PROYECTO DE TESIS DE DOCTORADO

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLOESCUELA DE POST GRADOPROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIAS BIOMEDICAS

EFECTO ADYUVANTE DE LAS SAPONINAS DE Sapindus saponaria L. PARA ANTGENOS DE Leishmania braziliensis EN MSCULO ESTRIADO DE Rattus rattus var albinus

TESISPARA OPTAR EL GRADO DEDOCTOR EN CIENCIAS BIOMEDICAS

Autor: M.Sc. Segundo Manuel Miranda Leyva

Asesor: Dr. Ramn Piminchumo Carranza

TRUJILLO - PER2013

INDICEPginaINDICEiRESUMENiiSUMMARYiiiI. INTRODUCCIN1II. MATERIAL Y MTODOS37III. RESULTADOS40IV. DISCUSIN42V. CONCLUSIONES48VI. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS49VII. ANEXOS52

NDICE DE ILUSTRACIONESFigura Anexo 1. Corte de pelo del muslo izquierdo para inyectar53Figura Anexo 2. Inyeccin en el msculo del muslo izquierdo53Figura Anexo 3. Grupo testigo T. Recibi Solucin Salina Fisiolgica54Figura Anexo 4. Grupo Experimental C. Recibi Asociacin Saponinas Antgenos de L. Braziliensis54Figura Anexo 5. Obtencin de Sangre Perifrica (colas)55

ResumenSe llev a cabo un estudio comparativo en Rattus rattus var. Albinus para investigar el efecto coadyuvante de las saponinas de Sapindus saponaria L. (sapindussaponina) para los antgenos de Leishmania braziliensis. Con tal finalidad se inyect va intramuscular (IM) a 4 grupos de cinco ratas machos cada uno, en el msculo del muslo izquierdo solucin salina fisiolgica, antgenos de Leishmania braziliensis, sapindussaponina, y la asociacin sapindussaponina - antgenos de Leishmania braziliensis correspondientemente. Para evaluar los cambios en la frmula leucocitaria, a las 48 y 192 horas se tomaron muestras de sangre perifrica (cola) de los especmenes de cada grupo. Se prepararon los frotis y se realiz el conteo de glbulos blancos con microscopio ptico con lente de inmersin. Los resultados porcentuales fueron sometidos al anlisis de varianza ANOVA de un factor con la prueba post hoc t de Dunnett. Se concluye que la inyeccin de sapindussaponina y sapindussaponina - antgenos de Leishmania braziliensis provoca cambios en la frmula leucocitaria; y que las variaciones de porcentaje de leucocitos: neutrfilos, eosinfilos, linfocitos y monocitos indican la respuesta celular a las saponinas y la asociacin saponinas fracciones antignicas de Leishmania braziliensis.

Palabras clave: Sapindussaponina, antgenos de Leishmania braziliensis, inyeccin intramuscular, respuesta celular.

Summary

They conducted a comparative study in Rattus rattus var. Albinus to investigate the adjuvant effect of Sapindus saponaria L. saponins (sapindussaponin) for Leishmania braziliensis antigen. For this purpose was injected intramuscularly (IM) to 4 groups of five male rats each in left thigh muscle physiological saline, Leishmania braziliensis antigen, sapindussaponin and the association sapindussaponin - Leishmania braziliensis antigen correspondingly. To assess changes in the leukocyte, 48 and 192 hours, peripheral blood samples (tail) of the specimens of each group. Smears were prepared and performed the white blood cell count with microscope immersion lens. The percentage results were subjected to analysis of variance one-way ANOVA with post hoc Dunnett t. We conclude that injection of sapindussaponin and sapindussaponin - Leishmania braziliensis antigen causes changes in the leukocyte, and that variations in percentage of leukocytes: neutrophils, eosinophils, lymphocytes and monocytes indicate the cellular response to the saponins and the association saponins - fractions antigenic Leishmania braziliensis.

Keywords: Sapindussaponin, Leishmania braziliensis antigens, intramuscular injection, cellular response.

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iiI. INTRODUCCIONEl hombre siempre ha estado interesado por conocer la naturaleza y aprovecharla para la solucin de diferentes problemas (Boege, n.d.) tales como la necesidad de a) alimentacin para una poblacin humana cada da mayor, b) nuevos medicamentos para las enfermedades que en la actualidad son incurables, y c) nuevas materias primas industriales; motivo por el cual, se ha empeado en investigar cientficamente las sustancias presentes en los seres vivos que le rodean, tanto plantas (Fitoqumica) como animales (Zooqumica).ADYUVANTES VACUNALES: ESTADO ACTUAL Y NUEVAS TENDENCIASAguilar J. y Leal M. (1999) presentaron un trabajo de revisin sobre el estado de desarrollo y los principales resultados obtenidos con los adyuvantes; ellos exponen que:La meta principal de la vacunacin contra enfermedades infecciosas, es el establecimiento de una resistencia de larga duracin contra la infeccin luego de una o pocas inmunizaciones. En el caso de las vacunas vivas atenuadas como las que se emplean contra la varicela y la poliomielitis, esta meta se ha alcanzado con xito, mientras que las vacunas que contienen microorganismos inactivados o sus subunidades son menos inmunognicas y, con frecuencia, se administran con un adyuvante. Los adyuvantes son sustancias o procedimientos que aceleran, prolongan o potencian la respuesta inmune especfica contra los antgenos inoculados. La palabra adyuvante proviene del latn adjuvare, que significa ayudar, asistir. Los adyuvantes inmunolgicos se comenzaron a desarrollar a partir de la segunda dcada del siglo xx, cuando Ramon y colaboradores observaron que los caballos que desarrollaban abscesos en el sitio de inyeccin del toxoide diftrico, generaban mayores ttulos de anticuerpos especficos que aquellos que no los tenan. Posteriormente, se report que los abscesos generados por la inyeccin de sustancias extraas junto con el toxoide, aumentaban la respuesta antitoxina en caballos. En 1926, Glenny demostr la actividad adyuvante de los compuestos de aluminio mediante el uso de una vacuna de toxoide diftrico precipitado en almina. En la actualidad, los adyuvantes de aluminio (fosfato e hidrxido de aluminio) continan siendo los adyuvantes inmunolgicos ms ampliamente usados y los nicos presentes en las vacunas licenciadas en los Estados Unidos. En 1936, Freund desarroll una emulsin de agua en aceite mineral que contiene micobacterias muertas, lo que actualmente se conoce como adyuvante completo de Freund (ACF). El ACF es uno de los adyuvantes ms poderosos, pero es muy reactognico para ser usado con fines clnicos. Aun as, el adyuvante incompleto de Freund (AIF) la emulsin sin la adicin de la micobacteria muerta ha sido empleado en formulaciones vacunales en humanos. En 1956, Johnson demostr la actividad adyuvante de la endotoxina lipopolisacardica (LPS) proveniente de una bacteria gramnegativa. Estos estudios son la base del uso actual del LPS detoxificado o de sus componentes como candidatos de adyuvantes para uso en humanos. En 1974, Lederer y colaboradores identificaron el muramildipptido (MDP) como un componente con actividad adyuvante de la micobacteria presente en el ACF. Ms recientemente, otros compuestos de origen bacteriano han sido identificados y caracterizados, y se ha comprobado su funcin inmunomoduladora e inmunopotenciadora como parte del ACF. Se conoce que cientos de compuestos naturales y sintticos poseen actividad adyuvante. Estos adyuvantes, que pueden ser usados para adicionar o reemplazar a la almina en vacunas humanas, han estado en desarrollo y evaluacin preclnica durante dcadas. Varios de ellos han demostrado ser ms efectivos que la almina y potencian respuestas inmunes mediadas por anticuerpos, as como respuestas celulares intensas. En la actualidad, se consolidan estrategias ms racionales en el diseo de vacunas. stas requieren la identificacin de eptopos apropiados y el desarrollo de formulaciones que permitan generar una respuesta inmune protectora con esos eptopos. La funcin de los adyuvantes inmunolgicos en el diseo racional de vacunas, es dirigir y optimizar respuestas inmunes apropiadas hacia eptopos vacunales protectores (). Adyuvantes vacunales Ventajas de su uso Entre las ventajas del uso de adyuvantes se hallan: (i)su capacidad de potenciar la inmunogenicidad de antgenos con un grado de pureza elevado o recombinantes; (ii) la reduccin de la cantidad de antgeno y del nmero de reinmunizaciones requeridas para proveer una inmunidad protectora; (iii) el aumento de la eficacia de las vacunas en los recin nacidos, los ancianos y las personas inmunocomprometidas, y (iv) permitir el envo mucosal de vacunas dirigidas a incrementar la respuesta inmune a nivel de mucosas. A diferencia de la presentacin del antgeno en su entorno microbiano natural, el uso de adyuvantes permite una forma menos txica y ms segura de inoculacin. Su utilizacin desborda el universo de las vacunas preventivas y se introduce en las formulaciones vacunales con objetivos teraputicos. Seleccin Entre los factores involucrados en la seleccin de un adyuvante se encuentran: el tipo de respuesta deseada o que se quiere evitar, la especie vacunada, la ruta de administracin y los efectos colaterales inducidos por el adyuvante. La disponibilidad clnica de adyuvantes adecuados, seguros y efectivos es decisiva en el desarrollo de las nuevas vacunas. De forma ideal, los adyuvantes deben ser materiales baratos, no txicos y poco inmunognicos. Adems, deben ser estables, biodegradables y, preferiblemente, deben promover inmunidad tanto humoral como mediada por clulas, en dependencia del requerimiento de proteccin del patgeno. La generacin de una respuesta inmune protectora a nivel de mucosas, es de gran inters para quienes estudian las enfermedades que afectan las mucosas o que tienen en ellas su puerta de entrada. Existen diferencias en la efectividad de los adyuvantes por las diferentes rutas, debido a que las vas mucosales tienen caractersticas fisiolgicas que las diferencian entre s y de las rutas sistmicas. De ah que el desarrollo de vectores, sistemas de envo de antgenos y otros compuestos con actividad adyuvante tiene en cuenta las caractersticas de la ruta por la cual ha de ser inoculado. Seguridad Los beneficios de la incorporacin de adyuvantes en formulaciones vacunales para potenciar su inmunogenicidad, deben ser sopesados con el riesgo de reacciones adversas que estos compuestos pueden inducir. El marcado efecto inmunopotenciador de la mayora de los adyuvantes est relacionado directamente con su toxicidad. La introduccin de adyuvantes potentes en los ensayos clnicos, comenz en relacin con las vacunas preventivas y teraputicas en las que los adyuvantes de aluminio son inefectivos. Uno de los objetivos del desarrollo actual en materia de adyuvantes, consiste en disminuir al mximo su toxicidad sin afectar el efecto inmunopotenciador. Las regulaciones establecidas para el uso de los adyuvantes novedosos en humanos son rigurosas, comparado con las que se aplican para las vacunas veterinarias. Los animales afectivos son diferenciados de los dems. Las reacciones adversas asociadas a los adyuvantes se clasifican en locales y sistmicas. Las reacciones adversas locales incluyen dolor, inflamacin local, necrosis en el sitio de la inyeccin o en zonas adyacentes, linfadenopatas regionales y, en raras ocasiones, la induccin de granulomas y la formacin de abscesos estriles. Las reacciones sistmicas observadas incluyen nuseas, fiebre, artritis por adyuvante y uvetis, anafilaxis, toxicidad especfica de rgano e inmunotoxicidad, como por ejemplo, liberacin de citocinas, inmunosupresin y enfermedades autoinmunes. La evaluacin toxicolgica sistemtica, como la requerida para productos farmacuticos, no es rutinaria en el caso de vacunas que tienen compuestos de aluminio como adyuvante. Aunque el uso de estos compuestos ha sido asociado con algunas reacciones locales, la vasta experiencia con este tipo de adyuvantes en vacunas indica que la observacin del animal posinyeccin y del sitio de inyeccin es generalmente adecuada desde un punto de vista de la seguridad preclnica, sin la necesidad de una toxicologa formal, a menos que exista algn problema especial con el antgeno. A diferencia de los compuestos de aluminio, muchos de los adyuvantes en investigacin deben ser objeto de un estudio toxicolgico ms intensivo. Para algunos adyuvantes, existen datos histricos que constituyen pruebas de seguridad adicionales previas a la evaluacin de la formulacin antgeno-adyuvante en humanos. Como parte de la evaluacin inicial, se deben realizar estudios preclnicos con el adyuvante por separado, como los estudios toxicolgicos de dosis nicas y repetidas, incluida la ruta de inoculacin que se pretende para el uso clnico. Usualmente, se dispone de informacin sobre estudios toxicolgicos con el adyuvante solo, incluso en ms de una especie, realizados por los fabricantes del adyuvante. Adems de los estudios preclnicos realizados con el adyuvante solo, el producto combinado antgeno-adyuvante debe ser caracterizado en un estudio de seguridad que cuente con buenas prcticas de laboratorio y obtenga datos relevantes, como mnimo, para apoyar la iniciacin de los estudios de fase I en humanos. Esta evaluacin debe ser conducida en una especie animal pequea en que el antgeno sea inmunognico, y que pueda ser inmunizada por la misma ruta anticipada para uso en humanos. La dosis o frecuencia de inmunizaciones con el candidato vacunal, debe ser igual o mayor que aquellas que van a ensayo clnico en cuanto a cantidad, y similar en cuanto a frecuencia e intervalos. Lo expuesto anteriormente es un mandato de la Administracin de Alimentos y Frmacos (FDA, por sus siglas en ingls) de los Estados Unidos, con el objetivo de ofrecer la mejor oportunidad para identificar problemas potenciales de seguridad. Los puntos de mayor inters para avalar la seguridad, donde no se incluyen todos los aspectos de rutina de un estudio toxicolgico, se muestran en la Tabla. Hay que destacar que los estudios preclnicos pueden ser usados para seleccionar dosis apropiadas e identificar situaciones donde se deben garantizar con cuidado rangos de dosis para los estudios de fase I. Adems, estos estudios pueden avalar nuevas dosis y esquemas, o detectar situaciones especiales durante el desarrollo del producto. Tabla. Puntos de mayor inters en los anlisis de seguridad preclnica de un adyuvante. Valores de laboratorio Panel de ensayos sricos pre y posvacunacin. Pruebas de funcionamiento heptico y renal, creatina-kinasa y hematologa (conteo completo de clulas de la sangre). La inmunogenicidad se puede determinar para correlacionarla con otros hallazgos, aunque no sea definitoria.

