REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA

UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL SIMÓN RODRÍGUEZ

MAESTRÍA EN BIOTENOLOGÍA ALIMENTARIA

FERMENTACIONES INDUSTRIALES

PPRODUCCIÓNRODUCCIÓN YY U USOSSOS DEDE LALA L LEVADURAEVADURA DEDE C CERVEZAERVEZA

Facilitador: Autores:

M.Sc Nilo Rivas Lic. Colmenares, Milagros

CI: v- 19.111.616

Lic. Laurens, Aurimar

CI: v- 16.243.829

Mayo de 2012

La Cerveza: Bebida popular más antigua

La fabricación de Cerveza está ligada a una sucesión de tres procesos bioquímicos: la formación de enzimas en el grano de cereal germinante, la degradación del almidón a azúcar y, a continuación, la fermentación del azúcar a alcohol y CO2. Estos procesos y su resultado embriagantes son conocidos por la gente ya desde miles de años, sin que se reconociera de primera intención cómo estaban relacionados y su controlabilidad.

Nuestros conocimientos respecto de una fabricación encauzada de cerveza por parte del hombre se pierden en los tiempos prehistóricos. Probablemente el momento está relacionado con el sedentarismo de los recolectores y cazadores, con el cual se inicia también el cultivo de cereales.

La mención más antigua de la cerveza se halla en una escritura cuneiforme del año 2800 a.C en la Mesopotamia, la cual describe la distribución de una ración diaria de cerveza y pan a los trabajadores. En el antiguo Egipto la fabricación de cerveza experimentó un estado de prosperidad, tal y como resulta de numerosas ilustraciones y descubrimientos.

Producción de Cerveza en el Antiguo Egipto

En Europa la cerveza era ya una bebida muy popular para los Germanos, Escitas y los celtas, siendo fabricadas por las mujeres como alimento para los hogares, dado que tanto la fabricación de la cerveza como la panificación eran trabajos femeninos en todas las culturas primitivas. En la cervecería de los monasterios, se realizó luego el pasaje a la industria cervecera, dado que ya no se fabricaba la cerveza para consumo propio sino que se la entregaba contra pago. Al mismo tiempo se produjo el cambio hacia una producción masculina lo cual se ha mantenido hasta el presente.

En el siglo XIV se produce la utilización del lúpulo como único saborizante, luego de haber usado antes una mezcla de condimentos llamado “GRUT” en idioma Alemán.

Durante la edad media, en Alemania se diferenciaban notablemente las fabricaciones de cervezas entre el norte y el sur, fabricándose cervezas con derecho cívico

en grandes ciudades cerveceras como Bremen y Hamburgo y cervezas de origen casero hacia el paso de la producción industrial, respectivamente. Esta producción de dicho rubro se convierte en la temprana edad media en una industria muy extendida en Alemania.

Fabricando Cerveza, año 1397 en los Monasterios

En el siglo XV se afianza la posición industrial de los cerveceros los cuales dominaban el monopolio de la fabricación de las levaduras; pero más adelante, circunstancias adversas y las malas cosechas y en conjunto con la escasez de materias primas, llevaron a la utilización de materias primas diferentes a las usuales lo cual ponía en riesgo la salud de los consumidores, lo cual hace que se reglamente la utilización exclusiva de lúpulo, malta y agua para la fabricación: Artículo 12 de la “Statua Thaberna” de 1434 en Weibensee.

La guerra de los años 30 hizo retroceder el desarrollo en la fabricación de la cerveza; lo que de forma simultánea a la aparición de bebidas como el té y el café causó una reducción notable en la producción de cerveza por un período prolongado.

Hacia el año de 1842 se desarrolla el prototipo de cerveza Pilsen, después de los trabajos de Emil Christian Hänsen, Louis Pasteur y Carl Von Linde que aportaron piezas claves para la nueva era de la cerveza en Alemania, la cual se extendería por toda Europa.

Hace cien años: Vista a una sale de limpieza de barriles…

En 1875 este tipo de cerveza es introducida al mercado Americano bajo la marca Budweiser, siendo esta la marca de cerveza más grande en el ámbito mundial.

Con el pasar años llenos de altos y bajos, entre ellos el estancamiento del consumo de cerveza en muchos países de Europa y Norte América, la producción de cerveza ha crecido enormemente en los últimos 20 años, existiendo el mayor consumo per cápita para los Checos el cual se sitúa en 160 lts, seguidos por los Irlandeses y los Alemanes.

Según cifras del año 2003, Venezuela estaba poseía una fabrica Cervecera entre las 40 más grandes del mundo. (Kunze, 2006)

Cerveza

Nombre de una bebida alcohólica elaborada por la fermentación de soluciones obtenidas de cereales y otros granos que contienen almidón. La mayor parte de las cervezas se elaboran con cebada malteada a la que se da sabor con lúpulo. En Japón, China y Corea, la cerveza se hace con arroz (y recibe el nombre de sake, samshu y suk respectivamente); en África se usan mijo, sorgo y otras semillas; mientras que el kvass ruso se hace con pan de centeno fermentado. (Clubplaneta)

Según la normativa Venezolana COVENIN a través de la Norma 91:2002 en su 3era

revisión definen a la cerveza como: una bebida alcohólica obtenida de la fermentación mediante una levadura de cultivo de la especia Saccharomyse Cerevisiae, de un extracto contenido de cereales entre los cuales debe figurar la cebada malteada como componente mayoritario (>50%) y el resto, de los otros cereales malteados o no, y/o de otros adjuntos cerveceros, adicionada de lúpulo o sus derivados, a fin de impartirle aroma y sabor amargo

característicos y demás sustancias aprobadas por la unidad sanitaria competente. La clasificación de “Cerveza Genuina” se reserva para el producto obtenido de cebada malteada y lúpulo, sin adición de otro cereal. (Sencamer, 2002)

Clasificación de las CervezasEn Venezuela, la Norma Covenin realiza una clasificación de la cerveza, de la

siguiente manera:

Otra clasificación de la cerveza:

Proceso de Elaboración de la Cerveza

Germinación de la Malta

El grano de cebada, seleccionado, limpiado y humedecido, se extiende en una gran sala llamada cámara de germinación, la cual esta acondicionada a 18-20ºC. Enseguida con ayuda del Galland, (aparato formado por dos cilindros, uno metálico exterior y otro interior giratorio de tela metálica) en donde caen las semillas desde una tolva; por un eje interior sale una corriente de aire húmedo. El proceso dura de ocho a nueve días y se interrumpe con una corriente de aire a 25ºC que deseca los granos (malta verde. Enseguida se tuestan en hornos especiales entre 100 y 200ºC y se muelen hasta reducirlos a harina.

