simulacion de procesos de purificacion de enzimas
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Tema Simulacion de procesos de purificación de enzimas
HUACHO, MAYO 2008
Simulación de Procesos de purificación de enzimas
Tema Simulacion de procesos de purificación de enzimas
LA ESTRATEGIA DE LA PURIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA
UNA CLASE VIRTUAL DEL LABORATORIO Las conferencias pueden cubrir los aspectos teóricos de la purificación de la proteína y las clases del laboratorio pueden enseñar las técnicas prácticas, pero hay otros asuntos cuál es difícil de enseñar por métodos convencionales. Para purificar cualquier proteína que usted necesite saber qué técnicas de la separación son probables ser las más eficaces en las circunstancias y, probablemente más importante, que las técnicas no son. Este conocimiento no se puede tomar por después de una receta fija para una clase práctica. Requiere algún pensamiento y viene generalmente con experiencia, generalmente durante la investigación graduada. El material presentado aquí se ha desarrollado en la escuela de la bioquímica y de la biología molecular en la universidad de Leeds. Apunta dirigir a estudiantes con una simulación de algunas de las técnicas más de uso general de la separación de la proteína y las dejó experimentar con la simulación. Comienza dejando al usuario examinar cómo una mezcla simple de proteínas se comporta durante la filtración de gel y la cromatografía de intercambio iónico y después se enciende permitir el diseño y la prueba de los protocolos completos de la purificación usando mezclas más complejas de proteínas. Se asume que los estudiantes son familiares con el fondo teórico a las técnicas más comunes de la separación, los análisis de enzima etc. y que entienden el concepto del punto isoeléctrico de proteínas. Considere que esto es una simulación del laboratorio. NO ES Una CLASE PARTICULAR Autónoma EN LA PURIFICACIÓN de la PROTEÍNA. Los ejercicios confían en un programa de Java y sus archivos asociados. Usted debe utilizar un browser Java-permitido tal como versiones 3 del Internet Explorer de Netscape u o más adelante (preferiblemente las versiones 4 o más adelante.) El programa de Java puede ser comenzado chascando en el botón abajo. Usted necesitará guardar el programa y su funcionamiento del browser de WWW y
después cambiar entre ellos. Si usted tiene el lujo de dos computadoras, usted podría funcionar el programa sobre uno y su browser de WWW en el otro. Los
ejercicios se ilustran con las imágenes que representan el programa que funciona en una computadora de Windows, pero si usted la está funcionando en una diversa computadora - no se preocupan, él funciona de una manera idéntica. Si usted ha comenzado el uso, usted es listo trabajar con los ejercicios.
Estas páginas se ven lo más mejor posible con el Internet Explorer de Netscape o , versión 4,0 o más adelante, maximizado, usando una resolución de la pantalla de 800 x 600 en 256 colores. Hay muchos de imágenes, así que si usted tiene una conexión lenta o si usted está utilizando una conexión demarcado manual, usted puede ser que sea mejor de descargar las páginas con un uso tal como agente secreto de modo que usted pueda visión las off-line. Si usted hace esto, recuerde que si las páginas son actualizadas, su copia llegará a ser anticuada. Si usted es profesor, y usted se siente que este material pudo ser útil para su enseñanza, usted puede ser que tenga gusto de saber sobre el redactor de la mezcla, que permite que usted diseñe sus propias mezclas de la proteína. Entre en contacto con a autor si usted desea los detalles o si usted tiene cualesquiera comentarios sobre el material presentado aquí.
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EJERCICIO 1 DE 6 CARGAR UNA MEZCLA SIMPLE DE PROTEÍNAS
Usted verá que la barra de menú es muy simple. Aparte de ayuda solamente el comienzo está disponible, así que chásquelo encendido El menú de la gota abajo ofrecerá comienzo de comenzar e irá a casa... Chasque encendido el comienzo de comenzar.
