segunda parte martes 17 de abril: 14.30-17.30 cursotroncal2007
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Segunda parte
Martes 17 de abril: 14.30-17.30
ftp://einstein.ciencias.uchile.cl/CursoTroncal2007
Los canales responsables del potencial de acción en el axón gigante de jibia tienen dos atributos importantes.
•Selectividad. Conducen Na o K en forma excluyente.
•Excitabilidad. Capacidad de cambiar capacidad de conducir iones en función del voltaje.
Los canales tienen una compuerta en la entrada intracelular.
CH3
N
CH2
CH3
CH2
CH2 CH3CH2CH3
Tetra Etil AmonioTEA
El TEA bloquea los canales de K con una cinética muy rápida
CH3
N
CH2
CH3
(CH2)8
CH2 CH3CH2CH3
C9
C9 también bloquea pero su cinética es lenta.
+ +
Armstrong 1971 JGP 58:413
Armstrong 1971 JGP 58:413
Control
Armstrong 1971 JGP 58:413
+C9
Armstrong 1971 JGP 58:413
++C9
Armstrong 1971 JGP 58:413
+++C9
Armstrong 1971 JGP 58:413
En: Hille Armstrong MacKinnon 1999 NatureMedicine 5:1105-1119
Armstrong 1971 JGP 59:413
En: Hille Armstrong MacKinnon 1999 NatureMedicine 5:1105-1119
Armstrong 1971 JGP 59:413
En: Hille Armstrong MacKinnon 1999 NatureMedicine 5:1105-1119
Armstrong 1971 JGP 59:413
Conclusiones 1971:
El canal de K es un poro
La compuerta está por dentro
Hay un vestíbulo interno amplio capaz de alojar C9
Las paredes del vestíbulo son hidrófobas.
Salto en el tiempo al siglo XXI
Doyle et al 1998 Science 280:69-77
El cristal de KcsA corresponde a un canal cerrado
Bicapa
KcsAMthK
Jiang et al 2002 Nature 417:515-522
El cristal de MthK corresponde a un canal abierto
Mecanismo de activación por ligandos intracelulares.
Jiang et al 2002 Nature 417:523-526
417523-aS2.mov 417515-aS2.mov
Jiang et al 2002 Nature 417:523-526
417515a-s2.mov
417523a-s2.mov
KcsA MthK
Apertura 4 Ǻ 26Ǻ
La compuerta cerrada deja una abertura de 4 Ǻ de diámetro. Pero el K+ tiene sólo 2 Ǻ de diámetro. ¿Por qué el K+ no puede pasar?
Electrostática :
Una carga eléctrica, q, genera un campo eléctrico a su alrededor. Este campo se manifiesta por el potencial eléctrico en la vecindad de la carga.El potencial eléctrico, de un punto en el espacio se define como el trabajo (joule) necesario para traer una carga unitaria (1 coulomb) desde el infinito a ese punto del espacio. Se mide en Volts (joules/coulomb)
El potencial eléctrico depende de distancia entre el punto y la carga que crea el campo. El gradiente de potencial eléctrico se llama intensidad de campo E. Se mide en volt/metro es una magnitud vectorial y su magnitud y tiene unidades de newton coulomb-1.
E
El flujo eléctrico que emana de una superficie cerrada es la integral de la intensidad de campo eléctrico sobre el toda el área de la superficie cerrada.
-12CNm AEA
ddA es un elemento,minfinitesimal de área, normal a E
1-NC dx
dE
La ley de gauss:
La ley de Gauss dice que el flujo proporcional a la carga q encerrada en la superficie cerrada.
-12CNm AEA
ddA es un elemento,infinitesimal de área, normal a E
El flujo eléctrico que emana de una superficie cerrada es la integral del campo eléctrico potencial eléctrico sobre el toda el área de la superficie cerrada.
1-2
0
CNm AEq
dA
El factor de proporcionalidad es 1/ y es la permitividad eléctrica.
mNC 108542.8 -2-12120
Para una esfera de radio r con una carga puntual Q al medio, la integral es fácil porque la intensidad de campo E es igual en toda la superficie.
1-2
0
2 CNm 4E
qr
Para una esfera de radio r con una carga puntual Q al medio, la integral es fácil porque la intensidad de campo E es igual en toda la superficie.
1-2
0
2 CNm 4E
qr
1-2
0
NC 4
Er
q
Ésta es el la fuerza que siente una carga unitaria puesta a una distancia r de la carga q.
Ahora podemos calcular el trabajo necesario, para traer una carga unitaria desde el infinito a un distancia r de la carga q.