Maceración

Transformación del almidón en azúcar fermentable, que se realiza entre 60 y 70ºC mediante la diastasa y dura unas 3 horas. El agua caliente se añade a las cubas que tienen agitadores en las que está la harina de malta. Hirviendo el líquido se detiene la acción enzimática, y las proteínas indeseables coagulan y precipitan. Se filtra en una cuba decantadora (lauter), provista de doble fondo agujereado, o bien en filtros prensa. El filtrado, llamado mosto, se hierve en grandes depósitos, en donde se adiciona la cantidad precisa de lúpulo. Se filtra, se enfría y airea.

Fermentación

Se introducen levaduras que se clasifican en: 1) altas: formadas por cultivos de Saccharomyces cerevisiae, que suben a la parte posterior del tanque de fermentación (cervezas "ale"). El proceso empieza alrededor de los 9ºC; la temperatura asciende unos pocos grados en la fermentación tumultuosa, y finalmente desciende alrededor de 5ºC en el enfriamiento. Al cabo de unos días comienza la fermentación lenta, que dura de quince a veinte días, según la fábrica y el tipo de cerveza.

2) bajas: formadas por cultivos de S. Carlsbergensis, que se depositan en la parte inferior, con temperaturas entre 15 y 20ºC (cervezas "Lager").

Primera fermentación: durante esta se distinguen dos fases metabolicas la primera es aeróbica en la cual la levadura agota el oxigeno del medio, posteriormente el metabolismo del microorganismo se vuelve completamente fermentativo en el cual los azucares del medio son absorbidos y degradados a etanol y dióxido de carbono.

Durante el transcurso de la fermentación el objetivo principal es mantener el sabor y aroma en la forma final de la bebida, aun la cerveza se encuentra altamente inmadura lo cual permite realizar ajustes para llevarla al perfil que se desea.

Seguidamente se presenta el proceso de Maduración que es llevado a cabo por una Fermentación Secundaria, en la cual, se evidencian varios cambios, estos se pueden enumerar de la siguiente manera:

1. Maduración del sabor.2. Carbonación.3. Estandarización.4. Estabilidad de la claridad de la bebida en frio.5. Clarificación.

Además, se adicionan agentes antioxidantes, ácido sulfuroso o ácido ascórbico, para evitar el cambio de gusto durante el tiempo de reposo que se encuentre en los tanques especiales.

Los compuestos generados durante la fermentación van a distinguir el perfil final de la bebida. Los microorganismos anteriormente mencionado determinaran ciertas características del producto, sin embargo la genética puede jugar un rol importante en la especificación de las mismas. Al final del proceso se agrega azúcar para generar una segunda fermentación con el remanente de levaduras que hayan quedado presente, luego se adiciona colágeno de pescado para coagular las células de las levaduras, y asi finalizar el proceso.

Envasado

El contenido de anhídrido carbónico se regula en el tanque embotellador. El envasado de la cerveza se realiza en botellas, botes, cubas o barriles, generalmente se pasteuriza. La cantidad de alcohol oscila del 2 al 6%. Gracias al envasado la cerveza llega a su hogar con las mayores garantías de conservación, sabor y cuerpo. (Clubplaneta)

Esquema del proceso productivo de la Cerveza

Una vista en detalle de las Materias Primas utilizadas en su elaboración

Para la fabricación de la cerveza se requiere de cuatro materias primas: cebada, lúpulo, agua y levadura. La calidad de estas materias primas tiene una influencia decisiva sobre la calidad de los productos fabricados. El conocimiento de la calidad de las materias

primas, de su influencia sobre el proceso y sobre el producto final proporciona el fundamento para su tratamiento y procesamiento.

La Cebada es la materia prima principal para la fabricación de la cerveza. Su utilización se basa en el hecho de que tiene un alto contenido de almidón y que la cascara sigue adherida al grano después de la trilla después de haber sido procesada para la trasformación en malta. La cáscara, posee además, la propiedad de formar una capa filtrante, necesaria en una posterior etapa de fabricación. Previo a su procesamiento en la fábrica de cerveza, la cebada debe ser convertida en malta.

En algunos países son utilizados en el procesamiento también cereales sin maltear tales como el maíz, arroz, sorgo, cebada, trigo o productos elaborados a partir de éstos, como Adjuntos. El Trigo y otros cereales pueden ser utilizados.

El Lúpulo le da a la cerveza el sabor amargo y tiene influencias sobre el aroma. De su calidad depende en gran medida la calidad de la cerveza.

La mayor proporción de materia prima está formada por el Agua, la cual influye en el carácter y la calidad de la cerveza a través de muchos procesos durante la fabricación. A parte de ello, se requiere el agua para la limpieza y desinfección, y para muchos otros procesos en la maltearía y en la fábrica de cerveza.

En la cerveza, la fermentación alcohólica depende de la actividad de la levadura, que es por ello necesaria para la elaboración de cerveza. Debido a sus subproductos, la levadura tiene también una gran influencia sobre la calidad de la cerveza.

La CEBADA

La cebada (Hordeun Vulgare) suministra el almidón necesario para la fabricación de la cerveza, el cual es transformado posteriormente en la sala de cocción en extracto fermentable. Es necesario producir cebadas que suministren maltas ricas en extractos, por medio del cultivo de variedades adecuadas.

Morfología de las especies de cebada

La cebada es un cereal cuyas espigas se destacan por tener barbas particularmente largas. En la cebada se diferencia del tipo invernal (cebada de invierno), que es sembrado a mediados de Septiembre, y el tipo estival (cebada de verano), sembrado de marzo a abril.

En ambos existen variedades que, según el ordenamiento de los granos sobre los raquis (eje de la espiga), pueden ser clasificadas en variedades de dos hileras o de varias hileras. En las cebadas de varias hileras se encuentran sobre cada nudo del raquis una espiga de tres florecillas fértiles, las cuales forman un grano cada una, luego de la polinización. En las cebadas de dos hileras se forma solamente un grano de cada segmento intermodal del raquis, debido a que se encuentra disponible solo una florecilla fértil.

Los tipos de cebada se diferencian entre sí por varios factores, que son importantes para nosotros.

