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UNIVERSIDAD DE JAÉN
Facultad de Ciencias Experimentales
Trabajo Fin de Grado
Trabajo Fin de Grado
María José Santolaya Hernández.
Septiembre, 2016
Análisis microbiológico de
diferentes encurtidos
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UNIVERSIDAD DE JAÉN
Facultad de Ciencias Experimentales
Trabajo Fin de Grado
Trabajo Fin de Grado
María José Santolaya Hernández
Septiembre, 2016
Análisis microbiológico de
diferentes encurtidos
3
ÍNDICE
RESUMEN…………………………………………………………………… 4
ABSTRACT…………………………………………………………………. 4
1) INTRODUCCIÓN…………………………………………………….. 5
1.1 Encurtidos……………………………………………………….. 5
1.2 Proceso de fabricación de los encurtidos…………………. 6
1.2.1 Cambios físicos………………………………………… 8
1.2.2 Cambios químicos……………………………………... 8
1.2.3 Cambios microbiológicos……………………………… 8
1.3 Control de la fermentación……………………………………. 9
1.4 Microbiota asociada a procesos de fermentación………… 10
1.4.1 Bacterias productoras de ácido láctico……………….. 10
1.4.2 Levaduras……………………………………………….. 13
1.4.3 Bacterias productoras de gases………………………. 14
1.5 Saprófitos y alteración………………………………………….. 14
1.6 Efectos de la conservación de los alimentos: encurtidos y
fermentación………………………………………………………….. 15
2) OBJETIVOS…………………………………………………………… 17
3) MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………… 18
3.1 Alimentos utilizados…………………………………………….. 18
3.2 Material de laboratorio………………………………………….. 18
3.3 Medios de cultivo empleados…………………………………. 19
3.4 Preparación de los medios de cultivo……………………….. 24
3.5 Procesado de los alimentos…………………………………… 25
3.6 Recuento e identificación preliminar………………………… 26
4) RESULTADOS ……………………………………………………….. 30
5) DISCUSIÓN……………………………………………………………. 41
6) CONCLUSIONES……………………………………………………… 43
7) BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………… 44
4
RESUMEN
El proceso de fabricación de encurtidos es un método de conservación muy antiguo,
originado por la necesidad de conservar las cosechas de temporada. Una parte
importante de los métodos utilizados para la conservación de alimentos es inhibir el
desarrollo de los microorganismos que pueden llevar a su deterioro, pero también
existe la posibilidad de utilizar algunos microorganismos para conseguir esa
conservación, generando condiciones desfavorables para el desarrollo de otros
microorganismos. En este trabajo se persiguió estimar la incidencia de
contaminación microbiana en los encurtidos vegetales empleados, analizar la
presencia de distintos grupos bacterianos en ellos y realizar un estudio de los
microorganismos presentes sobre estos alimentos. Para ello, se llevó a cabo la
estimación de la carga microbiana de los microorganismos crecidos a partir de las
muestras de encurtidos en los diferentes medios selectivos y no selectivos y se
realizó una identificación preliminar de los microorganismos aislados mediante
tinción de Gram y prueba de la catalasa. Los resultados obtenidos muestran que la
mayoría de los grupos bacterianos aislados son microorganismos asociados a los
procesos de fermentación de los encurtidos: bacterias ácido lácticas y levaduras.
ABSTRACT
The manufacturing process of pickles is a conservation method very old, arising from
the need to conserve the crops seasonal. An important part of the methods used for
food preservation is to inhibit the growth of microorganisms that can lead to their
deterioration, but there is also the possibility of using some microorganisms to get
that conservation, creating unfavorable for the development of other microorganisms
conditions. In this work the incidence of microbial pollution in vegetable pickles
employees was estimated as well as the presence of diverse bacterial groups on
them. To this, it was performed to estimate the microbial load of microorganisms
grown from samples pickled in different selective and nonselective mediums were
performed a preliminary identification of isolated microorganisms using Gram’s stain
and catalase test. The results showed that most groups are bacterial isolates
associated microorganisms fermentation of pickles: lactic acid bacteria and yeasts.
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1) INTRODUCCIÓN.
1.1 Encurtidos:
Los encurtidos son los alimentos que han sido marinados en una solución de sal y
que fermentan por si solos o con la ayuda de un inoculo (microorganismo como
Lactobacillus plantarum), el cual baja el pH y aumenta la acidez del mismo con el
objetivo de poder extender su conservación. Son aquellos productos vegetales
hortícolas que, tras ser sometidos a diversas transformaciones, tienen en común su
aderezo con vinagre. Este proceso permite preservar por más tiempo los alimentos.
Las especies hortícolas más cultivadas para la realización de encurtidos son:
pepinillo, cebollita, guindilla, rabanitos, zanahoria, repollo, berenjenas, remolacha de
mesa, judía verde, pimiento, tomate verde, alcaparra, coliflor y apio.
La materia prima puede someterse a fermentación ácido-láctica o bien no
fermentarse. Los encurtidos totalmente curados, almacenados en sal, se pueden
convertir en una gran diversidad de productos eliminando la mayor parte de la sal.
La adicción de vinagre los convierte en encurtidos ácidos. También pueden
elaborarse numerosos tipos de encurtidos mediante adiciones de azúcares,
especias, esencias y aromas, pero siempre con presencia de vinagre, ya que es la
característica fundamental del encurtido. Independientemente de los encurtidos se
fermenten o no, pueden pasteurizarse para mejorar su conservación.
Todos los productos de esta naturaleza presentan una gran ventaja: que el riesgo de
intoxicación alimenticia es mínimo.
El encurtido permite conservar los productos vegetales durante mucho tiempo y
tiene la ventaja de que sus características nutritivas y organolépticas se mantienen.
En la elaboración de encurtidos dependen mucho los gustos, las costumbres y las
tradiciones, así como la preferencia por sabores dulces, ácidos, agridulces o
picantes.
6
1.2. Proceso de fabricación de los encurtidos.
El proceso de fabricación de encurtidos consta de las siguientes fases (Martínez,
1988):
- Materia prima: Constituida por los frutos inmaduros de las especies vegetales
utilizadas.
- Selección: Eliminación de las partes blandas de la planta, que normalmente
contienen poblaciones de hongos.
- Calibrado: Clasificación de los frutos según su tamaño.
- Lavado: se realiza un lavado para disminuir la suciedad y los restos de tierra
adherida que puedan llevar los frutos. La higiene en el manejo de la materia es
fundamental al ser la fermentación acido-láctica un proceso microbiológico.
- Fermentación: Es el apartado más importante de todo el proceso de fabricación.
El proceso de fermentación conlleva el uso de microorganismos para realizar
transformaciones de materia orgánica, catalizadas por enzimas. La fermentación ha
sido considerada durante muchos siglos como un arte, la elaboración de vino se
practica desde hace al menos 10.000 años, los historiadores indican que los
egipcios producían cerveza 5.000-6.000 años a.C. y también existen referencias de
elaboración de queso 5.000 años a.C. En resumen, la producción de alimentos y
bebidas fermentadas se viene realizando desde hace aproximadamente 10.000
años, antes de que se conociera la existencia de los microorganismos. (Casp y col.,
2003).
Una parte importante de los métodos utilizados para la conservación de alimentos es
inhibir el desarrollo de los microorganismos que pueden llevar a su deterioro, pero
también existe la posibilidad de utilizar algunos microorganismos para conseguir esa
conservación, generando condiciones desfavorables para el desarrollo de otros
microorganismos, como por ejemplo, la producción de grandes cantidades de
alcohol o de ácido por ciertos organismos crea unas condiciones desfavorables para
el desarrollo de otros. En este principio se basan los métodos de conservación de
alimentos por fermentación (Casp y col., 2003).
7
Un alimento se considera fermentado cuando sus componentes químicos
considerados útiles, son atacados por microorganismos, debido a ello, su
composición química se modifica. En estos procesos fermentativos, además de los
microorganismos, también pueden intervenir procesos proteolíticos debidos a la
acción de enzimas propias del producto alimentario de partida. En algunos casos,
además, el proceso fermentativo es realizado por microorganismos distintos, uno
actúa después de que el otro haya modificado la materia prima original, como por
ejemplo, el caso de los quesos azules, en los cuales después de que las bacterias
lácticas hayan realizado la fermentación de la lactosa, tiene lugar el desarrollo del
moho.
