‘1:ï‘-'.)tiesa: ’etlyfi ¿rededor del 4.3 1.. (

aplicaron temperaïuecu simLiare A ¿?u usadas en procesos tecno?

gicos corrientes de obtenciia de ¿cai es )a El coatenido en áchoquinico resultó Lrversamente reiacLonadc a aque: del clor0génico:

34’el tratamiento a 7G“ elevó su contenido en un 12 e y las mayores

temperaturas produjeron una elevación del 44 K en las mismas nues«

tras en las cuales decreció SIMLJarmenïee? :zovogéneco:

Duranïe el eataciunamíensü prolongeáo laa enestras coatrol y la preVLameniecalentaca a 7n° no registraron prácticamentecambios en los respectivos contenxdoe de los ácados, mientras que

las previamente erpeestas a mayores temperaturaa ( 100 y 135° 3 agflalaron resíntesis Se clorcgéniCG.

Los 'a;511dos* purificados de ácido clorogénico y quinicononostraron “¡Tr-ne”ePerïrto irmi‘zsitorjo sobre la actividad de 0€

anilasa, pero inhibieron parc;almente la actividad de lipasa y elácido clorogénico mostró cierta ¿naibiuión en la digestión de ca—.seina por tripsina, no registrabie para el quínLco.

Ha sido notada por varios imvestigadores la interferegcia que producen los compuestos polefenólicos presentes en el ais»lamiento de enzimas vegetales ( ureasa, fosfatasas, Eosforilasas,

Q-glucosidasa. dehidrogenasa málica, etc“ ). y en algunos casos sehan diseñado métodos para salvar la inhibición de las mismaz. Ya

en 1932. guastel hizo referencia a la fuerte inhibición de la uregsa por ciertos compuestospolífenólicos, y que los tioles podianprevenirla. Obtuvoevidencias que indicaban que realmente los inhibidores eran quinonas y que aún trazag de ellas producían elevadoefecto (31).

Los CPWPÚÉSÏÜÏ“ewóliroü ee coabinen reversiblemente

17

:on las proteínas por uniones hidrógeno ( entre grupos hidroxilosFenólicos y grupos carbonilos de las uniones peptidicas de las prgteinas ), e irreversiblemente, luego de oxidación, por condensacig¡es covalentes.

Las tecnicas para aislar enzimas de plantas que contig¡en compuestosfenólicos requieren separar específicanente los fexfles de las proteinas y al mismotiempo prevenir su oxidación. Deestudios realizados hasta el momento surge que la reacción esen :ial seria 1a adición 1-4 de grupos anino libres de la proteina a¡uinonas formadas por oxidación de fenoles, resultando un "cross Linking' tipo covalente (32). Las quinonas se unen irreversibleIente a polianidas ( ejenplo es el caso del 'nylon' ). Los analisis¡ostraron que algo ¡enos de l mol de quinona se une a 2 moles de¡rupos anino libres de la polianida.

Asi, aquellos fenoles que forman complejos por unión¡idróqeno con proteinas, eran removidos por la adición de grandes:antidades de sustancias que contienen grupos similares a los deLaunión peptidica. Los agentes más satisfactorios han sido los digtintos grados de poliVinilpirrolidonas ( PVP) solubles e insolubles.

f

H2C———CH2 ]

Hzc 0:0\N/-[———clm—cu2akn\ I

polivinilpirrolidona

Unapráctica corriente ha sido la de agregar agentes rs¡actores tales cono ascorbatos o tioles durante la extracción de egninas de tejidos vegetales. Noobstante, aquellos no actúan evitan

18

do la oxidaciúade Penoles sino más bien removiendo rápidamente las

quinonas formadas, previniendo su acumulación y disminuyendo la pgsibilidad de su reacción con proteínas. El ascorbato reduce la: qu;nenas, mientras que los tioles reaccionan con ellas para Barna: tigéteres.

Un punto muy importante es el pH óptimo de extracción.

En muchas experiencias se describe el uso de"1:mI>‘1-‘ers‘lde pH 7.4

7,5,aunque un pHmenor ( cerca del pH isoelectrico de las proteinas)resulta mas satisfactorio cuando se usa polivinilpirrolidonas (PVP).en razón de evitar la ionización de los fenoles. Los fenolea ioningdos no pueden ligar bidrógenos con las proteínas ni con el 'PVP' y¡1 mismo tiempo son más rápidamente oxidados que cuando están en

sus formas no ionfzadas. Es probable que algunos compuestos Eenólicos que no forman complejos con proteínas o “PVR”a traves de unio

nes hidrógeno, sean también rápidamente oxidados a quinonas (31).

Uncomportamiento similar se podria esperar para el castde los compuestos fenólicos y proteinas contenidos en la semilla degirasol, en el momentode su extracción acuosa, aunque en este casopodria no resultar de aplicación exitosa el recurrir a la accióncompetitiva del “PVP”con las proteinas para bloquear los conpuestos fenólicos y efectuar luego su separación.

En estos últimos años, el interés creciente en la cosgcha del girasol en los Estados Unidos de Norteamérica, ha traido cg

ID consecuencia la expansión de actividades sobre aspectos nutricignales y quimicos del aceite y de los subproductos remanentes de suextracción. La inquietud por conocer los constituyentes menores de

las harinas de extracción decidió a Mikolajczak y ggl. (33) a aislar e identificar algunos componentesfenólicos y azúcares en una

variedad rusa de girasol ( Arnavirsg ) de alto rendiliento en ace;

te, muy d

pflhfluuverse afeïïhlatQS EYEÏXU} ,' ::»

n¿co i 3»tificados ea 2desgrzsada. ¿;x¿lzfi

dos ¿FCMÉílu-É

ciones 7,sLdo dake a

cáridas ydisacáerr X.apecto de í? t¿5u vfl

por hidró‘a, ztrate dexïfivamcosa y fructa&

compuestox Étmdel 2.4 i v eï c

4) Recientgg art ¡ »th& Ï2‘J ;;¿2: 12¿2Hmfilüfiï

Chile no .715 ¿2:3 E ¡“.‘w.

20

ehaniento de los subproductos de la industria aceitera. Unade lasposibilidades con que cuenta ese pais para subsanar aquel problelaseria, —al igual que nuestro pais -, la utilización de las tortasresiduales de semilla de girasol, ya que el cultivo de esta oleaginosa esta bastante difundido.

Unestudio realizado por Ballester y Sol. (34) sobrediversas nuestras de tortas ( descascaradas parciallente hasta un

minimode 8 x de fibra ) de semillas procedentes de la industriade Santiago, mostró que estos“concentrados”proteinicos constituíanuna buena fuente de proteinas, minerales ( Ca, P, Fe ) y vitaninassolubles en agua ( tianina, riboflavina y niacina ). Las experiencias biológicas de suplementación con aminoácidos la señalaron deficiente en lisina y los ensayos de toxicidad, a través de estu dios histológicos de distintos órganos y tejidos de ratas durante6 ¡eses no revelaron signos de daños patológicos.

Por otra parte, dentro del programaconjunto que lleva a cabo el personal especializado perteneciente a la Uniuersidad

Nacional gs ggils y el Departamentogg Ciencia z Tecnoloaia deB Universidad d_e_California ( EEUU) (35) (36). se contenpló elestudio de 1a co-posición quimica, ensayos de toxicidad en ratas.evaluación de la calidad nutricional en ratas y niños y aceptabilidad por niños en edad preescolar, de harina de pescado desgrasada y desodorizada , harina residual de extracción de semilla degirasol y diversos alimentos “mezcla” conteniendo los "concentrados" ya mencionados. Los ensayos de toxicidad revelaron que lastasas de crecimiento en ratas fueron similares, pero ligeramentetemores, con "concentrados" de harina de pescado y harina de girasol, que con una mezcla de caseina-leche (control) al mismonivel de proteinas-calorias ( 20 1 proteinas-calorias, por 6 ne

21

ses). Algunosórganos diferian significativamente en el peso. en

ratas alimentadas con cualquiera de los dos"concentrados', no pgdiéndose explicar esas diferencias. ya que los estudios histológicos en todos los grupos no revelaron alteración en los riñones.