Las cebadas de dos hileras tienen granos grandes e hinchados, usualmente con una cáscara delgada, finamente arrugada. Con ello, esta cebada contiene relativamente más substancias útiles y tiene menos cáscaras, conteniendo así menos taninos y compuestos amargos. Los granos son todos muy uniformes. El contenido de extractos es comparativamente alto. Las cebadas de dos hileras son cultivadas preferentemente como cebadas de verano y concentran en sí mismas todas las ventajas para la fabricación de malta y cerveza.

Las cebadas de seis hileras tienen granos de tamaño irregular. Debido a que los granos no tienen suficiente lugar para el crecimiento, aquellos ubicados en las hileras de granos laterales son más delgados y su extremo distal está curvado (granos doblados). Los granos doblados sirven como características para reconocer cebadas de seis hileras.

Para obtener una buena malta uniforme es necesario que, en lo posible, todos los granos de la partida sean de la misma variedad. Consecuentemente, deben cultivarse variedades puras de hojas grandes, en lo posible. Solo así puede aprovecharse completamente la ventaja del cultivo de variedades puras. En el cultivo de variedades se da gran importancia a los aspectos cualitativos:

Resistencia a las enfermedades y parásitos, buena estabilidadElevada capacidad de aprovechamiento de nutrientesAlto rendimiento en granosBuena forma y distribución de los granosBuena capacidad de absorción de agua y reducida sensibilidad al aguaBajo contenido de albúminasAlto poder germinativo en el momento de maduración de malteadoBuena capacidad de formación de enzimas, buen poder disolventeElevado rendimiento en extractos en el malteado

Las cebadas utilizadas en la industria cervecera siempre son del tipo glumáceo. Es decir, que las cáscaras ventral y dorsal están tan íntimamente ligadas con el pericarpio y la testa del grano que quedan en él después de la trilla. Esto contrasta con el trigo, en el cual ambas cáscaras se desprenden en la trilla, dejando el fruto desnudo. Existen también variedades de cebada en las cuales sucede esto, pero estas no son utilizadas en la fabricación de la cerveza.

El grano de la cebada se divide en tres partes principales: la región germinal, el endospermo y las cubiertas del grano. La región germinal contiene el embrión con nudos de crecimiento para la acrospira y las raicillas.

Está separada del endospermo por una fina capa de tejido, el escutelo y la capa epitelial, que es una capa de células de paredes muy finas, con forma de palizada. El endospermo está compuesto por células estables, que contienen los granos de almidón. Estos son de tamaño grande y pequeños, siendo estos últimos los que representan entre un 70 a 95% del número total de granos de almidón en dicha parte; pero solamente contienen entre el 3 y 10% como máximo, del peso de almidón. Los espacios entre los granos de almidón están medianamente rellenados con una matriz del endorpermo, que contiene proteínas; esta porción matricial puede ser muy densa o faltar completamente.

El contenido restante se denomina materia seca. En promedio, la materia seca de la cebada tiene la siguiente composición:

Hidratos de carbono con un 70 – 85 %: son el mayor complejo de substancias; siendo las importantes el almidón, los azúcares, la celulosa, así como también, la hemicelulosa y las gomas.Proteína con un 10,5 – 11, 5 %: el 30 % de dicho intervalo están depositadas en forma de proteínas de transporte en las paredes del endospermo y regulan el metabolismo. De estas substancias solo un tercio llega a la cerveza terminada influyendo notablemente en la calidad de la misma en la formación de turbidez o en la estabilidad de la espuma.Substancias Minerales con un 2 – 4 %: están presente en compuestos inorgánicos siendo los más importantes los fosfatos, los silicatos y las sales de potasio. Los fosfatos son los más importantes ya que de estos compuestos se libera el fosfato que da a lugar a los procesos de fermentación. Grasas con un 1,5 – 2 %: dichas materia grasa está contenida en la capa de aleurona y en el embrión. Dichos ácidos grasos (componentes principales de las grasas) han alcanzado una importancia especial, ya que no solo poseen importancia en la alimentación, sino también en que ellos son importantes en la constitución e la pared celular de la levadura; pero sus derivados son también responsables de los procesos posteriores al envasado, de envejecimiento del sabor de la cerveza.

Otras Substancias con un 1 – 2 %: influyendo de manera importante en la calidad de la cerveza y sobre todo en su fabricación. Entre ellas están:

Los polifenoles (antocianinas) que pueden alterar el color o impartir sustancias aromáticas dependiendo del pH del medio, así como también causar turbidez por la asociación de ellas con substancias albuminoideas.

Vitaminas: como B1 (tiamina) B2 (riboflavina) C (ácido ascórbico) E (tocoferol). Dichos compuesto se deterioran progresivamente durante el almacenamiento y el procesado.

Enzimas: favorecen a las transformaciones que ocurren durante el malteado y la fabricación de la cerveza.

El LÚPULO

El lúpulo (Humus Lupulus L.) es una planta trepadora, perenne, dioica, perteneciente al grupo de las urticáceas y la familia cannabaceae. En la fábrica de cerveza se utilizan únicamente la inflorescencia de las plantas femeninas. Éstas contienen las resinas amargas y los aceites etéreos que le suministran a la cerveza los componentes amargantes y aromáticos.

Formulándolo de otra manera: los lúpulos son los estróbilos secos de la planta de lúpulo femenina, como también los productos fabricados a partir de aquellos, conteniendo estos productos solamente componentes del lúpulo. Solo son cultivadas en la producción agrícola las plantas femeninas, las cuales producen inflorescencia a partir del segundo año.

La composición del lúpulo tiene gran influencia sobre la calidad de la cerveza fabricada a partir de este. En su materia seca, el lúpulo está compuesto por:

Compuestos Amargos 18,5%Aceite de lúpulo 0,5%Taninos 3,5%Proteínas 20%Substancias minerales 8%

El resto está compuesto por celulosa y otras substancias que no son de importancia para la fabricación de cerveza.

El AGUA

Cuantitativamente, el agua es la mayor porción de materia prima usada para la fabricación de cerveza. Sin embargo, solamente una parte de la cantidad de agua requerida es usada directamente en la cerveza, mientras que la otra parte se requiere para la limpieza, enjuague y otros propósitos.

La obtención y el tratamiento del agua son de particular importancia para el cervecero, dado que la calidad del agua influye sobre la calidad de de la cerveza fabricada a partir de aquella.