El proceso de fermentación consiste en poner las especies vegetales en solución
salina -salmuera y dejar que la flora microbiana que se encuentra asociada de
forma natural a la materia prima realice la fermentación natural. Los frutos se
reblandecerían durante las primeras horas y comenzarían a producirse
fermentaciones indeseadas que provocarían putrefacción si no utilizásemos un
medio adecuado, por lo tanto, debemos evitar fermentaciones anómalas y crear un
medio adecuado y favorable para la fermentación, como es el caso de la
fermentación acido-láctica.
La combinación de dos factores importantes da lugar a un medio favorable para la
fermentación. Estos factores son:
la concentración de sal
el descenso del pH de la salmuera debido a la producción de ácido láctico por
las bacterias fermentativas.
La fermentación se realiza en depósitos de diferentes tipos y capacidades. Este
proceso tiene lugar en condiciones de anaerobiosis. Durante la fermentación, se
producen cambios físicos, químicos y microbiológicos en los alimentos. (Martínez,
1988).
8
1.2.1 Cambios físicos:
En las primeras 48-72 horas el agua, azúcares, proteínas, minerales y otras
sustancias contenidas en el vegetal se difunden por ósmosis en la salmuera. Estas
sustancias constituirán el alimento de las bacterias productoras de ácido láctico,
bacterias fermentativas y de otros microorganismos. A raíz de ello, los frutos se
arrugan y pierden peso. A continuación, la sal comienza a introducirse en los tejidos
y como consecuencia se produce una entrada de agua que hace que el vegetal
gane peso y vuelva a su situación original. El cambio de textura durante la
fermentación es de gran importancia ya que va a determinar las diferencias
cualitativas entre los encurtidos procedentes vegetales fermentados y de frescos. La
textura de los encurtidos preparados sin fermentación previa es dura, mejorándose
en gran medida con la fermentación.
1.2.2 Cambios químicos:
El principal cambio químico es debido a la transformación de los azúcares
contenidos en los frutos en ácido láctico como consecuencia de la acción
microbiana. El principal producto de la fermentación es el ácido láctico, pero también
se producen cantidades más pequeñas de ácido acético. También aparecen
alcoholes y ésteres en menores proporciones.
A medida que aumenta la producción de ácido láctico, desciende el pH inicial de la
salmuera 6,5- 7, pasando a valores entre 3,4 y 3,8, pero nunca superior a 4.
1.2.3 Cambios microbiológicos:
Durante la fermentación de las hortalizas, la flora implicada en el proceso procede
de las hortalizas crudas y del equipo de la planta de tratamiento utilizado para
prepararlas para el tanque de fermentación. Las hortalizas no se blanquean, gracias
a ello, retienen las bacterias acido-lácticas epifíticas que se encontraban asociadas
con ellas en el campo.
9
Primero se sala la hortaliza mediante una salmuera, éste salazón tiene un efecto
importante en la selección de la microflora predominante. Durante la fermentación, el
desarrollo de los microorganismos se lleva a cabo mediante una compleja
interacción de diversos factores: pH, sal, ácidos orgánicos, actividad del agua,
temperatura, potencial rédox, oxígeno y dióxido de carbono. Con algunas
variaciones, la fermentación de todos los alimentos vegetales sigue un patrón
parecido, que consta de un crecimiento secuencial de bacterias acido-lacticas que
incluyen Leuconostoc-mesenteroides, Lactobacillus brevis, Pediococcus acidilactici,
Pediococcus pentosaceus y Lactobacillus plantarum. Se han observado otras
lácticas, como Enterococcus faecalis, pero no son importantes en la fermentación.
1.2 Control de la fermentación.
El control de los microorganismos de la alteración depende del tipo de producto
encurtido, pero generalmente se consigue mediante:
Distribución adecuada de la sal o de la composición de salmuera: La
concentración de sal de las salmueras es otro de los parámetros más
importantes. No sólo se trata de favorecer una correcta fermentación desde el
inicio sino que debiera mantenerse una concentración constante y renovarla
si fuese preciso (Özay y Borcakli, 1995; Montaño y col., 1993; Bobillo y
Marshal, 1991). Tassou y col., (2002) demostraron que una concentración de
sal baja favorece el crecimiento de bacterias lácticas mientras que valores
elevados estimulan el crecimiento de levaduras.
Control del pH: Uno de los parámetros que se controlan de forma rutinaria
para evaluar el éxito de una fermentación es la acidez, tanto libre como total
(Panagou y Tassou, 2006).
Secuencia de fermentación adecuada (en los encurtido fermentados)
Mantenimiento de la temperatura apropiada durante la fermentación:
Tassou y col., (2002) también pusieron de manifiesto la importancia de la
temperatura en los procesos de fermentación. El uso de temperaturas
elevadas para la preservación del alimento está basado en su efecto
destructor en los microorganismos (Jay, 1992).
10
Destrucción o inhibición de la actividad de levaduras oxidativas: Se puede
conseguir cubriendo totalmente la superficie del tanque para excluir el
oxígeno.
Uso de cultivo indicadores.
1.3 Microbiota asociada a procesos de fermentación:
Existen numerosos tipos de microorganismos que intervienen en la fermentación, sin
embargo, los más importantes son:
Bacterias productoras de ácido láctico.
Bacterias productoras de gases.
Levaduras.
1.4.1 Bacterias productoras de ácido láctico
Una correcta fermentación se basa en la presencia y el rápido crecimiento de
bacterias lácticas (Garrido Fernández y col., 1997).
Las bacterias lácticas son un grupo de microorganismos representado por varios
géneros, con características morfológicas, fisiológicas y metabólicas en común.
Generalmente, las BAL son cocos o bacilos Gram positivos, no esporulados, no
móviles, anaeróbicos aunque generalmente toleran el oxígeno (aerotolerantes);
oxidasa, catalasa y bencidina negativas, carecen de citocromos, no reducen el
nitrato a nitrito y producen ácido láctico como el único o principal producto de la
fermentación de carbohidratos ( Carr y col., 2002; Vázquez y col., 2009). Además,
las BAL son acido tolerantes, pudiendo crecer algunas a valores de pH tan bajos
como 3.2, y valores tan altos como 9.6, y la mayoría crece en pH entre 4 y 4.5,
permitiéndoles sobrevivir en medios donde otras bacterias no aguantarían la
aumentada actividad producida por los ácidos orgánicos (Carr y col., 2009).
Las bacterias ácido lácticas comprenden un grupo muy heterogéneo de
microorganismos con fenotipos semejantes. Se clasifican en géneros en función de
sus diferentes características como morfología, modo de fermentación, crecimiento,
etc. Son los siguientes géneros: (Axelsson, 1998; Carr y col., 2002)
11
Aerococcus, Alloinococcus, Carnobacterium, Dolosigranulum, Enterococcus,
Globicatella, Lactobacillus, Lactococcus, Lactophaera, Leuconostoc, Oenococcus,
Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus y Weisella.
Sin embargo, en el grupo de las bacterias lácticas caracterizadas por una gran
producción de ácido láctico y que presentan un interés particular en la fermentación
de alimentos se incluyen los géneros:
Lactobacillus: Los lactobacilos son bacilos que de manera habitual se
asocian en cadenas largas. Algunos lactobacilos alteran alimentos (por
ej.,Lb.plantarum), mientras que otros son valiosos cultivos indicadores para la
industria láctea.
Streptococcus: Presentan células similares a las del género Lactococcus La
mayoría de las especies crecen a 45ºC pero no a 10ºC. Streptococcus
thermophilus se utiliza como cultivo indicador en la elaboración de queso y
yogurt.
Leuconostoc: Son cocos que se agrupan en pares o en cadenas. Estas
bacterias son las encargadas de la fermentación de los carbohidratos
produciendo ácido y gas. Los leuconostoc son relativamente ácidorresistentes
y moderadamente tolerantes a la sal. Algunas de las especies de este género,
se utilizan en la fermentación de hortalizas (por ej., L. mesenteroides).
Pediococcus: Son cocos que se presentan individualmente, en pares o
tétradas. Juegan un papel importante en la fermentación de la carne. Las
especies de mayor interés son P.acidilactici y Pediococcus.cerevisiae.
