síntesis de un análogo del antígeno tn derivado de la a … · cariño y apoyo bajo ningún...
TRANSCRIPT
Víctor Pérez Martínez
Síntesis de un análogo del antígeno Tn derivado de la a-bencilserina
Francisco Corzana López
Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática
Máster en Química Avanzada
2012-2013
Título
Autor/es
Director/es
Facultad
Titulación
Departamento
TRABAJO FIN DE ESTUDIOS
Curso Académico
© El autor© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2013
publicaciones.unirioja.esE-mail: [email protected]
Síntesis de un análogo del antígeno Tn derivado de la a-bencilserina, trabajo finde estudios
de Víctor Pérez Martínez, dirigido por Francisco Corzana López (publicado por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una Licencia
Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported. Permisos que vayan más allá de lo cubierto por esta licencia pueden solicitarse a los
titulares del copyright.
UNIVERSIDAD DE LA RIOJA FACULTAD DE CIENCIAS, ESTUDIOS AGROALIMENTARIOS E INFORMÁTICA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ÁREA DE QUÍMICA ORGÁNICA
Síntesis de un análogo del antígeno Tn derivado de la
-bencilserina
Trabajo de investigación Proyecto Fin de Máster
Víctor Pérez Martínez Junio 2013
F
d
F
RANCISCO C
el Departam
HACE
Que la
bencils
en el D
inmedi
crédito
de Más
do.: Francisc
CORZANA LÓ
mento de Quí
E CONSTAR
memoria " S
serina" ha sid
Departamen
ata dirección
os ECTS corre
ster.
co Corzana Ló
ÓPEZ, Profes
ímica de la U
R:
Síntesis de u
do realizada
nto de Quím
n y reúne la
espondiente
ópez
sor Contrata
Universidad d
un análogo d
a por el Licen
mica de la U
as condicione
es al período
Logroño, J
ado Doctor d
de La Rioja.
del antígeno
nciado VÍCTO
Universidad d
es exigidas p
o de investig
Junio 2013
de Química
o Tn derivado
OR PÉREZ M
de La Rioja,
para consegu
gación del Tr
Orgánica
o de la a‐
MARTÍNEZ
, bajo su
uir los 30
rabajo fin
A mis padres, por su apoyo y sus consejos.
A mi hermano, por su ánimo.
A mi familia y amigos, por estar siempre ahí.
A Alberto, Pere, Héctor y Marimar por haberme aconsejado, ayudado y
formado y haber despertado mi interés por la Química Orgánica.
También, agradecer especialmente a Paco por su paciencia y su ayuda en
el desarrollo de éste trabajo Fin de Máster.
A mis compañeros de laboratorio por resolverme las dudas que pudiera
tener.
A mis compañeros de Máster, por estar siempre dispuestos a echar una
mano en lo que fuera.
A mis amigos, que me han aguantado cuando más lo he necesitado.
Por último, a toda mi familia, porque nunca han dejado de darme su
cariño y apoyo bajo ningún concepto.
Finalmente, me gustaría agradecer a las siguientes instituciones la ayuda
económica aportada para la realización de este proyecto:
Ministerio de Economía y Competitividad/FEDER, por la
aportación económica al proyecto CTQ2012‐36365.
Universidad de La Rioja, por conformar el marco humano y
cientifico idóneo para el desarrollo de este trabajo.
ÍNDICE
Abreviaciones
1. Introducción y objetivos 1
2. Antecedentes 9
2.1. Formación del enlace O‐glicosídico 11
2.2. Interacciones CH‐ 15
3. Discusión de resultados 18
4. Conclusiones 30
5. Experimental 34
6. Anexo: Espectros de Resonancia Magnética Nuclear 50
del compuesto final
I
Abreviaciones
desplazamiento químico 1H RMN resonancia magnética nuclear de protón 13C RMN resonancia magnética nuclear de carbono‐13
Ac acetilo
Ac2O anhídrido acético
AcOEt acetato de etilo
Bn bencilo
Boc terc‐butoxicarbonilo
Boc2O di‐terc‐butil dicarbonato tBu terc‐butilo tBuOH terc‐butanol
CAN Nitrato de cerio y amonio
CH3CN acetonitrilo
COSY COrrelated SpectroscopY d doblete, día
DCC N,N’‐diciclohexilcarbodiimida
EtOH etanol
Fmoc 9‐Fluorenilmetoxicarbonilo
g gramo
GalNAc N‐acetilgalactosamina
HMPA hexametilfosforamida
HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence
iPrOH isopropanol
J constante de acoplamiento
LHMDS hexametildisililazida de litio
M molaridad
m multiplete
Me metilo
mmol milimol
NOESY Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY
RMN resonancia magnética nuclear
s singlete, azúcar (del inglés, sugar)
THF tetrahidrofurano
1. Introducción y objetivos
3 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
La naturaleza ha sido siempre una inagotable fuente de inspiración para el
hombre. Los fenómenos que en ella ocurren y sus características no han dejado
indiferentes a los científicos, que a lo largo de la Historia han tratado de
explicarlos e imitarlos. A través de los años se ha buscado comprender cómo
transcurren los procesos biológicos, en particular aquellos relacionados con
actividades catalíticas y/o de reconocimiento molecular de un sustrato.
El reconocimiento molecular puede describirse como la unión específica
de una molécula a un receptor. Entre los sistemas biológicos en que se da este
tipo de procesos están los enzimas, los anticuerpos y los receptores hormonales
capaces de identificar selectivamente a un sustrato, un antígeno o una hormona,
respectivamente. Por supuesto, estos sistemas de identificación química selectiva
son de enorme interés en la ciencia actual en campos como la química analítica,
médica o farmacéutica.
Sin lugar a dudas, el reconocimiento proteína‐carbohidrato es de gran
importancia ya que juegan un papel fundamental en procesos biológicos como la
comunicación celular, procesos infecciosos, metástasis de tumores y diferentes
aspectos de la respuesta immune.1
Las interacciones dominantes implicadas en la formación de complejos
proteína‐carbohidrato son fundamentalmente enlaces de hidrógeno y fuerzas de
van der Waals (Figura 1).2 La fortaleza de los enlaces de hidrógeno depende en
gran medida de la interacción entre los grupos hidroxilo del carbohidrato y las
cadenas polares de los aminoácidos que se encuentran en los sitios de unión. El
átomo de oxígeno del grupo hidroxilo puede participar en dos enlaces de
hidrógeno como aceptor, mientras que el protón actúa como dador. En este
contexto, es importante señalar que la orientación de los distintos grupos
hidroxilos (bien sea axial o ecuatorial) del carbohidrato es decisiva para la afinidad
sustrato‐ligando y la especificidad del reconocimiento molecular.