Las mezclas dadas a infantes resultaron de exce

lente aceptabilidad y tolerancia, similares a la de la leche devaca. Las deposiciones Fueron de consistencia normal cuando losinfantes fueron alimentados ya sea con el “concentrado” de hariana de pescado solo o con 1a mezcla con harina de girasol, pero

fueron de color verde oscuro. El 'concentrado' de harina de girasol produjo deposiciones más compactas que las de leche o l'concentrado' de harina de pescado solos.

La harina de extracción de girasol ensayada. contenía alrededor de 43 1 de proteina (N x 6,25). 10,8 I de fibracruda, 8.2 1 de cenizas, 1,7 1 de extracto etereo y 6,9 1 de

agua, y con este material de partida prepararon las dietas a losniveles requeridos. Su primer aminoácido limitante fue lisina ycomoera esperado, su calidad biológica se vió incrementada porla suplementación con el "concentrado" de harina de pescado. Lasmezclas de ambos'c0ncentrados' mostraron un alto valor de “uti

lización proteica neta” (“UPN”)en las ratas y produjeron crecimientos normales en niños cuando suplian el 70 1 del total deproteinas de la ración diaria.

En nuestro país, la información recogida de los

trabajos de 53235 y gol. (37) reveló que no hay diferencias significativas al compararel valor biológico de las proteinas deharinas de extracción de pepa industrial de girasol (concentradas en laboratorio por eliminación parcial de la cáscara. hastaun tenor en fibra de alrededor del 8 1), con el de otras obte-—nidas en el laboratorio nor extracción de la semilla

22

nolida ( previamente descascarada hasta un valor de aproximadamente 3 2 en fibra ) con éter de petróleo p. eb. 30°- 60°. Se observóune relación inversa entre la digestibilidad y el contenido en fibra cruda. Los resultados obtenidos indicarian que en principio.seria posible" utilizar el primer tipo de harinas mencionado.parala preparación de "concentrados" y "aislados" proteinicos sin nodificar el proceso actual de extracción industrial del aceite.

En conexión con un proyecto de índole nutricional con

ducido por Etiopía y Suecia ( Ethio - Swedish Nutritigg Proxect ).el enriquecimiento de alimentos a base de cereales con "concentra

dos'de proteinas de leguminosas o de oleaginosas pareció una alternative pronisoria en vista de las considerables cosechas de aquellasproducidas en Etiopia.

Muchassemillas de oleaginoSas contienen factores tóxicos que complican el uso de sus "concentrados" en proteinas paraconsueo humano. El girasol es una de las pocas especies cuyas senillas parecieran esiar libres de factores antinutricionales. de anique podria cumplir con los requerimientos que cubrieran esas nece

sidades proteices cn forma inmediata. Karen y Liedén (38) del Instituto gs Quimica Médica perteneciente a la Universidad gs Uppsala(Suecia), en vista de tales necesidades, prepararon un 'concentrado‘de proteinas de Sfi'illfi de girasol que contenía alrededor del 55 Xde proteínas ( N x 6,25 ) por remoción de las cáscaras a traves deun equipo refinador y limpiador de semillas. Las semillas enterasfueron extraídas con éter etílico y después del secado les fue pos;ble remover la delgada membranaamarilla de las pepas contraídas.

por aventaniento. Las pepas, nolidas, fueron extraídas repetidas vsces con éter etílico a temperatura ambiente en sistema de contracorriente. El material seco fue molido a harina fina.

23

Otro tipo de 'concentrado‘ lo prepararon suspendiendola harina fina en lo volúnenes de agua que posterior-ente se ca lentaron por circulación de vapor. El naterial coagulado se renovió por centrifugación y se secó con etanol y éter etílico. Estapreparación se analizó paralelamente con la harina anterior en suconposición general y contenido en aninoácidos. El análisis aprorinado de los “concentrados' así obtenidos reveló: 48 - 55 f proteinas

( I x 6.25 ): extracto en éter etílico, l - 5 1 : fibra cruda, 2 4 1; hnnedad, 7 - 9 1 y extracto libre de nitrógeno 31 - 30 x. Conexcepción de la lisina ( priner aninotcido linitante ). la colmo.sición aninoacidica de los 'concentrados' resultó bien bnlancoada,

siendo rica en netionina y triptorano, coincidiendo con otros antgcedentes de literatura. Despuésde la coagulación por calentaniento. la composiciónen aminoácidosno canbió significativa-ente excepto una ligera disninución en lisina.

En discordancia con lo que se venia sosteniendo en losprimeros trabajos. Bielorai y Bondi (39). nostraron que las pepa:de estas semillas contenían un inhibidor de tripsina que resultóactivo on ensayos"in vitro". Este factor antinutricional seria. ajuicio de larga y Liedén (38), el responsable de los ¡lo bajos valores en ensayos de crecimiento y de la "relación de eficiencia prgteica' ( "REP") obtenida con_dietas conteniendo ‘Concentrados' de

proteína cruda. suministradas a ratas, respecto de los obtenidos conpreparados a base de "concentrados" previa-ente coagulados por calentamiento ( resultado de la inactivación de un inhibidor de tripsinn cuando la harina 'es nervida por 10 - 15 ninutos' ).

La principal razón que sirvió de base a suscnmclusiones

reside en el hecho de que el girasol pertenece a la Eanilia de lasCOlPu‘Stls ( COlzgsitae ) y que han sido señalados 'concentrados' de

24

otras dos semillau pertenecientes a la mismafamilia ( Guizotia

abxssinica Cass. y Carthamus tinctorius L. ) conteniendo un factor de alto peso molecular que provocaba diarrea en ratas que se

alimentaban con tales "concentrados". Este Factor pudo ser parcialmente inactivado por coagulación en el calentamiento de los "concentrados' de esas semillas. Si un Factor similar estuviese presegte en los'toncentradog‘de girasol. debería estar en muypequeña prgporción, ya que las pérdidas por deposiciones ocurrían raramente enratas alinentadas con harina no tratada previamente por calor. Noobstante, resultó evidente la mejora en la calidad a través de losincrementos registrados en las tasas de crecimiento y en la "relación de eficiencia proteica" ( "RB?") despues del tratamiento porcalor. Los autores dejaron constancia de que la solución remanentedel tratamiento por coagulación, de color oscuro. no habia sido analizada para la búsquedade factores antinutricionales.

En tal sentido, los estudios realizados por raszrzzk y22;. (40), sobre separación y caracterización de glicósidos de 5plantas de la familia de las Compuestas,entre las que figura el girasol. señalan la presencia en las flores, de fracciones glicosidicaaque mostraron alta actividad hemolitica, sin hacer referencia a supresencia en las semillas.

Nose puede dejar de lado, inclusive. la posibilidad deque los polifenoles ( clorogenicos y relacionados ). anplianente digtribuidos en la semilla y por consiguiente en la harina (cruda) deextracción, pudieran constituir un-factor antinutricional, de acuerdo a lo señalado por gilig y cgi. (30) (inhibición de 1a tripsina ).En ese caso. la disminución de tal poder inhibitorio después de calentaniento a 108° , estaria relacionada a la conversión en ácidoquinico, el cual no exhibe tal propiedado

25

De todos los vegetales cosechados en Rumania. los grsnos de girasol, utilizados casi exclusivamentepara la fabricaciónde aceite, presentan interes particulannente para la obtención de'concentrados' de proteinas. Actualmentelas tortas se destinan pgra la alimentación animal. 2232 (41). en su publicación sobre "ut;lización de proteinas de girasol en la alimentación". ha ubicado alas proteinas de semillas de girasol, por su contenido y proporciónen aminoácidosesenciales, entre las de ¡ás elevado valor biológicode las de origen vegetal. aún siendo deficitarias en lisina. Teniqgdo en cuenta la conpensaciónde factores limitantes. presentarian laventaja de su combinación en mezclas con proteinas de origen animal,

o inclusive conlasdqáoya, que son deficientes en metionina. para og'tener productos de valor nutricional más elevado.

