riesgo de enfermar asociado al consumo de lechuga expuesta a la contaminacion por salmonella
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la lechuga contaminada con salmonellaTRANSCRIPT
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE QUERÉTARO
FACULTAD DE QUÍMICA
PROGRAMA DE POSGRADO EN ALIMENTOS DEL CENTRO DE LA REPÚBLICA
(PROPAC)
MAESTRÍA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS
RIESGO DE ENFERMAR ASOCIADO AL CONSUMO DE LECHUGA EXPUESTA A CONTAMINACIÓN POR Salmonella
TESIS
Que como parte de los requisitos para obtener el grado de
MAESTRO EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS
Presenta
SANDRA GUADALUPE GARCÍA GALVÁN
Querétaro, Qro. Enero del 2009
i
RESUMEN
La participación de las hortalizas como vehículo de microorganismos patógenos se ha incrementado en las últimas décadas en diversos países. El objetivo de este estudio fue determinar la incidencia de Salmonella y E. coli en lechuga expendida en mercados de la ciudad de Querétaro, estimar el patrón de consumo y determinar el comportamiento de Salmonella en esta hortaliza a partir de un modelo de contaminación cruzada. Se analizaron 647 muestras de lechugas colectadas entre octubre del 2007 y junio del 2008. A 50g de lechuga, se adicionaron 200 ml de caldo soya tripticasa y se homogenizaron. La mezcla se dividió en dos porciones iguales: 1) para la detección de Salmonella por PCR y 2) para estimar el contenido de E. coli por la técnica de NMP. El volumen restante de la segunda porción se almacenó en refrigeración (~24h) para cuantificar Salmonella (NMP) en las muestras positivas por PCR. Se detectó E. coli en el 14.9% de las muestras con niveles de 0.2 a 62 NMP/g y Salmonella en 0.6% con límites de <0.06 a 28 NMP/g. En la temporada cálida (marzo a junio) la positividad para Salmonella y E. coli fue de 1.9 y 25.3% respectivamente y, para la temporada fría (octubre a febrero) las cifras fueron de 0 y 1.4%. Para determinar el comportamiento de Salmonella en lechuga, se inoculó una tabla de madera para picar con una torunda previamente sumergida en jugo de carne cruda de cerdo inoculado con Salmonella (7 Log ufc/ml) resistente a rifampicina. Se colocaron 100 g de lechuga picada y se manipularon sobre la tabla inoculada durante 30-40 s. Porciones de lechuga contaminada (10 g) se almacenaron a 30, 22 y 4º C, sumergidas o no en agua. Se efectuaron recuentos periódicos en agar soya tripticasa suplementado con rifampicina. No se observó diferencia significativa (p< 0.05) entre el comportamiento de Salmonella en la lechuga sumergida y no sumergida en agua. A 30 ºC el patógeno incrementó su población cerca de 3 Log UFC/g en 8 h, mientras que a 22 ºC solamente 1.5 Log UFC/g en 12 h. A 4 ºC únicamente sobrevivió. El estudio sobre el consumo de lechuga reveló que el grupo de la población con mayor exposición al producto oscila entre 25 y 64 años de edad e ingiere porciones de 10 a 25 g una a dos veces por semana. Considerando la cantidad de alimento consumida, puede inferirse que en los casos de positividad a Salmonella estas personas llegan a ingerir entre 1.3 y 100 células del patógeno en una ocasión. Conocer la incidencia de patógenos en alimentos que se consumen crudos, así como la frecuencia y cantidad con la que se ingieren, son elementos que permiten estimar el riesgo al que se expone el consumidor y constituyen la base de los nuevos enfoques de prevención. (Palabras clave: lechuga, contaminación cruzada, Salmonella)
ii
SUMMARY The incidence of vegetables constituting a vehicle for pathogenic microorganisms has increased during the last few decades in different countries. The objective of this study was to determine the incidence of Salmonella and E .coli in lettuce sold in markets in the City of Queretaro, to calculate the consumption pattern and to determine the behavior of Salmonella on this vegetable using a cross-contamination model. 647 lettuce samples collected in October 2007 and June 2008, were analyzed. 200 ml. of tryptic soy broth was added to 50 g of lettuce and was homogenized. The mixture was divided into two equal portions: 1) for the detection of Salmonella by PCR and 2) to estimate the content of E. coli using the MPN technique. The remainder of the second portion was stored in refrigeration (approximately 24 h) in order to quantify Salmonella (MPN) in the samples that were found to be positive by PCR. E. coli was found in 14.9 % of the samples with levels of 0.2 to 62 MPN/g and Salmonella in 0.6% with limits of <0.06 to 28 MPN/g. In the hot season (March to June), positive testing for Salmonella and E. coli was 1.9 and 25.3 %, respectively. For the cold season (October to February), the figures were 0 and 1.4%. In order to determine the behavior of Salmonella on lettuce, a wooden cutting board was inoculated using a swab previously submerged in raw pork juice inoculated with Salmonella (7 Log CFU/ml) which was resistant to Rifampicin. 100 g of chooped lettuce was placed and moved around on the inoculated board for 30-40 s. Portions of the contaminated lettuce (10 g) were stored at 30, 22 and 4 ºC, some submerged in water and others not. Periodic counts were carried out in tryptic soy agar supplemented with rifampicin. No significant difference (p <0.05) was observed between the behavior of Salmonella on the submerged lettuce and the lettuce not submerged. At 30 ºC, the pathogen´s population increased close to 3 Log CFU/ g in 8 h, while at 22 ºC, it only increased 1.5 Log CFU/ g in 12 h. At 4 ºC it only survived. The study of lettuce consumption showed that the population group with the greatest exposure to the product varies from 25 to 64 years of age, and this group ingests portions of 10 to 25 g once or twice a week. Considering the amount of lettuce consumed, it can be inferred that in the cases positive to Salmonella, these people ingest between 1.3 and 100 cells of the pathogen on each occasion. Knowing the incidence of pathogen on food eaten raw, as well as the frequency and quantity in which they are ingested, are factors that make possible an estimate of the risk to which the consumer is exposed and form the basis for new prevention focuses. (Key words: Lettuce, cross-contamination, Salmonella)
iii
AGRADECIMIENTOS
- A CONACYT por el financiamiento otorgado para la realización de esta investigación.