Observaciones Observacin del sitio de la inyeccin anterior y durante tres das despus de cada inyeccin. Observacin del funcionamiento del miembro vacunado durante tres das al menos.

Patologa Evaluacin por cuantificacin de las reacciones inflamatorias. Adems, se debe realizar una necropsia completa con descripcin de los rganos, peso e histopatologa si se considera necesario para un estudio en particular. Considerar los datos disponibles en la literatura.*

Otros Evaluacin especial de ciertos parmetros especficos del producto o clase, por ejemplo, anlisis de induccin de uvetis si fuese aplicable. Los estudios preclnicos pueden ser usados para la seleccin de rangos de dosis o para resolver problemas de desarrollo del producto.

*Si se dispone en la literatura de datos clnicos favorables y de un estudio toxicolgico bien fundamentado con el mismo adyuvante solo o combinado con otros antgenos, y si el antgeno en cuestin no posee ningn riesgo adicional, es menos crtica la necesidad de un estudio toxicolgico preclnico que incluya la necropsia completa antes de la fase I. En el desarrollo clnico inicial del producto, se recomienda la inclusin de grupos controles con el antgeno solo y/o adyuvado con almina. Ya se han evaluado diversos adyuvantes en humanos, tanto en voluntarios sanos como enfermos. Estos adyuvantes se han relacionado con el desarrollo de vacunas, tanto preventivas como teraputicas, contra diferentes enfermedades y microorganismos. Una informacin ms detallada acerca de la toxicidad de los distintos adyuvantes, se puede encontrar ms adelante junto a la descripcin de los tipos de adyuvantes y sus mecanismos de accin. Clasificacin Los adyuvantes inmunolgicos pueden ser clasificados atendiendo a su fuente de origen, mecanismos de accin y propiedades fsicoqumicas. (), los adyuvantes pueden ser separados en tres clases amplias: (i) inmunoestimulantes activos, que son agentes que aumentan la respuesta inmune especfica contra el antgeno; (ii)portadores, que son protenas inmunognicas que proporcionan ayuda de clulas T; y (iii) adyuvantes tipo vehculo, como las emulsiones oleosas y los liposomas, que sirven como matriz para el antgeno y para la inmunoestimulacin. Esta clasificacin tiende a confundir por la propia forma en que se dividen. Tambin se han dividido en adyuvantes mucosales y sistmicos, teniendo en cuenta que las caractersticas fisiolgicas en cuanto a la toma y procesamiento del antgeno para ambas vas de inoculacin generan procederes diferentes de adyuvacin. Otra clasificacin aceptada los divide en: sales de aluminio y otros adyuvantes minerales; agentes tensoactivos; derivados de bacterias; vehculos y materiales de liberacin lenta, y citocinas. Una clasificacin reciente de los adyuvantes considera su separacin en los grupos siguientes: adyuvantes de tipo gel, agentes tensoactivos, productos bacterianos, productos basados en aceites y emulsiones, adyuvantes particulados, protenas de fusin y lipopptidos. De acuerdo con la definicin general de adyuvantes, a esta lista se pudieran adicionar los inmunomoduladores e inmunoestimulantes como las citocinas y otros compuestos naturales que activan el sistema inmune innato y que no estn incluidos en ninguno de los grupos destacados. Limitaciones A pesar del progreso actual en la definicin y comprensin de la naturaleza y mecanismos de accin de los adyuvantes, an existen limitaciones con respecto a su uso. Entre las limitaciones ms frecuentes se encuentran su grado de toxicidad, pirogenicidad, estabilidad, degradacin in vivo y rpida excrecin. Se han encontrado restricciones de tamao, carga e hidrofobicidad en la incorporacin de protenas y pptidos. Adems, se conoce que ocurren modificaciones epitpicas durante la formulacin o conjugacin. En el caso de las protenas transportadoras, una inmunidad preexistente contra ellas es una limitante para su uso repetido y eficiente. An est por demostrar para muchos adyuvantes si estos problemas se pueden superar. Cada adyuvante posee un perfil de respuesta inmunolgica caracterstico. La ineficiencia de los adyuvantes de aluminio para inducir ciertos isotipos y subclases, as como su incapacidad para generar clulasT citotxicas y proveer una buena respuesta inmune contra antgenos polisacardicos u otros antgenos T-independientes, limita su aplicabilidad, especialmente en aquellos casos donde estas caractersticas sean un requisito indispensable para una buena proteccin. Principales tipos de adyuvantes y sus mecanismos de accin De acuerdo con las clasificaciones existentes sobre adyuvantes, a continuacin se expone una descripcin de las caractersticas fsicoqumicas e inmunolgicas de los principales grupos de adyuvantes, y al mismo tiempo se describen sus mecanismos de accin. Adyuvantes de uso sistmico Adyuvantes de tipo gel. () las sales de aluminio principalmente aquellas de fosfato o hidrxido han sido ampliamente utilizadas para inmunizar humanos y animales. Estos compuestos son los nicos adyuvantes de aprobacin general para su uso clnico. Los compuestos basados en aluminio, a pesar de ser considerados seguros, son adyuvantes dbiles y muy poco consistentes en su capacidad de estimular respuestas inmunes mediadas por clulas, especialmente respuestas de clulas T citotxicas. Los primeros estudios acerca del modo de accin de los adyuvantes de aluminio, evidenciaron la formacin de un depsito en el sitio de la inyeccin, donde el antgeno es liberado lentamente. Investigaciones ms recientes sugieren que el antgeno soluble atrapado en el gel permite prolongar el tiempo de interaccin entre l, las clulas presentadoras de antgenos (CPA) y los linfocitos. El mecanismo de adyuvacin tambin abarca la estimulacin de clulas inmunocompetentes a travs de la activacin del complemento, la induccin de eosinofilia en el sitio de inyeccin, la activacin de macrfagos y la toma eficiente de partculas de antgeno por las CPA dada su naturaleza particulada y su tamao inferior a 10mm. Aunque los efectos colaterales son relativamente pocos, se han observado mucho ms granulomas en el sitio de inyeccin por va subcutnea o intradrmica que por la ruta intramuscular. Entre otras limitaciones se encuentran: la generacin de reacciones locales, la produccin de anticuerpos de tipo IgE y la inefectividad para algunos antgenos. Tambin hay reportes de la neurotoxicidad del aluminio y se plantea que pudiera desempear algn papel en la enfermedad de Alzheimer y el sndrome de encefalopata asociado a dilisis. Se conoce, adems, que la almina no es biodegradable y se detecta en el sitio de la inoculacin al ao de haber sido inyectada. En vacunas para uso en humanos, los adyuvantes de aluminio fueron usados inicialmente contra ttanos, difteria, pertusis y poliomielitis. Aunque algunos componentes de Bordetellapertussis pueden ocasionar efectos colaterales, se ha demostrado una reduccin significativa de dichos efectos con la adsorcin a adyuvantes de aluminio. En vacunas veterinarias, estos adyuvantes han sido utilizados ampliamente contra agentes virales y bacterianos, as como en vacunas antiparasitarias. Existen algunas similitudes entre la respuesta inmune estimulacin de IgE y eosinofilia inducida por algunos helmintos y la provocada al inmunizar con adyuvantes de aluminio. Dichas similitudes hacen que estos adyuvantes sean candidatos interesantes para vacunas antiparasitarias. Las sales de otros metales como el calcio, el hierro y el circonio, tambin han sido utilizadas para adsorber antgenos, pero no han tenido el amplio uso de las sales de aluminio. No obstante, el fosfato de calcio ha sido empleado durante dcadas para las vacunas del grupo de difteria-ttanos-pertusis. Aunque tiene propiedades similares a las de los compuestos de aluminio, esta sal presenta varias ventajas potenciales sobre ellos como: es un constituyente normal del cuerpo y, como tal, es bien tolerado; adsorbe eficientemente a los antgenos y permite su liberacin lenta; genera niveles elevados de anticuerpos IgG; y no incrementa la produccin de IgE. En varias pruebas se ha encontrado que el uso de vacunas adyuvadas con calcio es eficiente y seguro contra reacciones adversas a largo plazo que slo pueden ser reconocidas despus de muchos aos. Vale la pena destacar que se han observado reacciones neurolgicas espordicas en el caso de vacunas de pertusis adsorbidas a fosfato de calcio, y que algunos componentes de B.pertussis tienen propiedades inmunomoduladoras que contribuyen al efecto adyuvante de la preparacin vacunal. Agentes tensoactivos. La saponina Quil A extracto acuoso de la corteza de Quillaja saponaria Molina, y fracciones purificadas de sta principalmente QS-21, constituyen alternativas a la almina con potencial para inducir respuestas celulares intensas. Las saponinas son glicsidos tensoactivos que contienen un ncleo hidrofbico de estructura triterpenoide, y cadenas de carbohidratos enlazadas al triterpeno que conforman regiones hidroflicas. Entre las propiedades asociadas a las saponinas de Q. saponaria Molina, se incluyen: un excelente efecto adyuvante para antgenos tanto T-dependientes como T-independientes, y la estimulacin de isotipos asociados a respuestas de clulas T auxiliadoras de tipo 1 (Th1). Esta clase de adyuvantes induce, adems, respuestas de linfocitos T citotxicos (-CTL) CD8+, propiedad asociada usualmente con vectores virales. Las saponinas tambin potencian vacunas administradas por las vas mucosales. La saponina QuilA ha sido empleada en varias vacunas veterinarias. Es un producto heterogneo compuesto por 23 picos diferentes de saponinas detectables por cromatografa lquida de alta presin, que se une al colesterol de la membrana de los eritrocitos y los rompe provocando efectos colaterales indeseables. Estudios clnicos preliminares han demostrado la viabilidad, con un patrn toxicolgico aceptable, de usar la saponina QS-21 en vacunas humanas, como alternativa a los adyuvantes tradicionales de aluminio. Derivados de bacterias. Las estructuras bacterianas constituyen la principal fuente de inmunoadyuvantes. Incluso, se conoce que copias sintticas de bajo peso molecular como el pptidoglicano de la pared celular o el lpido A de bacterias gramnegativas, son capaces de alterar el sistema inmune sin ser ellas mismas inmunognicas. Esto se puede deber a que imitan las estructuras microbianas que proporcionan la seal de peligro para el inicio de las defensas del hospedero. () la base para el efecto adyuvante podra ser el reconocimiento de componentes microbianos definidos por receptores presentes en las clulas accesorias. Este reconocimiento induce a dichas clulas a producir citocinas que determinan la activacin de las subpoblaciones de linfocitos Th1 o Th2. Las estructuras microbianas conservadas tambin pueden inducir la activacin directa de clulas B o macrfagos que expresan una potente actividad coestimulatoria de la expansin clonal de las clulas T CD4+. Entre las bacterias usadas como adyuvantes se incluyen: Mycobacterium spp., Corynebacterium parvum o C. granulosum, y B. pertussis. Lamentablemente, estos microorganismos o sus productos son considerados muy txicos para ser usados como adyuvantes en humanos. Se ha trabajado mucho en la purificacin de los componentes activos de Mycobacterium spp., B.pertussis y C. granulosum. En la actualidad, se presta atencin a la purificacin de los componentes con poder adyuvante presentes en la micobacteria. El poder adyuvante del N-acetilmuramil-l-alanil-d-isoglutamina o el muramildipptido (MDP) el componente con actividad inmunopotenciadora ms estudiado del ACF depende de la forma en que se administre. En solucin salina aumenta principalmente la inmunidad humoral contra un nmero de antgenos naturales y sintticos de bacterias, virus y parsitos, mientras que incorporado a liposomas o mezclado con micolato de glicerol induce inmunidad mediada por clulas. Se ha demostrado que el MDP activa varios tipos celulares (macrfagos, leucocitos polimorfonucleares, mastocitos, plaquetas, clulas endoteliales y fibroblastos, entre otros) e induce la secrecin de una variedad de citocinas, incluidos la interleuquina 1 (IL-1), el factor de crecimiento de clulas B y el factor de activacin de fibroblastos. El MDP provoca, adems, un incremento en la produccin de superxidos, prostaglandinas y colagenasa. Se han obtenido algunos derivados del MDP para retener el poder adyuvante con un mnimo de toxicidad. De ellos, uno de los ms prometedores es el treonil-MDP, un adyuvante potente y apirognico. Los LPS y sus derivados son componentes de la pared celular de bacterias gramnegativas. Sus derivados son compuestos mitognicos para las clulas B, estimulan a las clulas T para que produzcan interfern gamma (IFN-g) y median las respuestas de hipersensibilidad tarda (DTH, segn sus siglas en ingls). La estructura de estos compuestos consiste en un polisacrido hidroflico unido a una porcin hidrofbica de naturaleza lipdica: el lpido A, que es el responsable de la toxicidad y el efecto adyuvante de los LPS. Por hidrlisis del lpido A en condiciones de mediana acidez, se puede obtener el lpido A monofosforilado, compuesto que retiene la actividad adyuvante pero muestra una menor letalidad y pirogenicidad que el lpido A. Otros compuestos derivados de bacterias son los dimicolatos de trehalosa (TDM, por sus siglas en ingls). Procedentes de la pared celular, son insolubles en agua, de naturaleza anfiptica, y capaces de potenciar la actividad presentadora de antgenos por mediacin de respuestas DTH, y un incremento en los ttulos de anticuerpos especficos contra el antgeno coinoculado. (), se demostr el efecto adyuvante del ADN micobacteriano compuesto presente en el lisado de micobacterias mezclado con aceite de parafina que Freund ensay hace 60 aos. Se demostr que la actividad adyuvante estaba relacionada a la existencia de motivos CpG en el ADN presente en las bacterias. Este efecto inmunoestimulatorio slo era desarrollado por el ADN bacteriano y no por el de vertebrados, hecho que se relacion con la baja metilacin de aqul. En los ltimos aos, se ha incrementado la cantidad de datos referidos al efecto inmunoestimulatorio del ADN bacteriano y de los oligodesoxinucletidos que contienen dichas secuencias inmunoestimuladoras. Ambos han demostrado que pueden inducir la proliferacin de clulas B y la produccin de inmunoglobulinas. Adems, estimulan la secrecin de IL-6, IFN-g, IL-12 e IL-18, que a su vez induce la produccin de IFN-g por las clulas asesinas profesionales (NK, por sus siglas en ingls). Se ha reportado que los oligodesoxinucletidos sintticos que contienen motivos CpG en los que se ha introducido un tomo de azufre en el enlace fosfodister, muestran una actividad inmunoestimulatoria mucho mayor que los naturales. Vehculos y materiales de liberacin lenta. Emulsiones Se encuentran en esta categora las emulsiones de aceite como el AIF, Montanide, Adyuvante 65 y Lipovant. El mecanismo de accin del AIF se atribuye a la formacin de un depsito en el sitio de inyeccin que posibilita la liberacin lenta del antgeno, con lo que se estimulan las clulas productoras de anticuerpos. Este adyuvante no se emplea actualmente en humanos debido a que ocasiona reacciones locales colaterales como la formacin de granulomas e inflamacin local. Se han evaluado varios tipos de emulsiones con diferentes tipos de aceite, con el propsito de encontrar un adyuvante mejor, estable y no txico. Una alternativa es el Adyuvante 65, que, a diferencia del aceite mineral del ACF y el AIF, tiene un componente aceitoso que es metabolizado por el organismo y ha demostrado ser seguro y potente en humanos. Tambin se han probado emulsiones diferentes como aceite en agua y agua en aceite. Esta ltima es tan potente como el AIF, menos viscosa, ms estable, fcil de administrar, y produce menos ndulos en el sitio de inyeccin. La familia de adyuvantes oleosos conocida como Montanide, ha probado ser potente en numerosas vacunas experimentales en ratones, ratas, gatos, perros y cerdos, tanto con pptidos sintticos como con antgenos virales. Se han conducido algunos estudios preliminares con Montanide ISA 720, con la finalidad de disear vacunas en humanos contra el VIH y la malaria. Liposomas Los liposomas son glbulos sintticos formados por capas de lpidos que encapsulan las sustancias teraputicas, y constituyen uno de los vehculos ms utilizados para las investigaciones en vacunas. Ya se ha descrito su uso en formulaciones vacunales complejas como vehculo de otros adyuvantes e inmunomoduladores (vea los subacpites Formulaciones adyuvantes, Derivados de bacterias y Sistemas sintticos o inactivados de envo de antgenos). Su adyuvanticidad depende del nmero de capas, la carga, la composicin y el mtodo de preparacin. Su uso potencia tanto la inmunidad humoral como la mediada por clulas para antgenos de naturaleza proteca y polisacardica. El tiempo de vida medio de los antgenos incorporados en liposomas en la sangre es notablemente prolongado, lo que asegura una mayor exposicin de antgeno a las CPA luego de su inyeccin. Microesferas copolimricas Entre la multitud de sistemas particulados y polimricos que se han desarrollado, el de las microesferas copolimricas de cido lctico y gliclico (DL-PLG) es uno de los que ms se destaca. Estas microesferas son partculas biocompatibles y biodegradables capaces de incorporar en su seno diferentes antgenos, entre ellos protenas. Con el empleo de por cientos adecuados de sus componentes, es posible controlar el tiempo de liberacin de los antgenos atrapados. Su uso abarca tanto rutas sistmicas como mucosales. Citocinas. Como regla general, en las clasificaciones ms recientes de adyuvantes se incluyen las citocinas. El IFN-g es una citocina pleiotrpica que puede potenciar respuestas inmunes mediadas por clulas T a travs de la regulacin positiva de la expresin de los determinantes del complejo principal de histocompatibilidad (MHC, por sus siglas en ingls). Esta citocina incrementa la liberacin de IL-1 y la expresin del MHC clase II en la superficie de las CPA, propiedades que pueden explicar su actividad adyuvante. El factor estimulante de la formacin de colonias de granulocitos y macrfagos (GM-CSF, por sus siglas en ingls), potencia respuestas inmunes primarias mediante la activacin o reclutamiento de CPA profesionales. Sin embargo, la aplicacin prctica de las citocinas como adyuvantes presenta varias dificultades, ya que es posible que se requieran mltiples dosis, y si se usa una citocina de una especie diferente, sta puede ser inmunognica en la especie "blanco". Carbohidratos como adyuvantes. Muchos carbohidratos complejos de origen natural estimulan las clulas de los sistemas inmune y reticuloendotelial. Entre ellos se encuentran los polmeros de plantas y hongos como los glucanos, las dextranas y los lentinanos todos ellos polmeros de glucosa, y los mananos, entre los que se encuentran los glucomananos y los galactomananos. Los levanos y los xilanos tambin han evidenciado actividad potenciadora. La actividad de muchos de estos poliglicanos sobre los macrfagos que tienen receptores de glucanos y mananos, incluye la induccin de fagocitosis y la secrecin de citocinas, leucotrienos y prostaglandinas. El lentinano, glucano comn de las setas, estimula la respuesta celular y de anticuerpos contra eritrocitos de carnero, aumenta la resistencia del husped a varios tipos de infecciones bacterianas, virales y parasticas, y ha restaurado la disfuncin inmunolgica en pacientes con neoplasias. Distintas pruebas invitro indican que los mananos activan los monocitos y los macrfagos, con lo que inducen la produccin de IFN-g, factor de necrosis tumoral-a, factor estimulante de la formacin de colonias de monocitos y granulocitos, IL-1b e IL-6. El acemanano es un polisacrido compuesto mayoritariamente por manosas con O-acetilaciones en aproximadamente 8 de cada 10 residuos. Se extrae como componente mayoritario de la sustancia mucilaginosa o gel de la hoja de Aloe barbadensis Miller, planta medicinal usada desde la antigedad. Este polisacrido potencia la generacin de linfocitos CTL, la actividad citotxica de clulas NK y tambin, modestamente, la alorrespuesta humana invitro. Recientemente, se