1 (a) Vyas, N. K. Curr. Opin. Struct. Biol. 1991, 1, 732–740. (b) Gabius, H. J.; André, S.; Jiménez‐Barbero, J.; Romero, A.; Solís, D. Trends Biochem. Sci. 2011, 36, 298– 313. 2 Gellman, S. H. Chem. Rev. 1997, 97, 1231–1232.
4 INTRO
A
de los a
modo, a
aminoác
reconoci
electrón
que reci
modo de
T
pueden
como a
rayos X
de resolu
3 (a) Lutt(b) CantaNucleic A4 Asensio954
ODUCCIÓN Y
Adicionalme
minoácidos
a la especific
cidos aromá
imiento, pe
ica deslocal
ibe el nomb
e resumen, la
Figura 1. In
Todas las in
analizar tant
nivel de reso
permiten m
ución atómic
eke, T.; Frankarel, B. L.; CoAcids Res. 2009o, J.L.; Ardia, A
Y OBJETIVO
ente, los cont
y del carbo
cidad de las
ticos (triptó
rmiten la e
izada del an
re de intera
as interaccio
nteracciones típ
nteracciones
to a nivel ma
olución atóm
edir paráme
ca y una desc
k, M.; von derutinho, P. M.9, 37, D233–DA.; Cañada, F.
S
tactos de va
hidrato cont
s interaccion
fano, tirosin
existencia de
illo aromátic
acción CH‐.4
ones proteína
picas entre un c
detallando la in
intermolecu
acroscópico
mica. Técnica
etros atómico
cripción estr
r Lieth, C.W. .; Rancurel, CD238. J.; Jiménez‐Ba
an der Waals
tribuyen a l
nes. En este
na y fenilala
e una intera
co y los gru4 En la sigui
a‐carbohidra
carbohidrato y
nteracción CH‐
ulares come
(estudios te
as tales com
os individua
ructural de la
Nucleic AcidsC.; Bernard, T
arbero, J. Acc
s entre átom
a estabilidad
sentido, la
anina)3 en lo
acción entre
pos C‐H del
ente figura
ato más relev
su correspondi
.
entadas ante
rmodinámic
o RMN o cri
les, consigui
a interacción
Res., 2005, 3.; Lombard, V
c. Chem. Res.,
mos no polare
d y, en cient
presencia d
os centros d
e la densida
carbohidrat
se muestra,
vantes.
ente receptor,
eriormente s
os y cinético
istalografía d
endo un niv
n.
33, D242–D24V.; Henrissat,
2013, 46, 946
es
to
de
de
ad
to,
a
se
os)
de
vel
46. B.
6–
5 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
Por otro lado, nuestro grupo de investigación lleva varios años
sintetizando amino ácidos no naturales ,‐disustituidos. Dichos aminoácidos
presentan un gran interés ya que son capaces de modificar las preferencias
conformacionales de los péptidos en los que son incorporados.5 Entre estos
compuestos, las α‐alquilserinas quirales y adecuadamente protegidas, como las
representadas en la Figura 2, han sido reconocidas como importantes
componentes en áreas como la química sintética y la química médica.6
Figura 2. ‐alquilserinas quirales.
El grupo hidroxilo de estas ‐alquilserinas puede formar un enlace O‐
glicosídico con un carbohidrato para dar lugar a los correspondientes O‐
glicosilaminoácidos. Estos residuos, cuando son incorporados en proteínas, dan
lugar a las llamadas glicoproteínas (Figura 3). En este contexto, un tipo
especialmente importante de glicoproteínas son las llamadas mucinas, las cuales
se encuentran en las membranas de muchas células epiteliales. Estas
glicoproteínas protegen a las células contra agentes externos, tanto químicos
como físicos y están involucradas en procesos de transducción de señales,
reconocimiento celular y en proceso como la inflamación y la respuesta
immunológica. 7
5 (a) Wirth, T. Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1997, 36, 225. (b) Cativiela, C.; Diaz‐de‐Villegas, M. D.; Tetrahedron‐Asymmetr. 1998, 9, 3517. (c) Cativiela, C.; Diaz‐de‐Villegas, M. D. Tetrahedron‐ Asymmetr. 2000, 11, 645. (d) Vogt Bräse, H. S. Org. Biomol. Chem. 2007, 5, 406. (e) Hruby, V. J. Acc. Chem. Res. 2001, 34, 389. (f) Kotha, S. Accounts Chem. Res. 2003, 36, 342. (g) Cativiela, C.; Diaz de Villegas, M. D. Tetrahedron‐Asymmetr. 2007, 18, 569. 6 (a) Ohfune,Y.; Shinada, T. Eur. J. Org. Chem. 2005, 5127. (b) Sagan, S.; Karoyan, P.; Lequin, O.; Chassaing, G.; Lavielle, S.; Curr. Med. Chem. 2004, 11, 2799. (c) Wilson, E. M.; Snell, E. E.; J. Biol. Chem. 1962, 237, 3180; (d) Davidson, B. S.; Chem. Rev. 1993, 93, 1771. 7 Gaidzik, N.; Westerlind, U.; Kunz. H. Chem. Soc. Rev. 2013, 42, 4421‐4442.