- A la Universidad Autónoma de Querétaro. - Al Dr. Escartín por el apoyo brindado y el tiempo dedicado durante
la elaboración de esta tesis.
- A los integrantes del comité de tesis por sus valiosos comentarios
- Gracias a la Dra. Montserrat por asesorarme en la redacción de la tesis, por tenderme la mano siempre que lo necesite, por su crítica siempre constructiva.
- A Betty por el apoyo brindado dentro y fuera del trabajo y por ser la
chispa del laboratorio.
- A Polo por la capacitación en las técnicas moleculares, y por ayudarme a resolver dudas siempre que lo necesite.
- A la Sra Martha y Erika por su compañía durante mi estancia en el
laboratorio, por su ayuda desinteresada, por los buenos momentos.
- A todas y cada una de las personas que de alguna forma colaboraron en la fase experimental de este trabajo.
v
ÍNDICE GENERAL PáginaRESUMEN i
SUMMARY ii
AGRADECIMIENTOS iii
DEDICATORIA iv
ÍNDICE v
ÍNDICE DE CUADROS ix
ÍNDICE DE TABLAS x
ÍNDICE DE FIGURAS xi
I. INTRODUCCIÓN 1
II. ANTECEDENTES 2
2.1. Frutas y hortalizas 2
2.1.1. Producción y consumo 2
2.1.2. Riesgos asociados al consumo de frutas y hortalizas 3
2.1.3. Brotes asociados a el consumo de frutas y hortalizas 4
2.1.4. Incidencia de Salmonella en frutas y hortalizas 6
2.1.5. Fuentes y mecanismos de contaminación 7
2.1.5.1. Contaminación cruzada 9
2.2. Lechuga 9
2.2.1. Brotes asociados a su consumo 10
2.3. Enfoques para lograr y preservar la inocuidad microbiana de los alimentos 12
vi
2.3.1. Prácticas sanitarias agrícolas 12
2.3.2. Análisis de peligros y puntos críticos de control 13
2.3.3. Análisis de riesgos 14
2.3.3.1 Evaluación de riesgos microbiológicos (ERM) 14
2.3.3.1.1. Identificación del peligro 16
2.3.3.1.2. Caracterización del peligro 16
2.3.3.1.3. Evaluación de la exposición 17
2.3.3.1.4. Caracterización del riesgo 21
2.4. Técnicas de detección de Salmonella en los alimentos 22
2.4.1. Detección por cultivo 22
2.4.2. Detección por PCR 23
2.5 Microbiología predictiva 24
2.5.1 Modelo de Baranyi 24
III. OBJETIVOS 26
IV. MATERIALES Y MÉTODOS 27
4.1. Material biológico 27
4.1.1 Equipo 27
4.1.2 Medios de cultivo 27
4.1.3 Soluciones 28
4.1.4 Reactivos 28
4.2 Material biológico 28
4.3. Sitios de muestreo 29
4.4. Validación de la técnica de cultivo para la determinación de Salmonella 29
4.4.1 Evaluación del caldo de preenrequecimiento en lechuga 29
4.4.1.1 Preparación del inóculo 29
4.4.1.2 Determinación del desarrollo de Salmonella en lechuga con
tres caldos de preenrequecimiento 30
4.5 Validación de PCR para la determinación de Salmonella 30
4.5.1 En cultivo puro 30
vii
4.5.2 En lechuga 31
4.5.2.1 Determinación de Salmonella con extracto de lechuga 31
4.5.2.2 Determinación del límite de detección 30
4.6 Comparación del cultivo y PCR para la determinación de Salmonella 30
4.7 Determinación del NMP de Salmonella en lechuga 30
4.8 Determinación de E. coli 30
4.9 Modelo de contaminación cruzada 32
4.9.1 Preliminares 32
4.9.1.1 Inoculación de la tabla de madera 32
4.9.1.2 Influencia del nivel de inóculo en la recuperación de
Salmonella a partir de la tabla de madera 32
4.9.1.3 Determinación de la variabilidad de contaminación de la
lechuga por medio de la tabla de la madera 32
4.9.2 Dinámica de Salmonella en lechuga 33
4.10 Estimación del patrón de consumo de lechuga 33
4.11 Análisis estadísticos 33
V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 35
5.1. Sitios de muestreo 35
5.2. Validación de la técnica de cultivo para la determinación de Salmonella 35
5.2.1. Evaluación del caldo de preenrequecimiento en lechuga 35
5.3. Validación de PCR para la detección de Salmonella en cultivo puro 37
5.3.1 Especificidad y sensibilidad de los iniciadores para la detección de
Salmonella (invA)
37
5.3.2. Validación de la técnica de PCR para la detección de Salmonella
en lechuga
38
5.4. Incidencia de Salmonella y E. coli en lechuga 40
5.5. Contenido de Salmonella y E. coli en lechuga 42
5.6. Asociación entre la detección de Salmonella y E. coli 45
5.7. Incidencia de Salmonella y E. coli según época del año 46
5.8. Comportamiento de Salmonella en lechuga a través de un modelo de
viii
contaminación cruzada 48
5.8.1. Estudios preliminares 49
5.8.1.1. Efecto del nivel de inóculo en la recuperación de Salmonella en
las tablas de madera 51
5.8.1.2. Contaminación de la lechuga 52
5.8.2. Comportamiento de Salmonella en lechuga sumergida y no
sumergida en agua
53
5.9. Estimación del patrón de consumo de lechuga 59
5.10. Estimación del riesgo de enfermar por Salmonella asociado al consumo
de lechuga
65
VI. CONCLUSIONES 69
VII. BIBLIOGRAFÍA 71
ix
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro Página
2.1 Fuentes de contaminación de microorganismos patógenos en frutas y hortalizas crudas y condiciones que influyen en su sobrevivencia y crecimiento