ha demostrado la actividad adyuvante del acemanano sobre el antgeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) por va mucosal, al generarse no slo niveles de anticuerpos en suero de similar intensidad que los obtenidos con almina como adyuvante, sino con la induccin de adems respuestas intensas de IgA secretoria en mucosas adyacentes y remotas, lo cual no ocurre en las vacunas inoculadas por va parenteral. Estos resultados, as como la reconocida inocuidad del acemanano, avalan al ensayo clnico de una formulacin nasal del HBsAg mezclado con el acemanano por va intranasal, (). Formulaciones adyuvantes. Las formulaciones adyuvantes han surgido como resultado del desarrollo en el conocimiento de los mecanismos de accin de estos compuestos. En ellas se combinan varios adyuvantes que, por lo general, poseen diferentes mecanismos de accin, con el propsito de aumentar la potencia y la calidad de la respuesta inmune contra los antgenos de inters. Entre las formulaciones adyuvantes que tienen como base los compuestos de aluminio, Cooper y colaboradores han combinado el hidrxido de aluminio con g-inulina polisacrido procedente de algas en un nuevo adyuvante denominado algamulina. Diversos antgenos comerciales han sido potenciados por la algamulina, entre los que se encuentran los toxoides diftrico y tetnico, el virus sincitial respiratorio, la protena E7 del papilomavirus humano, la glicoprotenaD del virus herpes tipo 2, el HBsAg, el virus completo de la influenza, Haemophilusinfluenzae, el conjugado peptdico del antgeno 2 de superficie de merozotos de Plasmodiumfalciparum, el extracto de esperma de ratn (vacuna anticonceptiva), y membranas de micoplasma porcino. Las saponinas tambin han sido utilizadas como parte de formulaciones adyuvantes en los complejos inmunoestimulantes (ISCOM, por sus siglas en ingls), y se ha demostrado la eficacia de combinaciones de aqullas con microesferas, liposomas e hidrxido de aluminio. Los ISCOM son partculas relativamente estables de 30-40nm de dimetro y estructura dodecahdrica, compuestos por Quil A, lpidos y antgenos anfipticos. Se disearon para combinar la presentacin fsica ptima, desde el punto de vista inmunognico, de los antgenos en una forma multimrica particulada submicroscpica con un adyuvante incorporado. Una amplia variedad de protenas de parsitos, bacterias y virus han sido formuladas en ISCOM. Tambin se han unido protenas no anfipticas y pptidos mediante enlaces covalentes, lo que ha generado una respuesta intensa de anticuerpos contra estos antgenos que son poco inmunognicos en solucin. Estas estructuras han posibilitado una presentacin ptima del antgeno con retencin de la actividad adyuvante y una disminucin de los efectos colaterales de Quil A. Los ISCOM han sido utilizados en modelos animales y han inducido inmunidad, tanto sistmica como local, cuando se administran por las vas oral, respiratoria y vaginal. En todos los casos evaluados, los antgenos formulados en ISCOM muestran un incremento en la respuesta de anticuerpos y en la respuesta mediada por clulas, en comparacin con los antgenos no incorporados. En experimentos de reto antignico, las inmunizaciones con ISCOM han protegido varias especies contra numerosos virus envueltos, incluidos los retrovirus, las bacterias y los parsitos. Se ha reportado que los ISCOM modulan la expresin de molculas del MHC clase II y podran actuar induciendo la liberacin de IFN-g. Tambin se ha establecido que son capaces de estimular las clulas T CD8+ restringidas a molculas del MHC clase I. Otro ejemplo de formulacin es el ACF, mezcla de agua, aceite y micobacterias muertas capaz de generar uno de los mayores efectos inmunopotenciadores. Sin embargo, su uso est restringido al trabajo de laboratorio por su toxicidad. Se ha demostrado que las formulaciones de vehculos como los liposomas, a los que se les adiciona o incorpora los MDP o monofosforil lpido A (MPL, segn las siglas en ingls), pueden incrementar la respuesta inmune especfica, tanto por vas mucosales como parenterales. Adyuvantes mucosales El desarrollo de los adyuvantes para uso mucosal constituye actualmente una necesidad en el campo de las vacunas. El progreso en el conocimiento de la fisiologa de las mucosas y del modo de accin de los adyuvantes, puede ayudar en el desarrollo de vacunas mucosales ms efectivas. Aunque los adyuvantes mucosales se pueden clasificar dentro de los grupos anteriormente expuestos, en nuestra opinin merecen ser considerados de forma independiente. La actividad inmunopotenciadora del adyuvante o sistema de envo de antgenos a mucosas, debe tener en cuenta, en primer lugar, la penetracin de los antgenos por esa va y posteriormente, la potenciacin de la inmunogenicidad de los antgenos por diferentes mecanismos que pudieran ser similares o no a los sistmicos. Se han obtenido resultados diferentes cuando se usa un mismo adyuvante, tanto por va sistmica como mucosal. La almina adyuvante sistmico ms universalmente utilizado no ha sido efectivo por va oral y nasal con antgenos que tradicionalmente son inyectados con este adyuvante, como el toxoide tetnico. Es bueno destacar que el antgeno per se puede poseer caractersticas que lo hagan "penetrante", como es el caso de determinados antgenos particulados y de otros que, aunque no lo sean, tengan la capacidad de adherirse a receptores especficos, o de establecer otro tipo de interaccin con clulas o componentes mucosales. Estas caractersticas conducen a una correcta asimilacin del antgeno por vas que favorecen las respuestas mucosal y sistmica. Se ha demostrado que las mucosas son puertas de entrada muy eficaces para ciertos patgenos. Aunque es muy difcil lograr una inmunidad de mucosa efectiva a partir de la inmunizacin sistmica, por la va mucosal se logra inmunidad de mucosas y sistmica. Tambin se ha demostrado que para los patgenos que permanecen en las superficies mucosales o tienen en ellas una puerta de entrada, la proteccin se relaciona mejor con una respuesta local fuerte. La estrategia de adyuvacin por la va mucosal, de acuerdo con las caractersticas del antgeno, exige procedimientos de unin o recubrimiento con ligandos especficos que enven el antgeno a clulas especializadas del epitelio mucosal simple (clulas M). Adems, para que el antgeno pueda cruzar las barreras que la ruta impone, se manipulan caractersticas propias del antgeno como tamao, presencia de ligandos mucosales, carga elctrica y lipofilicidad, as como el uso de sistemas de envo de antgenos que favorezcan dichas caractersticas. Una vez asimilado el antgeno, el adyuvante puede favorecer la respuesta por cualquiera de los mecanismos conocidos: adsorcin del antgeno, efecto de depsito, induccin de citocinas, activacin del sistema del complemento, reclutamiento de distintas poblaciones de clulas del sistema inmunolgico, envo del antgeno a diferentes clulas presentadoras de antgenos, regulacin de la expresin va MHC clase I o clase II, y estimulacin de la produccin de diferentes subclases de anticuerpos, en dependencia de la estrategia de adyuvacin utilizada. Derivados de bacterias. Algunos de los inmunoestimulantes conocidos, como el MDP, el MPL, la amina lipoidal Avridina y las conocidas toxinas de Vibrio cholerae (CT) y de Escherichiacoli (HLT), son adyuvantes reconocidos para antgenos administrados por va de mucosas. Aunque el MDP y el MPL han sido evaluados en formulaciones liposomales con fines teraputicos y profilcticos, las toxinas o sus subunidades (en especial CT y CTB), son los adyuvantes mucosales ms estudiados. La capacidad de CT de actuar como adyuvante oral ha sido confirmada por un gran nmero de investigadores. La toxina del clera no cumple con la definicin clsica de un adyuvante porque estimula una respuesta inmune contra ella misma y su actividad adyuvante es dependiente de su inmunogenicidad. Los efectos de CT y HLT que explican su fuerte actividad adyuvante, incluyen el incremento de la presentacin de antgenos por varios tipos de clulas B, el incremento en la diferenciacin de clulas B a clulas secretoras de IgA, la interaccin con clulas T y la produccin de citocinas. Desde el punto de vista prctico, el uso de la holotoxina en humanos no es factible debido a su toxicidad. Una estrategia acertada es la destoxificacin de CT por escisin de la subunidad A o por mutacin del gen que la codifica. Tanto CT como CTB subunidad no txica pueden potenciar la respuesta inmune contra varios antgenos acoplados covalentemente, debido a las interacciones especficas que se establecen con las clulas M. Sistemas de envo de antgenos a mucosas. Los sistemas de envo de antgenos, del ingls antigen delivery systems, han alcanzado un nivel de desarrollo suficiente que avala su introduccin en la prctica de la inmunizacin. Se espera que los sistemas particulados slidos, tanto para administracin parenteral como no parenteral, se encuentren dentro de los primeros productos a licenciar. Por las posibilidades que brindan los sistemas de envo de antgenos en la particulacin de antgenos solubles, y aprovechando las caractersticas fisiolgicas de la va mucosal, estos sistemas han sido ensayados y han mostrado actividad adyuvante. En la literatura se han clasificado como: a) sintticos o inactivados, y b) vivos. Sistemas sintticos o inactivados de envo de antgenos Se han obtenido diferentes resultados a partir del estudio de las partculas polimricas artificiales. Estas partculas comprenden las microesferas DL-PLG, los polmeros alternativos como polifosfacenos, los polmeros de acetato de celulosa, los iminocarbonatos, los polmeros de etilenvinilacetatos, las microesferas proteinoides, los polianhdridos y las nanosferas de dextranas, las partculas producidas a partir de materiales naturales (alginatos, gelatina y semillas de plantas), y los liposomas y sus variantes (proteoliposomas, virosomas e ISCOM). El tamao de las partculas es uno de los factores importantes para el envo de antgenos. Para el caso de la va mucosal de inmunizacin, se ha informado que las partculas de dimetro mayor de 10mm no son absorbidas. En experimentos en ratas se ha observado, luego de la administracin oral, que slo las partculas de 5mm penetran profundo en las placas de Peyer y las de 1mm penetran a los linfonodos y al hgado, y pasan a la circulacin sangunea. La extrapolacin de estos resultados a humanos an no est definida y a veces la absorcin por el tracto gastrointestinal no es un requisito del poder adyuvante. Aunque se ha comprobado que se potencie la respuesta inmune con la adsorcin del toxoide diftrico en semillas de plantas de hasta 2mm de dimetro, la determinacin de la talla ptima de los sistemas de liberacin controlada para va nasal, rectal o vaginal es motivo de investigacin en la actualidad. Otro factor que afecta las partculas es el balance hidrofobicidad-hidrofilicidad, que puede ser modificado para obtener una modulacin de la respuesta inmune. Los cocleatos proteicos son complejos de liposomas y cationes divalentes fundamentalmente calcio que, mediante la interaccin calcio-fosfolpido, posibilitan la formacin de una estructura de liposoma enrollado sobre s mismo, lo que permite la inmunizacin por diferentes vas. Con esta estructura se estimula tanto la respuesta inmune de anticuerpos como la respuesta mediada por clulas. Los liposomas y las micropartculas pueden adherirse a superficies mucosales por interacciones hidrofbicas, pero la entrada de los antgenos a las clulas M es muy poco eficiente debido a que son rpidamente atrapados en los geles mucosales y muchos no llegan a alcanzar la mucosa. Las macromolculas o partculas que se conjugan o recubren con ligandos como CTB, tienen como factor limitante la accesibilidad a los receptores. El uso de ligandos unidos a partculas puede resultar en una adherencia especfica a las clulasM, pero slo dentro de un rango de tallas restringido por el glicocliz. Las partculas de 1mm o mayores requieren ligandos dirigidos especficamente a componentes de las clulas M, aunque la identificacin de estos componentes an se encuentra en investigacin. Sistemas vivos de envo de antgenos En este grupo se puede apreciar bien que el concepto de adyuvante no se restringe a compuestos, sino que tambin incluye las estrategias encaminadas a desarrollar una respuesta inmune aunque no implique la adicin de alguna sustancia. Un grupo de bacterias patgenas es capaz de superar las dificultades de los sistemas no vivos al ser asimiladas eficientemente por receptores a nivel de las clulas M. Estas bacterias utilizan este mecanismo para infectar los tejidos mucosales y diseminarse sistmicamente antes de ser detenidas por el sistema inmune. Los patgenos bacterianos que se adhieren a la superficie de las clulas M, inician eventos de transduccin de seales a nivel epitelial que promueven su internalizacin. Teniendo en cuenta esta propiedad, se han obtenido cepas atenuadas de Salmonellatyphi ty21a para la cual se ha descrito una interaccin de tipo lectina con receptores de naturaleza polisacardica de la membrana citoplasmtica de las clulas M. Tambin son consideradas seguras y efectivas las cepas vivas atenuadas de V.cholerae y poliovirus para la inmunizacin oral. Las cepas manipuladas genticamente de estos microorganismos, comienzan a ser usadas en humanos como portadoras de antgenos heterlogos. La biologa de estos vectores vivos introduce nuevos retos. Las cepas vacunales de V.cholerae que no poseen los genes de la toxina an pueden causar diarreas, al parecer porque las clulas epiteliales liberan citocinas en respuesta a la adherencia bacteriana. La estrategia en el uso de las cepas manipuladas genticamente de S.typhi y S.typhimurium, consiste en lograr una atenuacin suficiente que brinde seguridad a la vez que conserve la adherencia a las clulas M y la proliferacin en mucosas para mantener su inmunogenicidad. Las cepas atenuadas de Shigella tambin son internalizadas por las clulasM, pero no son capaces de diseminarse de una clula a la otra. Este fenmeno es la base de la atenuacin, pero an hay una liberacin local de citocinas y factores quimiotcticos que puede producir la prdida de la funcin normal de la barrera epitelial. Los virus se encuentran tambin en estudio. El hecho de que el poliovirus tipo 1 y la cepa atenuada de Sabin utilicen el transporte a travs de las clulas M para cruzar la barrera epitelial, los convierte en candidatos importantes de vacunacin oral para el envo de antgenos forneos en humanos. El virus vaccinia y otros poxvirus son asimilados por las superficies mucosales, pero su interaccin con las clulas M no ha sido documentada. Nuevas tendencias en el desarrollo de adyuvantes Adyuvantes para la inmunizacin con ADN A principios de la dcada de 1990, se pens que las vacunas basadas en ADN desnudo, como su nombre lo indica, no tendran ningn componente adyuvante ni ninguna estrategia de adyuvacin. Esta creencia se generaliz teniendo en cuenta los resultados iniciales que demostraron que es posible generar respuestas inmunes potentes cuando determinadas protenas codificadas por vectores plasmdicos eran inoculadas en distintos modelos animales. El aumento del nmero de antgenos evaluados con esta tecnologa, permiti comprobar que no todos los antgenos tienen el mismo comportamiento y que compuestos que se usan rutinariamente en ensayos en modelos murinos como los agentes necrosantes, no pueden ser extrapolados a humanos por motivos obvios de reactogenicidad. En la actualidad, existe un nmero creciente de reportes en los que se utilizan nuevos elementos o estrategias para inmunopotenciar los candidatos vacunales basados en ADN. Coinoculacin de plsmidos que codifican inmunopotenciadores. Aunque los mecanismos involucrados en la induccin y el mantenimiento de la respuesta inmune an no estn claros, se ha utilizado con xito la estrategia de coinocular plsmidos que codifican citocinas y factores coestimuladores, con el objetivo de potenciar la respuesta inmune generada por el plsmido vacunal. Recientemente, se ha reportado que la inoculacin, en un mismo adenovirus, de genes que codifican el HBsAg y el factor coestimulador B7-1, induce una respuesta citotxica especfica mayor contra el antgeno viral con respecto a la generada por el gen de este antgeno solo. Tambin se ha demostrado que la coinoculacin del plsmido de expresin de B7-2 junto al ADN vacunal del VIH-1, incrementa la respuesta celular especfica contra el virus, comparado con la inoculacin del ADN del VIH-1 solo. Adems, se encontr que esta potenciacin de la inmunidad celular por B7-2 es dependiente de IFN-g. Otros autores han obtenido resultados similares que demuestran la potenciacin de la respuesta citotxica de linfocitos CD8+ restringidos al MHC clase I. Actualmente, se conoce que los miocitos, a pesar de expresar pobremente las molculas del MHC, tienen la capacidad de presentar antgenos asociados al MHC clase I. Con el uso de plsmidos que codifican las molculas coestimuladoras B7-1 y B7-2, se puede expresar una fuerte seal coestimuladora en los miocitos que no se puede generar de otro modo, y que induce niveles mayores de proliferacin y activacin de clulas T especficas para el antgeno introducido. ADYUVANTES INMUNOLGICOSSe ha precisado (MORRIS et al., 1999) que: Las sustancias inmunomoduladoras constituyen una familia muy heterognea si se toman en consideracin su origen, naturaleza qumica y actividad biolgica especfca. Dentro de ellas ocupan un lugar muy importante los agentes inmunopotenciadores, a los cuales se les atribuyen 2 funciones fundamentales: la estimulacin de la resistencia no especfica del husped contra las enfermedades infecciosas y el cncer; y, por otra parte, la potenciacin de la inmunogenicidad de las vacunas comerciales y de la respuesta de los animales de laboratorio durante la inmunizacin experimental con vistas a la produccin de antisueros. Los avances experimentados en la ltima dcada en la sntesis de pptidos, la secuenciacin de nucletidos y la ingeniera gentica han posibilitado el desarrollo de las denominadas "vacunas de nueva generacin"; sin embargo, la utilizacin exitosa de estas nuevas tecnologas requiere de un esfuerzo investigativo sostenido para hallar sustancias con actividad inmunopotenciadora (adyuvantes), eficaces en la estimulacin de la respuesta inmune y desprovistas de propiedades biolgicas adversas. Los adyuvantes son sustancias o preparados qumicos que, incorporados al antgeno o inyectados simultneamente con l, hacen ms efectiva la respuesta inmune.Con su empleo se logra una economa de antgeno y de tiempo, as como un mayor nivel de anticuerpos especficos.El mecanismo de accin de estas sustancias ha sido objeto de numerosos estudios y, al parecer, existen diversos factores que explican su modo de accin. El antgeno libre normalmente difunde con mucha rapidez desde los tejidos locales que rodean el sitio de inoculacin, y una de sus funciones importantes es crear un reservorio o depsito del antgeno de larga vida. Las investigaciones realizadas han demostrado que virtualmente todos los adyuvantes activan o estimulan los macrfagos; stos cuando son activados estimulan la respuesta inmune por un incremento de la cantidad de antgeno expresado en la membrana celular y de la eficiencia de su presentacin a los linfocitos. El macrfago tambin libera factores solubles estimulantes, que amplifican la proliferacin de los linfocitos. Por otro lado, algunos adyuvantes poseen la capacidad de actuar especficamente sobre los linfocitos; pero, en general, stas funcionan mejor si facilitan la liberacin simultnea del antgeno y de sustancias inmunomoduladoras al tejido linfoide.En el nivel internacional, la lista de productos naturales y derivados de la sntesis qumica, con propiedades adyuvantes/inmunopotenciadoras, es cada vez mayor; sin embargo, slo un reducido nmero se utiliza en la formulacin de vacunas veterinarias y humanas, existiendo una tendencia relacionada con la evaluacin de nuevas sustancias con esta finalidad. En funcin del campo de aplicacin y de la relacin eficiencia/seguridad se pueden reconocer diferentes categoras de adyuvantes, que sern examinadas a continuacin con ms detenimiento.