H2N CO2H
RHO
6 INTRO
unido di
o tambi
muestra
aminoác
antígeno
presente
existe un
clínico p
desarrol
anticuer
8 Gaidzik,
ODUCCIÓN Y
Figura 3. Gli
Una caract
rectamente
ién llamada
en la Figur
cido en pos
o Tn. Actual
e en las célu
n gran interé
para determi
lo de vacun
rpos anti‐Tn c
, N.; Westerlin
Y OBJETIVO
icoproteína MU
tre
terística imp
a las serina
GalNac, m
ra 4. Dicho
sición axial.
lmente está
ulas tumoral
és en monito
inar la prese
as contra e
como distint
nd, U.; Kunz, H
S
UC1 donde la ca
eonina del epíto
portante de
(o treonina)
mediante un
enlace deja,
Este glicos
siendo obje
es pero no
orizar su expr
encia de tum
l cáncer. Pa
tas lectinas. 8
H. Chem. Soc.
adena peptídica
opo PDTR.
las mucina
) es siempre
enlace ‐O, como pued
silaminoácid
eto de estu
en las célula
resión en las
mores y porq
ra dicha det8
Rev., 2013, 4
a se encuentra
s es que el
e la N‐acetilg
O‐glicosídico
de observar
do recibe e
udio ya que
as sanas. Co
s células com
que es impo
tección se e
2, 4421‐‐4442
glicosilada en la
carbohidrat
galactosamin
tal como s
se, el residu
l nombre d
se encuent
omo resultad
mo diagnóstic
rtante para
emplean tant
2
a
to
na,
se
uo
de
tra
do
co
el
to
7 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
Figura 4. Estructura del GalNAc unido a serina mediante un enlace ‐O‐glicosídico.
Teniendo en cuenta todo lo expuesto anteriormente, se detalla a
continuación el objetivo principal de este trabajo de Fin de Máster:
Objetivo
Dada la importancia del antígeno Tn, así como de las interacciones CH‐, así como de los aminoácidos ,‐disustituidos, se pretende realizar la unión de un carbohidrato (N‐acetil‐galactosamina, GalNAc) con un aminoácido no natural
derivado de la serina (‐bencilserina) mediante un enlace ‐O‐glicosídico, para en un futuro y fuera del ámbito de este trabajo fin de máster, estudiar las
interacciones que se producen entre los grupos CH del carbohidrato y el anillo
aromático del bencilo de la ‐bencilserina.
En definitiva, se trata de sintetizar el siguiente glicoaminoácido
debidamente protegido (Figura 7), para que en un futuro pueda ser incorporado
en una secuencia peptídica.
8 INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
Figura 7. Glicoaminoácido objeto de síntesis.
Para ello, los grupos hidroxilo del carbohidrato se protegen en forma de
acetatos, el grupo ácido del aminoácido en forma de éster terc‐butílico y el grupo
amino como carbamato de Fmoc.
2. Antecedentes
11 ANTECEDENTES
A continuación se describen las reacciones más típicas empleadas hasta la
fecha para la obtención de glicosilaminoácidos convenientemente protegidos.
Además, se describen los aspectos más relevantes de las interacciones
CH‐ anteriormente comentadas.
Formación del enlace O‐glicosídico
En la mayor parte de las glicoproteínas, los carbohidratos se encuentran
unidos a la cadena peptídica mediante enlaces O‐glicosídicos. Esta incorporación
de la parte carbohidrato al péptido es un paso clave en la obtención de estos
productos y es la que se ha llevado a cabo para la síntesis de nuestra molécula
objetivo anteriormente comentada.
En la formación de un enlace O‐glicosídico pueden obtenerse dos
estereoisómeros distintos: los anómeros α y β. El enlace tiene el grupo OR en axial, mientras que en un enlace ‐O‐glicosídico, éste ocupa la posición ecuatorial (Figura 1).
Figura 1. Anómeros y para un enlace O‐glicosílico, en una silla 4C1.
Aunque en la bibliografía se han publicado varias revisiones acerca de la
formación de enlaces O‐glicosídicos,1 a continuación, se pasa a describir algunas
de las metodologías más habituales para la formación de este enlace con GalNAc.
1 a) Taylor, C. M. Tetrahedron 1998, 54, 11317‐11362; b) Boons, G. J. Tetrahedron 1996, 52, 1095‐1121; c) Davis, B. G. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 2000, 2137‐2160; d) Arsequell, G.; Valencia, G. Tetrahedron‐Asymmetry 1997, 8, 2839‐2876; e) Brocke, C.; Kunz, H. Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 3085‐3112.
12 ANTECEDENTES
Método del tricloroacetimidato
Uno de los métodos para obtener mayoritariamente el anómero es el desarrollado por Wong y colaboradores,2 utilizando el tricloroacetimidato como
activador para la glicosilación de un derivado de treonina. Con esta metodología
en dos pasos se forma el enlace ‐O‐glicosídico mejorando el rendimiento global y
obteniendo los anómeros y en proporción 2:1, respectivamente (Esquema 1).
O
AcO
AcON3
OAc
O
NHFmoc
CO2Allyl
CO2Allyl
HO NHFmoc
+
O
AcO
AcON3
OAcCCl3CN, K2CO3, CH2Cl2 O
AcO
AcON3
OAc
O NH
CCl3
TMSOTf, CH2Cl2, éter
55% (Dos etapas)
Me
Me
OH
O
AcO
AcON3
OAc
O NH
CCl3
Esquema 1
Otro ejemplo en el que se obtiene mayoritariamente el anómero α a
partir de tricloroacetimidatos es el realizado por el grupo de Toyokuni, para la
serina debidamente protegida, donde la mezcla de anómeros se separa por
cromatografía de columna (Esquema 2).3
2 Payne, R. C.; Ficht S.; Tang S.; Brik A.; Yang Y‐Y.; Case D.A.; Wong C‐H. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 13527‐13536. 3 Toyokuni, T.; Dean, B.; Hakomori, S. Tetrahedron Lett. 1990, 31, 2673‐2676.
13 ANTECEDENTES
Esquema 2
Metodología de Schmidt
Otra de las metodologías más extendidas es la desarrollada por el grupo
de Schmidt.4,5 Este método se basa en una adición de tipo Michael, en medio
básico, de un alcohol al 2‐nitro‐D‐galactal adecuadamente protegido, formándose
los correspondientes productos de glicosilación (Esquema 3).