Ya en 1920, Orla-Jensen clasificó las bacterias lácticas en dos grupos según sus
características bioquímicas, las homofermentativas y las heterofermentativas. La
diferencia entre estos dos grupos se detecta por la liberación de oxígeno. Las
bacterias homofermentativas se caracterizan por la capacidad de transformar la
glucosa y, en la mayor parte de los casos, también la fructosa en ácido láctico, con
producción nula o mínima de otros productos secundarios. Las bacterias
heterofermentativas no tienen fructosa-difosfato-aldolasa y por lo tanto degradan los
glúcidos por la vía llamada de las pentosas fosfatos o de las hexosas fosfatos.
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Fermentación homoláctica (ruta de Embden –Meyerhof-Parnas):
C6H12O6 2 CH3-CH(OH)-COOH + 2ATP
La glucosa se convierte en ácido láctico casi cuantitativamente.
Fermentación heteroláctica (ruta de la fosfocetolasa):
C6H12O6 2 CH3-CH(OH)-COOH + CH3-CH2OH + CO2 + ATP
La glucosa se convierte en ácido láctico, etanol y gas dióxido de carbono.
Las homofermentadoras, como Lactococcus, Streptococcus, Pedicococcus,
Vagococccus y algunos Lactobacillus poseen la enzima aldolasa y producen ácido
láctico como el producto principal de la fermentación de la glucosa utilizando la via
de la glucólisis (Embden-Meyerhof)(Axelsson,1998). Por su parte las del género
Leuconostoc, Oenococcus, Weisella, Carnobacterium, Lactosphaera y algunos
Lactobacillus son heterofermentadoras y convierten hexosas a pentosas por la via 6-
fosfogluconato-fosfocetolasa, produciendo en el proceso cantidades significantes de
productos como acetato, etanol y CO2 además de ácido láctico. (Carr y col., 2002).
En la producción de moléculas no proteicas pequeñas y de bacteriocinas por las
bacterias lácticas, conviene resaltar que el desarrollo en aerobiosis de estas, lleva a
la formación de varios metabolitos del oxígeno, peróxido de hidrógeno, aniones
superóxido y radicales libres, que poseen un efecto bacteriostático y bactericida
frente a la flora láctica y no láctica. La actividad antimicrobiana de los ácidos
orgánicos (láctico, acético y fórmico) y del pH es complementaria, mientras que la
mayor actividad inhibidora la posee la fracción no disociada de los ácidos orgánicos.
La actividad antimicrobiana del diacetilo, acetaldehido y de los isómeros D de los
aminoácidos es mucho menor y menos significativa. (Hernández y col., 1993).
La síntesis del ácido láctico y la tolerancia de las bacterias lácticas a este ácido
orgánico y a un pH inferior a 7, se utilizan en la conservación de alimentos, en
productos lácteos, productos cárnicos y vegetales fermentados. Estas condiciones
soportables para las bacterias lácticas, no lo son para otros muchos
microorganismos causantes de alteraciones como Pseudomonas, enterobacterias,
Alcaligenes, Acinetobacter, etc. Sin embargo, las bacterias lácticas pueden crear
13
problemas en algunas otras industrias, produciendo sabores y olores desagradables,
como: vino, cerveza, carne, zumos de frutas, etc. (Casp y col., 2003)
La fermentación acido-láctica es uno de los métodos más antiguos para preservar
los alimentos, además de mejorar sus propiedades sensoriales y nutricionales, es un
proceso microbiano muy complejo en el cual la población de bacterias lácticas llega
a ser la microflora predominante. (Shirai y col., 1996; García y col., 1998; Schneider
y col., 2006).
1.4.2 Levaduras
Las levaduras son organismos heterotróficos cuyos hábitats naturales son la
superficie de tejidos vegetales. La mayoría son aerobios obligados, aunque algunos
son anaerobios facultativos. Son organismos bastante sencillos en sus demandas
nutricionales, requiriendo una fuente de carbono reducido, varios minerales, una
fuente de nitrógeno y vitaminas.
Las levaduras pertenecen a tres clases de hongos: ascomicetos, basidiomicetos y
deuteromicetos, ésta última incluye las formas imperfectas de las levaduras. La
temperatura normal que permite el crecimiento de la mayor parte de las levaduras
oscila entre 25 y 30ºC, a pesar de que éstas no son las temperaturas óptimas de
crecimiento de las levaduras en sus hábitats naturales. Su velocidad de crecimiento
disminuye progresivamente para valores de aw inferiores a 0.99. Aunque el efecto de
la presión osmótica varía de una cepa a otra, la mayor parte de las cepas no pueden
desarrollarse para actividades de agua inferiores a 0.90, pero algunas toleran
presiones osmóticas mayores. Todas las levaduras son capaces de desarrollarse en
presencia de oxígeno: no hay levaduras anaerobias estrictas. (Casp y col., 2003)
Las levaduras van siempre asociadas a la fermentación especies hortícolas y
pueden dividirse dividirse en dos grupos:
Levaduras oxidativas o formadoras de película en la superficie de la
salmuera, que dan lugar a malos olores y a un producto de calidad inferior
debido a que consumen ácido láctico por oxidación .Dentro de este grupo
están los géneros Debaryomices, Endomycopsis y Candida. Este grupo de
levaduras puede ser controlado mediante la acción directa de la luz solar,
rayos ultravioleta, aceite mineral o cubiertas de plástico. El desarrollo
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excesivo de estas levaduras traerá como consecuencia un peligroso ascenso
del pH de la salmuera al desaparecer el ácido láctico. Es por tanto
imprescindible la eliminación de estas levaduras.
Levaduras que desarrollan su actividad en la masa de salmuera y fermentan
restos de azúcares, produciendo una fermentación gaseosa (CO2) y alcohol.
Los géneros incluidos en este grupo son Torulopsis, Brettanomces,
Zvgosacharomices, Hajisenula y Kloeckera. La adición de ácido sórbico
inhibe la actividad de estas levaduras.
Durante la fermentación y el almacenamiento, las levaduras pueden producir
etanol, ácidos orgánicos, glicerol, alcoholes superiores, ésteres, y otros
compuestos volátiles que contribuirán significativamente a la textura y el aroma y,
a su vez, en la aceptación del producto por parte del consumidor (Garrido-
Fernández y col., 1997; Montaño y col., 2003; Sabatini y col., 2007).
1.4.3 Bacterias productoras de gases:
Dentro del grupo de bacterias productoras de gases tenemos las especies
coliformes del género Aerobacter. Estas bacterias se caracterizan por la producción
de anhídrido carbónico e hidrógeno. En una concentración de salmuera elevada
este género da lugar a una formación de gases muy vigorosa. A medida que
concentración de la salmuera desciende, la actividad se hace menor debido a que la
rápida formación de ácido láctico inhibe el desarrollo de estas bacterias productoras
de gases. Dentro de este grupo también se encuentra Lactobacillus brevis, que es
un bacilo productor de gas que en determinadas ocasiones puede ayudar a la
formación de ácido láctico.
1.5 Saprófitos y alteración:
La alteración de las hortalizas durante el proceso de fermentación se puede
producir de diversas maneras. Una de las principales causas es la distribución
irregular de sal. Si la concentración de sal es demasiado elevada en zonas
localizadas, pueden crecer algunas levaduras (Pederson y Kelly, 1938) o
lactobacilos (Stamer y col., 1973) y hacer que el producto adquiera color rosado; si
15
la concentración de sal es baja, es posible que la chucruta se ponga blanda debido a
las bacterias coliformes. Las hortalizas fermentadas se pueden convertir
microbiológicamente en estables con tal de que, todos los carbohidratos
fermentescibles sean eliminados durante la primera fermentación, exista ácido
suficiente para impedir el crecimiento de bacterias esporógenas de alteración, y el
oxígeno se elimine de los productos para impedir el crecimiento de superficie de
levaduras, de mohos y de bacterias esporógenas de la alteración (Fleming y col.,
1983). Si existe oxígeno, levaduras oxidativas pueden crecer rápidamente y utilizar
el ácido láctico que se forma. Debido a ello, aumentara el pH y permitirá el
crecimiento de las formas de alteración menos acidotolerantes.