SELECCIN DE UN ADYUVANTE CON FINES INVESTIGATIVOSCon fines investigativos, las exigencias ms importantes se relacionan con una elevada eficacia, un amplio espectro de aplicacin, una fcil manipulacin y, por supuesto, la disponibilidad comercial.El adyuvante completo de Freud (FCA) ha sido utilizado durante ms de 50 aos en la produccin de antisueros en animales y es empleado con frecuencia cuando se dispone de cantidades limitadas de antgenos o cuando presentan una baja inmunogenicidad. La gravedad de su toxicidad fue reconocida inmediatamente, pero los esfuerzos por encontrar opciones igualmente efectivas y menos txicas no han resultado del todo exitosos. Con los avances alcanzados en numerosas reas de las ciencias biolgicas y el creciente inters por el bienestar de los animales de experimentacin, existe una considerable presin para restringir el uso del FCA, y aunque no se cuenta en la actualidad con alternativas definitorias para este adyuvante, en diferentes estudios comparativos se informan resultados estimulantes en cuanto a eficiencia, menor nmero de efectos adversos y mayor facilidad en la manipulacin.En la investigacin pueden utilizarse, adems, los compuestos de aluminio, la formulacin "Syntex-1" (SAF-1) que contiene el treonil anlogo del dipptido murmico, polmeros no inicos en bloque (NBP), saponinas, bromuro de dimetil dioctadecil amonio (DDA), lipopptidos, etc.