Usted necesita comenzar con una mezcla muy simple con la cual poder experimentar. La lista de las mezclas disponibles que usted consigue puede no parecer exactamente esto, pero en alguna parte en la lista allí debe ser Easy3_Mixture . Selecciónela y después chasque encendido el botón ACEPTABLE
Como sugiere su nombre, esta mezcla contiene tres proteínas. La computadora preguntará cuáles de los tres usted desea purificar. Chasque en la caja de corregir, tipo 2, (o utilice los botones de la dirección) y después chasque encendido el botón ACEPTABLE.
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La computadora dará a proteína 2 una actividad enzimática y le dirá sobre su estabilidad. Por el tiempo que es, usted puede no hacer caso de ella y justo chasque encendido e ón l bot ACEPTABLE.
La ventana despejará y el menú cambiará. A este punto, usted es listo hacer algunos experimentos con la mezcla de la primera EJERCICIO 2 DE 6 FILTRACIÓN DE GEL DE UNA MEZCLA SIMPLE DE TRES PROTEÍNAS
A este punto, usted es listo hacer algunos experimentos con la mezcla de la proteína. En el momento que, usted no tiene ninguna información sobre la mezcla con excepción de un ciertos datos algo obscuros de la estabilidad. Usted puede examinar una muestra de la mezcla por el electrophoresis de dos dimensiones del gel de polyacrylamide (2d-page). Esto separa las proteínas en la primera dimensión por enfocarse isoeléctrico seguido por electrophoresis del gel de polyacrylamide en el SDS en la segunda dimensión. En la primera dimensión las proteínas se separan en orden del punto isoeléctrico y en la segunda dimensión se separan en la orden del peso molecular de la subunidad. Chasque encendido el menú del electrophoresis y seleccione la PÁGINA de 2 dimensiones. Usted debe conseguir el resultado
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Pues usted puede ser que haya esperado, hay tres puntos que corresponden a cada uno de las proteínas en la mezcla. Se numeran en el diagrama arriba. Mire el patrón de puntos. Estime el pi y el peso molecular de la subunidad de cada proteína. Anótelos porque usted necesitará referirles. Observe que el tamaño de cada punto es igual, indicando que hay cantidades iguales de cada proteína en la mezcla. Ahora chasque encendido el menú acabado para ir de nuevo al programa principal. (Nunca cierre esta ventana de cualquier otra manera o usted arriesgará el cerrar abajo del programa)
Usted puede ahora intentar separar las proteínas por la filtración de gel. Chasque encendido el menú de la separación y seleccione la filtración de gel...
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La computadora ahora le ofrecerá una selección de los medios de la filtración de gel. ¿Pero que uno debe usted elegir? Chasque encendido el botón del Info.
Los medios son productos representativos a partir de tres diversos surtidores. Mire sus gamas del fraccionamiento. Para conseguir la mejor separación, usted debe elegir un medio que gama empareje tan de cerca como sea posible el palmo de pesos moleculares en su mezcla. (Considere que éstos son pesos moleculares nativos, mientras que la PÁGINA del SDS da a subunidad pesos moleculares.)
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Cierre la ventana de browser del Info y entonces seleccione el radiobutton de Sephadex G-100 y chasque el botón ACEPTABLE.
La computadora entonces simulará la separación que usted habría obtenido si usted había pasado esta mezcla abajo de una columna convenientemente clasificada de Sephadex G-100. Ha recogido fracciones y ha medido la absorbencia de cada uno en los 280nm. ¿Qué esto representa? Mire el perfil del elution. ¿Cuántos picos hay? ¿Son del mismo tamaño? Mire los pesos moleculares de la subunidad que usted anotó para cada proteína. Examine el material en cada pico por la PÁGINA de 2 dimensiones (utilice el menú del electrophoresis). ¿Qué proteínas están en cada pico? ¿Puede usted explicar este resultado?
Intente mejorar la separación de las tres proteínas usando un diverso medio de la filtración de gel. Para hacer esto, chascar encendido el menú parado y seleccionar abandono este paso y continuar.
Entonces chasque encendido el menú de la separación y seleccione la filtración de gel... Elija un diverso medio e intente otra vez. ¿Trabajó para mejorar? ¿Puede usted explicar este resultado?