Los encurtidos dulces y ácidos (no pasteurizados) preparados a partir de encurtidos
conservados en sal se conservan con vinagre y/o azúcar. En el caso de que el nivel
de ácido o de azúcar sea insuficiente, se desarrollará la alteración debida a bacterias
acidolácticas o a levaduras (Etchells y Bell, 1976).
Las levaduras y bacterias acidolácticas alteraran el producto si los encurtidos recién
envasados presentan una pasteurización insuficiente. Si la acidez es insuficiente en
la salmuera, las esporas de los anaerobios butíricos germinarán, crecerán y
alteraran el producto. Elevadas poblaciones de esporas en los productos de este
tipo indican el escaso e insuficiente lavado del fruto antes de ponerlo en la
salmuera.
1.6 Efectos de la conservación de los alimentos: Encurtidos y Fermentación.
La técnica de la fermentación se desarrolló como una forma de energía baja para
conservar los alimentos, junto con el secado y salado antes de la aparición de la
refrigeración, congelación y enlatado. Los ejemplos más divulgados han sido la
utilización de bacterias del ácido láctico para reducir el pH y el empleo de la levadura
para efectuar fermentaciones alcohólicas. El mecanismo de preservación se lleva a
cabo por la conversión de los hidratos de carbono y componentes relacionados con
productos finales, como ácidos, alcoholes y dióxido de carbono.
El alimento conserva un amplio valor nutricional, además, los cambios que se
producen durante los procesos de fermentación pueden aumentar el valor
16
nutricional de las materias primas, como por ejemplo, la acumulación de vitaminas
y antioxidantes o la conversión de polímeros relativamente indigeribles a productos
de degradación a más asimilable.(Bamforth, C. W . 2008).
Las técnicas de preparación y conservación de los alimentos son notorias en todas
las principales culturas, ya que no solo nos facilitan el vino, el pan, el queso, sino
también, miso, temphe, shoyu, idli y poi-poi, los encurtidos y el chucrut. Durante el
proceso de fermentación, se desarrollan microorganismos que alteran la
composición del alimento vegetal o animal aumentando la cantidad del ácido láctico
que contiene. Debido a esto, cambia el sabor y el aroma de los alimentos, se hacen
más fuertes y característicos, y algunas veces más amargos. Aunque puede haber
alguna pérdida de vitaminas y minerales solubles en el agua durante los procesos de
encurtido y fermentación, en conjunto, la influencia de los alimentos fermentados en
nuestra salud es bastante favorable. Son fáciles de digerir, e incluso, algunos se
usan para ayudar a la digestión. La investigación moderna ha demostrado que la
fermentación aumenta los valores nutritivos de los alimentos, sobre todo la vitamina
B. Se ha demostrado que el miso y el temphe (ambos productos de la fermentación
de la soja) tienen propiedades antibacterianas y pueden ser efectivos agentes en la
prevención de la enfermedad. Además tanto en el temphe como el natto (otro
producto fermentado de la soja) se aprecian múltiples aumentos de la vitamina B12.
Podemos suponer con seguridad que toda esa actividad microbiana en los alimentos
fermentados también aumenta su nivel de energía. (Colbin, 2004, el poder curativo
de los alimentos).
17
3) OBJETIVOS:
Los objetivos de nuestro estudio fueron los siguientes:
Cultivar y aislar los diferentes microorganismos presentes en encurtidos.
Evaluar la carga microbiana de los diferentes alimentos encurtidos.
Realizar un estudio de identificación macroscópico y microscópico de los
organismos aislados.
Evaluar la variabilidad de los resultados obtenidos en las diferentes sesiones.
18
3) MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Alimentos utilizados:
Para la realización de este proyecto se han analizado muestras de 12 tipos de
alimentos diferentes. El estudio se dividió en dos sesiones.
En la primera sesión se utilizaron 6 muestras de encurtidos (pepinillos, guindilla,
berenjena casera, aceitunas machacadas, surtido y aceituna manzanilla).En la
segunda sesión se utilizaron 6 muestras de encurtidos distintas (alcaparras,
aceitunas negras, maíz, altramuces, aceitunas aliñadas y berenjenas).
La mayoría de muestras son procedentes de alimentos cogidos a granel y otras
muestras son procedentes de encurtidos caseros (guindilla, berenjena, aceitunas
machacadas y aceitunas negras) ya que poseen menos cantidad de conservantes
que las conservas industriales. (Ver Fig. 1)
Fig.1 Muestras de alimentos.
3.2 Material de laboratorio:
1. Cloruro de sodio (NaCl).
2. Agua destilada.
3. Matraz Erlenmeyer de 500ml
4. Gradilla.
5. Probeta.
6. 25-30 tubos Eppendorff de 1,5ml
7. Algodón hidrófobo
8. Papel de aluminio
19
9. Báscula
10. Mechero Bunsen
11. Autoclave
12. Placas de Petri de 15ml
13. Asa de siembra triangular de Digralsky
14. Bolsas de plástico de cierre hermético.
15. Caja de puntas estériles para pipeta de 100µl.
16. Pipeta de 100µl
17. Triturador homogeneizador Stomacher 80 Biomaster, Seward Ltd..
18. Tubos Falcon de 50ml.
19. Estufas de cultivo reguladas a 37ºC y 30ºC
20. Agua oxigenada.
Material para tinción:
1. Agua destilada
2. Mechero bunsen
3. Asa de siembra
4. Portaobjetos
5. Cubeta
6. Pinzas
7. Alcohol 96º
8. Cristal violeta
9. Safranina
10. Lugol
11. Aceite de inmersión
12. Microscopio óptico, objetivo 100X
3.3 Medios de cultivo empleados:
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros
componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de
microorganismos. Existe una gran variedad de medios debido a que la diversidad
metabólica de los microorganismos es enorme.
20
Para el análisis microbiológico de los alimentos se han empleado 5 tipos de medios
de cultivo:
Un medio general: Son medios apropiados para el crecimiento de la mayoría
de microorganismos por la facilidad con la que se desarrollan en ellos.
a) Tríptona Soja Agar (TSA) (Panreac,Barcelona)
Se utiliza como medio de uso general para el cultivo de todo tipo de
microorganismos .Su aportación nutritiva permite el desarrollo óptimo de un gran
número de microorganismos, tanto exigentes como no exigentes. Se utilizan como
tales o como base para preparar medios especiales (Agar Sangre, Agar Proteus)
Composición (g/l):
Digerido Papaínico de Soja 5,0 g
Digerido Pancreático de Caseína 15,0 g
Sodio Cloruro 5,0 g
Agar 15,0 g
pH final: 7,3±0,2
(Panreac, Manual Básico de Microbiologia, 2003)
Cuatro medios selectivos: Estos medios presentan componentes
inhibidores del desarrollo de ciertos microorganismos, lo cual permite aislar
una determinada especie o evitar la presencia de agentes contaminantes.
b) Eosina Azul de Metileno (EMB), Agar. (Panreac, Barcelona)
Es un medio diferencial que se emplea para el aislamiento y diferenciación de
bacterias entéricas Gram-negativas.
Gracias a la combinación de estos dos colorantes y los dos hidratos de carbono se
pueden distinguir algunos géneros. Las bacterias lactosa-negativas y sacarosa
negativas (Salmonella y Shigella) dan colonias incoloras, mientras que las lactosa
21
y/o sacarosa-positivas dan colonias púrpura-violeta negruzco con/sin un centro
oscuro y quedan rodeadas de una zona incolora. Estos productos, además inhiben
el crecimiento de la microflora acompañante, sobre todo la Gram-positiva. También
es posible la identificación de Candida albicans.
Composición (g/l):
Eosina Amarillenta 0,4
Azul de Metileno 0,065
Lactosa 5,0
Peptona Bacteriológica 10,0
di-Potasio Hidrógeno Fosfato 2,0
Sacarosa 5,0
Agar 13,5
pH: 7,2±0,2
(Panreac, Manual Básico de Microbiologia, 2003)
c) Vogel-Johnson, Agar (VJ) (Panreac, Barcelona)
Es un medio sólido con una fuerte acción selectiva para el aislamiento y la
identificación de Estafilococos donde la flora secundaria es inhibida casi por
completo. Los Estafilococos reducen el telurito a teluro metal lo que da colonias
negras sobre un fondo rojo si no son fermentadores del manitol y los fermentadores
del manitol dan colonias negras rodeadas de un halo amarillo. El cambio de color del
medio es debido al viraje del indicador de pH producido por la acumulación de
productos ácidos, obtenidos en la fermentación del manitol. La selectividad del
medio se mantiene durante las primeras 24 horas.