SELECCIN DE UN ADYUVANTE EN EL CAMPO DE LA SALUD VETERINARIAEn este campo, la eficacia es un elemento de gran importancia y se toleran ciertos niveles de efectos colaterales. Los adyuvantes ms ampliamente utilizados en las vacunas veterinarias son las emulsiones de aceite mineral (del tipo aceite en agua o agua en aceite) y los adsorbentes (hidrxido y fosfato de aluminio). En algunos casos, se emplean liposomas, saponinas, vitamina E, complejos inmunoestimulantes (ISCOMs), as como diferentes emulsiones de aceites de origen vegetal o animal. Las emulsiones de aceite mineral, especialmente las del tipo agua en aceite, si bien inducen una fuerte respuesta inmune, pueden provocar riesgos y efectos no deseados, a causa posiblemente de su limitada biodegradabilidad y biocompatibilidad.Por tal razn, se han realizado numerosos intentos para desarrollar adyuvantes eficaces y a la vez seguros. Ejemplo de ello es la formulacin compuesta por sulfolipopolisacridos sintticos, con caractersticas hidrofbicas, incorporados a una emulsin de escualeno en agua, desarrollada por la compaa belga Solvay SA. Este adyuvante ha sido validado exitosamente en animales de laboratorio con antgenos proteicos y virales, y resulta, al menos, tan efectivo como los adyuvantes basados en aceite mineral, empleados hoy da en diversas vacunas veterinarias.