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Hora de intentar algo diferente. Cromatografía de intercambio de Ion. EJERCICIO 3 DE 6 CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO DE ION DE UNA MEZCLA SIMPLE DE TRES PROTEÍNAS
Ahora usted va a intentar purificar la mezcla usando la cromatografía de intercambio de ion. El medio que usted utilizará es dEAE-cellulose. El deae- está parado para diethylaminoethyl -, un grupo amino terciario que lleve una carga positiva excepto en valores de pH muy alcalinos. Su medio será cargado tan positivamente y por lo tanto atará las proteínas que llevan una carga negativa neta. Usted necesita pensar cuidadosamente del punto isoeléctrico (pi) de una proteína y del valor de pH del almacenador intermediario en el cual se suspende la proteína. Si el pH del almacenador intermediario es igual que el pi de la proteína, entonces la proteína llevará la carga neta cero. (Carga no cero - las cargas del positivo igualan exactamente las cargas negativas y tan hay una carga de la red cero.) Si la proteína se suspende en un almacenador intermediario que valor de pH sea menos que el pi de la proteína, la proteína tomará los protones del almacenador intermediario y por lo tanto para tener una carga positiva neta. Inversamente, si la proteína se suspende en un almacenador intermediario más alcalino que el pi de la proteína, la proteína perderá los protones al almacenador intermediario y se convertirá en red cargada negativamente. Esto es un concepto importante en entender cómo las proteínas obran recíprocamente con los medios de intercambio iónico. Aquí está el gel de 2 dimensiones del electrophoresis de la mezcla. Mírelo otra vez. ¿Si esta mezcla fuera aplicada a una columna del dEAE-cellulose en el pH 7,0, que las proteínas atarían a la columna? ¿Qué proteínas atarían en pH 8,0? ¿Qué proteínas atarían en pH 6,0?
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Ahora pruebe sus predicciones. Si usted no ha hecho ya así pues, chasque encendido el menú parado y seleccione el abandono este paso y continúo.
Entonces chasque encendido el menú de la separación y seleccione la cromatografía de intercambio de ion...
Chasque entonces el encendido los botones de radio del gradiente del dEAE-celluose-celluose y de la sal. Entonces c LE.
hasque encendido el botón ACEPTAB
hasque en la caja de corregir, tipo 7,0 (o utilice los botones de la dirección) y después
Cchasque encendido el botón ACEPTABLE.
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Para enjuagar cualquier proteína límite a la columna, usted necesita lavar la columna
el gradiente
con una solución de sal protegida. Si la concentración de esta solución aumenta con tiempo, entonces las proteínas serán enjuagadas en orden de su carga neta. Usted necesita tan decir el programa sobre esta solución. Fije el comienzo da 0,0 y el final del gradiente a 0,5 muelas (si no se fijan ya a estos valores). Ahora chasque encendido el botón ACEPTABLE
e nuevo, la computadora simulará el comportamiento de la mezcla bajo condiciones
el
resis de 2
nte la
Dque usted solicitó. Mire el perfil del elution. Como antes, la computadora ha medido laabsorbencia de cada fracción en los 280nm. También ha medido la concentración de la sal en cada fracción. El gradiente de la sal comienza a emerger de la columna en la fracción 32, así que cualquier cosa presente en las fracciones ' anteriores ' representamaterial que no ató a la columna, pero fue lavado derecho a través. ¿Cuántos picos hay? Examine el material en cada uno por electrophodimensiones. ¿Qué proteína está en qué pico? ¿Este qué usted tendría espera? Utilice el menú parado para abandonar este paso y para continuar. Entonces interepetir el experimento en pH 8,0 y 6,0. (Usted puede necesitar ajustar el gradiente desal para asegurarse de que las tres proteínas están enjuagadas.) ¿Cómo los resultados diferencian? ¿Puede usted explicar las diferencias?
Usted piensa que usted podría purificar la proteína 2 en un solo paso por cromatografía
la proteína 2 de esta mezcla usando los
ual cada método fue utilizado?
¿de la filtración de gel o de intercambio de ion? ¿Puede usted pensar en un método para purificarmétodos que usted ha intentado hasta ahora? ¿Diferenciaría si usted cambió la orden en la c
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Intente purificar la proteína 2.