Composición (g/l):
Extracto de Levadura 5,0
Glicina 10,0
Litio Cloruro 5,0
D(-)-Manita 10,0
22
di-Potasio Hidrógeno Fosfato 5,0
Rojo de Fenol 0,025
Triptona 10,0
Agar 15,0
pH: 7,2±0,2
(Panreac, Manual Básico de Microbiologia, 2003)
d) MRS,Agar (Panreac, Barcelona)
Medio empleado para el cultivo y recuento de Lactobacilos. Es un medio ideal para
el crecimiento masivo de cepas de lactobacilos, tanto en productos lácteos como en
productos alimenticios en general.
La presencia de la peptona, glucosa, manganeso y magnesio aportan los
componentes nutritivos y energéticos para el crecimiento de los Lactobacilos. El di-
Amonio Hidrógeno Citrato es el inhibidor del crecimiento de la mayor parte de
gérmenes contaminantes. El di-Potasio Hidrógeno Fosfato estabiliza el pH del
medio, mientras que el Tween®constituye su fuente de ácidos grasos. Debido a ello,
este medio es ideal para el crecimiento masivo de todas las cepas de Lactobacilos,
incluso aquellas de crecimiento lento y difícil. El crecimiento también puede
mejorarse reduciendo el pH hasta 5,5 aproximadamente, sin embargo, se dificulta la
gelificación del medio. Si se acidifica a pH=5,5 ±0,1 permite el recuento de los
Lactobacilos propios del yogur.
Composición (g/l):
di-Amonio Hidrógeno Citrato 2,0
Extracto de Carne 8,0
Extracto de Levadura 4,0
D(+)-Glucosa 20,0
Magnesio Sulfato 0,2
Manganeso(II) Sulfato 0,05
Peptona Bacteriológica 10,0
23
di-Potasio Hidrógeno Fosfato 2,0
Sodio Acetato 5,0
Tween 80 1,0
Agar 10,0
pH: 6,2±0,2
(Panreac, Manual Básico de Microbiologia, 2003)
e) Agar Kanamacina Aesculina Azida (KAA- Agar) (Panreac, Barcelona)
Medio empleado para la detección, aislamiento y confirmación de enterococos en
alimentos, aguas y otras muestras biológicas. Este medio presenta una selectividad
muy elevada para enterococos, incluso superior a otros medios comparables.
Composición (g/l):
Sulfato de Kanamicina 0,02
Esculina 1,0
Azida Sódica 0,15
Citrato férrico 0,5
Extracto de Levadura 5,0
Cloruro de sodio 5,0
Citrato disódico 1,0
Triptona 20,0
Final pH 7,0 ± 0.2
(Panreac Manual básico de microbiología, 2003).
24
3.4 Preparación de los medios de cultivo:
Preparamos 5 medios de cultivo diferentes:
Un medio general (TSA) y 4 medios selectivos (EMB, MRSA, KAA y Vogel–
Johnson), todos ellos preparados según las indicaciones del fabricante.
Para el estudio fueron necesarias:
4 placas de TSA por muestra (6): 24 placas de TSA.
2 placas de MRS por muestra (6): 12 placas de MRS
2 placas de KAA por muestra (6): 12 placas de KAA
2 placas de Vogel-Johnson por muestra (6): 12 placas de Vogel-Johnson
2placas de EMB por muestra (6): 12 placas de EMB.
Con anterioridad, se prepararon dos matraces de solución salina esteril al 0,9%: 300
ml agua destilada + 2,7 gr ClNa para el procesado de los alimentos.
Solución salina estéril al 0,9%: 40 ml de agua destilada + 0,36 gr de ClNa para
diluciones.
Para la preparación de los medios de cultivo, se pesa la cantidad necesaria del
medio y su posterior disolución en agua destilada. Como las indicaciones del
fabricante están determinadas para la cantidad que hay que añadir para una
disolución en un litro de agua, se calcula la cantidad de medio necesario para diluirla
en 800ml de agua necesarios para el estudio. Así pues:
- TSA: 800 ml de agua + 32 g de TSA (Dilución original 40g/l)
- MRS: 800 ml de agua + 49.6 g de MRS (Dilución original 62g/l)
- KAA: 800 ml de agua + 34.4 g KAA (Dilución original 43 g/l)
- Vogel-Johnson: 800 ml de agua + 48 g Vogel-Johnson (Dilución original 60 g/l)
- EMB: 800 ml de agua + 28,8 g EMB (Dilución original 36g/l)
25
Una vez diluidos los medios en los matraces, estos se esterilizan mediante
autoclavado a 121ºC durante 20 minutos, a excepción del MRS que se autoclava a
115ºC durante 20minutos, ya que es un medio con gran cantidad de glucosa y a una
temperatura superior se carameliza. Una vez sacados del autoclave se pasan al
baño María donde se atemperan a unos 50ºC y se vierten en las placas Petri. Este
proceso se lleva a cabo siempre al lado del mechero para evitar contaminación
externa del medio. (Ver Fig.2 y Fig.3)
Fig.2. Preparación de los medios Fig.3. Preparación de los medios
A continuación las placas se dejan enfriar para que los medios solidifiquen y se
rotula en ellas el tipo de medio, el alimento sembrado y la dilución.
3.5 Procesado de los alimentos:
Para el procesado de alimentos se pesan 5gramos de muestra de cada tipo de
alimento y a continuación se introducen en bolsas herméticas donde se le añade
45ml de solución salina estéril al 0,9% a cada una de las muestras.
Posteriormente, la mezcla de alimento y solución salina son procesados por el
triturador- homogeneizador Stomacher 80 Biomaster, Seward Ltd.
Una vez homogeneizadas las muestras, se preparan tubos eppendorff en una
gradilla para realizar las diluciones decimales y cada tubo se rellena con 0,9ml de
solución salina estéril.
Para el medio general (TSA), se preparan diluciones seriadas a razón de -1,-2,-3 y la
solución madre que es considerada la dilución 0. Para los medios selectivos
(MRS,EMB, KAA ,VJ) se preparan diluciones a razón 0 (solución madre) y -1.
26
Las diluciones seriadas se preparan añadiendo 100µl de la solución madre sobre 0,9
ml de solución salina y así sucesivamente continuando de forma seriada. (Ver Fig.4)
Fig.4. Diluciones decimales.
Una vez realizadas las diluciones, se procede a la siembra de la muestra. Se
siembran 100µl de cada dilución, de la 0 hasta la -3 en el medio general TSA y 100µl
de las dos primeras diluciones (0 y -1) en las placas de los medios selectivos. Todo
el proceso se realiza siempre en condiciones estériles al lado del mechero Bunsen y
las muestras son distribuidas de forma homogénea sobre el medio con la ayuda de
la espátula de Drigalsky.
Los recuentos bacterianos de los medios se realizan tras 48horas, teniendo en
cuenta que a las 24horas ya no se aprecia el viraje de color en el medio selectivo
Voguel Jhonson y a una temperatura de 37ºC, con la excepción del medio selectivo
MRS que se incuba a 30ºC.
3.6 Recuento e Identificación preliminar:
Los recuentos e identificación bacteriana se llevaran a cabo tras 48horas de
incubación. Se observara el número y morfología de las colonias bacterianas
además de los cambios observados en los medios.
A continuación las colonias de diferentes morfologías obtenidas de cada medio de
cultivo serán seleccionadas para la identificación mediante la tinción de Gram y
prueba de la catalasa. (Ver Fig.5)
27
Fig.5. Identificación mediante Tinción de Gram
Tinción de Gram:
Tinción desarrollada por Christian Gram en 1884.Esta técnica es uno de los primeros
pasos a realizar para cualquier identificación bacteriana ya que es capaz de
diferenciar a 2 grandes grupos de eubacterias: Gram positivas y Gram negativas.
La tinción de Gram requiere cuatro soluciones:
1. Primer colorante: Un colorante básico que al contacto con las células cargadas
negativamente produce una reacción con ellas coloreándolas. El más usado es
el Cristal de Violeta.