7
2.2 Información generada y requerida para la evaluación de la exposición
19
5.1 Algunos estudios de Evaluación de Riesgos Microbiológicos realizados en países desarrollados
67
x
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla Página
5.1 Positividad de Salmonella en lechuga de tres sitios de comercialización
41
5.2 Positividad de E. coli en lechuga de tres sitios de comercialización
41
5.3 Contenido de Salmonella en lechuga de tres sitios de comercialización
44
5.4 Contenido de E. coli en lechuga de tres sitios de comercialización
45
5.5 Asociación entre la detección de Salmonella y E. coli en lechuga
46
5.6 Recuentos de Salmonella en lechuga contaminada a partir de la tabla de madera
53
5.7 Valores de F y significancia estadística en el análisis de varianza para la variable “velocidad de desarrollo” de los factores de estudio y su interacción
57
5.8 Velocidad de desarrollo de Salmonella en lechuga picada sumergida y sin sumergir en agua y almacenada a 4, 22 y 30 ºC
58
5.9 Porcentajes de frecuencia sobre la encuesta de consumo de lechuga cruda
61
xi
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura Página
2.1 Tendencia anual en brotes por frutas y hortalizas
5
2.2 Promedio de casos por brote según tipo de alimento
5
2.3 Fuentes y mecanismos de contaminación durante la obtención y procesamiento de frutas y hortalizas crudas
8
2.4 Patógenos en brotes de frutas y hortalizas
11
2.5 Marco general de la Evaluación de Riesgos
16
2.6 Evaluación de la exposición- del campo a la mesa
20
4.1 Formato de la encuesta sobre el consumo de lechuga
34
5.1 Cinética de Salmonella en lechuga con tres caldos de preenrequecimiento
36
5.2 Cinética de Salmonella en cultivo puro con tres caldos de preenrequecimiento
36
5.3 Especificidad de los iniciadores invA para detectar Salmonella en cultivo puro
37
5.4 Sensibilidad de la técnica de PCR para la detección de Salmonella en cultivo puro
38
5.5 Sensibilidad de iniciadores invA en lechuga
39
5.6 Cinética de Salmonella y BMAs en CST a 35 ºC
39
5.7 Salmonella y E. coli en muestras de lechuga durante dos épocas del año
47
5.8 Recuperación de Salmonella en tablas de madera
50
5.9 Influencia del nivel de inóculo en la recuperación de Salmonella en tabla de madera
50
5.10 Comportamiento de Salmonella en lechuga picada sumergida en agua y almacenada a diferentes temperaturas
55
xii
5.11 Comportamiento de Salmonella en lechuga picada sin sumergir en agua y almacenada a diferentes temperaturas
56
5.12 Grupos de población entrevistadas según edad
62
5.13 Frecuencia de sitios de consumo de lechuga cruda
62
5.14 Frecuencia de consumo de lechuga cruda
63
5.15 Frecuencia de cantidad de lechuga cruda consumida por ocasión
64
5.16 Frecuencia de padecimientos de diarrea al año por persona
64
5.17 Probabilidad de exposición de Salmonella en función de su incidencia, frecuencia y cantidad de lechuga consumida
68
1
I. INTRODUCCIÓN
Como consecuencia de la publicidad que reciben por parte de autoridades
sanitarias nacionales e internacionales y como parte de una dieta saludable,
actualmente se observa un incremento en el consumo de frutas y hortalizas
crudas. No obstante, se ha demostrado que este grupo de alimentos suele ser
vehículo de patógenos (Beuchat, 1996). Los brotes causados frutas y hortalizas
provocaron un promedio de 48 casos por brote en un periodo de 15 años en
E.E.U.U., colocándose por arriba de alimentos como pollo y mariscos (CSPI,
2007). El enfoque más moderno para la prevención de las enfermedades
microbianas asociadas al consumo de alimentos es la evaluación de riesgos. Este
enfoque se lleva a cabo en cuatro etapas: identificación del peligro, caracterización
de peligro, evaluación de la exposición y caracterización del riesgo. Durante la
etapa de evaluación de la exposición se utiliza la información sobre la incidencia,
concentración y comportamiento de un patógeno en un alimento particular en las
diferentes etapas del campo a la mesa. Es igualmente necesario conocer la
cantidad y frecuencia con la que se consume este alimento. Es posible así,
estimar el número de células que ingiere una persona al momento de su consumo
mediante el uso de la microbiología predictiva que considera las condiciones de
manejo del alimento previo al consumo. El presente trabajo tuvó como objetivo
determinar la incidencia de Salmonella en lechugas comercializadas en mercados
públicos de la ciudad de Querétaro, estudiar el comportamiento del patógeno en la
hortaliza a través de un modelo de contaminación cruzada y conocer la tendencia
de consumo como recurso para estimar la probabilidad de exposición a
Salmonella asociado al consumo de lechuga.