La aceptación de estas proteinas por el organismo humano parece no haber provocado problemas especiales, ya que los granos de girasol se vienen utilizando desde largo tiempo atras parala obtención de ciertos productos alimenticios y que hasta el presente no se han identificado sustancias tóxicas, comoen otras sen;llas. Noobstante, consideró que, comoresultado de búsquedas recientes. se habia establecido que 'un tratamiento termico ligero aumentaba la digestibilidad de las proteinas de girasol", recomendandoenconsecuencia introducir en el esquematecnológico de obtención del'concentrado' proteinico, la operación de torrefacción (tostación )a 100°. Por eliminación de 1a cáscara de las semillas de girasol,seguida. de lavado por flotación ( eliminación del resto de cásca ras) y secado. se obtendría un complejo lipo-proteico con 22 - 32 ide proteinas y 55 - 60 1 de aceite. que puede utilizarse comotalen la alimentación. Deperseguirse la extracción prácticamente totaldel aceite ( un remanente de 0,8 - 1,0 x ), se obtendría sobre elgrano totalnente descascarado, una harina con un nivel del 45 - 55 í

26

le proteinas, que puede ser utilizada comosuplemento para elevarel valor nutritivo de otros alimentos.

Por la desintegración y la emulsificación de pepas ( ssmillas totalmente descascaradas , y/o parcialmente prensadas ), enledio salino, o en poca leche, adicionadas de un estabilizador de:oloides ( pectinas ), se obtendrian "leches vegetales" con un elsrado tenor proteico y/o graso: ( procedimiento patentado en Rumaniaaara 1a preparación de 'leche vegetal concentrada" ) (41).

Merece mencionarse que para el desarrollo del programale investigaciones sobre oleaginosas, en los Estados Unidos de No;teamérica se cuenta con un nuevo laboratorio. creado en 1970 en

Éeorgia. que se ha especializado en plantas cultivadas en el sudegte de ese pais, particularmente en mani y girasol. El plan abarca21 estudio de modernos y eficientes métodos de elaboración, como

tambiénde producción de estas oleaginosas. con atención a los prg¡lemas crecientes de polución sobre los-productos agricolas.:1 mayor esfuerzo será dedicado a lograr un sistema de elaboración¡ue minimice los productos de desecho o los convierta en productositiles y a conseguir una mayor mecanización en la elaboración dealimentos para disminuir la posibilidad de contaminación a travesle la manipulación por el hombre. El máximointeres reside en las

:osechas de girasol. Por un lado, interesa lograr variedades de alto rendimiento en aceite. En este aspecto, los rusos han desarro Llado variedades cuyas semillas rinden hasta 60 1 de aceite, com«¡aradas con los rendimientos de alrededor de 25 1 de las variedadesInmicanas.

Conrelación a la parte proteica de 1a harina de semillale girasol, su valor biológico ya ha sido ensayado en varias espeáes. En cerdos. la lisina fue el factor limitante. en el hombre,

27

la lisina e isoleucina, y en pollos jóvenes, la lisina. leucina ytreonina. Se hallan bajo estudio los metodos de elaboración de laharina para obtener 'concentrados' proteicos para uso alimentarioy la influencia que ejercen las condiciones de los procesos sobrela composiciónde los nutrientes.

Entre los distintos productos que esperan producir a escala de laboratorio se señalan: harina 'blanda', desgrasada. parauso en preparados de cereales para desayuno. bebidas ricas en proteinas y productos cárnicos; harina 'de bajo contenido en ribra'.para uso en alinentos destinados a aves y alimentos para rumiantesa base de fracciones con cáscara, en los cuales un ninimo de 80 Ide los carbohidratos esten disponibles cono fuente energetica (en).

5) Aislamientogs proteinas ¿_partir es harinas gg semilla gg girasol - Antecedentes.—“

Unode los problemas en la obtención de 'aislados' proteinicos a partir de Harina de semilla de girasol por ol metodoconvencional, de extracción alcalina seguida de precipitación en sodio¡cido a pHisoelectrico, es el desarrollo del color verde intenso.que cono ya ha sido nencionado. se supone debido a la oxidación delos acidos clorogenicos, compuestosque quedarían ligados irreversiblementea la proteina precipitada. El color del producto final liIitaria su aplicación en la industria alinentaria.

Despuesde los estudios realizados por Elis! y ¿obnsen(20) un nuevo acercaniento al problema se repite en 1969 con los

trabajos de Sosulski y 2323; (43). Sus objetivos fueron investigarlos rendinientos de extracción del naterial nitrogenado en distintos mediosy las caracteristicas de los‘toncentrados' proteicos ai;

28

lados a partir de las harinas de semillas de nabo. lino y girasoly conpararlas con las de soya. Las semillas de soya y girasol fasron preparadas para la extracción del aceite por pasaje del granoa traves de rollos estriados y las cáscaras se eliminaron por aspiración. En el caso de las semillas de nabo y lino no fueron relovidas. La extracción del aceite se hizo a temperatura aebientecon hexanonor-a1 en nezcladora, y las harinas fueron desolveatisadas en vacio a 45° ( se trató de evitar desnaturalización de prgteinas y perdida parcial de solúbilidad ). Las proteinas fuerondispersadas a traves de una serie consecutiva de solventes de acne!do al procedimiento de Osborne ( agua destilada: solución de IaCIal 5 1: etanol 70 1 y solución de ¡son al 0.2 1 ). y SCparada-entepor el métodocoaercial usado para la extracción de proteina de egya (dispersión en nedio alcalina ).

Loslas altos niveles de dispersión del naterial nitrogenado fueron obtenidos con solución alcalina. Asi adaptaron conoprocediniento final para el resto del trabajo la extracción denuestras frescas desgrasadas ( harinas ) con solución de IaOHal0.2 Z por dos periodos de una hora cada uno.

El 91 - 96 x del nitrógeno total fue extraido de las harinas de lino y girasol, superandoen rendiniento a las otras dos.

La precipitación a pH ácido ( dentro de la zona de pH4.4 - 4,6 para todas las especies ) se practicó con BCI1.0 I. Elcoagulo de proteinas fue separado por centrifugación,del suero sgirenadante. luego lavado y liofilizado. ¡:1 nyór rendimiento enproteinas precipitadas ocurrió para el girasol ( aproximadalenteen 50 1 expresado cono g de producto aislado I 100 g de harina or;ginal ), siendo su contenido en nitrógeno de 14 1. Con excepciónde 1a proteina aislada de la harina de soya ( de color crela );las delas proteinas obtenidas resultaron intensa-ente coloreadas

29

( nabo. pardo; girasol, verde; lino, pardo - rojizo ).El fuerte color de las proteinas aisladas redujo su ati

lisación en distintos alinentos y solanente la proteina de lino pgdo ser agregada a preparaciones de color oscuro. sin presentar erestos observables en su apariencia final.

Nose ha hecho¡ención en el trabajo a otras caracteristicas fisicas de los'hislados' obtenidos y tampocose propuso can;no alguno para evitar o remover los respectivos conpuestos coloresdos.

Unade las últimas contribuciones en este aspecto. fueel trabado de Ghelasuddiny 52;. (44), quienes utilizaron una solución acuosa de Nazso3a1 0,25 1 durante 1a extracción del laterial nitrogenado a pH 10.5. Consideraron necesario el uso de unagente reductor, ya que los ácidos clorogenicos son rapidanenteoxidados ( en torna l'no enzimática" ) a quinonas. por acción del02 en medio fuertemente alcalino. ( Enzi-áticanente lo son. en laproxinidad del pHneutro. por acción de las polifenoloxidasas ).El extracto filtrado se ajustó con HCIa pH 5.0 , precipitando e1rededor del 80 Z de la proteina extraída.

Unaporción del precipitado fue 1avada(con agua destiigda)y liofilizada. Otra alícuota del precipitado fue extraída conisopropanol acuoso 50 i, luego lavada con agua destilada y final ¡ente liofilizada. El precipitado extraído con isopropanol. aunquecasi blanco, todavia contenía compuestos que inpartian color a 1aproteina puesta en solución alcalina; no obstante. este color nodesarrolló por debajo de pH 7,5.

