nueva síntesis de un análogo azufrado del antígeno tn · facultad de ciencias, estudios...

Marcos Villar Santamaría

María del Mar Zurbano Asensio y Jesús Manuel Peregrina García

Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática

Grado en Química

2014-2015

Título

Director/es

Facultad

Titulación

Departamento

TRABAJO FIN DE GRADO

Curso Académico

Nueva síntesis de un análogo azufrado del antígeno TN

Autor/es

© El autor© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2015

publicaciones.unirioja.esE-mail: [email protected]

Nueva síntesis de un análogo azufrado del antígeno TN, trabajo fin de gradode Marcos Villar Santamaría, dirigido por María del Mar Zurbano Asensio y Jesús Manuel Peregrina García (publicado por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una Licencia

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UNIVERSIDAD DE LA RIOJA

FACULTAD DE CIENCIAS, ESTUDIOS AGROALIMENTARIOS E INFORMÁTICA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ÁREA DE QUÍMICA ORGÁNICA

CURSO 2014-2015

Trabajo Fin de Grado

Grado en Química

Marcos Villar Santamaría Junio 2015

NUEVA SÍNTESIS DE UN ANÁLOGO

AZUFRADO DEL ANTÍGENO TN

Tutores: María del Mar Zurbano Asensio Jesus Manuel Peregrina García

MARÍA DEL MAR ZURBANO ASENSIO, Profesora Titular de Química Orgánica del

Departamento de Química de la Universidad de La Rioja.

JESÚS MANUEL PEREGRINA GARCÍA, Catedrático de Química Orgánica del

Departamento de Química de la Universidad de La Rioja.

HACEN CONSTAR:

Que la memoria "NUEVA SÍNTESIS DE UN ANÁLOGO AZUFRADO DEL ANTÍGENO TN" ha sido realizada por el alumno MARCOS VILLAR SANTAMARÍA en el Departamento de Química de la Universidad de La Rioja, bajo su inmediata dirección y reúne las condiciones exigidas para conseguir los 15 créditos ECTS correspondientes al período de investigación del Trabajo Fin de Grado.

Logroño, Junio 2015

Fdo.: María del Mar Zurbano Asensio Fdo.: Jesús Manuel Peregrina García

Índice Abreviaturas 1. Resumen 2. Introducción

2.1 Importancia biológica de las O-glicoproteínas 2.2 S-glicoproteínas y S-glicopéptidos

3. Antecedentes 4. Objetivos específicos 5. Discusión de resultados

5.1 Síntesis de un nuevo aceptor de Michael 5.2 Síntesis del dador GalNAc-α-SH 5.3 Reactividad S-Michael del equivalente sintético de

deshidroalanina 5.4 Obtención del análogo azufrado del antígeno Tn

6. Conclusiones 7. Parte experimental Anexo: Espectros de RMN

I

1

5 7

10

13

17

21 23 29

31 34

37

41

49

I Abreviaturas

Abreviaturas δ desplazamiento químico [α]25

D rotación específica µ micro oC grado Celsius 1H RMN resonancia magnética nuclear de protón 13C RMN resonancia magnética nuclear de carbono-13 Ac acetilo Ac2O anhídrido acético AcCl cloruro de acetilo AcOEt acetato de etilo anh anhidro APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization Boc terc-butoxicarbonilo Boc2O di-terc-butildicarbonato tBu terc-butilo c concentración cat catalizador cc concentrado/a COSY correlated spectroscopy Cys cisteína d doblete DBU 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno DCC N,N´-diciclohexilcarbodiimida DCM diclorometano dd doblete de dobletes ddd doblete de dobletes de dobletes Dha deshidroalanina DMAP 4-(dimetilamino)piridina ESI ionización por electrospray Et2O éter dietílico eq equivalente/s Fmoc 9-fluorenilmetoxicarbonilo g gramo GalNAc N-acetilgalactosamina h hora HC(OMe)3 ortoformiato de trimetilo

II Abreviaturas

Hex hexano HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence Hz hercio J constante de acoplamiento KHMDS hexametildisililamiduro de potasio M molaridad Me metilo MeOH metanol mg miligramo MHz megahercio min minuto mL mililitro mm milímetro mmol milimol mol mol MS espectrometría de masas m/z relación masa/carga NOE efecto nuclear Overhauser p posición para p-TsOH·H2O ácido p-toluensulfónico monohidrato ppm partes por millón RMN resonancia magnética nuclear s singlete Ser serina t triplete t.a. temperatura ambiente TFA ácido trifluoroacético THF tetrahidrofurano Thr treonina TLC cromatografía de capa fina TMB 2,2,3,3-tetrametoxibutano TMS tetrametilsilano TOF tiempo de vuelo

1.- Resumen

3 Resumen

Situándonos en el ámbito de las glicoproteínas, y más concretamente en el de los glicoaminoácidos, el antígeno Tn (α-O-GalNAc-Ser/Thr) es uno de los más importantes, ya que está relacionado con una de las enfermedades más relevantes de la actualidad, el cáncer.