1-2
0
NC 4 r
q
dr
d
1-2
0
JC 4
drrπε
qd 1-2
0
JC 4
drr πε
qd
rrr
r
1-
0
JC 4
rπε
qPotencial eléctrico en la superficie de
una esfera cargada.
1-
0
JC 4
rπε
qPotencial eléctrico en la superficie de
una esfera cargada.
El trabajo para aumentar la carga de la esfera en un dq es dq. J
4
1
0
qdq rπε
dq
La energía necesaria para cargar la esfera es la integral desde carga 0 hasta carga = q.
J 4
10
00
qdqrπε
dqqq
La energía necesaria para cargar la esfera es siempre positiva es la auto energía, self energy, o energía de Born
.
J 8 0
2
rπε
qU auto
Max Born
Born: 11 Dec 1882 in Breslau, Germany (now Wroclaw, Poland)
Died: 5 Jan 1970 in Göttingen, Germany
molJ
8
)(
0
20
rez
NU iB
Si un átomo tiene una carga zi, y la carga del electrón es eo la energía para un mol es su auto-energía molar:
Calcular la auto energía para un átomo con z = 1 y un radio de 1 Å.
2
29
0 Coulomb
Nm 109
4
1
-123 mol 10022.6 N
Coulomb 106.1 190
e m 10 10r
molJ
10 69.4 102
1096.16.1022.6 410
9191923
BU
kcal/mol 166kJ/mol 694 B U cal 239.0J 1
Recordar: kcal/mol 166 kJ/mol 694
8 0
20
Ne
Esto es en el vacío. En un medio material la auto energía es menor: cambia por un factor 1/ en que es la constante dieléctrica del medio.
Para el agua w= 80 y para la bicapa de lípidos b= 2 .
kcal/mol 2 80
166
8 0
20 w
Ne
kcal/mol 83 2
166
8 0
20 b
Ne
Doyle et al 1998 Science 280:69-77
6.3 kcal/mol
Energía libre de tansferencia del ion K+ desde el agua al centro de la cavidad
Benoît Roux an Roderick Mackinnon 1999 Science 285:100-102
Energía libre de transferencia del ion K+ desde el agua un medio de constante dieléctrica 2
RTGe /596.0/81 102 e
kcal/mol 81G
Energía libre de transferencia del ion K+ desde el agua al centro de una bicapa
de 40 Ǻ de espesor y = 2
RTGe /286.0/38 103 e
kcal/mol 38G
Parsegian V. A. 1969 Nature 221:884.
kcal/mol 81G
Energía libre de transferencia del ion K+ desde el agua al centro de la proteína
puesta en la bicapa = 2
RTGe /286.0/38 103 e
kcal/mol 38G
Benoît Roux an Roderick Mackinnon 1999 Science 285:100-102
kcal/mol 81G
Parsegian V. A. 1969 Nature 221:884.
Energía libre de transferencia del ion K+ desde el agua al centro de la cavidad
kcal/mol 3.6G
RTGe /56.0/3.6 103 e
kcal/mol 38G
Benoît Roux an Roderick Mackinnon 1999 Science 285:100-102
Parsegian V. A. 1969 Nature 221:884.
Energía libre de transferencia del ion K+ desde el agua al centro de la cavidad, estando dos iones en el filtro de selectividad
RTGe /126.0/3.16 105.1 e
kcal/mol 3.6Gkcal/mol 38G
kcal/mol 3.16G
Benoît Roux an Roderick Mackinnon 1999 Science 285:100-102
RTGe /66.0/5.8 105.1 e
kcal/mol 3.6Gkcal/mol 38G
kcal/mol 3.16Gkcal/mol 5.8G
Energía libre de transferencia del ion K+ desde el agua al centro de la cavidad, estando dos iones en el filtro de selectividad, considerando el efecto de las cargas de la proteína
Benoît Roux an Roderick Mackinnon 1999 Science 285:100-102
RTGe /36.0/5.4 102e
kcal/mol 3.6Gkcal/mol 38G
kcal/mol 3.16Gkcal/mol 5.8Gkcal/mol 5.4G
Energía libre de transferencia del ion K+ desde el agua al centro de la cavidad, estando dos iones en el filtro de selectividad, considerando sólo el efecto de las hélices del poro.