2. Solución mordiente: Cuya función es fijar las tinciones y aumentar la afinidad
entre el colorante y las células.
3. Agente decolorante: Un disolvente orgánico como alcohol.
4. Colorante de contraste: Un colorante de distinto color que el primero, como la
Safranina.
Las Bacterias Gram positivas se teñirán de azul debido al cristal violeta y no
perderán su coloración, sin embargo, las bacterias Gram negativas perderán la
coloración debida al cristal violeta en los sucesivos pasos y se teñirá de rosa debido
a la Safranina. Esta diferencia es debida a la composición de su envoltura celular.
Las bacterias Gram positivas poseen una malla de peptidoglicano en su parte
externa, sin embargo, las Gram negativas, recubriendo a una membrana de
peptidoglicano, presentan una membrana externa que envuelve toda la célula.
28
Realización:
- Añadir una gota de agua sobre un porta limpio
- Con el asa de siembra esterilizada se toma una muestra de la colonia
deseada y se extiende sobre la gota de agua.
- Secar y fijar la muestra con calor suave.
- Teñir con cristal de violeta y dejar actuar durante 2minutos.
- Escurrir el exceso de colorante y cubrir con Lugol durante 2minutos.
- Lavar con exceso de Lugol con agua.
- Decolorar con alcohol de 96º unos 30 segundos.
- Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.
- Teñir con Safranina y dejar actuar durante 3 minutos.
- Lavar con agua para eliminar el colorante.
- Secar la preparación.
- Añadir una gota de aceite de inmersión y examinar al microscopio con el
objetivo 100X.
(Fig. 6.) Tintes para la tinción Gram
29
Prueba de la catalasa:
Realizamos la prueba de la catalasa a las colonias aisladas del medio selectivo
Voguel Jhonson.
La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias. Dicha
enzima es la encargada de la descomposición de hidrógeno en agua y oxígeno. El
desprendimiento de burbujas de oxigeno indica que la prueba es positiva.
Método:
Colocar una gota de agua oxigenada sobre un portaobjetos. A continuación, hacer
en ella una suspensión del microorganismo.
La presencia de catalasa se pondrá de manifiesto por un desprendimiento de
burbujas.
2 H2O22 H2O + O2.
30
4) RESULTADOS:
Recuento y carga microbiana.
Para el recuento se seleccionan las placas en las cuales en número de colonias se
encuentre entre 30-300 colonias. Seguidamente recuento de colonias es expresado
en Unidades Formadoras de Colonias por gramo de alimento (UFC/g) que sirve
para evaluar la carga microbiana de los alimentos empleados.
Sesión 1
UFC/g TSA MRS VJ KAA EMB
Pepinillos
2.102 3.10³ x x x
Guindilla(casera)
1,25.106 5.102 x x x
Berenjena(casera)
1,5.107 >3.105 x >3.105 x
Aceitunas de cornezuelo (caseras)
x 1,7.104 5.103 x x
Surtido
1,7.104 1,1.104 x x x
Aceituna manzanilla
5.104 >3.105 x x x
Tabla 1: Resultados de la carga microbiana (UFC/g) de los distintos alimentos del grupo 1
sembrados en los diferentes medios.
De acuerdo con los resultados de la sesión 1, en los que se hace referencia en la
Tabla 1, en su mayoría, solo se aislaron bacterias en los medios de cultivo TSA y
MRS, lo que pone de manifiesto que los organismos presentes en estos alimentos
eran bacterias lácticas. Podemos destacar mayor número de bacterias lácticas en
aceituna manzanilla y berenjena, con recuentos que superan las 5 unidades
logarítmicas. Además, en berenjena también se obtuvo presencia de enterococos en
una proporción elevada.
En el caso de aceitunas de cornezuelo, no hay crecimiento en el medio TSA, sin
embargo, si se obtuvo en los medios MRS y VJ, por lo que suponemos que ha
habido algún error en el caso del TSA. (Ver Graf.1)
31
Gráfica 1. Representa la carga microbiana de las muestras de encurtidos presentes en los
distintos medios de cultivo utilizados en la sesión 1.
En la Grafica 1, podemos observar claramente que la mayor carga microbiana se
encuentra en los medios TSA y EMB en todas las muestras de encurtidos a estudio.
Sesión 2
UFC/g TSA MRS VJ KAA EMB
Aceitunas negras(caseras)
9.106 >3.105 >3.105 3,8.104 >3.105
Alcaparras
5.102 1,01.105 3.102 6.102 4,5.104
Maíz
x x x x x
Altramuces
7,2.104 >3.105 7,9.103 3.104 3.104
Aceitunas aliñadas
1,18.104 1,2.105 x 3.104 2.104
Berenjenas aliñadas
1,4.103 3.104 8.102 1,5.103 1,1.103
Tabla 2: Resultados de la carga microbiana (UFC/g) de los distintos alimentos del grupo 2
sembrados en los diferentes medios.
En la Tabla 2, que hace referencia a los resultados obtenidos en la sesión 2,
observamos mayor carga microbiana en casi todos los medios, a excepción del maíz
que no presenta crecimiento en ninguno de los medios. Podemos destacar un mayor
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
EMB
KAA
VJ
MRS
TSA
32
crecimiento en las aceitunas negras caseras y los altramuces comparados con los
demás con cargas microbianas superiores a los 3x105. (Ver Graf.2)
Grafica 2. Representa la carga microbiana de las muestras de encurtidos presentes en los
distintos medios de cultivo utilizados en la sesión 2.
En la gráfica 2, observamos una mayor distribución de microorganismos en los
diferentes medios, a excepción del maíz que no presenta crecimiento alguno. Sin
embargo, sigue habiendo predominancia del crecimiento de microorganismos en los
medios TSA y EMB.
Identificación macroscópica y microscópica (tinción de Gram) de
las muestras.
Una vez obtenido el recuento en los diferentes medios, elegimos algunas de las
colonias representativas de cada medio para, posteriormente, poder realizar un
estudio morfológico de ellas. En la identificación de los microorganismos se
observan las características macroscópicas (morfología, color, tamaño…) y las
características microscópicas en las que se puede observar las agrupaciones de los
microorganismos y el tipo de pared mediante la tinción de Gram.
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
EMB
KAA
VJ
MRS
TSA
33
Sesión1
TSA
Alimentos Identificación macroscópica
Identificación microscópica
Pepinillos Colonias blancas pequeñas Cocos Gram Positivos
Guindilla(casera) Colonias blancas pequeñas Gran cantidad de Cocos
Gram Positivos Berenjena (casera) Colonias blancas grandes
Colonias blancas pequeñas Bacilos Gram Positivos Cocos Gram Positivos
Aceitunas de cornezuelo(caseras)
Sin crecimiento x
Surtido Colonias blancas pequeñas Cocos Gram Positivos agrupados en racimos
Aceitunas manzanilla Colonias blancas pequeñas Bacilos dispersos Gram Positivos
Tabla 3: Características macro y microscópicas de los diferentes alimentos en medio TSA.
En la tabla 3, se muestran las características macroscópicas y microscópicas de
colonias aisladas en el medio general TSA. Con respecto a las características
macroscópicas, la mayoría de las muestras presenta crecimiento de colonias
blancas de diferentes tamaños (en su mayoría tamaño pequeño) a excepción de la
muestra de aceitunas de cornezuelo que no presenta crecimiento alguno ( debido a
un error).En cuanto a la tinción de Gram, la mayor parte son cocos Gram positivos a
excepción de las muestras de berenjena que en su caso presenta dos tipos de
morfologías (colonias blancas grandes y pequeñas) siendo las colonias de mayor
tamaño bacilos Gram positivos y las de tamaño menor cocos Gram positivos y la
muestra de aceitunas manzanilla que solo muestra presencia de bacilos Gram
positivos.
MRS
Alimentos Identificación macroscópica
Identificación microscópica
Pepinillo
Colonias blancas Levaduras
Guindilla (casera) Colonias blancas pequeñas Levaduras
Berenjena (casera) Colonias blancas grandes Colonias blancas pequeñas
Bacilos Gram Positivos Gran cantidad de levaduras
Aceitunas de cornezuelo (caseras)
Colonias blancas de diferentes tamaños
Levaduras
Surtido Colonias blancas grandes Levaduras
Aceitunas manzanilla Colonias blancas grandes Colonias blancas pequeñas
Gran cantidad de levaduras Bacilos alargados de gran tamaño Gram Positivos
Tabla 4: Características macro y microscópicas de los diferentes alimentos en el medio MRS.