Este antígeno suele formar parte de las mucinas, O-glicoproteínas que intervienen en la respuesta inmunitaria, cuya alteración producida por cambios en la glicosilación hace que el antígeno Tn quede expuesto al sistema inmune. Este hecho se da en células cancerígenas, por lo que se abre una nueva vía de estudio para el desarrollo de vacunas para la terapia contra dicha enfermedad.

La alta degradación de los O-glicopéptidos en los sistemas biológicos hace que su uso terapéutico a veces esté imposibilitado. Por esta razón, otra vía de estudio de la actividad biológica del antígeno Tn es mediante modificaciones estructurales, como puede ser la S-glicosilación. En concreto, en este Trabajo Fin de Grado se ha sintetizado un análogo azufrado del antígeno Tn a partir de la D-serina.

La síntesis de este compuesto ya había sido descrita con anterioridad en varias publicaciones utilizando metodologías diferentes. En esta ocasión, la síntesis se lleva a cabo mediante una adición de S-Michael diastereoselectiva entre el N-acetil-tri-O-acetil-α-S-D-tiogalactosamina (GalNAc-α-SH) y un equivalente sintético bicíclico y quiral de deshidroalanina.

Siguiendo esta nueva metodología sintética y ya fuera del ámbito de este trabajo, se podrá abordar la formación de péptidos no naturales que incorporen este S-glicoaminoácido sintetizado y su posterior estudio biológico.

4 Abstract

In the field of glycoproteins, more specifically in the topic of glycosylated amino acids, the Tn antigen (α-O-GalNAc-Ser/Thr) is one of the most important, because it is associated with cancer.

This antigen is often part of mucins, O-glycoproteins involved in immune response, whose alteration, caused by changes in glycosylation, makes the Tn antigen be exposed to the immune system. This happens in cancer cells, opening a new path of study for the development of vaccines for therapy against this disease.

Therapeutic use of O-glycopeptides is sometimes limited, since they are highly degradated in biological systems. For this reason, another way of studying the biological activity of the Tn antigen involves structural modifications, such as the S-glycosylation. Specifically, in this final project, a sulfur analog of Tn antigen has been synthesized from D-serine.

The synthesis of this compound has been previously reported in several publications using different methodologies. On this occasion, the synthesis is carried out by a highly diastereoselective S-Michael addition between N-acetyl-tri-O-acetyl-α-S-D-thiogalactosamine (GalNAc-α-SH) and a bicyclic and chiral synthetic equivalent of dehydroalanine.

Following this new synthetic methodology and outside the scope of this work, it could be attempted the synthesis of new non natural peptides incorporating this synthesized S-glycosylated amino acid and subsequent biological studies will be developed in due course.

2.- Introducción

7 2.- Introducción

2.1 Importancia biológica de las O-glicoproteínas

En la naturaleza, existen tanto carbohidratos como aminoácidos, ambos involucrados en la mayoría de los procesos biológicos que se dan en ella.

Los carbohidratos son biomoléculas mayoritariamente compuestas por carbono, oxígeno e hidrógeno, cuyas funciones en los seres vivos son de gran importancia. Por ejemplo, poseen tanto funciones estructurales (la celulosa presente en la pared de las células vegetales) como funciones energéticas (las células utilizan la glucosa (Figura 2.1) como fuente de energía).

Figura 2.1 Equilibrio entre α- y -D-glucopiranosa

Por otro lado, los aminoácidos son moléculas orgánicas con una característica principal: tienen un grupo carboxilo (-CO2H) y un grupo amino (-NH2). Los L-aminoácidos (Figura 2.2) son esenciales para la formación de péptidos y proteínas, por eso se conocen como proteinogénicos.

Figura 2.2 L-serina (Ser)

Los carbohidratos y las proteínas (o péptidos) pueden unirse mediante un enlace α- o β-glicosídico al grupo hidroxilo de la cadena lateral de una serina o treonina para dar una O-glicoproteína o O-glicopéptido (Figura 2.3).

Figura 2.3 α- y -O-glicosilación

8 2.- Introducción

Las O-glicoproteínas (Figura 2.4) son componentes de la superficie celular donde sus oligosacáridos están involucrados en procesos de reconocimiento molecular.

Figura 2.4 Estructura cristalina de una glicoproteína del virus del Ébola1

Uno de los glicoaminoácidos más importantes es el antígeno Tn (α-O-GalNAc-Ser/Thr) (Figura 2.5),2 que está formado por la unión de N-acetilgalactosamina a serina o treonina mediante un enlace O-glicosídico de tipo α.

1 J. E. Lee, M. L. Fusco, A. J. Hessell, W. B. Oswald, D. R. Burton, E. O. Saphire, Nature,

2008, 454, 177. 2 W. Dahr, G. Uhlenbruck, H. H. Gunson, M. Van Der Hart, Vox Sang.1975, 29, 36.