El agua suministrada en las plantas no siempre se corresponde con los requisitos cualitativos; al menos hay que controlar invariablemente el agua, respecto del mantenimiento de ciertos parámetros, a los efectos de cumplir con todos los requisitos. Primeramente, el agua para la cerveza debe tener la calidad de agua potable, que sea incolora, inodora y libre de substancias enturbiantes, así como también, cumplir con los altos requisitos de las constitución microbiológica. (Kunze, 2006)

Los ADJUNTOS

El potencial enzimático de la malta es suficiente para degradar almidón adicional. Es por ello que se decide la adición de adjuntos o no; esto más con relación a términos de costo y de calidad de la misma.

Un adjunto es un cereal sin maltear, que es más barato como proveedor de almidón No está permitida la adición de Adjuntos para aquellas cervezas que son fabricadas según la Ley de Pureza “Reinheitsgebot”.

Estos Adjuntos pueden presentarse en distintas formas: cereales crudos (cebada, trigo), molienda gruesa (maíz, arroz y sorgo), en copos (maíz, arroz, avena), micronizados o torrefactos (maíz, cebada y trigo), harina/almidón (maíz, trigo y sorgo) y malteados (además de cebada incluyen trigo, avena, centeno y sorgo). (Bamforth, 2005)

La LEVADURA

La Levadura es un sacaromiseto unicelular, el cual es capaz de cubrir su demanda de energía:

En presencia de O2 (aerobio), por respiración, yEn ausencia de O2 (anaerobio), por fermentación.

En la fabricación de cerveza, el azúcar del mosto es fermentado por la levadura a alcohol y CO2. Para ello en la fábrica de cerveza se utilizan hongos de levadura del tipo Saccharomyces Cerevisiae. Cepas seleccionadas de estas levaduras son aisladas y cultivadas de forma sistemática, como cultivos puros de levadura para cerveza. Otras cepas de esta levadura se utilizan como levadura para destiladores o para viñateros.

Dado que la levadura no realiza únicamente una fermentación alcohólica, sino que también tiene, debido a su metabolismo, una gran influencia sobre el sabor y el carácter de la cerveza, es importante el conocimiento de las substancias contenidas en la levadura, de su metabolismo y de su reproducción. Dentro de los tipos y razas de levadura de cultivo hay una serie de características diferenciantes.

Estructura y composición de la célula de Levadura

La levadura es procesada en forma de una masa gruesa. Esta masa está formada por billones de células de levadura actuando independientemente unas de otras. Las células de levadura son ovaladas a redondas, con una longitud de 8 a 10 µm y un ancho de 5 a7 µm.

Estas poseen ciertos requerimientos nutricionales que son obtenidos del extracto de la malta como por ejemplo el nitrógeno, el cual, posee una concentración de 65 a 100 mg por cada 100 ml del medio, de los cuales 30% es α amino nitrógeno, 20% son proteínas de alto peso molecular, 40% son polipeptidos y el 10% representa el nitrógenos en purinas y otros compuestos nitrogenados.

Los isómeros de forma L –amino pueden ser utilizados por la levadura a excepción del acido glutamico, acido aspartico y asparangina, la concentración de nitrógeno es del 7 % en la levadura, el mosto contiene de 650 a 1000 mg /l es decir un 30% de lo que se forma en aminoácidos, son necesario para el crecimiento de la levadura.

Vitaminas: Estas son necesarias para el metabolismo y así sintetizar los requerimientos de la levadura. El biotin es la vitamina mayormente utilizada, participa en todas las reacciones de carboxilación, y tiene una variedad de análogos como por ejemplo el biocytin, D-desthiobiotin, biotin-Dsulfoxido. Este se involucra en la síntesis de proteínas de los ácidos nucleicos, síntesis de ácidos grasos, metabolismo de los carbohidratos etc. Una deficiencia del mismo se evidencia claramente en una disminución del crecimiento y deterioro de la membrana plasmática.Por otra parte la tiamina, y fosfato de tiamina participan en la carboxilacion del piruvato, y el reordenamiento de las reacciones del ciclo de las pentosas. La presencia de estos compuestos es esencial para obtener valores óptimos en la fermentación.

Concentración de las vitaminas en la levadura:

Tiamina (B1) 8 a 15 mg/100 mg de materia de levadura secaRiboflavina 2 a 8 mg

Ácido nicotínico 30 a 100 mgÁcido fólico 2 a 10 mgÁcido pantoténico 2 a 20 mgPiridoxina 3 a 10 mgBiotina 0,1 a 1 mg

Minerales: La cantidad de minerales en la levadura es muy importante ya que determina el crecimiento de la misma, y la fermentación en la cual actúa, en orden de importancia son: fosforo, magnesio, potasio, sodio, manganeso y sulfuro, estos son parte integral de las proteínas activadores de enzimas y funcionan como cofactores en las reacciones bioquímicas.

Magnesio: este es esencial en el crecimiento de la célula, porque actúa como activador de innumerables reacciones bioquímicas, en las cuales se incluye la transferencia de fosfato y descarboxilaciones.

Fosfatos: este se encuentra en una concentración en el mosto de 450 a 900mg P2O5/ L, este es fundamental en el crecimiento y desarrollo celular.

Potasio: participa en el mecanismo de transporte y asociación con transferencia de iones H+, su concentración es de 0.018M.Concentración de minerales en la levadura:

2000 mg fosfatos,2400 mg potasio,200 mg sodio,20 mg calcio,2 mg magnesio, 7 mg cinc, yTrazas de hierro, manganeso y cobre.

Fermentación del azúcar: en los cultivos de cerveza de EE.UU contienen entre el 11-12% de extractos solubles de este porcentaje el 90% son carbohidratos soluble y de estos el 70-72% son azucares fermentables, no obstante el remanente predominante es la dextrina de alto peso molecular.

El principal carbohidrato fermentable es la glucosa 14%, fructosa 1%, sacarosa 6% maltosa 59% y maltotriosa 20%. La glucosa y fructosa son utilizados rápidamente, después la maltosa, luego que todos los azucares fermentables son utilizados se

comienza a asimilar lentamente la maltotriosa, isomaltosa y los grandes polisacáridos.