De la conparación de las curvas de solubilidad del nat!rial nitrogenado de los "aislados" obtenidos versus valores de pH,los autores sugirieron que habia ocurrido ¡uy poca desnaturaliza Cibao

30

La conposición sninoacidica ( ¡linoanslissdor ) mostrón severo decreéinicnto en cistina, mientras qu. los cantasidos deencina. tirosina y fenilalanins se incremsntaron.

Los autores atribuysran cstos cambios s ls nórdids porolubilidad en agua de fracciones de protsisss no procípitsblss porcido.

PALLTÍ-Ï .ï Í.

.OISCUSxOQ D.t'ü ¿5 ¿3535 EXPERIMENTAL

a} Objetivos.

b} Plan de trabajo y zu disausiónt

RESïltadOS - 5m IL

DISCUSION gg ¿.5 PART") EXPERIMENTAL

a) Objetivos.

Las tortas, 'expellers' y harinas de semillas de oleaginosas constituyen, según se señaló en la 25555 l. unn de las fue!tes más importantes y económicas para la obtención de ali-entos prgteínicos ( 'concentrados' y l'eislados" ). Conomateria prima parala elaboración de tales productos destinados a la nutrición banana.los 'expellers' y harinas de semilla de girasol revisten especialinteres. En efecto, la semilla de girasol y por consiguiente lossubproductos de la misma, son potencialmente inportantes en nuestro

pais por ser esta oleaginosa 1a de mayordifusión ( aproximadelente1.000.000 de toneladas para la cosecha 1970-71 ) y por contener unelevado nivel en proteinas Ce alta calidad.

En los últinos años se han registrado numerosas contribgciones hacia le transformación de tales subproductos en "concentredos" proteicos para uno huninc ( eliminación de la mayor parte de lafibra ) y en muchamenorescala hacia el aislanientc de las proteinasque contiene. Este último aspecto na sido menos considerado en razónde que las harinas o “expelïers” de semillas de girasol se señalan,hasta el presente, comolibres o prácticamente libres de conpuestostóxicos 7/0 antinutvicianalrs, pudiéndose aprovechar directamente, ypuraue la hpllCdCíóí ie métodos tradicionales de aislamiento conduCïfl a pratcinas de 2010? verde que no JGZArían ¿a aceptabilidad.

En la agita ¿ de este trabajo se ha hacho amplia referegcia a estos aspectos y a la calidad nutriciona: ie sus proteínas.

33'

El presente trabajo ha sido orientado esenciallente alestudio de metodosde aislaniento de proteinas y hacia la obtención

de las nisnas practica-ente blancas, a partir de harinas de extragción de pepa industrial, precisando rendinientos\y caracteristicasda los aislados "proteinicos' logrados.

Comprendeadenas el estudio de las condiciones de por;ficación de las proteinas precipitadas, principal-ente a traves de1a extraeción de lipidos asociados a las nisaas y la determinaciónde la concentración y conposición acidica de estos últinos.

Se han considerado los exámenesde conposición generalde la senilla y productos procedentes de su industrialización, poraplicación de las nisnas técnicas usadas en el estudio de la conpgsición de las harinas de partida.

Conoconplenento de estos estudios se ha contemplado

tanbien la deterninación del valor biológico, digestibilidad y co!posición en aminoácidosesenciales de las proteinas aisladas. porun ¡is-o nétodo. a partir de la harina de pepa industrial ( obten;da en laboratorio por extracción con banano ) y de 1a harina indugtrial o'ler' ( sonetida a prensado en caliente y posteriormente aqgtada por hexano ). con el objeto de establecer la posible incidencia de los tratanientos que se operan en fabrica sobre su valor biglógico. Asinisno, poder conparar en tales aspectos nutricionales.el efecto de la nodificación de la técnica operatoria para la ob tención de proteinas blancas respecto de las aisladas por el netodo clasico ( extracción acuosa alcalina y precipitación en medioacido ).

Si bien existen en literatura algunos antecedentes re cientes acerca del valor nutricional de las proteinas de harinas degirasol y valores de calposición de las distintas partes integran

34

tes de la semillag la ;nformución que se trató de adelantar en este trabajo. sc espera podrá ser de utilidad en el futuro con 01 finde hallar negores uqos piro Los subproductos considerados.

\

"rxA, 2.} EEE 51.292-9342 y. 7 L .---. a. w- w...w.-_..

Los eeuasas anaoáedentes registrados en litoratura sobra el ¡aglomiexto ¿o proteínas a partir de los subproductos de Q2miïla de giraaoí, a pfirticukar hacia la obtención de proteinasprácticamtnte bl¿ncas, indujeron a enfocar , cono pri-er paso, 01conocimiento de ¿a composicióngeneral de las harian: y 'lzpellers'

usados ccmo matxrka grama y la de gus fuantes de partida, procediqgdo luego, por Afiapïmtibn¿o técnicas previalcnte estudiadas. ¡1 ¡igLamiento de sus ?Püïflíhá5o

E5 Ali qua se ¿impuso el siguicntc orden de trabajo:

l) Estudiar la composicióngenfiral de senilla de girasol y de 1°!productos procedentes de su industrialización ( cáscara, pepa indqgtrial y harina induñtrial o '1ex'), de la pepa separada ¡anual-ente( en laboratorio ) y de la; hdrinas de extracción obtenidos en 1aboratoriow

2) Estuáiar las condiciones óptimas de extracción de proteinas enmedio alcalina í pHv temporaturaÉ núnero de extracciones ) y dotqgminar el pH de máximaprecipitación ( pH isoeléctrico ) opcrandosobre harini de extracción ( en laboratorio ) de pepa industrial.Efectuar el balance de la distribución del nitrógeno total de 1a harina en el proceso de aislamiento de las proteinas.

35

3) Resolver, a escala de laboratorio, 1a obtención de proteinasprácticamente blancas. Conesta finalidad realizar ensayos de extracción de proteínas en presencia de un reductor ( sulfito de sgdio ), por extracción con solución salina ( cloruro de sodio ) ,por agotamiento previo de la harina con metanol absoluto ( extrasción previa de polifenoles). y por dispersión en medio ácido.

4) Ensayar 1a purificación de las proteinas precipitadag,a travesde lavados etanólicos ( extracción de lípidos asociados ) y observar sus caracteristicas organolepticas y textura despues del secsdo en condiciones no drásticas ( vacío, 45° ). Ensayar la efectividad de otros solventes"

5) Elegidas las tecnicas adecuadas, proceder a su adaptación a 1aescala macro ( de laboratorio ) a fin de disponer. lediante su aplicación. de cantidad suficiente de "aislados' proteinicos paraefectuar ensayos de valor nutricional con animales de experiment;ción y obtener valores de digestibilidad, conoasi-isla realizar1a valoración de sus aminoácidos esenciales. La obtención en esos1a macropermitirá tener idea del rendimiento en proteinas. a treves de diferentes procesos de extracción. y su posterior comparación.

6) Disponer, paralelamente a los ensayos anteriores. de suficiente material extraído en 1a etapa de purificación de las proteinasprecipitadas ( lípidos asociados a las proteínas ) para determinarsu contenido porcentual, composición acidica y contenido en fósfocro lipídico.

7) Determinar en las proteínas precipitadas su contenido en nitrógeno, cenizass Fósforo total y fósforo de ácido fitico, perdidapor calentamiento a LOC"( vacio ) y algunos componentes particuig

36

nos según el procodiliento de obtcnción de la proteina ( ¡Ihidtidflnulruroso total).

8) Efectuar ensayos de disporsibilidnd del nntcrial nitrogcnndo enlas harinas de partida para la obtención de proteinas. Bucontinución.

37

_ 39125;! á '-_

38

:I‘áb 1.83

Comgosicióngeneñ¿¿ ¿É ¿a SCJillfi gg girasol z gs sus ¡reductos ggindustrializaciónr ¿É ¿5 2523 gegagsggganualnente (laboratorio) zQElas harinas obtenidas EEel laboratorio nor extracción (hexano).(Los valores están expresados en 1 de muestra tal cual).