Carbohidrato

Parte peptídica

9 2.- Introducción

Figura 2.5 Antígeno Tn

Este antígeno está implicado en los procesos de multiplicación de células cancerosas. Por ello, ha sido muy estudiado durante los últimos años como marcador o diana terapéutica contra dicha enfermedad.3 De hecho, varios grupos de investigación han desarrollado vacunas basadas en el antígeno Tn para el tratamiento y la prevención de carcinomas.4

Unas O-glicoproteínas importantes en las respuestas inmunológicas o en procesos contra la inflamación son las mucinas (Figura 2.6). Son moléculas de gran interés en el desarrollo de vacunas contra el cáncer,5 y el antígeno Tn (Figura 2.5) es uno de los componentes principales de las cadenas de mucina.

Figura 2.6 Parte de la O-glicoproteína de una mucina

3 P. R. Desai, Tranfus. Med. Rev. 2000, 14, 312. 4(a) S. Ingale, M. A. Wolfert, J. Gaekwad, T. Buskas, G. J. Boons, Nat. Chem. Biol. 2007, 3, 663; (b) R. Lo-Man, S. Vichier-Guerre, R. Perraut, E. Dériaud, V. Huteau, L. BenMohamed, O. M. Diop, P. O. Livingston, S. Bay, C. Leclerc, Cancer Res. 2004, 64, 4987. 5 J. N. Blattman, P. D. Greenberg, Science 2004, 305, 200.

10 2.- Introducción

Hoy en día se sabe que las mucinas en células cancerosas están sobreexpresadas, ocurriendo cambios en la glicosilación. Presentan glicoproteínas con glicanos más cortos y menos complejos de lo normal. Debido a este hecho, varios fragmentos como el antígeno Tn quedan expuestos al sistema inmune (Figura 2.7).6

Figura 2.7 Mucina sana y mucina con errores de glicosilación

2.2 S-glicoproteínas y S-glicopéptidos

En la naturaleza también existen otro tipo de glicoproteínas, como son las S-glicoproteínas o los S-glicopéptidos. Esto ocurre cuando el carbohidrato se une a la parte peptídica a través de un enlace glicosídico mediado por el azufre de una cisteína (Figura 2.8).

Figura 2.8 S-glicosilación

6 (a) S. Sell, Human Path, 1990, 21, 1003-1019; (b) S. Hakomori, Y. Zhang, Chem. Biol.

1997, 4, 97.

11 2.- Introducción

La baja estabilidad química de los O-glicopéptidos ha hecho que su uso terapéutico muchas veces este imposibilitado. Por ello, estudios recientes se han centrado en la síntesis de glicopéptidos análogos con el enlace glicosídico más estable, para poder así estudiar su actividad biológica.7

La síntesis de análogos del antígeno Tn azufrados (incorporando una cisteína glicosilada en lugar de serina o treonina) es de gran importancia, ya que el cambio del átomo de azufre por el de oxígeno, pasando de una O-glicoproteína a una S-glicoproteína, mejora la estabilidad química, los hace más resistentes frente a las enzimas y son toleradas por más sistemas biológicos.8 De hecho, el análogo azufrado del antígeno Tn tiene una mejor actividad inmunoestimulante con respecto al antígeno Tn presente en la naturaleza (Figura 2.5).9

Además, se han encontrado cisteínas S-glicosiladas en algunas bacteriocinas, como la sublancina, propias de algunas bacterias. Esta glicosilación es esencial para su actividad antimicrobiana.

Teniendo en cuenta la importancia de este análogo azufrado del antígeno Tn (S-α-D-GalNAc-L-Cys), el objetivo principal de este trabajo de investigación es su síntesis, la cual se pretende abordar a partir del aminoácido no natural D-serina (Esquema 2.1).

Esquema 2.1

7(a) L. A. Marcaurelle, C. R. Bertozzi, Chem.-Eur. J. 1999, 5, 1384; (b) D. P. Gamblin, E. M. Scanlan, B. G. Davis, Chem. Rev. 2009, 109, 131. 8 B. Capon, Chem. Rev. 1969, 69, 407. 9 (a) E. Bousquet, A. Spadaro, M. S. Pappalardo, R. Bernardini, R. Romeo, L. Panza, G. Ronsisvalle, J. Carbohydr. Chem. 2009, 19, 527; (b) J. R. Rich, D. R. Bundle, Org. Lett.

2004, 6, 897; (c) B. Kuberan, S. A. Sikkander, H. Tomiyama, R. J. Linhardt, Angew.

Chem., Int. Ed. 2003, 42, 2073.

3.- Antecedentes

15 3.- Antecedentes

Como ya se ha comentado brevemente en la introducción, el objetivo de este Trabajo Fin de Grado es la síntesis de un análogo azufrado del antígeno Tn.

Para su síntesis, existen varias metodologías. Una de ellas, utiliza un derivado de β-bromoalanina y el GalNAc-α-SH, con unas condiciones de reacción difíciles de reproducir (Esquema 3.1).1

Esquema 3.1

Por ello, en el grupo de investigación en el que se ha hecho este trabajo, se realizó la síntesis del building block azufrado análogo al antígeno Tn, utilizándose una reacción del tipo S-Michael asimétrica, como etapa principal, seguida de hidrólisis ácida (Esquema 3.2).2

Esquema 3.2

1 D. A. Thayer, H. N. Yu, M. C. Galan, C.-H. Wong, Angew. Chem., Int. Ed. 2005, 44, 4596. 2 C. Aydillo, I. Compañón, A. Avenoza, J. H. Busto, F. Corzana, J. M. Peregrina, M. M. Zurbano, J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 5354.

