sergio serrano. técnicas diagnósticas en el estudio de los

Técnicas diagnósticas en el estudio de los linfomas

Sergio SerranoUAB, IMIM, Hospital del Mar

Criterios de clasificación

• Morfológicos

• Inmunofenotípicos

• Genéticos

• Clínicos

Genética

Morfología Histología

Técnicas de diagnóstico

FISH

PCR

Inmunohistoquímica

Citometría de flujoInmunofenotipo

Fijación

Morfolgía

Inmunohistoquímica

FISH

PCR


Control de calidad del ADN

400 bp300 bp200 bp100 bp

600 bp

fresco parafina

• Fijación

• Inclusión

• Corte

• Tinción

Morfología

• Análisis de la arquitectura: patrones

• Análisis citológico

Morfología

• Identificación del problema

• Diseño de los estudios subsiguientes:

Inmunohistoquímicos

Moleculares

Citogenéticos (FISH)

Morfología

Genética



FISH

PCR

Inmunohistoquímica


Ag

CD79a

CD20

CD23

bcl-2

bcl-6

CD10

Ag

Burkitt

CBMV CPNH CB CC

Ag

CD79a

CD20

CD23

bcl-2

bcl-6

CD10

Burkitt

• Fijación

• Recuperación antigénica

• Reacción antígeno-anticuerpo

• Detección de la reacción

Inmunohistoquímica

BCL2 enz

BCL2 mw 15’ BCL2 aut 6’

• Fijación

• Recuperación antigénica

• Reacción antígeno-anticuerpo

• Detección de la reacción

MorfologíaInmunohistoquímica

AB-Pc D1

Dextrano-Pc D1

CSAc D1

• Selección de un panel de ac. primarios

• Evaluación de los controles int. y ext.

• Identificación de las células tumorales

• Interpretación del resultado


- Niño de 2 años

- Tumoracion intranasal

- Sospecha de linfoma T/NK de tipo nasal

- Se solicita realización de CD56

Desmina

Porta con control

Control externo + + - -

Control interno + - + -


“ Bajo condiciones inapropiadas cualquier anticuerpo puede dar resultados aparentemente positivos en cualquier tejido”


- Niño de 9 años

- Sin antecedentes patológicos

- Dolor abdominal

- Masa abdominal

- Tumoración gástrica

MPXCD20

• Células tumorales

Se detecta: ……..

No se detecta: ……….

• Células acompañantes

Se detecta: ……

No se detecta: ……

- Varón de38 años

- Astenia anorexia y pérdida de peso

- No adenopatías

- Nódulos pulmonares bilaterales de 1 a 20 mm de Ø

- Sospecha de linfoma T pulmonar. Se remite muestra para estudio del reordenamiento del gen que codifica el TcR

CD20 CD3

Genética



FISH

PCR

Inmunohistoquímica


Criterios de clasificación

• Morfológicos

• Inmunofenotípicos

• Genéticos

• Clínicos

Genética



FISH

PCR

Inmunohistoquímica


MorfologíaFISH

• Improntas o extendidos iicitológicos

• Secciones de tejido incluido iien parafina

MorfologíaFISH

Sondas

Detección de fusiones (“dual-color, dual-fusion”)

Detección de roturas (“split”, “break-apart”)

MorfologíaFISH

Sondas

Detección de fusiones (“dual-fusion”)


A

B

A

B

A

B

A

B

A

B

A

B

B

A

BCL-2IgHBCL-2IgH

A

B

B

A

X

X

A

B

B

A

A

A

B

B

A

BCL-2IgH

MorfologíaFISH: detección de fusiones

• Ventajas

Proporciona información sobre i los dos genes implicados en la iiiiiiiiiitranslocación

• Inconvenientes

Dificil de interpretar

MorfologíaFISH

Sondas

Detección de fusiones (“dual-fusion”)


A

B

B

A

MorfologíaFISH: detección de roturas

• Ventajas

Facil de interpretar

• Inconvenientes

iiiiiiiSolo nos proporciona información iiiiiiisobre uno de los genes implicados iiiiiiien la translocación

Genética



FISH

PCR

Inmunohistoquímica


• Detección de translocaciones

• Detección de clonalidad

MorfologíaPCR

A

B

A

B

A

B

“Un resultado positivo tiene mucho más valor que un resultado negativo”

MorfologíaPCR

48%MBR+mcr

55%MBR+3´MBR

58%MBR

Regiones estudiadas

Falsosnegativos %

t (14;18) en Linfomas Foliculares

MBR+mcr+3´MBR 42%

MorfologíaPCR

MBR

mcr

3´MBR

MorfologíaPCR

• Detección de translocaciones

• Detección de clonalidad

MorfologíaPCR

T

B

Reordenamiento Ig

Reordenamiento TCR

Org linfoides secundarios

Hipermutación Ig ICambio isotipo

Ag

Sangre

NK

CD4

CD8

Org. linfoides primarios


MorfologíaPCR

18%FR1+FR2+FR3

18%FR1+FR3

21%FR2+FR3

30%FR1

33%FR2

52%FR3

Regiones del gen IgH estudiadas

Falsosnegativos %

Clonalidad en Linfomas FolicularesMorfologíaPCR

IgH FR1

IgH FR3

IgH FR2

Cadenas ligeras kappa

Cadenas ligeras lambda

MorfologíaPCR

FR1

FR2

FR3

T

B

Reordenamiento Ig

Reordenamiento TCR

Org linfoides secundarios

Hipermutación Ig ICambio isotipo

Ag

Sangre

NK

CD4

CD8

Org. linfoides primarios

TcR Gamma

TcR Beta

TcR Delta

MorfologíaPCR


MorfologíaPCR

“Los estudios de clonalidadno deben utilizarse para establecer el linaje de unlinfoma”

- Mujer de 68 años

- Desde hace 6 meses presenta en la mitad superior de la espalda un nódulo solitario de 2cm de Ø que no se halla ulcerado

- No se detectan otras lesiones ni adenopatías

IgH TcR

Recapitulación y diagnóstico

• Diagnóstico de una entidad reconocida por la OMS

• Linfoma de dificil clasificación

• Infiltración linfoide de significado incierto

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