ADYUVANTES PARA VACUNAS HUMANASEl criterio ms importante, sin lugar a dudas, para la seleccin de un adyuvante destinado a vacunas humanas es la bioseguridad y, en la prctica, los compuestos de aluminio son los nicos adyuvantes licenciados para uso humano.El hidrxido de aluminio tiene un punto isoelctrico de 11,1 y, por tanto, est cargado positivamente en las condiciones biolgicas, por lo que puede adsorber protenas cargadas negativamente y adsorber dbilmente las protenas bsicas. El grado de adsorcin depende de la naturaleza y concentracin del antgeno, de la presencia de sales e iones bufferantes y del pH de la mezcla resultante. Las fuerzas de atraccin electrostticas y las interacciones hidrofbicas son las responsables de la adsorcin de los antgenos a los adyuvantes que contienen aluminio, pero probablemente las fuerzas de Van der Waals y los enlaces de hidrgenos tambin contribuyan a la adsorcin en estos sistemas; sin embargo, se ha sealado que el alumbre puede inducir anticuerpos de la clase IgE, as como reacciones alrgicas. Segn las regulaciones de la FDA, son permisibles cantidades no mayores de 0,85 mg de aluminio por dosis de vacuna.Las nuevas vacunas recombinantes y sintticas poseen una baja inmunogenicidad en comparacin con las vacunas tradicionales, consistentes en los microorganismos intactos, atenuados o inactivados por el calor; de ah el inters por la bsqueda de diferentes inmunoadyuvantes para incrementar la efectividad de estas nuevas vacunas para uso humano. En este sentido, Tamura y otros, notifican en estudios realizados en ratones, la utilidad de 2 derivados del dipptido murmico como adyuvantes para la vacuna recombinante de la hepatitis B, primera de esta categora en ser licenciada para uso en humanos y disponible comercialmente en forma adsorbida al alumbre. La respuesta de anticuerpos obtenida con los derivados del MDP result similar a la inducida por la vacuna adsorbida en alumbre y se discute, por los autores, el posible papel de estos compuestos como su sustituto.

SAPONINASLos vegetales que contienen saponinas (Evans, 1989), hetersidos llamados saponinas (del latn sapo, jabn), se han utilizado profusamente en muchas partes del mundo por sus propiedades detergentes.Saponina es una sustancia capaz de formar espuma al ser agitada con agua o disuelta en alcohol. Las contienen plantas muy diversas (Evans, 1989), entre ellas la acacia, la saponaria o jabonera, el castao de indias y muchas otras. Las saponinas se han utilizado mucho, y an se utilizan en ocasiones, como agentes limpiadores de la contaminacin producida por vertidos txicos. Algunas presentan propiedades hipocolesterolmicas.Existen unas 6 familias de plantas que presentan grandes cantidades de saponinas, una de stas es Sapindaceas con la especie Sapindus saponaria. Las saponinas son glicsidos resultante de la unin de la sapogenina (aglicn) con uno o ms azcares. Las Saponinas aisladas (Tsuzuki et al., 2007) de Sapindus saponaria son las L-Hederina (sapindussaponinas): two pure triterpene acetylated saponins: 3-O-(4-acetyl--D-xylopyranosyl)-(13)--Lrhamnopyranosyl-(12)--L-arabinopyranosyl-hederagenin (1) and 3-O-(3,4-di-acetyl--D-xylopyranosyl)-(13)--L-rhamnopyranosyl-(12)-- L-arabynopyranosyl-hederagenin (2), la sapogenina es la L-Hederagenina y los azcares: rhamnosa y arabinosa.