16 3.- Antecedentes

Además, recientemente en el citado grupo de investigación, se ha sintetizado el diastereómero de dicho compuesto objetivo, utilizando otro aceptor de Michael diferente para intentar aumentar la reactividad del alqueno (Esquema 3.3).3

Esquema 3.3

En este caso, se utiliza un biciclo como equivalente sintético de la deshidroalanina (aceptor de Michael), ampliando así la versatilidad de las reacciones S-Michael.

En el caso de este trabajo de investigación, se pretende utilizar la metodología anteriormente mencionada, pero a partir de la deshidroalanina de configuración contraria (Esquema 3.4).

Esquema 3.4

3 M. I. Gutiérrez-Jiménez, Trabajo de Investigación Proyecto Fin de Máster, Universidad de La Rioja, 2014.

4.- Objetivos específicos

19 4.- Objetivos específicos

Teniendo en cuenta los antecedentes mencionados anteriormente y con idea de conseguir el objetivo principal de este trabajo que consiste en la síntesis del análogo azufrado del antígeno Tn que aparece a continuación (Figura 4.1), es preciso desarrollar una serie de objetivos específicos que nos conduzcan a él.

Los objetivos específicos de este trabajo se pueden dividir en tres puntos:

1. Sintetizar un nuevo N,O-acetal bicíclico quiral, a partir de la D-serina,

equivalente sintético de la deshidroalanina (Dha), que sea un buen

aceptor de Michael para comprobar su reactividad frente al

tiocarbohidrato GalNAc-α-SH. Se pretende mejorar la reactividad en las

adiciones de Michael de los alquenos ya estudiados previamente.

2. Comprobar la reactividad S-Michael de este nuevo equivalente sintético

de deshidroalanina (Dha) frente al tiocarbohidrato GalNAc-α-SH, de

manera diastereoselectiva, obteniendo, si es posible, un único

diastereoisómero.

3. Obtención del análogo azufrado del antígeno Tn (S-α-D-GalNAc-L-Cys) a

partir del diastereómero obtenido en el paso anterior, utilizando una

hidrólisis, y su posterior comprobación comparando sus características

físicas con las descritas en la bibliografía.1

Figura 4.1 Análogo azufrado del antígeno Tn

1C. Aydillo, I. Compañón, A. Avenoza, J. H. Busto, F. Corzana, J. M. Peregrina, M. M. Zurbano, J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 5354.

5.- Discusión de resultados

23 5.- Discusión de resultados

Como ya se ha mencionado con anterioridad, la molécula objetivo (Figura 5.1), es el análogo azufrado del antígeno Tn, ya sintetizado anteriormente con diferentes metodologías,1,2 y al que le hemos llamado compuesto 7.

Figura 5.1. Antígeno Tn y molécula objetivo

Podemos estructurar este apartado en cuatro bloques; inicialmente se comentará la síntesis de un nuevo aceptor de Michael, equivalente sintético de la deshidroalanina (Dha); a continuación, la síntesis del tiocarbohidrato GalNAc-α-SH y la reactividad Sulfa-Michael del equivalente sintético de la Dha. Finalmente, la obtención del análogo azufrado del antígeno Tn.

5.1 Síntesis de un nuevo aceptor de Michael

En este apartado se lleva a cabo la síntesis de un nuevo aceptor de Michael bicíclico (compuesto 4), equivalente sintético de la deshidroalanina (Dha) (Figura 5.2)

Figura 5.2. Deshidroalanina (Dha) y su equivalente sintético (4)

5.1.1 Síntesis del equivalente síntético de la D-serina (Ser) 1D. A. Thayer, H. N. Yu, M. C. Galan, C.-H. Wong, Angew. Chem., Int. Ed. 2005, 44, 4596. 2 C. Aydillo, I. Compañón, A. Avenoza, J. H. Busto, F. Corzana, J. M. Peregrina, M. M. Zurbano, J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 5354.


Para la síntesis del nuevo aceptor de Michael hay que realizar primero la síntesis de su precursor, un N,O-acetal bicíclico equivalente sintético de la D-serina (1). Se optó por utilizar la misma metodología que para el equivalente sintético de la L-serina, ya sintetizado previamente en el grupo de investigación donde se ha realizado el trabajo.3 En ese caso, se partía del aminoácido natural, pero se obtenía el equivalente sintético de configuración contraria. Por eso, en nuestro caso se partió de la D-serina (Figura 5.3).

Figura 5.3. L y D-serina

Inicialmente, se realizó la esterificación del grupo ácido de la D-serina por el método de Fischer (Esquema 5.1). Ésta se llevó a cabo con cloruro de acetilo y metanol, durante dos horas a reflujo, generándose cloruro de hidrógeno. Se obtuvo, como único producto, el clorhidrato del éster metílico de la D-serina de una manera casi cuantitativa.