2
II. ANTECEDENTES 2.1. FRUTAS Y HORTALIZAS 2.1.1. PRODUCCIÓN Y CONSUMO
Las frutas y hortalizas son parte fundamental de la dieta del hombre;
representan una apreciable fuente de nutrientes para el adecuado funcionamiento
del organismo. En general, su contenido de proteínas y lípidos es muy reducido; el
agua, fibra, almidones, algunas vitaminas y minerales son sus componentes
primarios (Fernández, 2000).
Durante las últimas tres décadas el consumo de frutas y hortalizas crudas en
los Estados Unidos (E.E.U.U.) se ha incrementado en cerca de 50%
(Sivapalasingam et al., 2004). Actualmente es notable una más amplia distribución
global, variedad de productos y disponibilidad a lo largo de todo el año (Beuchat y
Ryu., 1997). A partir del 2000 en E.E.U.U., los productores de frutas y hortalizas
orgánicos representan el 2 % de la venta, y se espera que este mercado siga
aumentando hasta 10-12% anual (Natvig et al., 2002).
La producción agrícola alimentaría desempeña un importante papel en la
economía de muchos países. México cuenta con 23 millones de hectáreas para el
cultivo es decir el 11.7% de la superficie total del país. La variación del clima de
tropical a templado permite cultivar una gran variedad de frutas y casi cualquier
hortaliza (FDA/CFSAN, 2001). En nuestro país el 4% de la tierra para cultivo es
empleada para producir frutas y hortalizas. Un 20% de la producción de frutas y
hortalizas se destina a la exportación, el resto para el mercado nacional.
Las exportaciones de frutas y hortalizas constituyen un amplio porcentaje de
los ingresos de muchos países de Latinoamérica (Huang, 2004). México ocupa el
10° lugar de exportadores a nivel mundial; son importantes los ingresos por las
3
actividades agropecuarias ya que un tercio de la población económicamente activa
obtiene sus ingresos trabajando en este rubro.
2.1.2. RIESGOS ASOCIADOS AL CONSUMO DE FRUTAS Y HORTALIZAS
Las frutas y hortalizas frescas constituyen un problema de salud pública
desde el punto de vista de la seguridad alimentaria. En 1980 Hauschild y Bryan
estimaron que los casos de enfermedades transmitidas por alimentos y agua en
los EUA era de 1.4 a 3.4 millones por año. Se estima que cada año afectan de 6 a
8 millones de personas, causan 9,000 muertes y tienen un costo estimado en 5 mil
millones de dólares (Alterkruse et al., 1997; Mead et al., 1999).
El escenario de los brotes ha pasado de afectar a pocas personas debido al
mal manejo del alimento, al actual, nivel bajo de contaminación de un alimento
producido en gran escala y ampliamente distribuido (Rushing, 2001). Por tanto, los
brotes aparecen diseminados y extensos (Tauxe y Hughes, 1996). Algunos
factores que pueden estar afectando la transición de las ETAs incluyen cambios
en las prácticas agrícolas (Alterkruse et al., 1997), redes de distribución más
amplias (Naimi et al., 2003) y productos y sistemas de distribución y preservación
mas complejos (Taietjen y Fung, 1995).
El problema seguramente no es excepcional en países como el nuestro en
donde aún se observan (aunque cada vez menos frecuentes) prácticas insalubres
en su cultivo, cosecha, transporte, comercialización y preparación. Si los reportes
de brotes no son frecuentes, probablemente se deba más a deficientes servicios
de epidemiología que a una ausencia real de incidentes. Pero aun en países
desarrollados que no suelen utilizar aguas negras en el riego de hortalizas, se
cuenta con reportes de brotes en la población.
Bacterias enteropatógenas como E. coli O157:H7, Campylobacter jejuni,
Listeria monocytogenes y Salmonella, aparte virus, protozoarios y helmintos, son
4
transmisibles a través de verduras o frutas que se consumen crudas. Las llamadas
ensaladas verdes que contienen verduras como lechuga, brócoli, zanahoria,
jitomate, apio y otras, y que suelen ofrecerse en las barras de restaurantes y
prepararse en casi toda cocina, incluidos los hogares, constituyen un riesgo
especial (Sivapalasingam, 2004).
2.1.3. BROTES ASOCIADOS A EL CONSUMO DE FRUTAS Y HORTALIZAS
Debido a que las frutas y hortalizas se han visto involucradas en brotes de
enfermedades transmitidas por los alimentos (ETAs), ha surgido la necesidad de
conocer la distribución de microorganismos patógenos en este tipo de alimentos.
Algunos vehículos frecuentes en brotes en Estados Unidos son los jitomates,
lechuga, germinados de alfalfa, perejil, cebollines, melón, así como jugos de
manzana y naranja sin pasteurizar, zarzamoras y fresas congeladas
(Beuchat,1996).
Una revisión de los brotes asociados a frutas y hortalizas desde 1990 a 2005
mostró que hubo un incremento importante de brotes a partir de 1998 (figura 1);
sin embargo este incremento se debió probablemente a una mayor vigilancia por
parte de el Centro para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) (Smith y
Bhuiya, 2007).
Dentro de este mismo estudio se realizó una revisión de brotes en los que se
identificó la fuente de alimento. Los brotes ocasionados por frutas y hortalizas
crudas comprendieron el 13% (713/ 5,416) de los brotes y el 21% de los casos de
enfermedades en el periodo de 1990 a el 2005, de acuerdo con el Centro de
Ciencias para el Interés Público (CSPI).