En nuestro pas, tenemos la especie Sapindus saponaria L. (choloque o boliche), de la que desde pocas precolombinas (Almenara, 1984) se ha utilizado el pericarpio del fruto maduro por su alto contenido de saponinas. Motivo por el cual los seis ltimos aos se ha trabajado en nuestros laboratorios con la cscara del fruto maduro, para desarrollar una tecnologa de obtencin de un extracto concentrado de saponinas. Ahora es necesario encontrar aplicaciones cientfico-tecnolgicas que a futuro demanden la produccin industrial y la industrializacin del producto.Se ha reportado (Bonnin y Llorens, 2011) que del Castao de indias (Aesculus hippocastanum L.), se usan las hojas y la corteza porque contienen escina, mezcla de saponinas triterpnicas, que le confieren propiedades como venotnico y vitamnico P. En forma de cpsulas en mezcla con extractos de otras plantas se usa en la terapia de la lipoesclerosis.En Colombia estn formulando productos cosmticos que incluyen extracto de saponinas de Ruscus (Pizano, 2009) para estimular el metabolismo celular, la multiplicacin celular y micro circulacin cutnea.Investigadores del Centro de Investigaciones de Energa Solar en Santiago de Cuba (Morris et al., 1999), destacan las amplias posibilidades que ofrecen los productos naturales, especialmente polisacridos de diversas fuentes, en la tamizacin de sustancias con propiedades inmunoestimulantes y reportan que las saponinas estn siendo utilizadas como adyuvantes inmunolgicos en el campo de la salud veterinaria.En ciudad de La Habana, Cuba; luego de una evaluacin cientfica de plantas medicinales con accin antileishmanial, se ha reportado (Monzote, n.d.) que la saponina hederacolchisida A, purificada de Hedera colchica, ha mostrado una potente actividad in vitro frente a promastigotes (IC50=1.2 M) y amastigotes (IC50=0.053 M) de L. infantum. Otras dos saponinas purificadas de Hedera helix, y -Hederina; tambin han mostrado una actividad significativa contra esta misma especie de Leishmania, mostrando una inhibicin media del crecimiento menor de 14 M frente a promastigotes y menor de 0.4 M frente a amastigotes. Yuccasaponina MC3, saponina purificada de Yucca filamentosa 5 g/mL, ha mostrado un 100% de inhibicin del crecimiento de promastigotes de Leishmania mexicana amazonensis. Experimentos llevados a cabo por citometra de flujo, revelan que estos compuestos actan sobre el parsito mediante una unin inespecfica con la membrana que provoca la muerte celular. Segn datos anteriores, las saponinas interactan con el ergosterol presente en las membranas, induciendo prdida de su integridad o alteracin en la porcin hidrocarbonada cargada negativamente.En la Pontificia Universidad Catlica de Chile, en 2002 se anunci (Rosso, 2002) la creacin de una industria para la extraccin y comercializacin de saponinas, que en la actualidad muestra interesantes perspectivas de desarrollo por su aplicacin en el proceso de refinacin del cobre.La oferta de productos para la firma del Tratado de Libre Comercio (TLC Per EEUU); entre tantos otros productos naturales, incluye saponinas. As tambin, en la Lista Arancelaria de Colombia para el TPD (Colombia-USA), estn las saponinas.En el marco de la investigacin inmunolgica actual y con la finalidad de proponer como fuente de sustancias con propiedades inmunoestimulantes a Sapindus saponaria L. Choloque es necesario explicar cientficamente el mecanismo de la actividad de las saponinas de esta especie vegetal. Los resultados permitirn un mejor enfoque cientfico, tecnolgico y ecolgico de promocin de su cultivo.Adyuvante es una sustancia distinta de un antgeno que potencia la activacin de los linfocitos T al favorecer la acumulacin y activacin de otros leucocitos (Abbas et al., 2004), denominados clulas accesorias, en el lugar de exposicin al antgeno. En las clulas accesorias, los adyuvantes aumentan la expresin de coestimulantes y citocinas que activan a los linfocitos T y pueden prolongar tambin la expresin de complejos pptido-CPH en la superficie de las CPA.En el marco de la investigacin inmunolgica actual y con la finalidad de proponer como fuente de sustancias con propiedades inmunoestimulantes a Sapindus saponaria L. Choloque es necesario explicar cientficamente el mecanismo de la actividad de las saponinas de esta especie vegetal. Los resultados permitirn un mejor enfoque cientfico, tecnolgico y ecolgico de promocin de su cultivo.En tal perspectiva se plante el problema Cul es el efecto adyuvante de las saponinas de Sapindus saponaria L. para antgenos de Leishmania braziliensis en msculo estriado de Rattus rattus var albinus?La hiptesis de trabajo fue: Las saponinas de Sapindus saponaria L. actuando como adyuvantes en el msculo estriado de Rattus rattus var albinus, favorecen la acumulacin y activacin de clulas accesorias en la zona de depsito; potenciando las respuestas celular y humoral para los antgenos de Leishmania braziliensis.Dado que en nuestro pas subsiste el problema de la leishmaniasis estos resultados pueden representar una esperanza para desarrollar una vacuna para L. braziliensis que permita solucionar en parte la urgencia de atencin de salud en las zonas endmicas como los valles interandinos occidentales y la selva peruanos.

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II. MATERIAL Y MTODO

Material de estudioRattus rattus var albinus: 20 especmenes machos con peso entre 300 400 g; divididos al azar en cuatro grupos, un testigo y tres grupos ensayo de 5 especmenes cada uno.Materiales de prueba: Concentrado de Saponinas de Sapindus saponaria L. purificadas en el laboratorio de Anlisis Instrumental, suspensin de fracciones antignicas aisladas de Leishmania braziliensis preparada en el laboratorio de Toxicologa, suero fisiolgico, reactivos para microscopia ptica.Material de vidrio de uso corriente en el Laboratorio.Equipos: Columna de fraccionamiento de espuma, espectrofotmetro UV/Vis HP 8452A, microscopio ptico binocular, balanza analtica.

Mtodos y tcnicasDiseo experimental: Diseo clsicoLos grupos de Rattus rattus var albinus testigo y experimentales, fueron inyectados va intramuscular con suero fisiolgico (grupo T), suspensin de antgenos de Leishmania braziliensis en solucin salina fisiolgica (grupo A), saponinas en solucin salina fisiolgica (grupo B) y saponinas - suspensin de fracciones antignicas solucin salina fisiolgica (grupo C). Se tomaron muestras de sangre perifrica (cola) de los especmenes de cada grupo, a las 48 y 192 horas.

Extraccin de saponinas por maceracin.Cada vez se seleccion una muestra 25 frutos secos de Sapindus saponaria L. Se cort la cscara por el dimetro peciolar, se registr el peso de cscaras en balanza sensible al 0,01 g. Se macer las cscaras en 250 mL de agua por 24 horas. Se filtr el extracto a travs de torunda de algodn. El filtrado acuoso se deposit en el baln del Equipo de fraccionamiento de espuma con 70 cm de columna, a velocidad mnima. Se realiz el fraccionamiento de espuma hasta completar 100 mL de escurrido, el que fue sometido a ebullicin por 5 minutos. Se determin la concentracin de las saponinas mediante la ecuacin de la curva de calibracin respectiva.

Preparacin de los antgenos de Leishmania braziliensisEl cultivo de Leishmania braziliensis se realiz en frascos Roux con medio BHI agar enriquecidos con sangre total de conejo, con penicilina 100 UI/mL, estreptomicina 100 UI/mL, solucin salina fisiolgica. Se sembr e incub por 15 das a 20 C, se cosech con solucin salina fisiolgica estril, se centrifug durante 10 minutos a 3000 rpm. Se desech el sobrenadante, se resuspendi el precipitado en solucin salina fenolada 0,25% y nuevamente se centrifug. Se elimin el sobrenadante y se agreg solucin salina fisiolgica fenolada; se esteriliz a 121 C por 15 minutos a 15 atmsferas de presin y se conserv a -20 C.

Ensayo inflamatorioUn estudio comparativo en ratas se llev a cabo para investigar las reacciones locales y los cambios hematolgicos despus de la inyeccin de una dosis intramuscular de sapindussaponina (19,59 mg), y de vacuna de L. braziliensis sapindussaponina (19,59 mg 0,25 mL suspensin). Los efectos fueron comparados con los causados por suero fisiolgico y por la vacuna de L. braziliensis (0,25 mL suspensin). Grupos de cinco ratas machos fueron inyectados en el msculo del muslo izquierdo con 0.25 mL de la solucin de prueba a 0 das. A las 48 y 192 horas se tomaron muestras de sangre perifrica (cola) de los especmenes de cada grupo. Se prepar los frotis y se realiz el conteo de glbulos blancos con microscopio ptico con lente de inmersin.

Anlisis estadsticoSe realiz el ANOVA (Walpole et al., 1999) con las prueba de MSD y Dunnett para determinar si existe o no diferencia significativa entre las respuestas grupo experimental y testigo, mediante el software (Prez, 2001) SPSS v 16.