Nitrógeno Proteinas Aceite Fibratotal (N x 6.25) (hexano) cruda

7.: 2'. 1 x (x) 1. un)

Humedad Jfinizas

Semilla entera 6,40 3200 2,88 19,19 41.26 26.03

Cáscara(industrial) 9,58 2.70 0,65 4,49 2.31 53.56

Pepa{industrial) 5,45 3,20 3,18 21.01 45,50 16,86

Pepa (separadamanualmente en 4,?6 3,13 3.51 22.91 55.30 5.75laboratorio)

Harina de pepaindustr al (ngKano, laboratgrio)

10,90 6,80 6,00 39.67 - 16.86

Harina indusntrial ("lex") 4,13 6,20 6,07 39,56 1,23 17.60(xxx)

Harina de pepaseparada ma nualmente(xxxx)

"(x)— Sobre base seca.(xx)- Sobre el material libre de aceite (agotado por hexano. A.D.A.G.)(xxx)- Combinac1ón"expeller"-solvente.(¡1113- Extraída por hexano, en laboratorio.

39

fue procesada 1a semilla en la extracción del aceite. Esta supoqíción estaria confirmada por el valor alcanzado ( 57,30 i, sobrebase seca ) de contenido en proteinas ( N x 6,25 ), por la harinade pepa separada manualmente ( agotada por hexano. en laboratorio).

En el aspecru que se discute, los datos de este trabajo son acordes con los logrados por ¿gasg y 52;. (37) ( 37-42 i a;ra proteinas y 14-21 Z para fibra, ambosvalores sobre base seca ):siendo 1a materia prima de la mismaprocedencia.

Sólo las harinas de extracción provenientes de semillastotalmente descascaradas estudiadas por Sosulski y natal (43) Inestran simultáneamenteun alto valor en proteínas y en fibra ( 60-63Ïproteínas: 5.3-7,0 1 fibra; ambossobre base seca ). La variedad pgaria jugar aqui un_papel significativo, Factor que no deja de ladoel autor en 1a discusión de sus valores.

En el alguientfi Esauegi General se reúnen los valores

rialas de parïidapromediologrados en las disiíntas detarminaciones para los late

y pava las h&rinds de extracción.

ESQUIIA

Valores gg comgosicióngs ¿g semilla 2 glrasol, 2 los graz gs las harinas gs extracción. (Los valores están refcrido

SÉHILLA ENTERA (x)

ACEITE (41,26 X)

m01mm“\\'i-extracc. hexano, nolienda y eliminac.

\ (Soxhlet) solvente‘ l

gil-25273513) Ceni zas \‘ m._.I.N_A

' (3,00 1) Nitrógeno 1total (2,88 x)proteínas (N x 6,25) fibra cruda

(18.00 %)(19°19 ¡b 9_) - (26.03 i),

PEPA INDUSTRIAL (x)

molienda

_ extracc . Cenizas¿93.135.Whexano (Soxhlet) —--(45.50 x) Y (3.20 x)mollenda

Humedad Nitrógeno tm(5.45 x) (3-18 i)

' proteinas (Nx6.25)HARINA"‘“"’" (19.87 x)

(obt. en laborat.) (21,01be.)Nítróeno \ Fibracruda(16.861)total ¡6,00 X) v

proteínas (N x 6,25) Humedad(10.00 Z)(37,50 1) (39,67 x b.s.)

Cenizas (5,80 fi)

(x): Muestras malla 12 - 0%remitidas por 1a Granulonetria malla 20 - 3.1 Zindustria (ver malla 30 - 16,2 xParte Eggerimental). malla 30 - 81.0 x

“ESQUEMA; m2

rién gg ¿a semilla gg girasol, gs los Erodhctog gg gg_industrialización. gg ggz;wïraccïggga (Las valores están referido 5a msn“ tal cual-L

, 3 CASCARA INDUSTRIAL (x)ïx- /————-bACEIG

j¡—-—4vACEITE(41,26 x) l (Soxhlet)

ró

molienda -—-—->extracc. hexano y n

‘“’*'wnpags;e:¿mimo, analizada y el iminac. / (Gliíflaïklüí} solvente .

l HumedadHARINA 9’58 x)

Énü Cenizas

gw 1 72767)

Fil(5:

{2,88 fl.) Nit gene mg;¿m {N x ¿3325) Fibra cruda (0,65 1)¿Ü ‘ (26 03 .1) proteinas (N x 6,25)

(¿9919 ibasú) r ' (4.05 x) (4.49 x b.s.)

PEPA INDUSTREAL (x)

lj molienda

l Hunga. . 9'9‘(Saxhlet) m(3,20 1)/

Humedad Nitró eno toa].

(5.45 x) (3,18 x)proteínas (Nx6.25) "39.595.W 2 "ELE!"(X)

ÏÏÏ") (21'01 xb's’) molienda---—--,extr¡cc. hnFibracruda(16,86Z)xxx.«XXX w q

\\ MM MJ\ ‘fiüumedad(10,00x)

‘ Humedad

\‘Cenizas (5,30 74) 4.13 x) Cenizas

malla 12 - 0% (6.20 X) "ltró eno Jcwtria malla 2o -- 3,1 x proteinas 1

malla 30 - 16.2 x (37,93 x 4malla 30 w 81,0 1

Lstrialización, gs EeEa separada manualmente.¿a (x) PEPA SEPARADA MANUALMENTE

ACEITE(2.31 X) iobt. en laboratoriosnextracc. hexano y molienda

(Soxhlet) (eliminac. del mliemh' solvente)

extracc.por

¡vb d M922 (thefim)1 ra cru a o et‘\¡ (53.56 x) (4’26 x) y

Nitrógeno total Cenizas molienda(0.65 %) (3’13 x) ellm. solv.

‘oteínas (N x 6.25)‘06x) (4.49 1 b.s.) Nitrógeno total

(3.51 %)proteinas (N x 6.25)

(21’94 %)(22,9l 1 b.s.) vACEITE

v (55.307)Humedad =;_ ¿ygzINA

Cenizas

(7.09 x) .'Eïgïs EEEÉÉ Nitrógeno total(5.75 %) . (7,30 x)

:ALo "LEX" (x). proteinas (N x 6.25)(48.75 x) ‘

(57.3o x b.s.3l-—-—-——-—-—-—>GXtI‘lCC.hexano una-ACEITE (1,28 %) ’

molienda y eliminación solvente ——¡-Fibracruda17,60 15

É) Nitrógeno total (6.07 x)proteinas ( N x 6.25)(37.93 x) (39.56 x b.s.)

41

- Estudio gs las condiciones óptimas gs extracción I precipitación gg groteínas g Bartir de la harina gs Eena industrial ggtenida En laboratorio.

a) Extracción.Se condujo una serie de ensayos previos a fin de 3

justar las condiciones óptimas Operatorias, de acuerdo al nótodo deextracción acuosa en medio alcalino y precipitación en medio acido.procedimiento que la literatura'seflala comomás conveniente para operar en gran escala.

Por aplicación de la tecnica cuyo detalle se incluyeen 1a Parte Experimental, la determinación del pH óptimo de extracción del material nitrogenado presente en 1a harina (lanteniendoconstantes otras variables: tenperatura. relación harina z agua. tglocidad y tiempo de agitación y condiciones de centrifugación). pe;nitió observar que el máximose logra a un valor ¡uy elevado z pu ILOo superior.

En experiencias individuales y partiendo de 5 g de ngrina, se extrajo el material nitrogenado dispersable para cubrir losvalores de pHcomprendidos en el anhito 6.5 a 11.5. Los valores registrados fueron:

BE N 1 harina N 1 N total {en harina)

6,5 2,11 35.27.5 3.81 63.58.5 4.78 79.69.5 4.90 81.6

10,5 4,92 82,011.5 5.09 84.8

La regresentación grafica (Pia. ¿13) de las cifras

42

ï¿r¿wgfiwí m PROTEIHAS DE HARIEA DE PÉPA.IHDÜSTRIAL Ds GIRASOL

Kitrégfifiü axtraiáa {i s fatal en harina) en función delpH ¿a axï?&caiáa;

43

consignadas en la 3e colunna (N extraido x N total en harina, en

función del valor de pH). nuestra una rápida elevación hasta alcagzar el valor de pH 8.5 y luego una pendiente suave entre ese valory 11,5.