5
Figura 2.1. Tendencia anual en brotes por frutas y hortalizas (CSPI, 2007).
Figura 2.2. Promedio de casos por brote según tipo de alimento (CSPI,
2007).
Frutas y hortalizas
pollo Cárnicos Pescados y mariscos
Año
Brotes Casos
Brotes Casos
6
2.1.4. INCIDENCIA DE Salmonella EN FRUTAS Y HORTALIZAS La mayoría de la personas asocian apropiadamente a Salmonella con las
aves. Sin embargo, una investigación de los brotes por alimentos realizada por
CSPI, reveló que las frutas y hortalizas crudas están alcanzando las mismas cifras
que alimentos como el pollo como principales responsables de las infecciones por
Salmonella (CSPI, 2005).
Se ha demostrado la presencia de Salmonella en frutas y hortalizas diversas
como alcachofa, remolacha, germinados de semilla, calabaza, coliflor, perejil,
chiles, cilantro, lechuga, endivia, apio, pimiento, ensalada de verduras, espinacas
(Beuchat, 2002), jitomate (Rico, 2002) melones, sandia (CDC, 1991), naranja,
coliflor y cebollines (FDA/CFSAN, 2001).
En España, García-Villanova et al. (1987) encontraron Salmonella en 7.5%
verduras de mercado. En un estudio realizado en la FDA se recuperó el patógeno
(1%) de la cáscara de melones y sandías (CDC, 1991).
Algunos estudios de frutas y hortalizas han revelado la presencia de diversos
serotipos de Salmonella capaces de causar enfermedad. Tamminga et al. (1978)
aislaron Salmonella en 23 de 103 muestras de coliflor, lechuga, endibia, berenjena
y pimientas cultivadas en Netherlands. Ercolani (1976) reportó que el 68% de 120
muestras de lechuga y el 72% de 89 muestras de hinojo, obtenidas en comercios
de Italia, encontró cinco diferentes serotipos de Salmonella. Entre 1981 y 1983,
García-Villanova Ruiz et al. (1987) analizaron 345 muestras de hortalizas
colectadas en el campo, mercados y supermercados en España para detectar la
presencia de Salmonella. Encontraron este microorganismo en alcachofa,
remolacha, apio, lechuga, calabaza, coliflor, espinaca y perejil. Otros
investigadores como Jerngklinchan y Saitanu en 1993 realizaron en Bangkok una
encuesta en brotes de frijol. Revelaron que 30 de 344 (8.7%) muestras contenían
Salmonella.
7
2.1.5. FUENTES Y MECANISMOS DE CONTAMINACIÓN
La configuración de los riesgos microbianos en los alimentos se inicia con el
proceso de contaminación, es decir, con el mero ingreso de microorganismos al
alimento (Fernández, 2000). Las frutas y hortalizas pueden contaminarse en
cualquier punto durante su cultivo, cosecha, procesamiento, transporte y
preparación final (Beuchat et al., 2003).
Cuadro 2.1 Fuentes de contaminación de microorganismos patógenos en frutas y
hortalizas crudas y condiciones que influyen en su sobrevivencia y crecimiento
(Beuchat, 1996).
Precosecha Poscosecha
• Heces
• Suelo
• Agua de riego
• Aire (polvo)
• Animales domésticos
y silvestres
• Manejo humano
• Heces
• Manejadores de alimentos (trabajadores o
consumidores)
• Equipo de poscosecha
• Aire (polvo)
• Contenedores para transporte (del campo
hasta el empacado)
• Agua de lavado y enjuague
• Vehículos de transporte
• Hielo
• Almacenamiento inapropiado (temperatura,
medio ambiente físico)
• Contaminación cruzada (otros alimentos en
almacenamiento, preparación y áreas
expuestas)
• Manejo inadecuado durante la venta al
mayoreo y menudeo.
8
Dentro de las principales fuentes de contaminación durante su cultivo se
encuentran el agua de riego, la tierra, el abono, animales domésticos y silvestres y
los agricultores. Durante la precosecha son de interés la manipulación humana, la
maquinaria y el equipo, el agua de lavado y enjuague, el aire y una posible
contaminación cruzada (Beuchat, 1996).
Los mecanismos, o bien, la manera y términos en los que ocurre la
contaminación en las frutas y hortalizas son diversos. Durante la poscosecha
puede ocurrir por medio del material de transporte, el agua de lavado y por
contaminación cruzada con otros alimentos (Watchel, 2002).
Figura 2.3 Fuentes y mecanismos de contaminación durante la obtención y
procesamiento de frutas y hortalizas crudas (Beuchat, 1996).
heces
drenaje
agua
suelo
Carne, leche, huevo
ANIMALES
Contaminación cruzada
FRUTAS Y HORTALIZAS
HUMANOS
Ambiente durante el cultivo, cosecha y
procesamiento
9
2.1.5.1. CONTAMINACIÓN CRUZADA
Este mecanismo consiste en la transferencia de un material contaminado a
otro. Las posibilidades de contaminación cruzada durante la preparación de
alimentos en las cocinas son muy amplias. Esta constituye probablemente el factor
principal como determinante de la presencia de microorganismos patógenos en los
alimentos que se preparan en sitios como el hogar o restaurantes (Fernández,
2000).
La contaminación cruzada puede ocurrir en las cocinas por el contacto con
las manos de alimentos crudos de origen animal, o bien, con las superficies de
tablas de cortar y utensilios que se emplean durante la preparación de estos
alimentos. La inadecuada manipulación de alimentos en los hogares es uno de los
principales factores que contribuyen al desencadenamiento de enfermedades
bacterianas (Zhao et al.,1998).