La fermentación de la maltosa por la cepa S cerevisiae requiere de dos enzimas la α 1,4 D glucosidasa y la maltosa permeasa, la entrada de maltosa y maltriosa a la célula de la levadura es conducida por pernmeasas especificas, esto es posible gracias a que se induce el transpoprte de maltosa a través de la membrana, este es unidireccional, y la hidrólisis intracelular es seguida inmediatamente por la fosforilacion y la liberación de las moléculas de glucosa y ellas entran en la ruta de la glicolisis.

En resumen la célula de levadura está compuesta en un 75% de agua. La materia seca está compuesta, en forma variable, por:

Substancias albuminoideas 45 a 60%Hidratos de carbono 35 a 35%Grasas (lípidos) 4 a 7%Substancias minerales 6 a 9%

Cada célula de levadura está compuesta por el plasma celular (citoplasma, citosol), el cual está envuelto por una membrana celular, la plasmalerna. El plasma celular aloja una serie de organelos, que se encargan de las reacciones metabólicas.

En este caso el organelo más importante es naturalmente el núcleo de la célula, la central de comando de esta. De igual manera posee una gran cantidad de mitocondrias que importa el piruvato formado en el citosol y lo convierten por respiración en CO 2 y agua, en etapas parciales complicadas. En este proceso se forma ATP y ADP los cuales actúan por efecto recíproco como portadores de energía muy importantes. Por eso, las mitocondrias son llamadas “centrales de energía celular”.

Metabolismo de la célula de Levadura

Para la realización de sus proceso metabólicos vitales y la formación de nuevas substancias celulares, la levadura necesita energía y nutrientes, tal como cualquier otra célula.

La energía para la realización de estos procesos es obtenida por la levadura preferiblemente por respiración, tal como todos los demás seres vivientes. La obtención de energía es muy grande con la respiración, dado que la glucosa es descompuesta a CO2 y H2O sin que queden residuos. El CO2 y el H2O se encuentran el punto más bajo de la escala energética.

Con la respiración, los nutrientes ingeridos, por ejemplo el azúcar, son degradados en CO2 y agua, sin que queden residuos. Ante la ausencia de aire, las levadura pasa a la fermentación alcohólica, la cual tiene un mecanismo metabólico que deriva de la necesidad de un esqueleto carbonado para la síntesis de nuevo material celular y generar energía. La fermentación ocurre bajo condiciones anaeróbicas donde la fermentación de los azucares produce etanol y dióxido de carbono, generando 2 moles respectivamente de cada uno por cada mol de glucosa utilizado, bajo estas condiciones la multiplicación de las levaduras es mínima. No obstante Pasteur demostró que bajo condiciones aereobeas y con baja concentraciones de azúcar < 1%, las levaduras pueden usar el azúcar exclusivamente por la ruta oxidativa para la producción de biomasa, de manera que la energía obtenida por fermentación para la célula de levadura es mucho menor que la obtenida por respiración, ya que en la primera se cuentan solo con el 8% de la energía atrapada en el glucósido a diferencia de la segunda se producen 34 moléculas de ATP.

La degradación (catabolismo) de la glucosa hasta alcohol o, en el caso de la respiración, hasta CO2 y el agua tiene lugar en numerosas etapas de reacción. En esto, cada reacción es catalizada por una enzima especial.

Las substancias necesarias para la respiración o fermentación son absorbidas por las proteínas integradas de las plasmalerna y transportadas a través de la membrana. Es por ello que solamente pueden ser absorbidas por la célula de levaduras aquellas substancias para las cuales existan los correspondientes mecanismos de transporte. Ello depende a su vez del espectro enzimático de la célula de levadura.

Por otro lado, los niveles altos de alcohol formados durante la fermentación en profundidad son un 60% de isoamil alcohol, n-propanol, en orden de creciente magnitud. Estos se ven afectados por las condiciones de temperatura, aereacion, agitación entre otros. Las diferentes cepas de levaduras tiene variadas capacidades para la producción de diversos niveles de alcohol, por ello es muy importante controlar su selección.

El diacetyl y 2,3 pentadiona son de interés considerable, ya que con baja concentración afectan el sabor de la bebida, es por ello que debe tomarse en cuenta los siguientes aspectos durante la fermentación:

1- Controlar la temperatura durante la fermentación.2- Usar cepas con baja producción de diacetyl.3- Evitar la contaminación con cepas salvajes de levadura.(como los pediococcus, y

lactobacilus).

Asimismo, la producción de esteres en la bebida tiene una concentración de 25 a 50 ppm siendo los más comunes el etilacetato, isoamilacetato y feniletilacetato. Estos contribuyen a

la formación del sabor ocurriendo dicho fenómeno durante la fase activa de crecimiento mediante las reacciones químicas entre los ácidos y los alcoholes en la bebida.

Finalmente, los sulfuros como compuestos volátiles producidos por las levaduras también afectan el sabor de la bebida, este es absorbido por el microorganismo en muy baja concentración, este elemento es considerado esencial para el desarrollo de la levadura y puede ser reemplazado por los siguientes elementos que contienen grupo sulfuro: metionina, cisteína, cistina, biotin, tiamina, siendo estos asimilados para la biosíntesis de las proteínas, coenzimas y ciertas vitaminas para posteriormente ser incorporados en la molécula orgánica.

La levadura tiene metabolismos complicados de:

Hidratos de carbonoSubstancias albuminoideasMateria grasa Substancias minerales.

El metabolismo de los hidratos de carbono sirve prioritariamente para la obtención de energía por respiración y fermentación, mientras que sólo una parte más pequeña de los azúcares contenidos en el mosto es depositada como reserva, en forma de glicógeno y trehalosa.

Reproducción y Crecimiento de Levaduras

La forma típica de propagación de las levaduras es la gemación. En la gemación, la célula madre forma una pequeña protuberancia vesiculosa, en la cual entran una parte del citoplasma así como también un núcleo hija, formado por división, dando la forma a la célula hija completa.

Si se transfieren microorganismos a una solución nutriente fresca, tal como sucede, por ejemplo, en la fabricación de cerveza, en el inicio de la fermentación del mosto con la levadura, éstos comienzan a crecer. Este crecimiento está marcado en 6 fases:

1. Fase de latencia o inducción.En la fase de latencia, también llamada inducción, tiene lugar una activación del metabolismo. Dicha fase termina con la primera división celular.

2. Fase de aceleración.En la fase de aceleración, que sigue a la fase de latencia, aumenta progresivamente la velocidad de división.