Este comportamientogeneral y en particular la bajadispersibilidad a valores de pHpróximosa la neutralidad (7,0). ya

señalados en literatura (20), quedaron corroborados a traves de estas experiencias. gaita y lohnsen (20) señalan una extracción del20 1 del nitrógeno total a pH 6,6 y del 100 1 a pH superiores a 10,0,

para la harina de semilla totalmente descascarada y desengrasadacon eter de petróleo p. eb. 30 - 60°. En este trabajo, se operó conuna harina (agotada por hexano técnico, en laboratorio) provenientede pepa industrial con alto contenido en fibra (17 x).

Durante la extracción y a valores de pH superiores a6.0 se observó la rapida aparición de un color anarillo - "crono"que se intensificaba con el tieapo de agitación (extracción), pasasdo finalnente al verde intenso. ApH 11,0 y superiores el color final fue pardo oscuro. Estas coloraciones serian indicativas de lapresencia de acidos clorogénicos en la harina.

El liquido de extracción permaneciópracticanente igcoloro a valores de pH inferiores a 6,0. Dentro de ese anbito de pH1a dispersibilidad del material nitrogenado fue baja. gaita y Johnson(20) (22) asociaron ambosfenómenos interpretando que'el acido clorggénica“ presente en la harina "retardaba' la extracción de las proteinas. .

Aúncuando el hecho experimental registrado en estetrabajo confirsa una baja de material nitrogenado a valores de pH igferiores a 3,0, no existen pruebas cono para atribuir ese efecto a1a presencia de ácidos clorogénicos.

Contrariamente, Sosulpki y ggïgí (43) sostienen haber

44

extraido las FICÏQÏNiï !Ápld&neflte, a part r de harinas. cono ocurre con las de soya. ¿aüe‘ar. own embargo, que la cosecha y la variedad vegetal afectxr masolubilidad.

El nana: observado experimentnlnente un náximo de eftraccion a pH 11,0 ó zopélior. no significa operar en condicionesopti-as para la extracción de profieinas.

Varroa Aaaores han sefinlaco que el trate-lento enérgico de enzilas y proteínas de distintas fuentes. por álcelis. podíainducir cambios QUÏMLCOSen dichas proteínas. conduciendo a la Bore:ción de nuevos aminoácidos: lisinoalanina, lantionina y ornitinoalenine. Esas modificaciones involucran a los aminoácidos cistina, 1133na, trainina y serina. (48) (49) (50) (51). Comolos ¡ninoácidos másfácilmente efecíados (cistina y llsina) frecuentementeson linitan te: en 1a mayoría de las proteinas alimenticias. la exposición de unaproteína a1 ilcali (en condiciones drásticas) podria disninuir su vílor nutritivo.

Estas revelaciones sirvieron de base e un elplio estadio llevado a cabo por gs 93223 y ElBEE(52) quienes trataron de establecer une serie de condiciones bajo 1a; cuales el tratamiento a1calino severo de proteinas (harxna de soya, caseina. 'concentrados'de proteínas animales, productos comerciales ricos en proteinas de c3co, sósalo, etc.), podia tener efecto sobre la conposición en ¡ninoácidos y valor nutritivo de les mismas. Estos estudios mostraron queel tretaniento e pH 12,2 y 40° por 4 horas, podia provocar cambiosquilicos con le ocurrencia de un nuevo aminoácido (lisinoalanina).condeereciniento del contenido en cistina y en menorextensión de lisina.Tratamientos lis drásticos, a temperaturas entre 40 y 80°, tambiéndestruian seria; y arginina.

Un canbio primario en 1a proteina por acción del ¿legli. se atribuyó a la formaciónde residuos dehldroalanina a partir de

45

los restos cistinilo y serilo (50), compuestoaquél que reaccionaria con el grupo s-amino de la lisina para formar lisinoalanina. ocon restos cistinilo intactos, en la formaciónde lantionina.

La exposicion de proteina de soya al alcali (pH 12,2,40', A hrs.) estuvo invariablemente acompañadapor un decreciniento en la utilización proteica neta de la misma. La calidad de laproteina (valores de "UPN")en las muestras sometidas a tratamientoalcalina (variando pH, temperatura-y tiempo de exposición), mostraron una muysignificaziva correlación negativa con los contenidosen lisinoalanina de las mismas(r: -0,96).

Los resultados obtenidos por estos investigadores 92gieren que el tratamiento a pH 12, aún a temperatura ambiente y portiempo relativamente corto, destruiria algo de cistina, lo cual ingvitablenente conduciria a un menorvalor nutritivo.

Bressani y gol. (53) no obtuvieron diferencias apreciables en los valores de "REP"y "UPN"entre proteina de soya ais—

1ada.antes y después de exponerla al alcali (pH 12 a temperatura agDiente), con un contacto menor de 10 minutos (preparación de "Bilanentos' de proteina de soya).

Cono no todas las proteinas se comportaban de manerasimilar frente a las mismascondiciones del medio alcalino severo,

ggggg (SO) ha sugerido tentativamente que serian de importancia. enla formación más o menosrapida ce lisinonlanina, las posiciones ocupadas por los grupos cistinilo y lisilo en la secuencia de 1a nolécula de proteína, sin dejar de lado que también podría formarsede estos nisnos restos ubicados en otra relación espacial.

En base a estas observaciones y no contando con antgcedentes al respecto para proteínas de girasol, pareció razonable nooperar las extracciones a valores de pH superiores a 11.0 (de prefg

46

rencia hacerlo entre 10 y 11.0) y a temperatura nayor que 1a an

biente. Las extracciones llevaron una hora de agitación cada Ilsr_[y en los líquidos finales reunidos se precipitaron innediatanentelas proteinas a1 pHacido elegido.

Conoconplenento de estos ensayos. las experienciasque se nencionan a continuación confirnan que, de operar con dis tintas relaciones de harina z agua en las extracciones. o con di«Perente núnero de extracciones, no se afecta practicanente el rendiniento en naterial nitrogenado extraido. La ventaja en el casode proceder con sólo dos extracciones y a nenores relaciones. est;ria en nanipular nenores volúnenes.

u Relación I° de I extraido I extraidoP harina : agua extracciones 1 de harina 1 de I total

1 z 5011.0 2 5,09 84.8

1 1 : 50

1 : 2011.0 1 z 5 3 5.10 64.9

1 : 5

1 = 2° 4.65 77.5‘11.0 1 z 5 3 0.22 3.8 83.1

1 = 5 0,11 1.a

Conopuede observarse. una 3: etapa de extracción ssria innecesaria en la practica, ya que dispersa nenos del 2 i delnitrógeno total de 1a harina. En estos ensayos se han nantenido con;tantes, ade-as del valor de pH. las otras condiciones operatorias:tenperatura. tie-po de extracción en cada etapa y tie-po de centrifiggación.

47

b) Elección del gg gs máximaBrecipitación (EE¿gpeléctrico).

Para estos eflsapcs, ia harina fue extraída a pH 11.0con relaciones de harina : agua de 1:20 ; 1:5 ; 1:5 , y el materialno dispersado (residuo) fue remcviáo üOFcentrifugeción. fic cnaayo1a precipitación a d ¿tintos valores de pH, sobre alícuota! del egtracto alcalino por adición de variadas cantidades de solución deHCl, con agitación constante, El precipitado fue removido por centrifugación,midiéndose el nitrógeno sobrenadante para cada valor depH.

Los valores logrados según La técnica que se detallaen 1a 23255 Egkerinental. y que figuran a continuación. están reppssentados en 1a grafica correspondiente (?ig. N° 2}.

pH de N sobrenadante pH de N sobrenadanteprecipitación i de N extraido precipitación X de N extraído

2.6 55.6 4,5 21.8 l3.o 38.4 4.6 21.7395 27,5 4,8 23,6

3.8 24,6 5,0 25.54.0 22.7 5.2 26.44.2 21.7 5.5 33.9

4.4 lelï 5.8 80,1

Zonade En de máximaprecipitación (punto isoeléctrico): 4.2 a 4.6.N total en harina: 6,00 x. N extraido 1 N total en harina (pron.k85

Si bien 1a zona de pH isoeléctrico (máximaprecipitación) está comprendida dentro de 1a señalada por Smith y ¿ohneen (20)(PH 4.0 - 6.5). an el caso estudiado presenta un margen más estrecho

Pia. N' 2 —-PROTEIIAS DE HARINA DE PEPA IIDUSTRIAL DE GIWOL

n sobrenadante 1 I extraido en ¡función dal pHde precipitación.

i y ‘- n 49

(pH 4,2 - 4,6) (señalada entre fí&ckza3. Es evidente que alradedoridel 20 i del material mitïügfinfiáü ï@ï@}¿e la harina. queda añ somlución al valor del pH 353&1%5ïric&{mimiabde salubilidad d%pra»teínas).

