Seminario N1Antgenos-Inmunizacin

Inmunologa Clnica

2010

INMUNIZACION: el proceso de induccin de inmunidad artificial frente a una enfermedad..... (def. mdica)

PASIVA: adquisicin de Ac de una fuente externa.

ACTIVA: produccin local de Ac.

Qu es un adyuvante?

Son sustancias o preparados qumicos que, incorporados al antgeno o inyectados simultneamente con l, hacen ms efectiva la respuesta inmune.

Con su empleo se logra una economa de antgeno y de tiempo, ascomo un mayor nivel de anticuerpos especfico

Mecanismo de accin: El antgeno libre normalmente difunde con mucha rapidez desde los tejidos locales que rodean el sitio de inoculacin, y una de sus funciones importantes es crear un reservorio o depsito del antgeno de larga vida. Por otro lado todos los adyuvantes activan o estimulan los macrfagos; stos cuando son activados estimulan la respuesta inmune por un incremento de la cantidad de antgeno expresado en la membrana celular y de la eficiencia de su presentacin a los linfocitos. El macrfago tambin libera factores solubles estimulantes, que amplifican la proliferacin de los linfocitos.

Adyuvantes emulsiones usados en inmunologa experimental

Completo de Freund Respuesta de Ac y C.T. Muy txico

Incompleto de Freund Respuesta humoral

Elevada eficacia, amplio espectro de aplicacin, fcil manipulacin y disponibilidad comercial.

El adyuvante completo de Freud (FCA): Produccin de antisueros en animales cantidades limitadas de antgenos presentan una baja inmunogenicidad. Toxicidad En la investigacin pueden utilizarse, adems, los compuestos de aluminio "Syntex-1" (SAF-1): treonil anlogo del dipptido

murmico, polmeros no inicos en bloque (NBP) saponinas, bromuro de dimetil dioctadecil amonio (DDA), lipopptidos,

Consideraciones:

Bienestar animal: la extraccin de los anticuerpos del animal se realiza de una manera no invasiva, minimizando el sufrimiento del animal, as como tambin permite la reduccin en el nmero de animales necesarios para obtener una cantidad de anticuerpos determinada.

Cientficas: permite el uso de estas inmunoglobulinas en sistemas de investigacin y diagnstico, permitiendo la obtencin de anticuerpos contra antgenos mamferos muy conservados filogenticamente.

Econmicas: reduccin de costos en la produccin de anticuerpos policlonales, ya que la cantidad de inmunoglobulinas que pueden obtenerse a partir de la yema de huevo de las aves es similar a la producida por animales grandes, mientras que el costo de mantenimiento de una gallina es similar al de un animal pequeo.

Ratn Rata Cobayo Conejo caballo

Oral 0,5-1ml

/sonda gstrica

1-2ml 1-2ml 5-7ml

ID 0,1ml piel

lomo

0,1ml 0,1ml 0,1ml

SC 0,5- 1ml piel

laxa lomo

1-5ml 1-2ml 1-5ml

IP 1ml lateral

abdomen

5ml 10ml 20ml

IM 0,05ml muslo

posterior

0,1ml 0,1ml 0,2ml

IV 0,2ml vena

lateral cola

0,5ml 0,5ml vena

metatarsiana

0,5ml vena

marginal de la

oreja

Extraccin de

sangre

0,3ml vena de

la cola- seno

orbital-

puncin

cardiaca

0,3ml 5ml Vena de

la oreja- vena

metatarsiana

15ml vena

marginal de la

oreja

30- 50ml

VIAS DE ADMINISTRACIVIAS DE ADMINISTRACIN N

Formas de introducir una vacuna al organismo

Oral

Intramuscular

Subcutnea

Intravenosa

Intradrmica

SITIOS DE APLICACISITIOS DE APLICACINN

Lugar anatmico seleccionado para que el dao tisular vascular sea mnimo

Induzca la respuesta inmune deseada

Provoque el menor dao local y sistmico

Tipo de respuesta inmune segn la va de infeccin del patgeno

Bacterias no invasivas (Vibrio cholerae, ETEC) epitelios no permeables a las Igs sricas ruta tpica de vacunacin sIgA producida localmente

Patgenos invasivos (Chlamydias, H. pylori, virus como herpes simple) proteccin mediada por clulas CD4+ o por CTLs y clulas NK

Patgenos de la mucosa respiratoria o urogenital mas permeable a las Igs sricas una ruta parenteral de vacunacin puede ser tambin efectiva.

Patgenos entricos que invaden la mucosa o proliferan en los tejidos linfoides de la submucosa (S.typhi) y luego se expanden por el organismo una ruta parenteral de vacunacin puede ser tambin efectiva

Las Igs producidas atraviesan placenta?

Vaca, cabra , cerdo y caballo mayor permeabilidad en el intestino: se absorben los Ac del calostro pero no atraviesan la placenta.

Hombre, mono y cobayo atraviesan la placenta pero no se absorben en intestino los anticuerpos de la leche.

.

Inmunizacin con Cndida. Antgeno?

Mezcla de extracto crudo: fcil de obtener, gran nmero de antgenos, dificil de estandarizar y reaccin cruzada ( bacterias y otros hongos).

