separacion y aislamiento del adn
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Extracción de ADN de tejidos animales y vegetales.
I. INTRODUCCIÓN
Todos los seres vivos están formados por células que son la mínima
organización supramolecular, que cumplen con todas las
características de los seres vivos. Estas están compuestas por: -una
membrana plasmática o celular, conocida como plasmalema,
compuesta por una doble capa de fosfolípidos en la que están
inmersas diferentes proteínas; -una matriz citoplasmática o
citoplasma que consiste en un gel casi liquido compuesto por agua, en
el que están inmersas moléculas y macromoléculas libres, como
glúcidos, lípidos, aminoácidos y proteínas; -material genético o
cromatina, que les permite autoduplicarse y transmitir a su
descendencia las características de la especie, y que está formado por
ácido desoxirribonucleico (ADN) asociado a proteínas (histonas),
situado en el núcleo de las células eucariotas; el núcleo esta formado
por un carioplasma (sustancia viscosa en estado de gel, con ácidos
nucleicos, aminoácidos, nucleótidos, proteínas, glucógeno, etc.) y
rodeado por una doble membrana: la carioteca o envoltura nuclear.
El ADN constituye el material hereditario de un individuo. En él están
escritas las instrucciones que deben seguir las células para construir
un organismo y mantenerlo vivo. Todas las células que forman un
individuo contienen una copia idéntica del ADN. Cada una de ellas, sin
embargo, lee una parte de estas instrucciones y por eso hay células
con diferentes formas y funciones. Está formado por
Desoxirribonucleótidos (A, G, C, T), que a su vez están formados de
desoxirribosa y un ion fosfato. La proporción y la secuencia de las
bases nitrogenadas diferencian a los polinucleótidos. Estructuralmente
la molécula de ADN se presenta en forma de dos cadenas helicoidales
enrolladas alrededor de un mismo eje (imaginario); las cadenas están
unidas entre sí por las bases que la hacen en pares. Los
apareamientos son siempre adenina-timina y citosina-guanina. Desde
el punto de vista químico, el ADN es un polímero de nucleótidos, es
decir, un polinucleótido. Un polímero es un compuesto formado por
muchas unidades simples conectadas entre sí. En el ADN,
cada unidad es un nucleótido, y cada nucleótido, a su vez, está
formado por un azúcar (la desoxirribosa), una base nitrogenada (que
puede ser adenina, timina, citosina o guanina) y un grupo fosfato que
actúa como enganche de cada unidad con la siguiente. Lo que
distingue a un nucleótido de otro es, entonces, la base nitrogenada, y
por ello la secuencia del ADN se especifica nombrando sólo la
secuencia de sus bases. La disposición secuencial de estas cuatro
bases a lo largo de la cadena es la que codifica la información
genética. En los organismos vivos, el ADN se presenta como una doble
cadena de nucleótidos, en la que las dos hebras están unidas entre sí
por unas conexiones denominadas puentes de hidrógeno.
II. OBJETIVOS
Extraer el ADN a partir de una muestra biológica.
Reconocer microscópicamente el ADN, haciendo uso de un colorante.
III. FUNDAMENTO TEÓRICO
La extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de
que los iones salinos son atraídos hacia las cargas negativas del ADN,
permitiendo su disolución y posterior extracción de la célula. Se empieza
por lisar (romper) las células mediante un detergente, vaciándose su
contenido molecular en una disolución tampón en la que se disuelve el
ADN. En ese momento, el tampón contiene ADN y todo un surtido de
restos moleculares: ARN, carbohidratos, proteínas y otras sustancias en
menor proporción. Las proteínas asociadas al ADN, de gran longitud, se
habrán fraccionado en cadenas más pequeñas y separadas de él por
acción del detergente. Sólo queda, por tanto, extraer el ADN de esa
mezcla de tampón y detergente, para lo cual se utiliza etanol.
El ácido desoxirribonucleico (DNA) es la molécula que contiene y
transmite la información genética de los organismos, excepto en algunos
tipos de virus. Está formado por dos cadenas complementarias de
nucleótidos que se enrollan entre sí formando una doble hélice que se
mantiene unida por enlaces de hidrógeno entre bases complementarias.