3. Fase exponencial.

En la fase de propagación exponencial o logarítmica, la velocidad de propagación es constante y máxima; es el período en el cual se duplica el número de células y es la fase en la que la levadura posee mayor vitalidad.

4. Fase de deceleración.La fase exponencial está limitada temporalmente, debido a diferentes factores, por ejemplo empobrecimiento del sustrato de nutrientes o enriquecimiento en productos metabólicos que inhiben el crecimiento. Ella pasa a una fase de deceleración con velocidad de propagación decreciente.

5. Fase estacionaria.En la fase estacionaria posterior, el número de microorganismos permanece constante. Hay equilibrio entre la calidad de las células nuevas y las células que mueren.

6. Fase declinante.En esta última fase mueren más células que las nuevas, que se forman por propagación. La duración y la intensidad de cada una de las fases de crecimiento son influidas esencialmente por el sustrato, la temperatura y el estado fisiológico de la levadura. El sustrato debe contener todos los nutrientes necesarios para el crecimiento. De la misma manera, son decisivos para el crecimiento el contenido de agua, el pH y la concentración de oxígeno del sustrato.

Caracterización de las levaduras para Cerveza

Dentro del tipo de levaduras utilizada predominantemente como la levadura de cultivo en la fábrica de cerveza, se diferencian numerosas cepas. En la práctica cervecera, estas cepas se dividen en dos grandes grupos:

Levaduras de fermentación Altas (Saccharomyces Cerevisiae), yLevaduras de fermentación baja (Saccharomyces Carlsbergensis)

Entre las levaduras de fermentación alta y las de fermentación baja existen diferencias morfológicas, fisiológicas y tecnológicas.

Características Morfológicas

Las levaduras de fermentación altas y bajas pueden ser diferenciadas bajo microscopio por su comportamiento de gemación. Las levaduras de fermentación baja se encuentran casi exclusivamente como células individuales, respectivamente como pares de células, mientras que las levaduras de fermentación alta forman cadenas. En las levaduras de fermentación altas, las células madre e hija permanecen unidas, por lo general, durante un tiempo más largo, por lo cual se forma cadenas celulares ramificadas. En las levaduras de fermentación baja, las células madre e hija se separan entre sí, luego de finalizada la propagación. Ambos tipo de células tienen la misma forma celular.

Diferencias Fisiológicas

La característica de diferenciación fisiológica más importante entre ambas levaduras se encuentra en la fermentación del trisacárido rafinosa. Las levaduras de fermentación baja pueden, debido a su espectro enzimático, utilizar completamente la rafinosa, mientras que las levaduras de fermentación alta no fermentan el trisacárido o fermentan un tercio.

Otra característica es la diferenciación del metabolismo de respiración de la fermentación y la capacidad de la formación de esporas. Mientras que las levaduras de fermentación baja prepondera por lejos el metabolismo de fermentación, las levaduras de fermentación altas se caracterizan por un metabolismo más marcado de respiración.

Las levaduras de fermentación baja son más pobres en enzimas que las cepas de fermentación alta. En las levaduras de fermentación baja, la capacidad de formación de acoesporas es restringida. Ellas esporulan más esporádicamente, en comparación con las cepas de fermentación alta, y la formación de esporas dura más tiempo. Bajo condiciones normales de fermentación, no se realiza una formación de esporas.

Diferencias Tecnológicas

La denominación alta o baja en cepas de levaduras para cerveza deriva de su apariencia característica durante la fermentación. Las levaduras de fermentación alta suben a la superficie en el transcurso de la fermentación; las levaduras de fermentación baja se depositan al fondo, hacia el final de la fermentación. Las levaduras de fermentación alta también bajan hacia el fondo cuando alcanzan el final de la fermentación, pero mucho más tarde que las de fermentación baja.

Otra característica esencial de las levaduras de fermentación baja es el comportamiento diferenciado de floculación. De acuerdo con esto, las levaduras para cerveza de fermentación baja se dividen en floculantes y no floculantes. Las no floculantes, las células quedan finamente distribuidas en el sustrato de fermentación y recién descienden

lentamente al fondo al final de la fermentación. Las floculantes se aglomeran, después de algún tiempo, formando flóculos grandes, depositándose entonces rápidamente. El poder de floculación de una levadura está condicionado genéticamente y es heredado. Las levaduras de fermentación alta no floculan. (Kunze, 2006)

De todo esto se deriva la clasificación de las cervezas como:

Cervezas Ale (Fermentación Alta)

Las cervezas de fermentación alta o de tipo Ale fermentan a temperaturas más altas, entre los 15 °C y los 20 °C, y ocasionalmente por encima de los 24 °C. Las cervezas de levadura pura ale se elaboran con la espuma de la parte superior de la cerveza, es por esta razón por la que se denominan como cervezas de fermentación alta de la levadura. Las cervezas de tipo Ale se pueden beber generalmente a las tres semanas tras el comienzo de la fermentación, sin embargo algunas variedades pueden ofrecer envejecimientos que van desde algunos meses hasta años. Pueden variar en color, desde ser muy pálidas hasta alcanzar colores negros opalescentes. Inglaterra es el mejor ejemplo de cerveza de tipo Ale.

Cervezas larger (Fermentación Baja)

Aunque la naturaleza de las levaduras no fue perfectamente comprendida hasta que el investigador Emil Christian Hansen de la Carlsberg brewery en Dinamarca aisló una célula de levadura en el siglo XIX, los fabricantes de cerveza en Baviera tenían experiencia centenaria en el uso de levaduras de fermentación de baja tempertura mediante el uso de levaduras de tipo Lager, almacenándolas ("Lagern") en las cuevas alpinas. Este proceso de selección natural permitía que las levaduras resultantes ("levaduras salvajes") pudieran permanecer activas mientras la cerveza era almacenada en cuevas. Las levaduras de tipo Lager tienden a ser recolectadas del fondo del cubo de fermentación y es esta la razón por la que se suelen denominar como cervezas de fermentación baja. Las cervezas Lager son fermentadas a muchas más bajas temperaturas, alrededor de 10 ° C, comparado con una fermentación normal a temperaturas de 18 ° C. Durante el proceso se almacena la cerveza durante treinta días en condiciones muy cercanas al punto de fusión. Durante el almacenaje o proceso de "Lagering" la cerveza recobra un aroma y sabor especial. Los componentes de azufre desarrollados durante el proceso de fermentación se disipan. La popularidad de la cerveza lager creció bastante cuando se desarrollaron de manera eficiente los sistemas de refrigeración a comienzos del siglo XX.