Benoît Roux an Roderick Mackinnon 1999 Science 285:100-102
Estructura del canal KcsA cerrado
nm
Estructura del canal MthK abierto
Sólo tres subunidades dibujadas
Flexión de 300
de la hélice interna0.4 nm
1.0 nm
Jiang et al 2002 Nature 417:523-526
kcal/mol 38G
Energía libre de transferencia del ion K+ desde el agua al canal de entrada cerrado
kcal/mol 34Gkcal/mol 38G
Energía libre de transferencia del ion K+ desde el agua al canal de entrada cerrado
kcal/mol 34Gkcal/mol 38G
Energía libre de transferencia del ion K+ desde el agua al canal de entrada abierto
kcal/mol 0G
Identificación de las cargas del sensor de potencial
Un Condensador eléctrico consiste en dos placas conductoras separadas por un aislante.
Al cargar un condensador con una carga Q, se genera una diferencia de potencial eléctrico, V:
CVQ Un condensador de una capacidad de 1 Farad adquiere una diferencia de potencial de 1 Volt al cargarlo con 1 Coulomb.
La intensidad de una corriente eléctrica, I, se mide en Amperes.Una corriente de 1 Amper transporta 1 Coulomb por segundo. Un condensador de una capacidad de 1 Farad se demora un segundo al cargarlo con una corriente de 1 Amper.
CVtI
CVtI
t = 0s, V = 0 Volts
1A 1A
t = 1s, V = 1 Volt
Vacío entre las placas
CVtI
t = 0s, V = 0 Volts
1A 1A
t = 10s, V = 1 Volt
Un diléctrico entre las placas
CVtI
t = 0s, V = 0 Volts
+
+
+
+ -
--
-
1A 1A
t = 10s, V = 1 Volt
+
+
+
+
-
-
-
-
Un diléctrico entre las placas
V = 1.0 VoltV = 1.0 Volt
+
+
+
+
+
+
+
+
-
--
-
-
-
-
-
Las cargas del dieléctrico se mueven en el campo eléctrico produciendo una corriente de desplazamiento:
Las corriente de desplazamiento representa movimiento de cargas positivas desde el lado positivo hacia el lado negativo. Esta corriente transportó 9 Coulombs en 10 segundos. Representa la polarización del dieléctrico.
Oocitos sin Shaker
Oocitos con Shaker
Aggarwal y MacKinnon Neuron 16:1169-1177
Oocito de Xenopus expresando el canal Shaker de Drosophyla bloquados por AGTX
Sensores
Animación sensores.exe
sensores.exe
-40 mV
-100 mV
+40 mV
Oocito de Xenopus expresando el canal Shaker de Drosophyla bloquados por AGTX
Sin ShakerCon Shaker
Aggarwal y MacKinnon Neuron 16:1169-1177
Oocito de Xenopus expresando el canal Shaker de Drosophyla bloquados por AGTX
Sin ShakerCon Shaker
CerradosAbiertos
TransiciónCarga desplazada
Q = 40 nC, pero ¿de cuántos canales?Aggarwal y MacKinnon Neuron 16:1169-1177
El número de canales se determina con AGTX radiactiva de actividad específica conocida.
Resulta 13.6 cargas por canalAggarwal y MacKinnon Neuron 16:1169-1177
Nú
me
ro d
e c
arg
as e
lem
en
tale
s
Número de canales
>shaker 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1 MAAVAGLYGL GEDRQHRKKQ QQQQQHQKEQ LEQKEEQKKI AERKLQLREQ 50 51 QLQRNSLDGY GSLPKLSSQD EEGGAGHGFG GGPQHFEPIP HDHDFCERVV 100101 INVSGLRFET QLRTLNQFPD TLLGDPARRL RYFDPLRNEY FFDRSRPSFD 150151 AILYYYQSGG RLRRPVNVPL DVFSEEIKFY ELGDQAINKF REDEGFIKEE 200201 ERPLPDNEKQ RKVWLLFEYP ESSQAARVVA IISVFVILLS IVIFCLETLP 250251 EFKHYKVFNT TTNGTKIEED EVPDITDPFF LIETLCIIWF TFELTVRFLA 300301 CPNKLNFCRD VMNVIDIIAI IPYFITLATV VAEEEDTLNL PKAPVSPQDK 350351 SSNQAMSLAI LRVIRLVRVF RIFKLSRHSK GLQILGRTLK ASMRELGLLI 400401 FFLFIGVVLF SSAVYFAEAG SENSFFKSIP DAFWWAVVTM TTVGYGDMTP 450451 VGVWGKIVGS LCAIAGVLTI ALPVPVIVSN FNYFYHRETD QEEMQSQNFN 500501 HVTSCPYLPG TLGQHMKKSS LSESSSDMMD LDDGVESTPG LTETHPGRSA 550551 VAPFLGAQQQ QQQQPVASSL SMSIDKQLQH PLQHVTQTQL YQQQQQQQQQ 600601 QQNGFKQQQQ QTQQQLQQQQ SHTINASAAA ATSGSGSSGL TMRHNNALAV 650651 SIETDV
Estructura primaria del producto de expresión de un gen que le falta al mutante Shaker de Drosophila.