Esquema 3
En general, este método permite obtener mayoritariamente el anómero
, si bien, el control de la selectividad depende de la base empleada. Así, se
obtiene una alta selectividad con bases fuertes como tBuOK, mientras que las
bases tipo amina, como NEt3, favorecen la formación del anómero
4 Das, J.; Schmidt, R. R. Eur. J. Org. Chem. 1998, 1609‐1613. 5 Kogan, T. P.; Gaeta, F. C. A. Synthesis 1988, 706‐707.
14 ANTECEDENTES
Metodología de Koenigs‐Knorr
El método Koenigs‐Knorr es uno de los procedimientos más antiguos de
glicosilación.6 Se basa en el empleo de haluros derivados de carbohidratos, como
grupos dadores, y del alcohol correspondiente, como grupo aceptor. Un ejemplo
de glicosilación α, mediante la metodología Koenigs‐Knorr, es el utilizado por
Liebe y Kunz en la síntesis de un antígeno asociado a tumores (Esquema 4).7 Este
procedimiento permite el escalado a gramos fácilmente con rendimientos
elevados.
Esquema 4
Este último es el procedimiento experimental que se ha empleado en el
presente trabajo. Su elección se debe que el método es reproducible y con él se
han obtenido los mejores rendimientos. Por otro lado, la metodología de Schmidt
presenta una baja reproducibilidad y lleva asociado un paso de hidrogenación del
grupo nitro que se realiza con amalgama de níquel platinado, con los riesgos que
ello supone.
6 Koenigs, W.; Knorr, E. Chem. Ber. 1901, 34, 957‐981. 7 Liebe, B.; Kunz, H. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 618‐621.
15 ANTECEDENTES
Interacciones CH‐
Como ya se ha comentado en la introducción, el reconocimiento
de los carbohidratos por distintas proteínas es de gran importancia en el mundo
de la biología. Sin duda, una de las interacciones responsable de la especificidad
en el reconocimiento molecular es la formación de interacciones CH‐.
Inicialmente, podría considerarse desde una perspectiva teórica, que las
interacciones CH son análogas a los enlaces de hidrogeno. Los cálculos ab initio llevados a cabo a un nivel de teoría alto (CCSD(T))8 indican que la componente
dispersiva es dominante, mientras que la contribución electrostática es mucho
menor. 16 Por tanto, la naturaleza de la interacción CH está más cercana a las
fuerzas de Van der Waals. 9 Lógicamente, la contribución electrostática aumenta
en algunas interacciones CH por enlaces C‐H ácidos (acetileno, cloroformo,
etc…).10 Aun así, la magnitud de la atracción de la interacción CH es sustancialmente menor que la de los puentes de hidrogeno, debido a que esta
fuerza electrostática es débil.
Otra de las diferencias con los enlaces de hidrógeno, es que éstos
presentan una fuerte direccionalidad debido a la gran contribución de la
interacción electrostática, mientras que la direccionalidad de la interacción CH es muy baja por ese mismo motivo. (Figura 2)
8 a) Tsuzuki, S.; Fujii, A. Phys. Chem. Chem. Phys. 2008, 10, 2584–2594; b) Raju, R. K.; Ramraj, A.; Vincent, M. A.; Hillier, H.; Burton, N. A. Phys. Chem. Chem. Phys. 2008, 10, 2500–2508. 9 Morita S.; Fujii A.; Mikami N.; Tsuzuki S. J. Phys. Chem. A, 2006, 110, 10583; 10a) Shibasaki K.; Fujii A.; Mikami N.; Tsuzuki S. J. Phys. Chem. A, 2007, 111, 753. b) Fujii A.; Shibasaki K.; Kazama T.; Itaya R.; Mikami N.; Tsuzuki S. Phys. Chem. Chem. Phys., 2008, 10, 2836; c) Tsuzuki S.; Honda K.; Uchimaru T.; Mikami M.; Tanabe K. J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 3746. d) Tsuzuki S.; Honda K.; Uchimaru T.; Mikami M.; Tanabe K. J. Phys. Chem. A, 2002, 106, 4423; e) Tsuzuki S.; Honda K.; Uchimaru T.; Mikami M.; Fujii A.; J. Phys. Chem. A, 2006, 110, 10163.
16 ANTEC
de los en
(r‐6) y po
depende
superfici
compon
fuerzas a
los comp
de sustit
los grup
en el azú
CEDENTES
Figura 2. De
laces CH‐ y
Por o
or tanto su
e enormeme
ies que inte
ente electro
atractivas en
plejos carbo
tuyentes dad
os CH que in
úcar.
ependencia d
enlace de hid
otro lado, la
contribución
ente de la co
eractúan. E
oestática es
ntre los anillo
ohidrato/aro
dores de elec
nteraccionan
e la orientaci
rogeno.
componente
n sólo es im
omplementar
s important
pequeña, o
os aromático
mático podr
ctrones en e
n podría aum
ón respecto a
e dispersivas
portante a d
riedad de los
te señalar q
ofrece la opo
os y los azúca
rían aument
l anillo arom
mentarse con
a las energías
s dependen d
distancias co
s tamaños y
que, a pesa
ortunidad de
ares. Así, la
arse con la
mático. El car
n sustituyent
s de interacció
de la distanc
ortas. Ademá
formas de la
ar de que
e modular la
estabilidad d
incorporació
ácter polar d
tes adecuado
ón
cia
ás
as
la
as
de
ón
de
os
im
n
ar
ca
a
li
m
si
11
14
En
mportante y
ecesariamen
Figur
romático.
A p
arbohidrato,
finidades m
gandos no r
mayoría de l
ino que está
1 a) Laughrey, 4625–14633. 028. c) Barwe
las interacc
ya que el h
nte la desolv
ra 3. Carbohidr
esar del cos
, las prote
moderadas y
ecae exclusi
os casos los
n formando
Z. R.; Kiehna, b) Kiehna, Sell, N. P.; Davi
ciones CH‐hecho de qu
vatición parci
rato solvatado
ste energéti
eínas son c
y alta espec
vamente en
s grupos hid
enlaces de h
, S. E.; Riemen. E.; Laughreyis, A. P. J. Org
el papel d
ue se dé e
ial del carbo
y parcialmente
co que supo
capaces de
cificidad. Ad
los contacto
roxilo de lo
hidrogeno in
n, A. J.; Watery, Z. R.;Waters. Chem. 2011,
el disolvent
ste tipo de
hidrato (Figu
e desolvatado p
one la deso
reconocer
demás, la d
os carbohidr
s oligosacár
termolecula
rs, M. L. J. Am.s, M. L. Chem. 76, 6548–655
ANTECED
te (agua) pu
e interacción
ura 3).11
por la acción d
olvatación pa
carbohidra
desolvatación
rato/aromát
ridos no está
res.