Esquema 5.1



A continuación, el clorhidrato del éster metílico de la D-serina se trató con di-terc-butildicarbonato (Boc2O), con el objetivo de proteger la amina en forma de terc-butoxicarbonilo (N-Boc), y carbonato de sodio decahidrato (asegurarse de que la disolución quede básica, midiendo el pH) en una mezcla THF/H2O (4:1) durante 16 horas a temperatura ambiente (Esquema 5.2). El rendimiento de esta reacción, como en la anterior (Esquema 5.1), es casi cuantitativo.

Esquema 5.2

El 2,2,3,3-tetrametoxibutano (TMB), segundo producto de partida de nuestra síntesis tras la D-serina, se obtuvo a partir del ortoformiato de trimetilo y de la 2,3-butanodiona en MeOH, utilizando una catálisis ácida4 con ácido sulfúrico concentrado (Esquema 5.3), durante 20 horas a reflujo. Se neutralizaron los posibles restos de ácido con carbonato de sodio. El TMB se purificó por destilación a vacío.

Esquema 5.3

4 J. L. Montchamp, F. Tian, M. E. Hart, J. W. Frot, J. Org. Chem. 1996, 61, 3897.


Una vez obtenidos tanto el éster metílico de la (R)-N-Boc-serina como el TMB, se hicieron reaccionar para obtener el equivalente bicíclico de la D-serina (1). Para ello, se utilizaron las condiciones de reacción citadas en síntesis previas del grupo.5 Se usó el p-TsOH como catalizador y tolueno como disolvente (Esquema 5.4). Se dejó a reflujo durante 12 horas.

Esquema 5.4

Como se puede observar en el Esquema 5.4, se generan dos nuevos centros quirales, debidos a la configuración del producto de partida, la D-serina. Ésto indica que se tiene un completo control de la estereoselectividad, y además, con buenos rendimientos. El compuesto 1 se obtuvo como un aceite amarillo.

5 (a) C. Aydillo, A. Avenoza, M. M. Zurbano, J. H. Busto, G. Jiménez-Osés, J. M. Peregrina, Tetrahedron: Assymetry, 2008, 19, 2829. (b) C. Aydillo, G. Jiménez-Osés, M. M. Zurbano, J. H. Busto, J. M. Peregrina, A. Avenoza, Chem. Eur. J. 2007, 13, 4840. (c) J. H. Busto, G. Jiménez-Osés, C. Aydillo, M. M. Zurbano, J. M. Peregrina, A. Avenoza, J.

Org. Chem. 2007, 72, 5399.


5.1.2 Síntesis del aceptor de Michael, equivalente sintético de deshidroalanina (Dha)

Tras la obtención del compuesto bicíclico equivalente sintético de la D-serina (Esquema 5.4), se realizó una reacción de β-eliminación para obtener el deshidroaminoácido quiral (2). Para ello, se añadieron 2 equivalentes de KHMDS gota a gota al compuesto bicíclico 1 en THF anhidro a -78 °C, durante 5 minutos bajo atmósfera inerte (Esquema 5.5).

Esquema 5.5

Entonces, después de los 5 minutos (se observa un color amarillo anaranjado), se añadió el mismo volumen de una disolución saturada de NH4Cl que el añadido de THF. A continuación, se realizó el work-up y se purificó por cromatografía en gel de sílice. Se obtuvo el acrilato como un sólido blanco con buen rendimiento (82%).

Seguido, se sintetizó el derivado ácido (3) del acrilato (2) (Esquema 5.6). Para ello, se realizó la hidrólisis del éster metílico en medio básico con hidróxido de litio monohidrato, en una mezcla THF/H2O (1:1) durante 30 min a 0 °C. Por último, se añadió HCl 2 M para asegurse que el compuesto formado quede protonado, y tras el consiguiente work-up, se obtuvo el compuesto 3 como un sólido blanco.

Esquema 5.6


Para obtener el compuesto bicíclico deseado (4), se realizó una lactonización utilizando agentes de acoplamiento. Para ello, al compuesto 4 se le añadió N,N´-diciclohexilcarbodiimida (DCC) y 4-dimetilaminopiridina (DMAP) en diclorometano anhidro bajo atmósfera inerte (Esquema 5.7).

Esquema 5.7

El compuesto bicíclico formado (4) se purificó filtrando sobre tierra de diatomeas con una fina capa de sílica y por cromatografía de columna sobre gel de sílice.


5.2 Síntesis del dador GalNAc-α-SH

Para realizar la adición de Michael se necesita sintetizar, además de un aceptor de Michael (4), un dador. En nuestro caso, el dador fue un tiocarbohidrato, el GalNAc-α-SH (5), que se sintetizó del modo propuesto en la bibliografía.6 Para ello, fueron necesarias tres etapas de reacción.

Primero se realizó la síntesis de la galactosamina peracetilada añadiendo anhídrido acético en piridina sobre el clorhidrato de la galactosamina comercial (Esquema 5.8).