Hoy en día las lagers representan a una vasta mayoría de las cervezas producidas, una de las más famosas es la denominada Pilsener originaria de la ciudad de Pilsen, República Checa (Plzeň en checo). Es un error muy común creer que todas las Lagers son claras de color y esto no es cierto: las cervezas de tipo lager pueden variar desde las muy claras hasta las oscuras (al igual que las cervezas de tipo Ale).

Preparación y Propagación de Inoculos

El punto de partida de cualquier fermentación es un recipiente limpio que ha sido esterilizado y rellenado con el medio de cultivo estéril. Posteriormente, el fermentador se inocula con el microorganismo adecuado. El tamaño del inóculo generalmente es del orden del 1-10% del volumen total del medio. Si es inferior a esta proporción puede existir un excesivamente prolongado período de latencia, lo que prolongará el período de fermentación. Para evitar estos problemas, el proceso de fermentación se lleva a cabo en cuatro etapas:

N°1 Preservación del inóculoN°2 Multiplicación del inóculoN°3 Cultivo de pre-fermentaciónN°4 Fermentación de producción

Etapa N° 1 Preservación del Inóculo

La preservación de las cepas de producción a lo largo de un período de tiempo largo es un requisito básico para una fermentación práctica. El objetivo no es la mera supervivencia de las cepas. Los microorganismos pueden ser mantenidos viables fácilmente a través de un período de transferencia, pero lo que debe ser preservado es su capacidad de formar el producto de interés. Las cepas superproductoras están frecuentemente dañadas en su metabolismo primario durante el proceso de selección de cepas y tales cepas frecuentemente degeneran durante las sucesivas transferencias, probablemente como resultado de mutaciones espontáneas (revertientes).

El objetivo de la preservación es, por consiguiente, mantener las cepas durante tanto tiempo como sea posible sin división celular. Las cepas maestras no deberían ser cultivadas más que una vez cada dos años controlando los niveles de actividad con cada uso. Dependiendo de la cepa, deben ser llevados a cabo periódicamente programas de selección. Las cepas de trabajo derivan de las cepas maestras. Las cepas de trabajo deben ser inspeccionadas en relación a su pureza y su capacidad de formar producto para posteriormente ser almacenadas hasta su uso.

Los distintos métodos de conservación y mantenimiento ya los hemos visto y dentro de ellos se debe seleccionar el óptimo para cada cepa.

Etapa N° 2 Crecimiento del Inóculo

El cultivo preservado se reaviva inicialmente mediante crecimiento en un cultivo líquido en agitación o en medio sólido si se requiere la formación de esporas. Las condiciones utilizadas en el cultivo inicial (composición del medio, temperatura de

incubación, etc.) dependerán del proceso específico. Los tiempos normales de incubación serán, tentativamente, los que aparecen en la tabla de la transparencia.

Etapa N° 3 Precultivo en el Fermentador

A fin de obtener suficiente inóculo para el fermentador de producción, deben realizarse precultivos en fermentadores más pequeños. Si un fermentador de producción se inicia con demasiado poco inóculo, el crecimiento se retrasa y la velocidad de formación del producto puede ser insatisfactoria. La concentración óptima del inóculo para el fermentador de producción determina el número de etapas del precultivo de fermentación que son necesarias. En general se requieren las siguientes concentraciones de inóculo:

Actinomicetos...........5 - 10 %Otras Bacterias..........0,1 - 3,0 %Hongos..................5 - 10 %

A veces el medio de cultivo de producción se utiliza en la última etapa de formación del inóculo a fin de inducir la formación del producto.

Etapa N° 4 Fermentación en Producción

Dependiendo de la fermentación se utilizan biorreactores de distinto tamaño y no puede darse un esquema general para la inoculación de un fermentador de producción. En la tabla de la transparencia se dan los tamaños de varios fermentadores de producción en uso real.

Contaminantes de la Cerveza

Levaduras salvajes: son contaminantes que se encuentran en el aire, agua, u otros materiales e insectos, en general la contaminación puede ocurrir durante la fermentación primaria, debido a que aun se encuentran en el medio suplementos que le permiten desarrollarse. Es por ello que la evaluación microbiológica es esencial para detectar estos casos, las cepas contaminantes son: Candida, klocckera, entre otros.

Bacterias contaminantes: la naturaleza y la magnitud en la flora bacteriana durante la fermentación va a depender del control microbiológico durante el proceso de elaboración, afortunadamente las condiciones de la fermentación reducen el numero de bacterias, ya que son afectadas por la alta concentración de etanol y la acides del medio.

Recuperación de Productos

El término recuperación (downstream processing) es un término colectivo, útil para todas las etapas que se requieren a fin de recuperar los productos útiles de cualquier tipo de proceso industrial. Cuando se discute la recuperación del producto se debe distinguir entre los conceptos de purificación y concentración. Una etapa de recuperación cambia la pureza y/o la concentración de un metabolito. En el proceso ideal de recuperación se optimizan ambos parámetros.

En los primeros tiempos de la Microbiología Industrial las técnicas utilizadas en la recuperación de productos (extracción, destilación, diálisis, cristalización, precipitación, desecación) se tomaron más o menos directamente de la ingeniería química sin más que un intento aproximado para adaptarlas a los materiales biológicos. Sin embargo, gradualmente se comprendió que había que perfeccionar procesos específicos de purificación para materiales biológicos ya que los bioproductos son frecuentemente compuestos muy lábiles cuyas estructuras activas pueden sobrevivir solamente bajo condiciones definidas y limitadas de pH, temperatura, fuerza iónica, etc. También resultó claro que no existe una operación única, ideal o universal, ni siquiera secuencias de operaciones que puedan ser recomendadas; las operaciones individuales unitarias deben ser combinadas de la forma más adecuada para cada problema particular.

En muchos casos la primera etapa, al final de una fermentación, es la separación de los sólidos del líquido que casi siempre es acuoso. El propio microorganismo puede ser el producto final deseado, sin embargo, en la mayor parte de los procesos a gran escala el producto deseado es un metabolito que está presente intra o extracelularmente. Ejemplos de metabolitos intracelulares incluyen a los ácidos nucleicos, las vitaminas, enzimas y ciertos antibióticos como la griseofulvina. Ejemplos de metabolitos extracelulares incluyen a los aminoácidos, el ácido cítrico, alcohol, algunos enzimas (amilasas y proteasas) y la mayor parte de los antibióticos (penicilina, estreptomicina). En unos pocos casos se encuentran metabolitos tanto en las células como en el filtrado del cultivo (vitamina B12).