Y Para üüüüñ 123 ïaímr;3 ¿a yfii el color ae las prúuteinasprecipitadas V‘fiïfig {35216:quese atribuyaal complejo irrever51hle qaiflüfiasw?rüï%ífififig ya q&e los polifenü m

le: expgrinentan oxiáación ¿a medio a;&aíin@durante el proceso de'extracción.

En exyerieacias más complatas, una vez alegidc el pHde máximaprecipitaciéa, Be prócedié á hagár un balance cuantitatgvo de las distintas Eraacianes saparadas durante el aislamiento delas proteinas. El siguiefite esquemailustra sobre los resultadosobtenidos:

HARINA 10 g (6.00 x N total)

33°, 1 hr. agitación coatinua

3 extracciqnes ; can relaciones 1 : 20sucesivag a pH 11,3 harina z agua 1 : 10

3 n

É 1 o 5“.W‘W'VM \.-s,

-MÑMM aRXn“\\LIQUIDO DECANTADD Nkggsmvo

i Q 5,16 N i karina 0,?3 N x h¡rina5-553ï5599°{95.9 R í k ïaïalmwmm+>?8*li»¿MWMWa512,2a x n total

áresiduO'seco g 109“.A r ¿ ¿A en vacío: 4,12 g gPrec¿p¿t&c¿aa love H g regiáüü)

i ,{2 lavadas acuüaas,2?Pfi9e) 3 lavaáas mtansl 96%

r Bárínfi y 1 aïárüu; macada asonnznADAHTE '“”““w»_fic

1.02 H É harinas magias ¿ásïa gg¿ 17,0 H i'm Éüïáï g ïüïáá

. "RL-m»g;J ff; C???» :5 2 g Q ¿36‘E ü?*“fl 3 É fiü se}

50

El rendiniento teórico en nitrógeno precipitado (oen proteinas precipitadas). seria el obtenido por diferencia entreel nitrógeno extraido y el nitrógeno sobrenadante. o see. 68.9 Zdel nitrógeno total de la harina. valor que es algo superior a1 e!centrado (calculado este en base a1 peso de las proteinas preotpitgdas y su 1 en nitrógeno). Esa diferencia se atribuye a las perdidasque ocurren en las operaciones de lavado acuoso y etasóiico (etanol961) del precipitado. y a 1a capa del nisno que queda adherida a1tubo de centrífuga.

Purificación gg; precipitado gg proteinas - Lipidos asociados ¿_¿¿¿proteinas.

El precipitado de proteinas. una ves separado por

centráfugación. tenia color verde intenso. El liquido sobrenadaste.a1 pHde precipitación, resultó linpido y de color verde-parduscobrillante. Igual-ente lo fueron. aunquesenos intensos, los liquidos de lavado acuosa (agua ajustada previasente a1 pu isoeiectrico).

El precipitado increnentó‘progresivanente su colorhasta el verde oscuro, casi negro, a1 ser secado en vacio a 45°.cuando no se efectuaron los lavados etandlicos.

En tal sentido. 1a experiencia practica obtenida enun trabajo anterior (purificación de proteinas aisladas de senillade lino) (54). a su ves basada en los trabajos de ¡odangekar y 52;.(55) y en los a. v_ol_ry g. (56). M y _co_1.(57) y Bnilex y¿giga (58). sirvió para establecer las condiciones que pernitieronlograr durante el secado de las proteinas ( sea en vacio o en corrie!te de aire en rotavapor, a 45‘). un color estable y reproducible endiferentes partidas, a1 igual que otras caracteristicas fisicas yorganoldpticas del precipitado.

Tal tdcnica se aplicó a las proteinas ya lavadas con

51

agua. suspendiéndolas por agitación (3 veces) en etanol 961 y finalmente (1 vez) con éter etílico, para acelerar el secado (ver¿este Ezperimental). '

Se obtuvo asi un producto que durante el secado a45°, no intensificó ai cambió su color. quedando finalmente como

polvo verde-grisaceo claro, de grano muyfino y suave al tacto. ingdoro e insipido.

Los dos primeros lavados etanólicos resultaron lilpidos y de color amarillo-verdoso, siendo el tercero ligeramenteturbio e incoloro. Dicha turbidez es producida por la suspensiónde muyfinas particulas del precipitado, no sedimentables en esemedio por centrifugación. (Este fenómenoocurre cuando se ha eliminado la mayorparte del agua retenida por el precipitado proteico.y constituye un factor de perdida adicional en el rendimiento final).

La literatura ofrece varios trabajos acerca de lacaracterización de los componentespresentes en extractivos etanolicos de proteinas. y del efecto que los solventes tienen sobrelas propiedades fisicas de las proteinas asi purificadas (los alcoholes son agentes desnaturalizantes). Los materiales más estudiados han sido las proteinas de soya. y en menor escala. proteinasde hojas y de otras fuentes vegetalesa

En sus estudios, Eglg y 52;. (56) señalaron que elóptimo de remociónde lípidos (fosfolipidos) de las proteinas aisladas. ocurría a altas concentraciones de alcohol (B3i o superiores), con un minimode desnaturalización de las proteinas. Mostraron que el máximode extracción de fosfolipidos (con etanol de 831y para proteinas de Soya) se logra cuando se usa una relación 20:1(m1 etanol por g proteinas) o mayor.

Efectuar-onla purificación“ las proteínas conducieg

52

do 3 lavados con buena agitación, centrifugando y decantando cadavez. dejando en contacto la proteina con el alcohol en el tercerlavado por un par de horas. Para Facilitar la remoción del alcoholresidual, realizaron un lavado con éter etílico y finalmente secaron la proteina en estufa de vacío a 37°. Los sólidos extraídos delo proteina precipitada, los determinaron por evaporación de alienstas del extracto alcohólico. secando en vacio a 50°.

Sus resultados mostraron que solventes cono ¡etanol94 i. etanol 83 1 e isopropanol 77 í renovieron a tenperatura an Diente (25°) entre el 7 y 8 X del peso de las proteínas. Cerca de

1/3 a l/b de ese naterial resultó tanbien soluble en Clacn. Los agtores señalaron comocomponentesmás probables en el extractivo:Posfolipidos, azúcares y otros materiales solubles en alcohol presentes en las proteinas crudas.

Tanbien dejaron constancia que la remoción de dichosconponentes, especialmente los lípidos, tenia marcadoefecto en laspropiedades de "formación de espuma" de las proteinas de soya. Lasespana: las estables. de baja densidad, fueron preparadas con la prgteina purificada por extracción alcohólica (56) (59).

La renoción de lípidos por alcohol tanbien resulta útilen la conservación de l'concentrados" proteinicos de hojas. ¿Egg (60)probó que los lípidos fueron responsables del desarrollo de fenóleínos de rancidez en "concentrados" de proteinas de hojas de maiz, tr;go, trébol rojo, etc., en exposición prolongada al aire, siendo susprincipales precursores los fosfolipidos. Unavez inactivados (porcalentamiento a 100°) los sistemas enzináticos que originaban cambiosorganolépticos en el 'concentrado', continuó la oxidación de lípidosy se hizo evidente. El producto liofilizado fue estable a temperatura anbiente por 2 - 3 meses, pero es necesaria la remoción de los

53

lípidos si se desea mantenerlo por un tiempo prolongado.