Esquema 5.8

A continuación, se añadió el reactivo de Lawesson (Figura 5.9) sobre el carbohidrato peracetilado, y se dejó una noche a reflujo, utilizando tolueno como disolvente (Esquema 5.9).

Figura 5.9. Reactivo de Lawesson, el monómero es la molécula reactiva

Esquema 5.9

6 S. Knapp, D. S. Myers, J. Org. Chem. 2002, 9, 2995.


Para finalizar, se realizó la hidrólisis del ciclo formado añadiendo primero TFA en MeOH a 0 °C, y por último H2O a temperatura ambiente durante 2 horas (Esquema 5.10).

Esquema 5.10

La espuma blanca obtenida (5) se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice.


5.3 Reactividad S-Michael del equivalente sintético de deshidroalanina

Una vez obtenidos puros los dos compuestos deseados, se procedió a la realización de la adición S-Michael. Se utilizaron las condiciones de reacción mostradas a continuación (Esquema 5.11).

Esquema 5.11

Se disolvieron los compuestos 4 y 5 en THF anhidro, bajo atmósfera inerte. Se dejó enfriar a -78 °C y se añadió la base 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU) lentamente. Al cabo de 3 horas, se añadió una disolución saturada de cloruro amónico y se purificó por cromatografía de columna sobre gel de sílice, obteniendo un rendimiento casi cuantitativo de un único producto.


Es de destacar la alta estereoselectividad con la que transcurre la adición de S-Michael. La generación del centro estereogénico ocurre en la etapa de protonación, efectuándose ésta exclusivamente por una de las dos caras del enolato formado (Esquema 5.12)

Esquema 5.12

La estereoquímica propuesta se corroboró mediante un experimento NOE. Así, el efecto NOE observado entre la señal del grupo metilo del biciclo y la señal correspondiente a los protones CH2 de la subestructura de la cisteína, confirma que ambos grupos presentan una disposición cis (Figura 5.4). Por tanto, el compuesto 6 se corresponde con el compuesto que aparece en la Figura 5.5.


Figura 5.4 Espectro NOE en el que se puede ver un pico de cruce entre el grupo metilo y el grupo CH2 de la cisteína.

Figura 5.5 Los dos posibles isómeros formados en la adición de S-Michael


5.4 Obtención del análogo azufrado del antígeno Tn

Para finalizar, se realizó una hidrólisis con HCl (4 M) a 40 °C durante una noche, para obtener el S-α-D-GalNAc-L-Cys deseado (compuesto 7) (Esquema 5.13).

Esquema 5.13

Para corroborar la estereoquímica generada en la reacción de S-Michael, se compararon los datos físicos de este compuesto 7 con los que aparecen publicados en la bibliografía para este mismo compuesto, pero sintetizados por otra metodología (Esquema 5.14).2

J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 5354–5357

Esquema 5.14


Se compararon los espectros de RMN de 1H de ambos compuestos con el espectro obtenido en este trabajo, coincidiendo el compuesto 7 con el producto que tiene configuración R en la cisteína (Figura 5.6).

Figura 5.6 Análogo azufrado del antígeno Tn

6.- Conclusiones

39 6.- Conclusiones

Como se ha podido comprobar a lo largo de este trabajo de investigación, se han llevado a cabo diversas rutas sintéticas con las que podemos concluir varios aspectos:

1. Se ha sintetizado un equivalente sintético bicíclico quiral de la

deshidroalanina, a partir de la D-serina, utilizando la metodología descrita en la literatura, de manera estereoselectiva y con altos rendimientos (Figura 6.1).1

Figura 6.1 Equivalente sintético de la deshidroalanina

2. A partir del tiocarbohidrato GalNAc-α-SH (5) y el biciclo quiral (4), se realizó la adición de S-Michael, que transcurrió de manera altamente diastereoselectiva, ya que se obtuvo un único diastereoisómero (Figura 6.2). Cabe resaltar que, como en la síntesis del deshidroaminoácido quiral, el rendimiento fue bastante alto, en este caso casi cuantitativo.

Figura 6.2 Adición de S-Michael


40 6.- Conclusiones

La estereoquímica de este aducto de Michael se estableció mediante experimentos de tipo NOE.

3. Por último, se llevó a cabo la hidrólisis del compuesto anterior (6),

obteniendo el compuesto S-α-D-GalNAc-L-Cys de manera estereoselectiva. La obtención del análogo azufrado del antígeno Tn (7) permitió corroborar la estereoquímica del centro estereogénico creado en la adición de S-Michael, comparando sus datos físicos (1H RMN) con los publicados en la bibliografía (Figura 6.3).2

Figura 6.3 S-α-D-GalNAc-L-Cys

2C. Aydillo, I. Compañón, A. Avenoza, J. H. Busto, F. Corzana, J. M. Peregrina, M. M. Zurbano, J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 5354.

7. Parte experimental

43 7.- Parte experimental

Notas previas:

- Todas las reacciones se llevaron a cabo utilizando disolventes secos,

previamente purificados y secados mediante técnicas estándar.