PROTEÍNA - UN PROCESO SECUENCIAL EJERCICIO 4 DE 6 PURIFICANDO UNA
Ahora usted habrá realizado que usted no puede purificar la proteína 2 en un solo paso
y dos
rificar la proteína 2.
por cromatografía de la filtración de gel o de intercambio de ion. (La mezcla fue diseñada especialmente para contener dos proteínas con el mismo peso molecularcon el mismo punto isoeléctrico.) Sin embargo, usando las dos técnicas secuencialmente debe ser posible purificar la proteína 2. Este uso secuencial de las técnicas que hacen uso las diversas características de una proteína es una característica dominante de la mayoría de los esquemas de la purificación. Aquí es unidireccional en cuál usted podría pu
Si usted no ha hecho ya así pues, chasque encendido el menú parado y seleccione el
abandono este paso y continúe.
Chasque encendido el menú de la separación y seleccione la filtración de gel...
Seleccione el radiobutton de Sephadex G-100 y chasque el botón ACEPTABLE.
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Usted conseguirá el mismo perfil del elution que usted hizo la vez última que usted s
a
das
utilizó Sephadex G-100. Vez última, usted identificó qué proteínas estaban en los dopicos usando electrophoresis de 2 dimensiones. Esto es algo poco realista, puesto que los dos geles son desperdiciadores de tiempo instalar y funcionar. Usted no los utilizaríciertamente como sistema rutinario para supervisar fracciones. La proteína 2 es una enzima, así que usted puede descubrir que las fracciones la contienen probándolas topara la actividad enzimática.
.
sted pudo haber notado que el menú de las fracciones está disponible ahora. Utilícelo
Upara probar actividad enzimática
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primera.
esto lejos.
La actividad enzimática (en rojo) está toda en el segundo pico, allí no está ninguna en la
Usted necesita reunir y guardar las fracciones el contener de la actividad enzimática y lanzar el r
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La actividad enzimática (en rojo) está toda en el segundo pico, allí no está ninguna en la rimera.
esto lejos.
pUsted necesita reunir y guardar las fracciones el contener de la actividad enzimática y lanzar el r
menú de las fracciones y seleccione las fracciones de la piscina...
Chasque encendido el
este punto, los contornos del programa en negro las fracciones que deben ser unidas. Comienza si se asume que le desea reunir las fracciones 40 a 80. Esta
Areselección es demasiado ancha. Deseamos solamente el segundo pico.
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juste el comienzo de la piscina a la fracción 65 y después chasque encendido el botón
ACEPTABLE.
A
Ése es el final del primer paso en el esquema de la purificación. La computadora da la información a este punto le dejó saber bien (o de otra manera) usted está haciendo. Un
. informe sobre la marcha de los trabajos acumulativo está disponible del menú de ayuda
sted ha establecido edio de la filtración
de gel, así que chasca encendido el menú de la separación y selecciona la cromatografía U ya que no hay punto en intentar ningún otro m
de intercambio de ion... No utilice el menú parado, puesto que usted desea continuar usando el material reunido del paso pasado.
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hasque encendido los botones de radio del gradiente del dEAE-celluose-celluose y de
la sal. Entonces chasque encendido el botón ACEPTABLE.
omo antes, fije el valor a 7,0 y después chasque encendido el botón ACEPTABLE.
C
C
omo previamente, fije el comienzo del gradiente a 0,0 y del extremo a 0,5 muelas.
Ahora chasque encendido el botón ACEPTABLE. C
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Éste es el perfil del elution que usted debe obtener. ¿Parece diferente de ése obtenido uando la mezcla entera fue utilizada? c
¿Qué pico contiene la proteína 2? Pruebe la actividad enzimática para descubrir.
Rq
eúna las fracciones que contienen la actividad enzimática. La proteína 3 se debe haber uitado por el paso de la filtración de gel, dejando las proteínas 1 y 2 que se separarán
por la cromatografía de intercambio de ion. Tan su material debe ser puro. Ahora está digno de examinarlo por el 2.o el electrophoresis del 1D- y para comprobar su pureza.