Los cuatro nucleótidos que forman el DNA contienen las bases adenina
(A), guanina (G), citosina (C) y timina (T). El modo en que funciona una
célula depende de su DNA, que actúa como un plano o como un
conjunto de instrucciones, y es el encargado de codificar todo lo que
nosotros somos, desde el color del pelo hasta las proteínas que tenemos
en nuestra sangre. El conjunto completo del DNA de un organismo se
conoce como su genoma. La extracción de DNA requiere una serie de
etapas básicas. En primer lugar, se tienen que romper tanto la pared
celular (en el caso de tratarse de células vegetales) como la membrana
plasmática, para poder acceder al núcleo de la célula. A continuación,
debe romperse también la membrana nuclear para dejar libre el DNA.
Por último, hay que proteger el DNA de enzimas que puedan degradarlo
y para aislarlo hay que hacer que precipite en alcohol.
En esta práctica, simplemente utilizando detergente, papaína (del zumo
de piña), y etanol, el DNA puede obtenerse tanto de frutas como la fresa
u hortalizas como la cebolla.
IV. MATERIALES Y EQUIPOS
Proporcionado por el
laboratorio
Solución salina
fisiológica.
Solución de cloruro de
sodio 2M.
Colorante de Acridina o
Safranina.
Mortero.
Vasos de precipitación.
Plátano molido
(aprox. 10 gr)
60 ml de detergente líquido
Papel filtro
Alcohol etílico al 96%
Balanza Hígado molido
(aprox. 10gr)
Varillas de agitación.
Pipetas de 10ml.
Embudo de vidrio.
Laminas portaobjetos.
V. PROCEDIMIENTO
1. triturar 10 gr de hígado de pollo con 15 ml de SSF.
2. Filtrar la mezcla para eliminar restos de tejido.
3. Agregar una solución de NaCl 2 M en igual volumen que el filtrado.
4. Lugo añadir 1 ml de detergente y con una varilla agitar durante 10 minutos.
5. En un vaso de preciptado añadir la muestra y por la paredes agregar alcohol lentamente hasta que se formen dos capas, en la interfase está el ADN.
6. Con una varilla ir moviendo en el mismo sentido, hasta formarse una fibra blanquesina a simple vista (ADN).
7. Realizas un preparación en fresco sancando una fibra de ADN y depositándolo e una lámina portaobjetos y agregar el colorante.
8. Dejar actuar el colorante durante 2 minutos. Llevar al microscópio y obrvar su estructura fibrilar.
VI. RESULTADOS
A. Extracción del ADN del Hígado y plátano
a. Rompimiento de membranas y paredes celulares
b. Ruptura de núcleos
c. Separación de proteínas, carbohidratos y lípidos
Lo mismo se repite para el plátano
Plátano triturado Hígado triturado
Muestra del hígado y plátano ya agregado el detergente
Ruptura de la muestra del hígado y plátano
d. Precipitación del ADN
Muestra del plátano ya agregado alcohol. Y vista de la fibra de ADN.
Muestra del hígado ya agregado el alcohol. Y vista de la fibra de ADN.
e. Observación microscópica del ADN
VII. DISCUSIONES
El producto filamentoso obtenido de la extracción no es ADN
puro ya que, entremezclado con él, hay fragmentos de ARN.
Una extracción "profesional" se realiza añadiendo enzimas
que fragmentan las moléculas de ARN e impiden que se
unan al ADN.
Las células vegetales son distinguibles de las células
animales por su pared celular rígida y orgánulos como el
cloroplasto. También contienen proteínas y enzimas que
juegan un papel en la fotosíntesis. Algunas células de las
plantas son poliploides, lo que significa que tienen más de
una copia de cada cromosoma por célula. Los procesos
celulares que ocurren en las plantas tales como la
Muestra del Hígado en el microscopio.
Muestra del plátano en el microscopio.
fotosíntesis producen una gama de metabolitos secundarios.
Las células animales no tienen una pared celular, pero
todavía necesitan ser tratadas con productos químicos como
el dodecilsulfato sódico (SDS) para romper la membrana
celular para liberar el ADN genómico.
El ADN genómico de las plantas es más difícil de extraer a
causa de la pared celular de la planta, que se elimina por
homogeneización o mediante la adición de celulasa para
degradar la celulosa que forma la pared celular. Además, los
metabolitos presentes en la célula vegetal pueden interferir
con la extracción de ADN genómico por la contaminación de
la muestra de ADN durante el proceso de precipitación.