. Chem. Soc. 2 Commun. 2057.
1DENTES
uede ser
n implica
e un grupo
arcial del
atos con
n de los
ico. En la
án libres,
2008, 130, 007, 4026–
7
3. Discusión de resultados
20 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Como se ha comentado anteriormente, el objetivo de esta investigación
es la síntesis del glicoaminoácido proveniente de la unión entre ‐N‐acetil‐galactosamina y el aminoácido no natural (S)‐‐bencilserina, para en un futuro y fuera del ámbito de éste Trabajo Fin de Máster estudiar las interacciones CH‐ que pueden existir en este sistema.
1
Figura 1. Molécula objeto de síntesis.
Síntesis del compuesto 1 Las etapas clave para la síntesis del compuesto 1 consiste en la
formación del enlace glicosídico entre el aminoácido no natural sintetizado
anteriormente (S)‐‐bencilserina y el carbohidrato ‐N‐acetil‐galactosamina,
siguiendo la metodología que se ha explicado en el capítulo Antecedentes. Para
ello es necesario disponer del carbohidrato y el aminoácido con los grupos
principales adecuadamente protegidos.
A. Preparación del carbohidrato
La galactosa 2 se hace reaccionar con ácido bromhídrico (HBr) durante 3
horas a temperatura ambiente, obteniendo el compuesto 3 (Esquema 1).
21 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Esquema 1
Tras disolver el producto 3 en acetona, se le añade zinc y NaH2PO4,
dejándose reaccionar durante 5 horas. Después de purificar mediante columna
cromatográfica se obtiene el producto 4 con un 88% de rendimiento. (Esquema 2)
Esquema 2
Posteriormente, se disuelve el galactal en acetonitrilo y a baja
temperatura se añade azida de sodio y tricloruro de hierro.1 Una vez hechas las
extracciones y la purificación por columna, se obtiene el carbohidrato 5 con un
rendimiento del 78% (Esquema 3).
1 Plattner, C.; Höfener, M.; Sewald, N.;Org. Lett. 2011, 13, 545‐547.
22 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Esquema 3a
Otro método para la preparación del carbohidrato es la formación de la
bromoazida en lugar de cloroazida. En este caso, en un schlenk a ‐20ºC se
introduce nitrato de cerio y amonio (CAN) y NaN3 bajo atmosfera inerte. Se
disuelve en acetonitrilo, y se añade también el galactal 4, dejándolo reaccionar
durante 10 horas.2
A continuación, y bajo condiciones de atmosfera inerte, se añade LiBr
disuelto en acetonitrilo. Una vez realizadas las extracciones y tras purificación se
obtiene el compuesto 5b que también puede usarse para la síntesis del building
block objeto de estudio. 10 (Esquema 3b)
Esquema 3b
Después de realizar las dos reacciones, se obtienen mejores
rendimientos con la cloroazida, además de que su síntesis requiere un solo paso y
es más rápida.
2 Lemineux, R. U.; Ratcliffe, R. M.; J. Chem. 1979, 57, 1244.
23 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
B. Preparación del aminoácido
A continuación, se prepara el aminoácido con los grupos funcionales
adecuados de tal forma que la reacción con el producto 5a o 5b sea óptima.
Se parte de L‐serina (compuesto 6), comercialmente disponible, y se
hace reaccionar con cloruro de acetilo en metanol, para proteger el grupo ácido
en forma de éster metílico (Esquema 4) .
Esquema 4
Posteriormente se protege el grupo amino con dicarbamato de di‐terc‐
butilo (Boc2O) mediante una reacción con Na2CO3, utilizando como disolvente una
mezcla de THF y H2O (Esquema 5).
Esquema 5
24 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
El siguiente paso es la formación del biciclo de serina 9 con
tetrametilbutano (TMB) y ácido para‐toluensulfónico en tolueno (Esquema 6).
Esquema 6
Posteriormente se alquila el biciclo 9 mediante el uso de yoduro de
bencilo, previamente sintetizado mediante la metodología explicada en el
apartado “Experimental”. Se añade hexametildisililazida de litio (LHMDS) y
hexametilfosforamida (HMPA) (Esquema 7). La LHMDS nos servirá para
desprotonar la posición alfa del éster y el HMPA actuará como un acelerador de la
reacción. La reacción se realiza en THF a ‐78ºC, obteniéndose el compuesto con
un rendimiento del 61%.
Esquema 7
Otra opción sería el uso de bromuro de bencilo en lugar del yoduro de
bencilo, pero se prefiere el uso de este último porque al ser el yodo mejor grupo
saliente se obtiene un mayor rendimiento en la reacción de alquilación.
25 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Después de la purificación mediante columna cromatográfica, se
hidroliza el biciclo utilizando ácido clorhídrico 6N a reflujo durante 12 horas,
obteniéndose el correspondiente aminoácido en forma de clorhidrato. Éste se
libera por adición de óxido de propileno en etanol. (Esquema 8)
O
NO
O
MeO
MeO2C Bn
10
1) HCl 6N, reflujo 12h
2) O , EtOH, reflujo 2h
H2N OH
CO2HBn
11
Esquema 8
El siguiente paso es proteger el grupo amino y el ácido del aminoácido.
Para ello hacemos reaccionar el compuesto 11 con Fmoc‐O‐succinimida en medio
básico, durante 3 días. El elevado tiempo de la reacción se debe a la baja
reactividad del grupo amino unido al carbono cuaternario. De éste modo se
protege el grupo amino en forma de carbamato de Fmoc. (Esquema 9)
Esquema 9
26 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Para proteger el grupo ácido, se hace reaccionar el producto 12 con
diciclohexilcarbodiimida (DCC), terc‐butanol y cloruro de cobre (I) durante un día.
(Esquema 10)
Esquema 10
Así se obtiene el producto 13 puro, y con los grupos amino y ácido
protegidos, listo para reaccionar con el carbohidrato a través del grupo hidroxilo
(OH).
27 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
C. Acoplamiento mediante Koenigs‐Knorr
Una vez que se dispone de los productos 5 y 13, se sigue la metodología
descrita por Koenigs‐Knorr,3 que emplea derivados de plata para que la reacción
tenga lugar con un rendimiento aceptable, como se ilustra en el Esquema 6,
obteniéndose el precursor del building block objetivo.