Los datos epidemiológicos sobre las enfermedades transmitidas por los
alimentos reportados por el CDC en el periodo de 1972 a 1987, comprendieron
7,458 casos, de los cuales 21% ocurrieron en los hogares (Bean, 1990). Sin
embargo, el porcentaje real de los brotes que ocurren en los hogares puede ser
mucho mayor, debido a que estos pequeños brotes generalmente no son
reportados o investigados (Tauxe, 1996).
2.2. LECHUGA
La lechuga (Lactuca sativa C) es la hortaliza más importante del grupo de los
vegetales de hoja que se consumen crudos. Ampliamente conocida, se cultiva en
casi todos los países durante todo el año, al aire libre o bajo invernaderos. Es una
planta anual y autógama, su raíz no llega nunca a sobrepasar los 25 cm de
profundidad, es pivotante, corta y con ramificaciones; las hojas están colocadas en
roseta, desplegadas al principio, en unos casos siguen así durante todo su
10
desarrollo (variedades romanas), y en otros se acogollan más tarde. El borde de
los limbos pueden ser liso, ondulado o aserrado, su tallo es cilíndrico y ramificado.
Su hábito de crecimiento determina su clasificación en tres tipos principales,
que incluyen todas las variedades comerciales: la lechuga de hoja suelta
corresponde a la variedad botánica crispa; la de cabeza, a la variedad capitata; las
lechugas arrepolladas que forman cabezas son las de mayor demanda comercial
(SIAP, 2008).
La temperatura óptima de germinación oscila entre 18 y 20ºC, en fase de
crecimiento el cultivo requiere temperaturas entre 14 y 18ºC por el día y 5 a 8ºC
por la noche, pues exige que haya diferencia de temperaturas entre el día y la
noche. Durante el acogollado se requieren temperaturas en torno a los 12ºC por el
día y 3 a 5ºC por la noche, como temperatura máxima puede soportar hasta los
30ºC y como mínima hasta -6ºC. Los suelos deben ser ligeros, arenoso-limosos,
con buen drenaje, situando el PH óptimo entre 6.7 y 7.4. (SIAP, 2008)
Esta hortaliza es la base de cualquier ensalada y es un ingrediente básico en
dietas bajas en calorías, aporta minerales y vitaminas. De acuerdo con los datos
proporcionados por el Instituto de la Nutrición en México, en 100 gramos de peso
neto la porción comestible de la lechuga es de 69%, aporta 19 calorías, 1.3
gramos de proteínas, 0.1 gramos de grasa y 4.1 gramos de carbohidratos;
además, es rica en vitaminas y minerales (Hernández et al., 1974).
2.2.1. BROTES ASOCIADOS A SU CONSUMO
La lechuga fue una de las hortalizas más comúnmente implicada en los
brotes de ETA´s en E.E.U.U. entre 1973 y 1997 (Sivapalasingam et al., 2004).
En los últimos años, varios brotes de Escherichia coli O157: H7 han sido
causados por el consumo de lechuga o ensaladas contaminadas después de la
cosecha. (Watchel, 2002). La CDC informó que entre 1998 a 2005 se presentaron
11
20 brotes y 634 casos de enfermedad asociados a esta bacteria por el consumo
de lechuga.
En Oklahoma EE.UU., se presentó un brote de campylobacteriosis debido
al consumo de lechuga. La contaminación de esta hortaliza fue debido al mal
manejo de carne cruda de pollo, propiciando así, una contaminación cruzada hacia
la lechuga (MMWR, 1997).
Así mismo en Australia en 2001, se presentó un brote de salmonelosis
asociado al consumo de lechuga. La falta de mantenimiento en los equipos de
corte de la lechuga fue un factor clave en este brote (Stafford et al., 2002). De
acuerdo con el estudio realizado por CSPI en 2007, la lechuga es la segunda
hortaliza asociada a brotes, seguida de las ensaladas verdes. Salmonella es uno
de las principales patógenos asociados a brotes por este alimento (Figura 2.4).
Figura 2.4. Patógenos en brotes de frutas y hortalizas (CSPI, 2007).
Bro
tes
Ensaladas Lechuga Papa Frutas Col
Vehículos
12
2.3. ENFOQUES PARA LOGRAR Y PRESERVAR LA INOCUIDAD MICROBIANA DE LOS ALIMENTOS 2.3.1. PRÁCTICAS SANITARIAS AGRÍCOLAS
El llevar alimentos a la mesa del consumidor desde el campo involucra
muchos procesos (siembra, desarrollo del cultivo, cosecha, transporte a la planta,
empaque, almacenamiento, transporte a mercados terminales y distribución) en
los que los productos se encuentran expuestos al manejo humano y al contacto
con material y equipo que aumentan el riesgo de contaminación con agentes de
riesgo. Aunque los alimentos pueden llegar a ser contaminados por agentes
químicos u otros cuerpos extraños que pueden tener acceso a ellos durante su
manejo y empaque, las probabilidades de contaminación por adulteración son
menores. El principal problema para los productos alimenticios, en general, es
evitar los riesgos por contaminación microbiológica y su descomposición.
Por lo tanto, es importante que durante las operaciones de campo y
empaque se sigan ciertos lineamientos, normas y controles que aseguren que el
crecimiento de la flora normal del producto esté controlado, y que exista un
programa preventivo de contaminación por microorganismos patógenos (Siller et
al, 2002).