34
En la Tabla 4, se muestra las características de las colonias crecidas en el medio
selectivo MRS. Hay similitud en cuanto a la identificación macroscópica de las
diferentes muestras, en las que se observan colonias blancas de diferentes
tamaños. En la identificación microscópica podemos apreciar que en todas ellas hay
crecimiento de levaduras. Sin embargo, en muestras de berenjena y aceitunas
manzanilla se aislaron además de levaduras, colonias de diferente morfología,
resultandos ser bacilos Gram positivos, lo que pone de manifiesto la presencia de
bacterias lácticas en dichos alimentos.
Vogel Jhonson (VJ)
Alimentos Identificación macroscópica
Identificación microscópica
Pepinillo Sin crecimiento x Guindilla (casera) Sin crecimiento x Berenjena(casera) Sin crecimiento x
Aceitunas de cornezuelo (caseras)
Colonias blancas Levaduras
Surtido Sin crecimiento x Aceitunas manzanilla Sin crecimiento x
Tabla 5: Características macro y microscópicas de los diferentes alimentos en el medio VJ.
En la Tabla 5, no se observa crecimiento alguno en el medio VJ a excepción de
aceitunas de cornezuelo .A la hora de los recuentos, en el medio VJ se observó la
presencia de colonias blancas que no presentaban la morfología típica de una
colonia de estafilococos, por lo que se pudo concluir tras la tinción que se trataba de
levaduras como podemos apreciar en la Fig. 7.
Fig.7 Imagen microscópica de levaduras tras la tinción de Gram.
35
KAA
Alimentos Identificación macroscópica
Identificación microscópica
Pepinillos Sin crecimiento x
Guindilla (casera) Sin crecimiento x
Berenjena(casera) Colonias negras pequeñas Cocos Gram Positivos
Aceitunas de cornezuelo (caseras) Sin crecimiento x
Surtido Sin crecimiento x
Aceitunas manzanilla Sin crecimiento x
Tabla 6: Características macro y microscópicas de los diferentes alimentos en el medio KAA.
Con respecto a la Tabla 6, solo se observa crecimiento en el medio selectivo KAA
para muestra de berenjena (casera), en la que se puede observar
macroscópicamente una morfología típica de colonias de enterococos de pequeño
tamaño y de color negro que mediante la tinción de Gram se identificaron como
cocos Gram positivos.
EMB
Alimentos Identificación macroscópica
Identificación microscópica
Pepinillo Sin crecimiento x
Guindilla (casera) Sin crecimiento x
Berenjena (casera) Sin crecimiento x
Aceitunas de cornezuelo (caseras) Sin crecimiento
x
Surtido Sin crecimiento x
Aceitunas manzanilla Sin crecimiento x
Tabla 7: Características macro y microscópicas de los diferentes alimentos en el medio
EMB.
En la Tabla7, no se observa crecimiento de microorganismos en ninguna de las
muestras de alimentos sembradas en el medio selectivo EMB.
36
Sesión 2
TSA
Alimentos Identificación macroscópica
Identificación microscópica
Aceitunas negras (caseras) Colonias blancas pequeñas y medianas
Gran cantidad de Bacilos Gram Negativos agrupados muy juntos
Alcaparras Colonias pequeñas blancas Levaduras Maíz Sin crecimiento x
Altramuces Colonias blancas de diversos tamaños
Agrupaciones de Levaduras
Aceitunas aliñadas Colonias blancas de diferentes tamaños
Levaduras
Berenjenas aliñadas Colonias blancas pequeñas Gran cantidad de Cocos Gram Positivos
Tabla 8: Características macro y microscópicas de los diferentes alimentos en el medio TSA.
En relación a los resultados obtenidos en la sesión 2, a los que se hace referencia
en la Tabla 8, podemos observar diversas morfológicas de colonias en el medio
TSA, ya que es un medio general que permite el desarrollo óptimo de diversos
microorganismos. En las muestras de las alcaparras, altramuces y aceitunas
aliñadas se aislaron colonias de la misma morfología pero de diferentes tamaños,
concluyendo mediante la tinción de Gram la presencia de levaduras. Sin embargo,
en muestras de aceitunas caseras y berenjenas aliñadas se aislaron colonias
blancas de pequeño tamaño identificadas mediante la tinción como bacilos Gram
negativos (aceitunas negras) y gran cantidad de cocos Gram positivos en
berenjenas aliñadas.
MRS
Alimentos Identificación macroscópica
Identificación microscópica
Aceitunas negras(caseras) Colonias blancas pequeñas. Colonias blancas medianas. Colonias blancas grandes.
Cocos Gram positivos agrupados en racimos. Levaduras agrupadas en racimos. Hongos.
Alcaparras Colonias blancas medianas Levaduras Maíz Sin crecimiento x
Altramuces Colonias blancas pequeñas
Agrupaciones de Cocos Gram Positivos
Aceitunas aliñadas Colonias blancas
Bacilos Gram positivos de gran tamaño
Berenjenas aliñadas Colonias blancas de diversos tamaños
Levaduras
Tabla 9: Características macro y microscópicas de los diferentes alimentos en el medio
MRS.
37
En la tabla 9, se muestra las características de las colonias aisladas en medio
selectivo MRS, empleado para el cultivo de lactobacilos. Podemos observar en las
muestras de aceitunas negras, alcaparras y berenjenas aliñadas crecimiento de
colonias de diversas morfologías y tamaños que no eran típicas de la morfología
clásica de bacterias lácticas, concluyendo con la tinción de Gram la presencia de
levaduras. Sin embargo, en las muestras de altramuces y aceitunas negras se
observa agrupaciones de cocos Gram positivos y en la muestra de aceitunas
aliñadas bacilos Gram positivos de gran tamaño, lo que desvela la presencia de
bacterias lácticas dichos alimentos.
Vogel Jhonson (VJ)
Alimentos Identificación macroscópica
Identificación macroscópica
Prueba de la catalasa
Aceitunas negras (caseras)
Pequeñas colonias blanquecinas
Cocos Gram Negativos
x
Alcaparras Colonias pequeñas blanquecinas
Bacilos alargados Gram Negativos de gran tamaño
x
Maíz Sin crecimiento x x
Altramuces
Colonias medianas amarillas. Colonias pequeñas rosas.
Cocos Gram Positivos Bacilos Gram Positivos grandes y alargados
Catalasa Negativa
Aceitunas aliñadas Sin crecimiento x x
Berenjenas aliñadas Colonias amarillas y rosas pequeño tamaño
Gran cantidad de Cocos Gram Positivos
Catalasa Negativa
Tabla 10: Características macro y microscópicas y prueba de la catalasa de los diferentes
alimentos en el medio VJ.
En los resultados recogidos en la Tabla 10, se muestran las características de los las
colonias aisladas del medio selectivo VJ para el aislamiento e identificación de
estafilococos.
En las muestras de aceitunas negras y alcaparras se observaron colonias blancas
de pequeño tamaño siendo cocos Gram negativos en el caso de aceitunas negras y
bacilos alargados de gran tamaño Gram negativos en el caso de alcaparras. Sin
embargo, aparecen colonias amarillas y rosas en las muestras de altramuces y
berenjenas aliñadas como podemos apreciar en la Fig. 8, en cuyo caso, se concluyó
que las colonias de color amarillo eran cocos Gram positivos y las colonias rosas
bacilos Gram positivos mediante la tinción de Gram.
38
Posteriormente a las colonias de cocos Gram positivos de dichas muestras se les
realizo la prueba de la catalasa, dando lugar en ambas un resultado negativo
(Catalasa Negativas).
Además, en la muestra de altramuces observamos que el medio cambia de color del
medio debido al viraje del indicador de pH producido por la acumulación de
productos ácidos, obtenidos en la fermentación del manitol. (Ver Fig.8)
KAA
Alimentos Identificación macroscópica
Identificación microscópica
Aceitunas negras (caseras) Colonias pequeñas negras Cocos Gram Positivos en parejas
Alcaparras Colonias pequeñas negras Cocos Gram Positivos Maíz Sin crecimiento x
Altramuces Colonias pequeñas negras Cocos Gram Positivos agrupados en parejas.