Esquema 6. Reacción de Koenigs‐Knorr
A continuación, se reduce la azida del carbohidrato a amina y se acetila
en un solo paso. Se disuelve el compuesto 14 en una mezcla de disolventes de
THF/Ac2O/HAcO en proporción 3:2:1, añadimos sulfato de cobre (II) y Zn.
Esquema 7
3 a) Koenigs, W.; Knorr, E. Chem. Ber. 1901, 34, 957‐981; b) Liebe, B.; Kunz, H. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 618‐621.
28 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Finalmente, tras las extracciones y la purificación por columna en gel de
sílice se obtiene el compuesto final 1 (Esquema 7).
A continuación se muestra un esquema general que recoge todo el
proceso sintético seguido para obtener el building‐block objetivo de este Trabajo
Fin de Máster
29 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
HBr, 3h, Tª amb OAcO
AcO
OAc
2 3
OAcO
AcOOAc
OAc
OAc
BrAcO
Zn, NaH2PO4
88%
NaN3,FeCl3.6
H2O
-30ºC, 10h
OAcO
AcO
OAc
N3 Cl
5a
CAN, NaN3
CH3CN, atm inerte
-20ºC, 10h
OAcO
AcO
OAc
N3
ONO2
LiBr, CH3CN
Atm inerte, 8h
OAcO
AcO
OAc
N3 Br
5b
O
OAc
AcO
AcO
4
Na2CO3.10H2O
CO2Me
BocHNOH
8
ClH3N
CO2Me
OH
7
Boc2O, THF/H2O
Tolueno
O
NO
O
MeO
MeO2C
9
TsOH, TMB
Cl
O
CO2H
OHMeOH
6
H2N
LHMDS, HMPA, BnI
THF, -76ºC
O
NO
O
MeO
MeO2C Bn
10
1) HCl 6N, reflujo 12h
2) O , EtOH, reflujo 2h
H2N OH
CO2HBn
11
Fmoc-O-Suc
FmocHN OH
HO2CBn
12
NaHCO3 CH3CN/H2O
32ºC, 3d
tBuOH
CuCl, DCC
FmocHN OH
tBuO2CBn
13
5a + 13O
AcO
AcON3
OAc
NHFmoc
CO2tBu
O
Ag2CO3, AgClO4CH2Cl2/tolueno
Bn
14
1)THF/Ac2O/HAcO 3:2:12) CuSO4, Zn O
AcO
AcOAcHN
OAc
O
1
NHFmoc
CO2tBuBn
Esquema 9. Ruta sintética del glicoaminoácido 1.
4. Conclusiones
32 CONCLUSIONES
Se ha logrado obtener un nuevo glicosilaminoácido derivado del
antígeno Tn con rendimientos moderados mediante el acoplamiento de GalNAc y
un aminoácido ,‐disustituido (‐bencilserina) debidamente protegidos,
empleando la metodología de Koenigs‐Knorr.
Se ha conseguido proteger el grupo ácido del aminoácido en forma de
éster terc‐butílico, mientras que el grupo amino se ha protegido como carbamato
de Fmoc. El carbohidrato tiene los grupos hidroxilos protegidos en forma de
acetatos.
Esta síntesis permitirá más adelante estudiar las interacciones CH‐que se producen entre el carbohidrato y el grupo bencilo.
5. Experimental
36 EXPERIMENTAL
Los espectros de resonancia magnética nuclear de 1H y 13C se realizaron en un
espectrómetro Bruker Avance‐400 para todos los compuestos. Los
desplazamientos químicos se expresaron en ppm en la escala δ y las constantes
de acoplamiento (J) en Hz. Se utilizaron como disolventes deuterados cloroformo,
con TMS como referencia interna y agua deuterada, con referencia interna del
propio disolvente.
Los análisis de electrospray‐espectrometría de masas (ESI‐MS) se
realizaron en un equipo microTOF‐Q‐BRUKER con fuente MultiMode, ionización
ESI+APCI y se registraron en modo de ión positivo.
La cromatografía de capa fina se llevó a cabo en placas de silicagel
(Polychrom SI F254) sobre soporte de poliéster y para su visualización se utilizó luz
ultravioleta, disolución reveladora de H2SO4 al 5% en etanol y revelador de ácido
fosfomolíbdico en etanol.
La cromatografía de columna se realizó utilizando silicagel de 0.04‐0.06
mm.
37 EXPERIMENTAL
Tri-O-acetil-D-galactal (4)
Se disuelve en un matraz penta‐acetilgalactosa (10.0 g, 25.6 mmol) en
CH2Cl2 (50 mL) y se adiciona HBr (18mL, 331.5 mmol) en un baño de hielo. Se deja
agitando 3h a temperatura ambiente. Se añade al crudo de reacción NaHCO3 5%
(200 mL) y CH2Cl2 (60 mL). Se realizan extracciones con CH2Cl2 (2x100 mL), el
conjunto de fases orgánicas se seca con Na2SO4 anhidro, se filtra y se evapora,
obteniendo el correspondiente producto bromado. A continuación, éste se
redisuelve en acetona (150 mL) y se añade zinc (20.0 g, 305.8 mmol), la disolución
saturada de NaH2PO4 (10 mL) y NaH2PO4 sólido (1 g, 8.33 mmol), dejando
reaccionar durante 5 horas a temperatura ambiente. Se diluye el producto en
AcOEt (200 mL) y se filtra. Se extrae con NaCl saturado (60 mL), se seca con
Na2SO4 anhidro, se filtra y se evapora. El residuo se purifica por cromatografía de
columna sobre gel de sílice (hexano/AcOEt, 6:4) obteniéndose el compuesto 4
(6.15 g, 88%) como un aceite amarillo.