III. RESULTADOS

Los resultados se presentan en los siguientes TABLASTABLA 1. FORMULA LEUCOCITARIA EN Rattus rattus var albinusPORCENTAJE DE CLULASGrupoHorasNeutrfilosEosinfilosBasfilosLinfocitosMonocitos

Testigo483251584

Testigo483261565

Testigo483441565

Testigo483331585

Testigo483561553

A483260584

A483350584

A483251584

A483431575

A483241585

B484440457

B484330477

B484531447

B484620466

B484440466

C484231486

C484221496

C484321486

C484230487

C484420477

Testigo1923361555

Testigo1923241585

Testigo1923451555

Testigo1923241594

Testigo1923361564

A1923361564

A1923151594

A1923241594

A1923461545

A1923261565

B1923531574

B1923631564

B1923621574

B1923521584

B1923431575

C1923531574

C1923431575

C1923621565

C1923521584

C1923421594

TABLA 2. FORMULA LEUCOCITARIA Rattus rattus var albinusAnlisis de varianza ANOVA de un factor

Sum of SquaresdfMean SquareFSig.

neu1Between Groups794,0007113,429113,4290,000

Within Groups32,000321,000

Total826,00039

eos1Between Groups56,80078,11410,1430,000

Within Groups25,600320,800

Total82,40039

bas1Between Groups3,20070,4574,5710,001

Within Groups3,200320,100

Total6,40039

lin1Between Groups805,5757115,08267,6950,000

Within Groups54,400321,700

Total859,97539

mon1Between Groups33,57574,79613,7040,000

Within Groups11,200320,350

Total44,77539

1; neu, neutrfio; eos, eosinfilo; bas, basfilo; lin, linfocito; mon, monocitoIV. DISCUSINLa hiptesis de trabajo planteaba que las saponinas de Sapindus saponaria L. actuando como adyuvantes en el msculo estriado de Rattus rattus var albinus, favorecen la acumulacin y activacin de clulas accesorias en la zona de depsito; potenciando las respuestas celular y humoral para los antgenos de Leishmania braziliensis. Se pas entonces a tomar las muestras de sangre para evaluar los cambios hematolgicos mediante el conteo de clulas blancas (frmula leucocitaria).Luego de la inyeccin de saponinas y saponinas asociadas a fracciones antignicas de L. braziliensis, el porcentaje de neutrfilos se incrementa a las 48 horas y disminuye muy poco a las 192 horas; las pruebas estadsticas indican con 95% de seguridad que tal variacin es significativa. No hay variacin estadsticamente significativa por inyeccin de las fracciones antignicas de L. braziliensis.Se conoce que en los seres humanos (Rodrguez et al., 1993), un aumento del porcentaje de neutrfilos puede deberse a inflamaciones y ciertas enfermedades infecciosas agudas.A las 48 horas hay una disminucin estadsticamente significativa de eosinfilos en los grupos que recibieron saponinas y saponinas ms fracciones antignicas de L. braziliensis; esta condicin se mantiene a las 192 horas.Cuando la persona tiene ciertas reacciones alrgicas, infecciones u otras afecciones mdicas (Gersten et al., n.d.), los eosinfilos se vuelven activos. Estas clulas conforman solamente un pequeo porcentaje del nmero total de clulas blancas, pero son una parte importante de la respuesta inmunitaria del cuerpo, pues liberan histamina y otras sustancias qumicas que actan sobre los vasos sanguneos cuando la respuesta inmunitaria es activada.A las 192 horas se registra una disminucin estadsticamente significativa de basfilos en los grupos que recibieron saponinas y saponinas asociadas a fracciones antignicas de L. braziliensis.Los basfilos conforman solamente un pequeo porcentaje del nmero total de clulas blancas (Dugdale et al. n.d.); pero son una parte importante de la respuesta inmunitaria del cuerpo, pues liberan histamina y otras sustancias qumicas que actan sobre los vasos sanguneos cuando la respuesta inmunitaria es activada. El basfilo es una clula preponderantemente sangunea (Bords, n.d.), acude a los tejidos durante el proceso inflamatorio y supone un refuerzo en la liberacin de mediadores ya que se activa por los mismos mecanismos que el mastocito y libera mediadores equivalentes a los de esta clula.El porcentaje de linfocitos disminuye a las 48 horas en los grupos que recibieron saponinas y saponinas asociadas a fracciones antignicas de L. braziliensis. A las 192 horas la diferencia no es estadsticamente significativa.A las 48 horas los grupos que recibieron saponinas y la combinacin saponinas antgenos de L. braziliensis experimenta una disminucin estadsticamente significativa en el porcentaje de monocitos; pero a las 192 horas el porcentaje tiende a su valor normal. Los monocitos colaboran con otros glbulos blancos en la eliminacin de tejidos muertos o daados, en la destruccin de clulas cancerosas y en la regulacin de la inmunidad contra las sustancias extraas. Al igual que otros glbulos blancos, los monocitos se originan en la mdula sea y luego entran en el flujo sanguneo. En unas horas, emigran a los tejidos donde se convierten en macrfagos, y constituyen las clulas defensivas (fagocitos) del sistema inmunitario.Estos hechos pueden ser explicados en parte por la dinmica del proceso inflamatorio presentado por Bords (n.d.). La inflamacin es un proceso tisular constituido por una serie de fenmenos moleculares, celulares y vasculares de finalidad defensiva frente a agresiones fsicas, qumicas o biolgicas. Los aspectos bsicos que se destacan en el proceso inflamatorio son en primer lugar, la focalizacin de la respuesta, que tiende a circunscribir la zona de lucha contra el agente agresor. En segundo lugar, la respuesta inflamatoria es inmediata, de urgencia y por tanto, preponderantemente inespecfica, aunque puede favorecer el desarrollo posterior de una respuesta especfica. En tercer lugar, el foco inflamatorio atrae a las clulas inmunes de los tejidos cercanos. Las alteraciones vasculares van a permitir, adems, la llegada desde la sangre de molculas inmunes.Esquemticamente la inflamacin tiene cinco etapas:1. Liberacin de mediadores. Son molculas, la mayor parte de ellas, de estructura elemental que son liberadas o sintetizadas por el mastocito bajo la actuacin de determinados estmulos.1. Efecto de los mediadores. Una vez liberadas, estas molculas producen alteraciones vasculares y efectos quimiotcticos que favorecen la llegada de molculas y clulas inmunes al foco inflamatorio.1. Llegada de molculas y clulas inmunes al foco inflamatorio. Proceden en su mayor parte de la sangre, pero tambin de las zonas circundantes al foco.1. Regulacin del proceso inflamatorio. Como la mayor parte de las respuestas inmunes, el fenmeno inflamatorio tambin integra una serie de mecanismos inhibidores tendentes a finalizar o equilibrar el proceso.1. Reparacin. Fase constituida por fenmenos que van a determinar la reparacin total o parcial de los tejidos daados por el agente agresor o por la propia respuesta inflamatoria.Es muy importante la Fase tarda. Llegada de clulas1. Basfilo. Contribuye, junto con el mastocito, a la liberacin de mediadores.1. Neutrfilo. Es de las primeras clulas en llegar al foco inflamatorio. Elimina al germen mediante fagocitosis o liberando factores txicos que contiene en sus grnulos citoplasmticos y producindole, as, una muerte extracelular.1. Monocito/Macrfago. Procedente de la sangre el monocito, y de los tejidos cercanos el macrfago, llegan al foco ms tardamente. El monocito, en los tejidos, se diferencia en macrfago. Esta clula presenta idnticas funciones a las sealadas para el neutrfilo. Acta adems, como clula presentadora del antgeno a las clulas especficas T y B, iniciando, de esta forma, la respuesta especfica.El macrfago sintetiza un pptido inespecfico, la interleucina 1 (IL-1), que es una autntica hormona del Sistema Inmune, ya que pasando a la sangre produce efectos sobre distintas partes del organismo. Determina la aparicin de fiebre, probablemente induciendo la sntesis de PGE en las clulas endoteliales que revisten los vasos sanguneos del hipotlamo; a su vez la PGE acta sobre el centro termorregulador. Sobre la mdula sea favorece la produccin y liberacin de neutrfilos, con la consiguiente neutrofilia. En el hgado incrementa la sntesis de protenas de la fase aguda.A nivel local, la IL-1 activa la proliferacin y diferenciacin de las clulas T y B contribuyendo, as a la respuesta especfica. Tambin activa la proliferacin de fibroblastos y produccin de colgeno, fenmenos incluidos en la fase de reparacin de la inflamacin.1. Linfocitos T y B. Potenciados por el macrfago inician la respuesta especfica. Las clulas B procedentes de los tejidos linfoides asociados a tejidos o mucosas sintetizan IgE, que unidas al mastocito o basfilo pueden potenciar la inflamacin. Por otra parte, las clulas T comienzan a producir linfoquinas que prolongan la inflamacin en una respuesta inmune ms elaborada.1. Eosinfilo. Aunque es una clula citotxica en las infecciones parasitarias, parece adems tener en la inflamacin una funcin reguladora, por lo que ser estudiada en el siguiente apartado.Pero tambin la REGULACIN DE LA RESPUESTA INFLAMATORIAComo la mayor parte de las respuestas inmunes, el fenmeno inflamatorio se encuentra estrechamente regulado, evitando, as una respuesta exagerada o perjudicial. Algunos de los mediadores que producen activacin, al variar su concentracin o actuar sobre distintos receptores, van a producir inhibicin, consiguiendo, de esta forma, un equilibrio o modulacin de la respuesta inflamatoria. Los siguientes factores intervienen en esta regulacin:1. Histamina. Actuando sobre receptores H2, induce en el mastocito y basfilo una inhibicin de la liberacin de mediadores, inhibe la actividad del neutrfilo, inhibe la quimiotaxis y activa las clulas T supresoras.1. PGE. Produce en el mastocito y basfilo una inhibicin de la liberacin de mediadores y sobre los linfocitos una inhibicin de la proliferacin y diferenciacin.1. Agonistas autonmicos. El mastocito y basfilo parecen presentar receptores y -adrenrgicos y -colinrgicos que sugieren que la liberacin de mediadores podra estar sometida a una regulacin autonmica. La activacin del receptor -adrenrgico produce una inhibicin, mientras que la activacin del -adrenrgico y -colinrgico inducen la estimulacin1. Heparina. Inhibe la coagulacin y la activacin de los factores del complemento.1. Eosinfilo. Esta clula, atrada por el ECF-A, acude al foco inflamatorio donde libera una serie de enzimas que degradan determinados mediadores potenciadores de la inflamacin. La histaminasa acta sobre la histamina, la arilsulfatasa sobre los leucotrienos y la fosfolipasa sobre el PAF.V. CONCLUSIONES

De acuerdo a los resultados se concluye:1. La inyeccin de saponinas y saponinas - antgenos de L. braziliensis provoca cambios en la frmula leucocitaria.2. las variaciones de porcentaje de leucocitos: neutrfilos, eosinfilos, linfocitos y monocitos indican la respuesta celular a las saponinas y la asociacin saponinas fracciones antignicas de L. braziliensis.

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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ANEXOS

Anexo 1. Corte pelo del muslo izquierdo para inyectar

Anexo 2. Inyeccin en el msculo del muslo izquierdo

Anexo 3. Grupo testigo T. Recibi Solucin Salina Fisiogica

Anexo 4. Grupo Experimental C. Recibi Asociacin Saponinas Antgenos de L. braziliensis

Anexo 4. Obtencin de Sangre Perifrica (cola)

M.Sc. Q.F. Segundo M. Miranda Leyva

VB _____________________________Dr. Ramn Piminchumo Carranza