Hay 7 cargas positivas en el posible sensor de potencial
13.6 -9.7 = 3.9 cargas para R1
Aggarwal y MacKinnon Neuron 16:1169-1177
13.6 -9.7 = 3.9 cargas para R113.6 -8.8 = 4.8 cargas para R2 suman 8.1
Aggarwal y MacKinnon Neuron 16:1169-1177
13.6 -9.7 = 3.9 cargas para R113.6 -8.8 = 4.8 cargas para R2 suman 8.1
13.6 -10.0 = 3.6 cargas para R3 suman 11.7
Aggarwal y MacKinnon Neuron 16:1169-1177
13.6 -9.7 = 3.9 cargas para R113.6 -8.8 = 4.8 cargas para R2 suman 8.1
13.6 -10.0 = 3.6 cargas para R3 suman 11.7
13.6 -9.8 = 3.8 cargas para R14 suman 14.5
Aggarwal y MacKinnon Neuron 16:1169-1177
13.6 -9.7 = 3.9 cargas para R113.6 -8.8 = 4.8 cargas para R2 suman 8.1
13.6 -10.0 = 3.6 cargas para R3 suman 11.7
13.6 -9.8 = 3.8 cargas para R4 suman 14.5
13.6 -11.5 = 2.1 cargas para K5 suman 15.6
Aggarwal y MacKinnon Neuron 16:1169-1177
13.6 -9.7 = 3.9 cargas para R1
13.6 -8.8 = 4.8 cargas para R2 suman 8.1
13.6 -10.0 = 3.6 cargas para R3 suman 11.7
13.6 -9.8 = 3.8 cargas para R4 suman 14.5
13.6 -11.5 = 2.1 cargas para K5 suman 15.6
13.6 -13.5 = 0.1 cargas para K7 suman 15.6
Aggarwal y MacKinnon Neuron 16:1169-1177
Experimentos de reactivos de grupos SH.MTSET CH3-S02-S-CH2-CH2-N+-(CH3)3
Hacer una mutación puntual, por ejemplo R326C
Comparar la rapidez de la reacción de cisteína-MTSET para el canal abierto y el canal cerrado, poniendo MTSET ya sea por el interior o por el exterior.
R1 R362R2 R365R3 R368R4 R371K5 K374
Esquema resumen de la accesibilidad de los residuos del segmento S4
Larsson et al 1996 Neuron 16:387-397
Modelo 1966 del funcionamiento del sensor de potencial eléctrico
Jiang et al 2003 Nature 423:33-41
El desplazamiento vertical es de 16 Ångström
Gonzalez et al 2000 J. Gen. Physiol. 115:193-207
Estructura cristalina del canal de potasio activado por potencial eléctrico KvaPVista desde el lado intracelular
Jiang et al 2003 Nature 423:33-41
Fragmento de anticuerpo
S4
Jiang et al 2003 Nature 423:33-41
Jiang et al 2003 Nature 423:33-41
La estructura cristalina difiere de la esperada.
Los segmentos de hélices alfa no están perpendiculares al plano de la membrana.
El segmento S4 está fuera de la membrana.
El segmento S3 está dividido en dos segmentos S3a y S3b.
El segmento S6 está quebrado: el canal está abierto
Esta estructura está distorsionada por la inmovilización del S3b-S4 por el Fab.
Jiang et al 2003 Nature 423:33-41
Estructura cristalina del sensor de potencial aislado de KvaP
Cristal completo
Composición de los dos cristales
Jiang et al 2003 Nature 423:42-48
Modelo de remo (paddle) del sensor de potencial
Cerrado Abierto
Jiang et al 2003 Nature 423:33-41
Gonzalez et al Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005 102: 5020-5025.
Gonzalez et al Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005 102: 5020-5025.
Los residuos del segmento S3b son accesibles en el estado de reposo o activo del sensor de potencial.
Francisco Bezanilla IEEE TRANSACTIONS ON NANOBIOSCIENCE, VOL. 4, NO. 1, MARCH 2005 34-48
Sensores
Animación opcl.exe
opcl.exe