La disminución de la probabilidad de contaminación puede alcanzarse a
través de adecuadas maniobras durante el cultivo y cosecha. Estas prácticas se
han derivado a partir del conocimiento del hábitat de patógenos, su
comportamiento en frutas y hortalizas y la eficiencia de tratamientos dirigidos a
cancelar/ reducir su presencia o desarrollo y se conocen como prácticas agrícolas
sanitarias (PSAs); no deben confundirse con las buenas practicas agrícolas
(BPAs) o con las buenas practicas de manufactura (BPMs). Mientras las dos
últimas tienen como meta la calidad del alimento, las PSAs cuidan el aspecto de
13
inocuidad. Las prácticas sanitarias no se limitan al campo de cultivo y es necesario
que se apliquen durante la producción, transporte y procesamiento.
2.3.2. ANALISIS DE PELIGROS Y PUNTOS CRITICOS DE CONTROL
El sistema de análisis de peligros y puntos críticos de control (APPCC) es
un enfoque moderno con fundamentos científicos cuya pretensión primaria
consiste en eliminar de los alimentos los riesgos a la salud asociados a su
consumo (Fernández, 2000).
El sistema APPCC funciona más eficazmente cuando se aplica de manera
concurrente con los programas de aseguramiento de la calidad. Elementos
implícitos fundamentales del sistema son las operaciones sanitarias de producción
y distribución, la adecuada sanidad, y el diseño y mantenimiento del equipo. Por lo
tanto, requiere la satisfacción de ciertos prerrequisitos y acciones preliminares.
Algunos ejemplos de estas últimas son la capacitación del personal y la
disponibilidad de recursos elementales, como la dotación de agua potable,
protección contra la fauna y la implementación de las PSAs, así como BPAs.
Después de realizar las acciones anteriores es necesario identificar los
peligros específicos para implementar medidas de control que se monitorean de
manera continua o periódica. Finalmente, si las acciones en el proceso de
elaboración del alimento no cancelan las oportunidades de contaminación,
sobrevivencia y desarrollo de agentes patógenos, se recomienda modificar el
proceso. Un plan de APPCC es específico para cada producto y proceso. Puede
ser desarrollado para asegurar la inocuidad de una ensalada de fruta en un
restaurante o de una salchicha en una planta procesadora de productos cárnicos
(Fernández, 2000).
14
2.3.3 ANÁLISIS DE RIESGOS
El análisis de riesgos es un proceso que comprende los siguientes
elementos: evaluación de riesgos: evaluación científica de los efectos adversos
conocidos o potenciales en la salud; gestión de riesgos: evaluación, selección, y
aplicación de alternativas de carácter normativo; y comunicación de riesgos:
intercambio de información entre todas las partes interesadas. Aunque la
separación funcional entre estos tres componentes es importante, hay un
reconocimiento cada vez mayor de la necesidad de interacción entre ellos
(FAO/OMS, 2002; OMS 2000).
2.3.3.1 EVALUACIÓN DE RIESGOS MICROBIOLOGICOS (ERM)
La evaluación de riesgos es un proceso que provee una estimación de la
probabilidad e impacto de un efecto adverso a la salud. Este sistema se introdujo a
finales de los 70´s y fue desarrollado como un medio para normalizar la base
reguladora para la toma de decisiones, específicamente en las áreas relativas a la
exposición humana a sustancias químicas (American Chemical Society, 1998).
En la actualidad la metodología de evaluación de riesgos es usada para
evaluar los riesgos en diferentes áreas, desde la toxicología y ecología hasta
ingeniería e investigación económica. Es recientemente que la evaluación del
riesgo se ha aplicado a los peligros microbianos, y las técnicas para su aplicación
están en plena evolución (Lammerding, 1997).
Dentro de este enfoque un peligro se define como un agente biológico,
físico o químico presente en un alimento con potencial de causar un efecto
adverso. Así mismo, el riesgo se define como la probabilidad de enfermar y la
severidad de esta, como consecuencia de la exposición a un peligro en el alimento
(Lammerding y Fazil, 2001).
15
La ERM puede considerarse un instrumento aplicable en la gestión de
riesgos ocasionados por los patógenos transmitidos por los alimentos y en la
elaboración de normas para el comercio internacional de productos alimenticios.
No obstante, se reconoce que la realización de una ERM, particularmente de tipo
cuantitativo, es una actividad que consume abundantes recursos y exige un
enfoque multidisciplinario. Así mismo, las enfermedades transmitidas por los
alimentos son uno de los problemas de salud publica mas frecuentes, y generan
cargas sociales y económicas, además de sufrimiento, por lo que deben
enfrentarse a el todos los países (FAO/OMS, 2004a).
La ERM nos permite estimar el riesgo para la salud de las personas
derivado de la presencia de determinados microorganismos en los alimentos.
Aunado a esto, sirve de instrumento con el que se puede comparar y evaluar
diferentes situaciones, y determinar que tipos de datos se necesitan para
determinar cuales son las medidas de control más eficaces y aplicarlas de forma
óptima (FAO/OMS, 2004b)
Dado que la evaluación de riesgos puede utilizarse también para justificar la
introducción de normas más restrictivas para los alimentos importados, su
conocimiento es importante para fines comerciales, y es necesario proporcionar a
los países, instrumentos para que puedan comprender y, si es posible, realizar
evaluaciones de riesgos microbiológicos (FAO/OMS, 2004a).
La comisión del Codex Alimentarius define la evaluación de riesgos
asociados a los peligros microbiológicos en los alimentos como un proceso con
una base científica formado por cuatro componentes (Figura 2.5): Identificación del
peligro, evaluación de la exposición, caracterización del peligro, y caracterización
del riesgo.