Aceitunas aliñadas Colonias pequeñas negras Cocos Gram Positivos Bacilos Gram Positivos
Berenjenas aliñadas Colonias pequeñas negras Cocos Gram Positivos en parejas o pequeños grupos
Tabla 11: Características macro y microscópicas de los diferentes alimentos en el medio
KAA.
La tabla 11, muestra las características macroscópicas y microscópicas de las cepas
aisladas en el medio selectivo KAA empleado para la detección, aislamiento y
confirmación de enterococos. Con respecto a la identificación macroscópica
observamos una morfología, tamaño y color común en todas las muestras, colonias
pequeñas de color negro. En cuanto a la identificación microscópica, en su mayoría
presenta cocos Gram positivos agrupados en parejas o pequeños grupos (ver Fig.9)
con excepción de aceitunas aliñadas que además presentan bacilos Gram positivos.
Fig.8 Identificación
macroscópica en medio VJ
39
Fig. 9 Imagen microscópica de cocos Gram positivos agrupados en parejas o pequeños
grupos ramificados.
Además, en el caso de las muestras de aceitunas negras, alcaparras y altramuces el
medio solido KAA cambia a color oscuro casi negro, esto es debido a que los
microorganismos hidrolizan la esculina presente en el medio con la producción de
glucosa y esculetina la cual reacciona con el citrato férrico para dar un complejo de
color variable entre el verde y el negro como podemos observar en la Fig. 10.
Fig.10 Cambio de viraje del medio KAA.
Todo ello pone de manifiesto que los organismos presentes en estos alimentos eran
enterococos.
40
EMB
Alimentos Identificación macroscópica
Identificación microscópica
Aceitunas negras (caseras) Colonias pequeñas verde brillante metalizado
Bacilos Gram Negativos agrupados en racimos
Alcaparras Colonias pequeñas blancas Levaduras Maíz Sin crecimiento x
Altramuces Colonias pequeñas verde brillante metalizado Colonias pequeñas blancas
Cocobacilos Gram Negativos Bacilos Gram Negativos
Aceitunas aliñadas Colonias pequeñas blancas
Bacilos Gram Negativos
Berenjenas aliñadas. Colonias blanquecinas Bacilos Gram Negativos
Tabla 12: Características macro y microscópicas de los diferentes alimentos en el medio
EMB.
La tabla 12 hace referencia a los resultados obtenidos en el medio EMB que es
utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rápido
desarrollo. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia
Enterobacteriaceae.
En las muestras de aceitunas negras y altramuces observamos crecimiento de
colonias de pequeño tamaño con un característico brillo verde metálico (ver Fig. 11)
identificadas mediante la tinción como bacilos Gram negativos, que presentan una
morfología clásica y un brillo clásico de muchas cepas de E. coli. Sin embargo, en
las muestras de altramuces, aceitunas y berenjenas aliñadas se identificaron
colonias blancas de pequeño tamaño siendo reconocidas como bacilos Gram
negativos. En alcaparras, hubo crecimiento de colonias blancas que no
correspondían con la morfología típica de enterobacterias y coliformes, dando lugar
como resultado a levaduras.
Fig11. Identificación macroscópica en medio EMB.
41
5) DISCUSIÓN
La presencia de microorganismos en los alimentos no significa necesariamente un
peligro para el consumidor o una calidad inferior de estos productos.
Como se observa en los resultados, en la mayoría de las diferentes muestras de
encurtidos se puede apreciar una microbióta típica asociada a procesos de
fermentación de los como son la presencia de bacterias acido lácticas y levaduras.
En determinados tipos de alimentos (por ejemplo, embutidos fermentados, col ácida,
queso y otros derivados lácteos) es natural y deseable una gran multiplicación
bacteriana, con una «fermentación» o «maduración» paralela del alimento. En estos
productos, un recuento elevado, como tal, carece prácticamente de significado, ya
que los microorganismos impropios no pueden diferenciarse generalmente de la
microflora propia o normal.
Sin embargo, si el proceso no se desarrolla adecuadamente, pueden aparecer otras
bacterias que alteran aún más el producto e incluso ser patógenas, como nuestro
caso en la muestra de aceitunas negras caseras en las que podemos destacar el
crecimiento de E.coli. Es un germen cuyo hábitat natural es el tracto entérico del
hombre y de los animales. Su presencia en alimentos representa mala calidad
higiénica en el proceso, falta de higiene de los manipuladores o recontaminación
después del proceso. Estas si bien no son generalmente patógenas de por sí, son
indicadores de presencia de microorganismos potencialmente patógenos y por lo
tanto son un índice de deficiencias sanitarias. (Perdomo y col., 2001) .E. coli es el
indicador clásico de la posible presencia de patógenos entéricos en el agua, en los
moluscos, en los productos lácteos y en otros alimentos. Según estudios científicos
E. coli O157:H7 es un miembro del grupo enterohemorrágico del patógeno E. coli
O157:H7 es altamente tolerante a pH ácidos, y los brotes atribuidos a esta bacteria
se han encontrado en muchos alimentos ácidos que tienen un nivel de pH similar a
los de los productos encurtidos (Sun Young Lee, 2005). E. coli O157: H7 y
Salmonella sp., especialmente, han sido implicados en la participación de varios
brotes de las frutas ácidas o jugos de fruta (Beuchat, 1996; Burnetty Beuchat, 2001;
Han y Linton, 2004). A diferencia de la mayoría de los patógenos transmitidos por
los alimentos, E. coli O157: H7 es tolerante con los ambientes ácidos (Lee y Kang,
2009).
42
Haciendo referencia a los resultados obtenidos en las muestras de aceitunas en
general, podemos decir que, aunque hay que tener en cuenta las condiciones
iniciales, se establece que las bacterias lácticas aparecen espontáneamente en
aceitunas aderezadas mientras que en aceitunas al natural pueden verse
desplazadas por las levaduras (Garrido Fernández y col., 1997; Balatsouras, 1995).
Las bacterias lácticas tienen un metabolismo complejo y diverso lo que les permite
adaptarse a situaciones cambiantes, aunque las condiciones de cultivo impuestas
cuando se trabaja con ellas en el laboratorio limitan sin duda sus posibilidades
(Axelsson, 1998).
En relación a presencia de enterococos en el caso de las muestras de aceitunas
negras, alcaparras y altramuces, Enterococcus se encuentran dentro del grupo de
microorganismos indicadores de la inocuidad de los alimentos, pues por su amplia
distribución pueden encontrarse en estos productos, especialmente en los de origen
animal. Suelen considerarse buenos indicadores porque mueren más lentamente
que los coliformes, debido a que son muy resistentes a condiciones adversas como
congelación, desecación y como resultado sobreviven más que éstos. Pequeñas
números de estreptococos fecales en los alimentos carecen de significado, excepto
cuando se trata de productos industrializados que han sido sometidos a un riguroso
tratamiento bactericida (por ejemplo, alimentos precocinados congelados). Carecen
igualmente de significado cifras elevadas en productos en cuya fermentación
intervienen normalmente estos microorganismos.
43
6) CONCLUSIONES:
1) Se ha comprobado la presencia de distintos grupos bacterianos, bacterias
Gram positivas, Gram negativas, hongos y levaduras en los distintos tipos de
encurtidos.
2) En general, la identificación preliminar de los microorganismos aislados
coincide con las características esperadas de acuerdo con los medios
selectivos empleados (enterobacterias en medio EMB, bacterias lácticas en
medio MRS y estafilococos en medio VJ).
3) En el medio selectivo EMB se observó una carga microbiana significativa en
la muestra de aceitunas negras caseras, concluyendo la presencia de E.coli,
que indica generalmente una contaminación directa o indirecta de origen
fecal.
4) No se encuentran diferencias significativas en cuanto a la diversidad de
microorganismos aislados en las diferentes muestras de encurtidos
envasados.
5) En general, podemos concluir que de los grupos bacterianos aislados, en
su mayoría son microorganismos asociados a los procesos de fermentación
de los encurtidos.
44
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