Los leucocitos de sangre periféricos son una fuente principal
de ADN genómico en animales, pero la recogida de muestras
es difícil ya que la sangre debe ser retirada del animal. La
sangre contiene una serie de compuestos como proteínas,
lípidos, glóbulos blancos, glóbulos rojos, plaquetas y plasma,
que pueden contaminar la muestra de ADN. El contaminante
principal del ADN de animal extraído por muestras de sangre
es hemo, el componente no proteíco de la hemoglobina.
Las diferencias entre el ADN de las plantas y los animales se
encuentra en la secuencia de bases en la hélice. Los
compuestos que se encuentran en las células vegetales
están ausentes en las células animales y las secuencias de
bases de ADN reflejan esto, puesto que el ADN genómico de
la planta es a menudo mayor que el ADN de los animales.
Estas diferencias afectan los métodos de extracción, ya que
impacta en el rendimiento y la pureza del ADN.
La observación de ADN como filamentos blanquecinos no ha
sido posible debido al vencimiento de la proteasa peptina. La
función de la encima proteolítica es proteger al ADN de
enzimas que puedan degradarlo y elimina las proteínas que
puedan contaminar al ADN y aquellas que se encuentran en
el núcleo celular. A partir de esto el ADN no se pudo ver
porque quedó atrapado en el núcleo celular donde, al no
funcionar la peptina, no se pudieron degradar las
membranas proteicas que recubren al ADN, haciendo que no
se desenrolle y salga al exterior.
Si la peptina hubiese separado al ADN de las proteínas
hubiera sucedido la precipitación del mismo ante la
presencia del alcohol para luego extraerlo de la solución. De
esta manera habríamos obtenido como resultado final la
aparición de fibras blanquecinas de ADN.
VIII. CONCLUCIONES
1. En esta práctica se logró el objetivo principal y planteado que es la
extracción del ADN en este caso fue de tejido animal, todo esto
siguiendo una serie de pasos para poder lograrlo, así se pudo
separar de otros componentes como proteínas, lípidos,
carbohidratos y se pudo distinguir cual era cual y el resultado final
fue la extracción y separación del ADN.
2. Para la obtención del ADN en las de tejidos vegetales suele ser
más compleja que en la de tejidos animales debido a su pared
celular.
3. Existen otros colorantes aparte del colorante de safranina o
acridina como; El bromuro de etidio, SYBR Green y Poliacrilamida.
4. Se considera a la pectina proteolítica como el único factor que
llevó a la falla de la experimentación ya que los pasos del
procedimiento fueron llevados a cabo.
5. En otro caso para poder cuantificar la cantidad de ADN Primero
separando bien el ADN de la muestra y después usando la técnica
de PCR (reacción en cadena de la polimerasa).
IX. CUESTIONARIO
1. ¿Qué muestras biológicas se puede utilizar para extraer ADN?
Para la obtención de ADN se puede utilizar cualquier muestra
biológica que cuente con enzimas ya que estas son las que
contienen el ADN.
2. ¿Cuál es el método estructural del ADN?
El ADN dentro del núcleo celular se encuentra enrollado y
comprimido, haciendo que su diámetro sea de 2nm. Pero es
posible verlo a simple vista luego de la experimentación ya que
el ADN al encontrarse fuera del núcleo, se desenrolla
aumentando su volumen al ocupar más espacio.
3. ¿Qué otros colorantes podrían ser utilizados para
visualizar ADN?
Entre otros tenemos al El bromuro de etidio, SYBR Green
Poliacrilamida, Agarosa y Almidón
4. ¿Cuál es la importancia de la práctica?
La importancia es que ya se conoce como encontrar el ADN y en que
partes específicas se puede encontrar, también para conocer cuáles
son los métodos más utilizados para el reconocimiento de este.
X. BIBLIOGRAFÍA
1. Mary K. Campbell,Shawn O. Farrell, Bioquímica. Editorial Cengage learning. 30/11/2006 - 844 páginas.
2. Helena Curtis, Sue James, Adriana Schnek. Biología, editorial médica panamericana, séptima edición.