Sus propiedades físicas coinciden con las descritas en la bibliografía. 1
1 Carolin Plattner, C.; Höfener, M.; Sewald, N. Org. Lett. 2011, 13, 545–547
38 EXPERIMENTAL
Cloruro de 3,4,6-tri-O-acetil-2-azido-2-desoxi--D-galactopiranosa (5a)
En un matraz se disuelve el tri‐O‐acetil‐D‐galactal 4 (3.5 g, 12.9 mmol) en
CH3CN y se enfría a ‐30ºC. Se añaden a continuación azida de sodio (1.79 g, 27.5
mmol) y tricloruro de hierro hexahidrato (10.5 gr, 39.0 mmol) y se deja reaccionar
durante 10 horas. Se diluye el crudo con éter (150 mL) y se extrae con H2O (4x50
mL), NaHCO3 saturado (50 mL) y NaCl saturado (50 mL). Se seca con Na2SO4
anhidro, se filtra y se evapora, obteniéndose el compuesto 5a (3.53 g, 78%) como
un sólido blanco.
Sus propiedades físicas coinciden con las descritas en la bibliografía.2
2 Plattner, C.; Höfener, M.; Sewald, N., Org. Lett. 2011, 13, 545-547.
39 EXPERIMENTAL
L‐Ser‐OMe (7)
El compuesto L‐serina (10 g, 83.9 mmol) se disuelve en metanol (140 mL)
y se le añade cloruro de acetilo lentamente en un baño de hielos (20 mL, 281.28
mmol). A continuación se pone a reflujo durante 2 horas a una temperatura de
73ºC. Se evapora el disolvente en rotavapor y se obtiene así el compuesto 7 con
un rendimiento próximo al 100%.
Sus propiedades físicas coinciden con las descritas en la bibliografía.3
3 Tesis Doctoral Carlos Aydillo Miguel. Universidad de la Rioja, 2011
40 EXPERIMENTAL
Boc-L-Ser-OMe (8)
El compuesto 7 (12.7 g, 81,8 mmol) se disuelve en agua (100 mL). Se
añade dicarbamato de di‐terc‐butilo (Boc2O) (27.5 g, 126.1 mmol) disuelto en THF
(50 mL) y Na2CO3 (97.3 g, 917.92 mmol) disuelto en agua (50 mL). Se evapora el
THF y se extrae con éter (3x50 mL) y lavando con NaCl saturado (3x50 mL). La fase
orgánica se seca con Na2SO4 anhidro y se evapora. Se purifica por cromatografía
de columna sobre gel de sílice (hexano/AcOEt, 6:4) obteniéndose el compuesto 8
(16.6 g, 78%) como un sólido blanco.
Sus propiedades físicas coinciden con las descritas en la bibliografía.3
41 EXPERIMENTAL
7-Metoxi-7,7a-dimetil-5-oxotetrahidro-2H-oxazol[4,3-b]oxazol-3-carboxilato de metilo (9)
Se hace reaccionar el aminoácido de serina protegido 8 (16.6 g, 75.7
mmol) con 2,2,3,3‐tetrametoxibutano (TMB) (27.0 g, 151.5 mmol) en presencia de
ácido para‐toluenosulfónico (1.44 g, 8.2 mmol) disueltos en tolueno (30mL). Se
realizan extracciones con éter (3x50 mL) y se lava la fase orgánica con NaCl
saturado (3x50 mL). Se seca con Na2SO4 anhidro y se evapora el disolvente. Se
purifica por cromatografía de columna sobre gel de sílice (hexano/AcOEt, 8:2)
cambiando luego a hexano/AcOEt 1:1, obteniéndose el compuesto 9 (13.82 g, 74
%) como un aceite marrón.
Sus propiedades físicas coinciden con las descritas en la bibliografía.3
42 EXPERIMENTAL
3-bencil-7-metoxi-7-metil-5-oxotetrahidro-2H-oxazol[4,3-b]oxazol -3-
carboxilato de metilo (10)
N
OO
O
MeO
CO2Me
10
Para sintetizar el producto 10, hay que sintetizar previamente el yoduro de
bencilo.
- Síntesis de yoduro de bencilo
En un schlenk se añade imidazol (1.45 g, 21.24 mmol), se hace atmósfera
inerte y se disuelve en tolueno seco (80 mL). A continuación se añade alcohol
bencílico (1 mL, 9.45 mmol) y cloro difenilfosfina (2.30 mL, 12.55 mmol)
agitándose durante 30 minutos.
En otro schlenk se disuelve yodo (3.19 g, 12.55 mmol) en tolueno (40 mL), y se
añaden al imidazol, dejándose agitando durante otros 30 minutos protegido de la
luz. Finalmente se lava la mezcla Na2CO3 saturado (3x50 mL), se seca con Na2SO4
anhidro y se evapora el disolvente. El yoduro de bencilo se guarda en atmósfera
inerte y a baja temperatura.
- Síntesis del compuesto 10
En un schlenk se añade el producto 9 (300 mg, 1.30 mmol) y se hace
atmósfera inerte, disolviéndose posteriormente en THF seco (80 mL). Se pone el
43 EXPERIMENTAL
compuesto en frío a ‐78ºC y se añade el yoduro de bencilo, HMPA (1mL, 5.75
mmol) y LHMDS gota a gota (3 mL de una disolución en THF 1M).
La reacción se para en frío con NH4Cl saturado (150 mL). Se deja subir a
temperatura ambiente y se realizan extracciones con éter (3x50 mL), lavándose
finalmente con NaCl saturado (3x50 mL). Se seca el conjunto de fases orgánicas
con Na2SO4 anhidro, se filtra y se evapora. El residuo se purifica por columna
sobre gel de sílice (hexano/AcOEt, 8:2) obteniéndose el compuesto 10 (256 mg, 61
%) como un sólido blanquecino.
Sus propiedades físicas coinciden con las descritas en la bibliografía.4
4 Aydillo, C.; Jiménez‐Osés, G.; Busto, J. H.; Peregrina, J. M.; Zurbano, M. M.; Avenoza, A.;
Chem.‐ Eur. J. 2007, 13, 4840‐4848.
44 EXPERIMENTAL
(S)--Bencilserina (11)
El producto 10 (256 mg, 0.76 mmol) se disuelve en HCl 6N (30 mL) y se
deja a reflujo a 100ºC durante 15 horas. El crudo de reacción se lava con H2O (50
mL) y se extrae con AcOEt (3x30 mL), quedándonos con la fase acuosa, que se
evapora, resultando un aceite oscuro.
Se disuelve el producto en EtOH (35 mL) y se añade óxido de propileno (35 mL). Se
deja la mezcla a reflujo durante 2 horas a 75ºC.