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UTORIZACIÓN, es puro. Ahora es su vuelta. Chasque encendido el menú parado y leccione el esquema del abandono y comience otra vez. Recargue la mezcla
e el revés
JERCICIO 5 DE 6 URIFICACIÓN DE UNA PROTEÍNA DE UNA MEZCLA MÁS COMPLEJA
AseEasy3_Mixture y vea si usted puede purificar la proteína 2 usando un método que impliqula cromatografía de intercambio de ion seguida por la filtración de gel, es decirde lo que usted acaba de hacer. Cuando usted ha hecho eso, entonces usted es listo intentar purificar las proteínas de una mezcla EP
intentar purificar una proteína de una mezcla más compleja de veinte proteínas.
ience tra vez.
Si usted ha purificado la proteína 2 de la mezcla simple de tres proteínas, usted es listo
Chasque encendido el menú parado y seleccione el esquema del abandono y como
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argue la mezcla Default_Mixture. Esto es una mezcla de 20 proteínas.
C
sted va a intentar purificar la proteína 10.
U
i usted examinara la mezcla por 2D-electrophoresis, parecería esto. El punto que orresponde a la proteína 10 se indica con una flecha. Considere que los pesos
ión roteína.
Scmoleculares dados son pesos moleculares de la subunidad. No obstante, la informacen este gel pudo ayudarle a pensar en un esquema de la purificación para esta p
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Inténtela hacia fuera. Experimento. Si un método particular no trabaja, intentar entenderporqué y entonces intente algo diferente. Recuerde que usted puede abandonar
lamente un paso si usted todavía no ha reunido fracciones, si no usted tendrá que soabandonar el esquema y recargar la mezcla.
o más de dos pasos. Si usted puede hacer eso, entonces intente purificar cualquiera de las otras proteínas en la mezcla. Algunos
n muy fáciles de purificar, otros son absolutamente difíciles. Usted puede utilizar
Debe ser posible purificar la proteína 10 en n
socualquiera de los métodos de la separación disponibles, pero sea sistemático y realista. ¡Vigile el coste! El programa está supervisando lo que usted hace y caminará adentro para pararle si no es feliz con lo que usted ha hecho. ¡Buena suerte!
acabe, intente este último experimento.
Ahora usted debe ser absolutamente familiar con el programa, cómo cargar diversas mezclas y cómo utilizar los métodos disponibles. Antes de que usted
EJERCICIO 6 DE 6 CALCULAR EL NÚMERO DE SUBUNIDADES DE UNA PROTEÍNA OLIGOMERIC
oleculares La mezcla Example_Mixture contiene seis proteínas monomeric con los pesos m
siguientes: proteína peso molecular1 200,000 2 100,000 3 50,000 4 25,000 5 12,500 6 7,400
¿Cuál gel filtración medio disponible en programa mejor resolver todo seis este proteína?
a mezcla (elija de las seis proteínas - no importa que) y sujétela a la filtración de gel usando el medio que usted ha elegido. Para cada uno de las seis proteínas, anote l número de la fracción del punto mediados de de su pico en el perfil del elution.
Cargue est
eDibuje un gráfico del número de la fracción contra el logaritmo del peso molecular de cada proteína. ¿Usted consigue una línea recta? Si no, entonces usted debe reexaminar sus datos antes de proceder.
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hora cargue la mezcla default.pt1 y elija la proteína 15. Sujete esta mezcla a la ltración de gel en el mismo medio que usted eligió para la mezcla anterior. Identifique
las fracciones que contienen la proteína 15 probando las fracciones para la actividad ar
a
Afi
enzimática. ¿Qué fracción contiene la actividad máxima? ¿Cuál es el peso moleculnativo de la proteína 15? Funcione un gel de 1 dimensión del SDS-sDS-polyacrylamide de la fracción que contiene la actividad máxima de la proteína 15. Identifique la vendque corresponde a la proteína 15 immunoblotting. ¿Cuál es el peso molecular de la subunidad aproximada