- La cromatografía de capa fina se realizó en placas de silicagel (Polichrom SI F254) sobre soporte de poliéster. Para su visualización se utilizó luz ultravioleta y reveladores de ácido fosfomolíbdico y ácido sulfúrico (cc al 5 %) ambos en etanol.

- La cromatografía de columna se realizó utilizando silicagel de 0.04 -

0.06 mm.

- Los análisis electrospray-espectrometría de masas (ESI-MS) se

realizaron en un equipo microTOF-Q-BRUKER con una fuente Multi

Mode e ionización ESI+APCI.

- Los espectros de RMN 1H y 13C se realizaron en un espectrómetro Bruker Avance-400. Los desplazamientos químicos se expresaron en ppm en la escala δ y las constantes de acoplamiento (J) en Hz. Se utilizó como disolvente deuterado cloroformo (CDCl3), con TMS como referencia interna, y agua deuterada (D2O).


Síntesis de los compuestos:

(3R,7S,7aR)-7,7a-Dimetil-7-metoxi-5-oxotetrahidro-2H-oxazolo[4,3-

b]oxazol-3-carboxilato de metilo (1)

A partir de la D-Ser, utilizando la metodología descrita en la bibliografía,1 se obtuvo el compuesto 1.

2-((4R,5S)-4-Hidroxi-4,5-dimetil-5-metoxi-2-oxooxazolidina-3-il)acrilato

de metilo (2)

El compuesto 1 (1.60 g, 6.52 mmol) se añadió a un schlenk y se disolvió con THF seco (100 mL) bajo atmósfera inerte. A continuación, se bajó la temperatura hasta -78 °C. Se añadió la base KHMDS 1 M en THF (13 mL, 13 mmol), gota a gota, y se dejó agitando durante 5 minutos. Pasado ese tiempo, se añadió una disolución acuosa saturada de NH4Cl (100 ml) y se llevaron a cabo extracciones con Et2O (3 x 50 mL). El conjunto de las fases orgánicas se lavó con una disolución

1 (a) C. Aydillo, G. Jiménez-Osés, M. M. Zurbano, J. H. Busto, J. M. Peregrina, A. Avenoza, Chem. Eur. J. 2007, 13, 4840. (b) J. H. Busto, G. Jiménez-Osés, C. Aydillo, M. M. Zurbano, J. M. Peregrina, A. Avenoza, J. Org. Chem. 2007, 72, 5399.


acuosa saturada de NaCl, se secó con Na2SO4 anhidro, se filtró y se evaporó el disolvente. Tras purificación en columna cromatográfica en gel de sílice (DCM/AcOEt 7:3) se obtuvo el producto 2 (1.31 g, 5.34 mmol, 82 %) como un aceite amarillo.

Las propiedades físicas y los datos espectroscópicos coinciden con su enantiómero puro ya descrito en la bibliografía.1 [α]D

25 = +124.0 (c 1.10, CHCl3)

Ácido 2-((4R,5S)-4-Hidroxi-4,5-dimetil-5-metoxi-2-oxooxazolidina-3-

il)acrílico (3)

Para la obtención del compuesto 3 (1.74 g, 3.89 mmol, 73 %), se partió del compuesto 2 (2.52 g, 10.28 mmol), se añadió el disolvente THF/H2O (1:1, 400 mL) y a continuación la base LiOH·H2O (2.50 g). La reacción se dejó 30 minutos a 0 ºC, y se paró neutralizando con HCl (2 M). Se extrajo dos veces con Et2O y tres con AcOEt y, para terminar, el conjunto de las fases orgánicas se secó con Na2SO4 (anh), se filtro y se concentró. Este compuesto se utilizó en la siguiente etapa sin previa purificación.


(7S,7aR)-7,7a-Dimetil-3-metilen-7-metoxi-dihidro-2H-oxazolo[4,3-

b]oxazol-2,5(3H)-diona (4)

El compuesto 3 (0.92 g, 3.89 mmol) se añadió a un Schlenk. A continuación se adicionaron DCC (0.90 g, 1 eq) y DMAP (0.05 g, 0.1 eq) y por último el disolvente seco, DCM anh (50 mL), todo llevado a cabo en atmósfera inerte. La reacción se dejó agitando durante 6 horas a temperatura ambiente. Para finalizar, se filtró sobre tierra de diatomeas con una fina capa de sílica y se evaporó el disolvente en un rotavapor. El compuesto obtenido (4), se purificó en columna cromatográfica (AcOEt/Hex, 3:7), obteniéndose 0.52 g, 2.44 mmol, 63 %.