Si el metabolito que se va a aislar es intracelular, éste debe ser liberado de las células antes de proceder a las siguientes etapas. Una vez el metabolito ha sido separado de las células, la selección de etapas adicionales de purificación dependerá del producto deseado. La transparencia resume varios procesos de purificación, ordenados de acuerdo con los principios de separación para partículas de varios tamaños, peso, carga, etc. Las últimas etapas en la recuperación implican precipitación, cristalización y/o desecación.

Separación de las Particulas

La primera etapa en la recuperación del producto es, por consiguiente, la separación de la biomasa celular y los ingredientes insolubles del sobrenadante de cultivo. Para este propósito existen varios métodos, que incluyen la floculación, flotación, filtración y centrifugación.

Floculación y flotación

Las células aisladas en el rango de tamaño de 1 a 10 µm sedimentan solo muy lentamente y son difíciles de precipitar incluso con la centrífuga. En estos casos se recurre a la floculación para producir grandes agregados que sedimentan mucho más rápidamente ya que la velocidad de sedimentación de una partícula aumenta con su diámetro (ley de Stokes).

En la mayor parte de los casos se añade un agente floculante como una sal inorgánica, polielectrolitos orgánicos o hidrocoloides minerales. La floculación depende tanto del agente floculante empleado como de otros factores como la naturaleza de las células, de los constituyentes iónicos así como su concentración. La floculación puede ocurrir reversiblemente si las cargas sobre la superficie de la célula pueden neutralizarse por iones de carga opuesta, e irreversiblemente si se forman, entre las células, puentes de moléculas poliméricas cargadas.

Si no se forma un flóculo suficientemente denso, puede utilizarse la flotación que es el proceso reverso a la floculación. La flotación se consigue introduciendo gas en el líquido. Las pequeñas burbujas de gas adsorben y atrapan a las células y suben a la capa de espuma en la parte superior del recipiente donde pueden ser recogidas y sacadas del biorreactor.

Usos y Aportes Nutricionales de la Levadura de Cerveza

¿Qué es la Levadura de Cerveza?

Es un tipo de levadura que permite obtener la cerveza a partir de la malta. Queda depositada en el fondo de los tanques de maduración y almacenaje de la cerveza en frío.Después de su lavado y secado ya es apta para su consumo.Aunque se obtenga con la elaboración de la cerveza no tiene alcohol.

¿Cuáles son las propiedades de la levadura de cerveza?

Es un gran depurador de la piel.La levadura de cerveza ayuda a regular los niveles de azúcar (glucosa en sangre)Fortalece el sistema nervioso.Mejora los estados anémicos.La levadura de cerveza ayuda en el control del peso (obesidad) (enbuenasmanos.com)

Por otro lado, la levadura de cerveza posee un elevado contenido en vitaminas del grupo B y además es un alimento rico en zinc, un oligoelemento que colabora en el funcionamiento de las hormonas sexuales. La elevada proporción de este mineral hace que su consumo disminuyan las molestias previas a la menstruación o síndrome premenstrual tales como hinchazón, irritabilidad, dolores de vientre, depresión.

Información nutricional y principales beneficios de la Levadura de Cerveza.

Proteínas. Al tener un alto nivel protéico es el complemento ideal para las dietas vegetarianas y para los vegetarianos debido a que cuenta con las propiedades que aportan las carnes y alimentos derivados de los animales.

Hierro. Complemento indispensable para las personas anémicas.

Vitamina B. Al ser una fuente de vitamina B es ideal para las personas nerviosas. Influye de manera positiva en los cuadros de irritabilidad, ansiedad o depresión. Estas vitaminas ayudan a superar los efectos causados por el estrés y, tomada en forma regular, ofrece muy buenos resultados contra el insomnio.

Cromo. Su alto contenido en cromo la hace ideal para los diabéticos, obesos y aquellas personas que no puede dejar de comer chocolate y dulces ya que contribuye a disminuir la ansiedad.

Acido Fólico. Excelente complemento para las mujeres embarazadas y/o en la etapa de la lactancia.

Otros beneficios:

Ayuda a disminuir los niveles del colesterol malo y aumenta los del llamado colesterol bueno. Ayuda a regular los niveles de azúcar (glucosa en la sangre) Alimento ideal para niños, adolescentes o deportistas en etapa de crecimiento. Desintoxica el organismo y contribuye para la regeneración de la flora intestinal. Las proteínas y las vitaminas del grupo B presentes en ella hacen una combinación ideal para el regeneramiento de los tejidos. Tiene rápidos y comprobados efectos en la recuperación de la piel luego de quemaduras o intervenciones quirúrgicas.

Contraindicaciones.

La levadura es rica en fósforo, pero cuando éste predomina sobre el calcio puede llegar a producir descalcificación. La misma se contrarresta aumentando el consumo de leche, productos lácteos o consumiendo un complemento rico en calcio.

Otro inconveniente es que la levadura de cerveza es rica en purina; si bien la purina aumenta las energías, favorece la producción corporal de proteínas y aminora el ritmo de envejecimiento, los desechos metabólicos de estos procesos es lo que nosotros conocemos como ácido úrico por lo que las personas que sufran de gota y reumatismo no deberían consumirlo antes de consultar a su médico. (El gourmet Urbano, 2010)

Bibliografía

Bamforth, C. W. (2005). Alimentos, fermentación y microorganismos. España: Acribia.

Clubplaneta. (s.f.). Recuperado el 25 de Marzo de 2012, de http://www.clubplaneta.com.mx/bar/proceso_de_elaboracion_de_la_cerveza.htm

El gourmet Urbano. (septiembre de 2010). Recuperado el 22 de abril de 2012, de http://elgourmeturbano.blogspot.com/2010/09/propiedades-y-beneficios-de-la-levadura.html

enbuenasmanos.com. (s.f.). Recuperado el 2012 de abril de 22, de http://www.enbuenasmanos.com/articulos/muestra.asp?art=48

Kunze, W. (2006). Tecnología para cerveceros y malteros - Cerveceria Polar. Alemania: VLB Berlin.

Sencamer. (2002). Semcamer - Normas Covenin. Recuperado el 02 de 04 de 2012, de www.sencamer.gob.ve