Se evapora el disolvente, se disuelve el producto con agua (50 mL) y se extrae con
AcOEt (3x30 mL). Se evapora el agua y se obtiene el producto 11 como un sólido
blanco. (132 mg, 88%)
Sus propiedades físicas coinciden con las descritas en la bibliografía.3
45 EXPERIMENTAL
Fmoc-(S)--Bencilserina (12)
Se disuelve el producto 11 (132 mg, 0.676 mmol) en H2O (30 mL) y se
añade NaHCO3 (0.50 g, 5,95 mmol). Se comprueba que el pH sea básico. Se añade
la Fmoc‐O‐Succinimida (0.85 g, 2.52 mmol), se añade CH3CN (60 mL) y se deja
calentando a 32ºC durante 3 días.
Se evapora el CH3CN y se hacen extracciones con éter (3x30 mL). Se acidifica el
medio básico con HCl 2N. Se realizan nuevas extracciones con CHCl3/iPrOH, se
seca el conjunto de fases orgánicas con Na2SO4 anhidro y se evapora
obteniéndose el producto 12, que se utiliza en la siguiente etapa sin purificación
previa.
46 EXPERIMENTAL
Fmoc-(S)--Bencilserina-OtBu (13)
FmocHN OH
tBuO2CBn
13
Se añade a un matraz de dos bocas, DCC (N,N'‐diciclohexilcarbodiimida)
(300 mg, 1.45 mmol) y CuCl (10 mg, 0.102 mmol) bajo atmósfera inerte. Se
disuelve todo entBuOH (100 mg, 1.35 mmol) y se deja reaccionar protegido de la
luz durante 5 días.
Se añade gota a gota el producto 12 (200 mg, 0.479 mmol) disuelto en CH2Cl2 seco
y se deja reaccionar durante un día más. Se filtra el crudo sobre tierra de
diatomeas y se realizan extracciones con NaHCO3. Se seca la fase orgánica con
Na2SO4 anhidro y se evapora.
El producto se utiliza en la siguiente etapa sin purificación previa.
47 EXPERIMENTAL
Fmoc-(S)--Bencilserina (-O-D-tri-O-acetil-2-azido-2-desoxigalactosil)-OtBu (14)
Se añade el compuesto 13 (220 mg, 0.46 mmol) con tamiz molecular,
tolueno (5 mL) y CH2Cl2 (10 mL) bajo atmosfera inerte. Se añade Ag2CO3 (213 mg,
0.776 mmol) y AgClO4 (23 mg, 0.113 mmol). Se añade el compuesto 5a (392 mg,
1.123 mmol) disuelto en una mezcla de tolueno/CH2Cl2 1:1 (20 mL). Se deja
reaccionar 12 horas protegido de la luz y a temperatura ambiente, se filtra sobre
tierra de diatomeas y se evapora.
El producto se utiliza en la siguiente etapa sin purificación previa.
48 EXPERIMENTAL
Fmoc-(S)--Bencilserina (-O-D-tri-O-acetil-2-N-acetil-2-desoxigalactosil)-OtBu (1)
Se añade a un matraz el compuesto 10 (50 mg, 0.064 mmol) y se disuelve
en una mezcla de disolventes THF/Ac2O/HAcO en proporción 3:2:1 (3 mL, 2 mL, y
1 mL respectivamente). Se añade una disolución de CuSO4 (100 µL) y Zn sólido (55
mg, 0.782 mmol) y se deja reaccionar durante 1 hora.
Se filtra la disolución con diatomeas, y se evapora el disolvente añadiendo tolueno
para arrastrar el ácido. Se purifica por cromatografía de columna sobre gel de
sílice (hexano/AcOEt 2:8) obteniéndose el compuesto 1.
1H RMN (400 MHz, CDCl3) (ppm): 7.82 (d, 2H, J=7.5 Hz, FmocAr), 7.67 (d, 1H,
J=7.5 Hz, FmocAr), 7.62 (d, 1H, J=7.3 Hz, FmocAr), 7.45 (t, 2H, J=7.3 Hz, FmocAr),
7.36 (d, 2H, J=13.9 Hz, FmocAr), 7.26 (s, 3H, o,p‐Bn), 7.11 (s, 2H, m‐Bn), 5.82 (s, 1H,
NHAc), 5.62 (d, 1H, J=9.8 Hz, HS1), 5.35 (s, 1H, HS3), 5.13 (d, 1H, J=10.1 Hz, HS4),
4.92 (s, 1H, HS2), 4.61 (m, 1H, FmocCH2), 4.60 (s, 1H, H), 4.32 (s, 1H, HS5), 4.32 (s,
1H, J=7.5 Hz, FmocCH2), 4.16 (m, 2H, HS6), 4.12 (s, 1H, FmocCH), 4.02 (dd, 1H, HS6),
3.84 (d, 1H, J=9.9 Hz, H), 3.55 (d, 1H, J=13.6 Hz, BnCH2), 2.99 (d, 2H, J=13.6 Hz,
BnCH2), 2.18 (s, 3H, AcO‐NH), 2.02 (s, 3H, AcO), 1.98 (s, 3H, AcO), 1.94 (s, 3H, AcO),
1.50 (s, 9H, O‐tBu).
49 EXPERIMENTAL
13C RMN (75 MHz, CDCl3) (ppm): 130.20 (m‐Bn), 128.88 (o,p‐Bn), 127.80 (FmocAr),
127.22 (FmocAr), 125.34 (FmocAr), 124.98 (FmocAr), 119.91 (FmocAr), 98.23 (HS2),
69.93 (H), 68.75 (HS4), 66.97 (HS3; FmocCH), 61.26 (HS6), 47.72 (FmocCH2), 47.02
(HS5), 130.20 (m‐Bn), 37.12 (BnCH2), 27.97 (O‐tBu), 23.24 (NH‐OAc), 20.71 (OAc),
6. Anexo: Espectros de Resonancia
Magnética Nuclear del Producto Final
52 ANEXO: ESPECTROS DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DEL PRODUCTO FINAL
1H RMN (400 MHz, CDCl3)
13C RMN (75 MHz, CDCl3)
53 ANEXO: ESPECTROS DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DEL PRODUCTO FINAL
COSY (400 MHz, CDCl3)
HSQC (CDCl3)