Con la intención de probar la eficacia de algunossolventes en la extracción de los compuestos que coloreaban las prgteínas precipitadas, se ensayo la purificación con otros solvente!distintos del etanol 96 x (acetona 80 x, etanol 60 X. ¡etanol 80 1.mezcla metanol-acetona 80 1 y acetato de etilo), a traves de 3 lavados en relación 25:1. En ningún caso se pudo elininar ni atenuar elcolor verde de las proteinas, resultando algunos de ellos menossatisfactorios que el etanol 96 1 (mayoroscureciniento durante el sscado a 45° - posiblemente debido a menor efectividad en la remociónde los lípidos asociados y/o más bajo efecto deshidratante -). Laliteratura registra antecedentes de lavados de "aislados" proteicosde soya (S6) (59) con solventes similares, realizados con el propósito de mejorar sus propiedades fisicas.

Aislamiento de proteínas en macro-escala gs laboratorio.

De ¿cuerdo a las condiciones experimentales de aislamiento anteriormente señaladas, pero reduciendo a dos las etapas deextracción , lo cual comoya fue discutido, no afecta el rendimiento

en material nitrogenadc extraido,(ver 22535 Experimental), se proqgdió al aislamiento en escala macro (en laboratorio) de aproximadamente 500 g de proteinas con destino a su evaluación biológica ycomposición en aminoáczdos esenciales.

Para lograrlo se aislaron las proteinas de 8 partidasde 200 g de harinn industrial (“lex”) de girasol. Se obtuvieron 440g de proteinas secas n 45° (en vacio), de los cuales 360 g se destinaron para el estudLo de su valor nutricional ( utilización proteica neta y digeslíbiïidnd) y valoración de aminoácidosesenciales.

S4

El resto del material se destinó para su caracterización, obte.niéndose la información que se detalla a continuación:

color verde claroaspecto polvo suave, muyfinoolor muyligeramente alcohólicosabor insípidas

pérdida a 100° 4(vacio) 1 ’—‘“‘"*‘*"’ '77

cenizas 0’52(500 - 550°)%——-«-—--——-v

N (Kjeldahl) 3:; 15.17

N (en base libre de humedïdy cenizas) % —__.________ 16,02

Fósforo total,como P, (61)% __“- 0,58

Se obtuvieron rendimientos que oscilaron entre 27.6y 30.0 i de "lex" (55.6 - 60,0 g de proteinas secas a 45° / 200 g

"lex"), acordes con el único valor consignado por EEES!y ¿ohnsen(20), (31 %), para proteinas obtenidas a partir de semilla totalmente descascarada y libre de aceite. y aisladas a traves de unatecnica similar. gggglgïi y ggggl (43) presentan valores de renqimiento para proteínas precipitadas, del orden de 53 1. sobre nar;na totalmente descascarada, señalando que los mismosexceden not;blemente a los logrados con otras oleaginosas.

Conpropósitos comparativos, se procedió a aislar,por igual procedimiento, las proteinas de 1a harina de pepa de alrasol separada manualmente(en laboratorio) y cuyas características figuran en la ÏÏEEÏ ¿, obteniéndose rendimientos del mismoo!den que los señalados para las proteinas aisladas a partir del “lexfi

55

Tambiénfueron similares el color, aspecto y contenido en nitróqgno del producto Binnl (proteinas lavadas con agua y etanol y seg!das en vacío a 45°): poivo muyPino, suave, de color verde claro.conteniendo 15,5 fi de nitrógeno.

Para y ¿3151;(43)el nterial departidaloconstituyeron harinas de pepa descascarada con un contenido en nitrógeno del orden del 10 i {promedio), mientras que 1a harina depepa separada manualmenteutilizada en el presente trabajo, contenía 8,7 S de nitrógenn en base seca. Aquellos autores lavaron lasproteínas y luego las liofilizaron; el producto final. de colorverde, contenía 14,0 fl de nitrógeno.

Lo expuesto resume la experimentación llevada a cabopara la vbtención de proteinas finales con caracteristicas de taztura satisfactoria, aunquede color verde claro una vez secas a45°. 3110 fue posible a través de la purificación por lavados sus;¡ivan acuosa: y etanólicos en las condiciones que se detallan en 1aÏÉEESExgerigsgggi. Cabe destacar -ya señalado antariorlente-, quelos don primeros EXÏFACCiVCSetanólicos resultaron limpidos y decolar amarillo-verdnsnï lo cual posiblemente contribuya a atenuaren parte el Colexvrrée final de la proteína. eliminandosilultafielmente agua, compuestos Lipidicos y otros materiales no protei C09 que acompañana 133 proteinas en su precipitación. Smith y

¿935255 (20} sólo csnziguieron obtener una proteina de color verdaclaro, después de lavar dos veces el coagulo con agua y cuatro vaces can etanol VU1 hirviente.

gcnposición gs los extractivos en etancl - Lipidos asociados a lasgreteínaa12recipiiadas.

En el curso de esta experimentación, fue tanbiún prg

56

úñsitn 1pwn:>:h‘ ex TBCtiVOSetanólicos obtenidos enIa puy¿ ;'a;;1a se Lü? y“ ïe-ïaa pre=ipitadas, para conocer su COIrüsicíón «Ciuiy 3 í¿ na‘araleva del material predominante an

lws EïGHOL fin ‘.:+ ¿LLÏCLCO(lapidos asociados l las proteinais :Í 5-"; 1)r

32 va:¿3;3 de 1amaxtracciunes etanólicas reunidas.

p eviamante Iqmac :¿r ázer et lico, fl“trado y llevado a peso coqgtante a 120” wn1::ÏC, andió ü,126 g de lípidos totales (2,07 x ggave pr0tegnas 5:61; a 43’) y presentá las siguientes caracteristi'CLSawa‘ífidafi:

H” ¿K ‘¿Ez {mg (CH/g? 71,6__u_.__________I Iii '..\'. ’Ï'.“ 'x’O‘É‘Ï iti- 115.4

"aya. .ón 205,0

ifiaï}, Hum. 4.55 (Sobre proteinaseca a 45‘:0009

r‘üi {Hüau"r¿nJ {Lhnhenn) 36.5

(Sobre proteinseca a 45':1.59 x)

,qp.3 'i __”Mm 76,76

(Sohre proteinseca a 45’:0,02)

0,91. ".4 .- . .. >..'1.--\. ——.—--—-—

'1d' Tüaïlefi obtenidos por saponificación, lipsr¿dos du ¿nüipüw:f¿u-ï ¡anvertidos en sus ésteres netilicos. r5vclaron 1¿ siguarxio ¿Ynüfiin acidica al ser analizados por crom4togra€ía ga; a L2:v\a¿ (vwï Egïïg Exgerimental):

láiQ ¿ÜJFJF¿iii ¿ÉLG‘J3v693 ¿Éiü (4'2)F 1331 (lava): ¿Big

(66,7) x rastwoa ie L¿¿g; }y¿¿; ¿g¿g y 16:1 ( 1 de ácidos totales).

57

Esta composición incluye los componentes mayores y menores señalados para los aceites de semilla de girasol de producción nacional(62).

l>

EFSAYOS BIOLOGICOS< )

a) Composicióngg aminoácidos esenciales.Se obtuvieron los siguientes valores (métodosnicrg

biológicos), en 9/16 g N :

Lisina 3.o

Lisina disponible 2.2 ( x de lisina disponible: 73.3)Metionina 1,7

Hetionina disponible 1,4 ( x de metionina disponible: 84,4)Treonina 3.7

Valina 4.9FeniIalanina 3.9Leucina 5.7

Igoleucina 4,3Triptofano 1,1Cistina 1,9

b) Valor nutritivo (63) (ratas)

Utilización proteica neta, UPN(0P) 48,6Digestibilidad, D (vitro) 90,0

Valor Biológico, VB(calc.) 54

(*) Resultados logrados en los laboratorios del Departamento de Bro

matología y Nutrición Experimental (Facultad de Farmacia y Bioquiaica, Universidad de BuenosAires).

a ESQUEMA GENERAL

WSEMILLAgg GIRASOL(cosecha1970)“) Nearacterizacmní/ (valores de co!

! x ral).

nexano HARINAINDUSTRIALg "¿55" (x)'¿::::::::::tecnico

553255 (obt. en laborar.) .

\‘t J a ¿Ó caracterizacióncarac eriz c‘ n (valores de composición¡valores de cog gener¡1)pos