Antgenos recombinantes: en husped procariota, fcil de estandarizar y se eliminan las reacciones cruzadas.

Pptidos sintticos

Levadura completa?

Microorganismo entero muerto por calor, acetona, formol, etanol.

A partir de cultivos en medios enriquecidos, se selecciona la colonia y se transfiere a caldo enriquecido, se incuba 6-8hs a 37C y se calienta a 100C 2hs.

Preservar con 0,5ml de formol al 10%

Concentracin del inoculo?

Concentracin 109 /ml Cmo ajusto la concentracin?

Tubo 3 del nefelmetro de Mac Farland (0,3ml ClBa 1%+ 9,7ml H2S4Al1%)

Leer a 660nm (previamente una curva (Abs. 700 correlaciona con 10000000)

Contar en cmara de Neubauer.

Pared celular de C. albicans:quitina N-acetilglucosamina (rojo) (componente fibrilar)-1,3-D-glucano (verde)-1,6-D-glucano (azul)mananos (D-manosa) (negro) protenas (naranja)

Antgeno purificado?

Hongos Hongos

Nature Reviews Immunology 4, 11-24 (January 2004)

InteracciInteraccin n PAMPPAMP--TLRTLR

The yeast cell wall is made of ~25% helical (1-3) and (1-6)-D-glucans and ~25% oligo-mannans, ~20 % protein, ~10% lipids, and some chitin. The protein component exists predominantly as a mannoprotein complex. Covalent linkages are reported to exist as (1-4)-linkages between the reducing ends of chitin and the nonreducing end of b(1-3)-glucans as well as among glycoproteins, (1-6)-glucans, and (1-3)-glucans.

Colonizacin vs Infeccin

Colonizacin comensal de la sup de mucosas. Individuos normales tienen anticuerpos. Falsos positivos

Infecciones oportunistas en inmunocomprometidos baja produccin de anticuerpos. Falsos negativos

H. UNICELULARH. UNICELULAR(levadura)(levadura)

Blastoconidio

Tubo germinal

Pseudomicelio

Invasin

Penetracin: secresin de enzimas hidrolticas como SAPs ( proteasa), Plbs (fosfolipasa), Lips (lipasa) que digieren la sup. epitelial

Endocitosis por cl. Epitelial ( Als3 . Proteina de adhesin anclada a GPI)

Antgenos especficos de la forma hifal

La transformacin a la forma hifal es un factor de virulencia, asociado con una fase invasiva:

Hyr1; proteina reguladora hifal glicoproteina de la pared del tubo germinal

Ece1: proteina de elongacin de la clula Als3: glicoproteina de la pared celular similar a

aglutinina implicada en la adhesin a la superficie del hesped

Hwp1: glicoproteina expresada en la superficie de la pared hifal relacionada con la adherencia y factor de virulencia

Enzimas

Enolasa: enzima glicoltica inmunodominante presente en el citoplasma y en la pared interna de Cndida Albicans en ambas formas.

Proteinasa aspartil secretada: Pt secretadas por Cndida sp. Considerada un antgeno inmunodominante y factor de virulencia asociado con adherencia e invasin a tejidos y diseminacin.

Protenas Recombinantes

Sistema de expresin: bacterias, hongos, baculovirus-cl de insectos: eleccin del vector( plsmido) y el hesped. Considerar: tamao del inserto, sitios de restriccn, estrategias de purificacin, resistencia a antibioticos para seleccin

DNA constructor Data base genoma de Cndida (CGD) http// www.candidagenome. org Importante conocer estado y sitios de glicosilacin,

uniones disulfuras,modificaciones postraslacionales, estabilidad de la proteina

Ej. Bacteriofago T7 en E.Coli ( pt no glicosiladas)

Fuentes naturales de protenas

Bajos rendimientos

Impurezas

Tcnicas de ADN recombinante

Permiten la sntesis y la expresin autnoma, en un husped determinado, de un hbrido formado por la

combinacin de molculas de ADN de orgenes diferentes

Protena heterloga

Estrategia para la obtencin de una Protena Heterloga

Clonado

Sistema de Expresin

Estabilidad

Solubilidad

Tamao

Modificaciones Post-traduccionales

Aplicaciones

Antgeno (alta cc, fcil purificacin)

Estudio de la funcin biolgica

(mantener la actividad)

Estudios estructurales (solubilidad)

Aspectos Tcnicos1- Seleccin del ADN de inters

Dnde buscarlo ?

Qu expresamos ?

Cunto necesitamos ?

2- Seleccin del vector Expresin en eucariotas

Expresin en procariotas

3- Digestin, Ligacin del vector y del inserto y transformacin

4- Clonado y Expresin de la protena

Plegamiento de la protena

5- Purificacin6- Deteccin (SDS-PAGE)

Confirmacin de identidad (WB/secuencia de ADN)

Seleccin del ADN de inters

Conocida cADN PCR(Gene Bank)

Desconocida(DNA library)

Qu porcin del gen vamos a expresar ?Inserto Compatible con el

del vector

Protena Entre 20- 100 kDa

Tener en cuenta:hidrofilicidad/hidrofobicidad

Secuencia

Tamao