Diacetato de (2R,3R,4R,5R,6R)-5-acetamido-2-(acetoximetil)-6-

((((3R,7S,7aR)-7,7a-dimetil-7-metoxi-2,5-dioxotetrahidro-2H-

oxazolo[4,3-b]oxazol-3-il)metil)tio)tetrahidro-2H-piran-3,4-diil (6)

El compuesto 4 (192 mg, 0.90 mmol) y el tiocarbohidrato 5 (400 mg, 1.1 mmol) se disolvieron en THF anhidro (12 mL) en un schlenk bajo atmósfera inerte. Agitando vigorosamente, se bajó la temperatura a -78 °C y se añadió DBU (170 mg, 1.1 mmol) lentamente. Se mantuvo la agitación y la temperatura durante 3 h y se añadió, en frío, una disolución acuosa saturada de NH4Cl (mismo volumen que THF, 12 mL). Se subió la temperatura hasta la ambiental agitando


vigorosamente en un baño y se extrajo con Et2O (3 x 15 mL) y con AcOEt (2 x 15 mL). El conjunto de las fases orgánicas se lavó con una disolución acuosa saturada de NaCl (15 mL), se secó con Na2SO4 anhidro, se filtró, se concentró y se purificó por cromatográfia de columna sobre gel de sílice (DCM/MeOH, 9:1), obteniendo el producto 6 (502 mg, 0.87 mmol, 97 %) como un sólido blanco. [α]D

25 = +159.2 (c 1.00, CHCl3) Punto de fusión = 74 - 78 oC 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ(ppm): 1.63 (s, 3H, MeOCCH3), 1.66 (s, 3H, NCCH3), 1.98 (s, 3H, OAc), 2.01 (s, 3H, OAc), 2.04 (s, 3H, OAc), 2.16 (s, 3H, NHCOCH3), 2.96 (dd, 1H, J = 14.4, 11.4 Hz, CHaHbS), 3.15 (dd, 1H, J = 14.4, 3.9 Hz, CHaHbS), 3.52 (s, 1H, OCH3), 4.05 – 4.20 (m, 2H, H6S),4.55 (dd, 1H, J = 11.3, 3.9 Hz, SCH2CH) 4.65 (t, J = 6.5 Hz, 1H, H5S), 4.80 (ddd, 1H, J = 11.9, 8.5, 5.3, H2S), 5.07 (dd, 1H, J = 11.8, 3.3 Hz, H3S), 5.42 (d, 1H, J = 1.9 Hz, H4S), 5.75 – 5.78 (m, 2H,H1S, NHAc).

13C RMN (100 MHz, CDCl3) δ(ppm): 16.7 (MeOCCH3), 20.8, 20.8, 20.8 (2 OCOCH3, NHCOCH3), 22.4 (NCCH3), 23.3 (OCOCH3), 31.3 (SCH2), 48.4 (C2S), 51.9 (OCH3), 62.0 (C6S) 62.2 (SCH2CH), 67.4 (C4S), 67.8 (C5S), 68.2 (C3S), 85.4 (C1S), 101.7 (NCCH3), 108.3 (MeOCCH3), 158.9 (NCO2), 169.9, 170.3, 170.5, 170.6, 171.1 (CO). HRMS (ESI +) (m/z): 599.1520 [M+Na]+; calculado C23H32N2O13SNa+: 599.1517

Ácido (R)-3-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-dihidroxi-6-

(hidroximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)tio)-2-aminopropanoico (7)

El compuesto 6 (20 mg, 34.71 µmol), se introdujo en un matraz esférico, y se añadió a continuación HCl 4 M (3 mL). La mezcla se dejó con agitación durante 16 horas a 40 °C. El disolvente se eliminó a vacío y el crudo formado se disolvió en


agua y se extrajo con AcOEt. La fase acuosa se evaporó y el crudo se purificó en un cartucho de fase reversa LC-18 SPE, dando como producto el compuesto 7 (10 mg, 27.77 µmol, 80 %).

1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ(ppm): 2.01 (s, 3H, Ac), 3.19 (dd, 1H, J = 3.9, 15.4 Hz, CHCH2), 3.36 (dd, 1H, J = 5.9, 15.4 Hz, CHCH2), 3.77 – 3.81 (m, 3H, H6aS, H6bS, H3S), 3.98 (s, 1H, H4S), 4.23 – 4.25 (m, 1H, CHCH2), 4.35 – 4.39 (m, 2H, H5S, H2S), 5.54 (d, 1H, J = 5.5 Hz, H1S), 8.24 (d, 1H, J = 8.11, NH).

Anexo: Espectros de RMN

51 Anexo: Espectros de RMN

En este apartado se presentan los espectros de RMN mono y bidimensionales de los productos descritos en este trabajo de investigación.

Los espectros de RMN de 1H, 13C, COSY y HSQC fueron tratados y

representados con el programa MestreNova (6.0.2) a partir de los archivos fid y ser obtenidos del espectrómetro Bruker Avance-400.


1H RMN 400 MHz en CDCl3 a 298 K

13C RMN 100 MHz en CDCl3 a 298 K


COSY en CDCl3 a 298 K

HSQC en CDCl3 a 298 K


1H RMN 400 MHz en CDCl3 a 298 K

13C RMN 100 MHz en CDCl3 a 298 K


COSY en CDCl3 a 298 K

HSQC en CDCl3 a 298 K


1H RMN 400 MHz en H2O/D2O (9:1) a 298 K

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