16
Figura 2.5. Marco general de la Evaluación de Riesgos. 2.3.3.1.1. IDENTIFICACIÓN DEL PELIGRO
La primera actividad en la evaluación de riesgos es la identificación del
peligro. Tradicionalmente, en la evaluación de riesgos químicos, este paso tiene
como objetivo determinar si una sustancia química podría causar algún tipo de
efecto adverso en la salud (cáncer, por ejemplo). En la evaluación de riesgos
microbiológicos, el microorganismo es usualmente ya identificado como un
patógeno capaz de causar enfermedad (ICMFS, 1998).
La identificación del peligro es en gran medida una evaluación cualitativa de
la información disponible, y considera en gran parte la misma información que se
analiza con más detalle en los siguientes pasos del proceso de evaluación.
Los peligros pueden identificarse a partir de fuentes de datos pertinentes,
tales como la literatura científica, investigaciones epidemiológicas, estudios
clínicos, entre otros (Lammerding y Fazil, 2001).
2.3.3.1.2. CARACTERIZACIÓN DEL PELIGRO
El propósito de esta etapa es proporcionar una descripción cualitativa o
cuantitativa de la gravedad y duración de los efectos adversos que pueden resultar
Evaluación de la exposición
Identificación del peligro
Caracterización del riesgo Caracterización del
peligro
Evaluación Dosis-Respuesta
17
de la ingestión de un microorganismo o sus toxinas con los alimentos. Deberá
efectuarse una evaluación de la dosis-respuesta, cuando es posible disponer de
datos necesarios (Teunis et al., 1996).
Existen varios factores importantes que deben tomarse en cuenta en la
caracterización del peligro. Éstos se relacionan tanto con el microorganismo como
con el huésped humano. En relación con el primero revisten importancia los
siguientes aspectos: 1) los microorganismos son capaces de multiplicarse; 2) la
virulencia puede cambiar en función de su interacción con el huésped y el medio
ambiente; 3) el material genético se puede transferir de un microorganismo a otro,
lo que conlleva la transferencia de características como la resistencia a los
antibióticos y factores de virulencia; 4) los síntomas clínicos pueden presentarse
bastante tiempo después de la exposición; 5) los microorganismos puede perdurar
en determinados individuos, causando una excreción continua del microorganismo
mismo y un constante riesgo de difusión de la infección; 6) en algunos casos,
dosis bajas de ciertos microorganismos pueden provocar un efecto grave; y 7) los
atributos de un alimento pueden modificar la patogenicidad microbiana, por
ejemplo en caso de alto contenido de grasa de un vehículo alimentario.
En relación con el huésped pueden revestir importancia los siguientes
factores: genéticos; características individuales de susceptibilidad del huésped
como edad, embarazo, nutrición, salud y medicamentos administrados,
infecciones simultáneas, estado de inmunidad e historial de exposición previa
(Coleman y Marks, 1998).
2.3.3.1.3. EVALUACIÓN DE LA EXPOSICIÓN
La evaluación de la exposición se refiere a la estimación de la probabilidad
de enfermar tras el consumo del alimento, y el número probable, o la dosis del
agente patógeno al que los consumidores pueden estar expuestos al ingerir ese
18
alimento. En una evaluación cuantitativa, la mayor parte del modelado y
simulación de estudio se encuentra en esta etapa (ICMSF, 1996).
Durante esta etapa se debe estimar la prevalencia y el alcance de la
contaminación microbiana en el alimento al momento de su consumo, la
probabilidad de que un individuo consuma el alimento en cierto periodo de tiempo,
el sitio implicado (casa, restaurantes, comedores industriales, etc.) y la cantidad de
alimento consumido.
Entre los factores que deben tomarse en cuenta para la evaluación de la
exposición figuran la frecuencia de la contaminación de los alimentos por el agente
patógeno, y el nivel de éste en dichos alimentos a lo largo del tiempo (Cuadro 2.2).
Influyente también son las características del agente patógeno, la ecología
microbiana del alimento y la contaminación inicial de la materia prima
(Lammerding y Fazil, 2001).
19
Cuadro 2.2 Factores necesarios para la evaluación de la exposición.
¿Qué concentración de
microorganismos ingiere el
consumidor?
¿Que tan frecuente y en qué cantidad
ingiere el individuo el alimento?
• Fuentes de contaminación:
frecuencia y concentración, y
estimación de la probabilidad de
concentración que será
consumida.
• Distribución, desarrollo,
inhibición o inactivación desde la
contaminación primaria, a través
del proceso, manipulación
durante el comercio, prácticas de
preparación.
• Estudios de comportamiento,
modelos predictivos
• Datos de fabricación del alimento
• Datos de vigilancia del alimento
• Composición del alimento- pH,
Aw, contenido nutricional,
presencia de sustancias
antimicrobianas, microflora
competitiva
• Población demográfica
• Patrones de consumo
Fuente: Lammerding et al., 2001
Todas las posibles fuentes de contaminación con microorganismos
patógenos en los productos alimenticios deben ser evaluadas. Debido a que no es
posible medir con precisión la población de los patógenos presentes en un
alimento al momento de su consumo, se deben desarrollar modelos o hipótesis
20
para estimar la exposición probable. En el caso de las bacterias, el crecimiento y
la muerte del organismo en los alimentos deben tomarse en cuenta, en virtud de
poder predecir las prácticas de manipulación y preparación, tales como
temperatura, tiempo, la composición química del alimento, así como la competencia de la microflora que pudieran afectar al crecimiento y las tasas de
mortalidad de los agentes patógenos (ICMSF, 1998).
Los modelos de predicción microbiana son cada vez más sofisticados, y
proporcionan herramientas valiosas para la obtención de estimaciones de
probabilidad de exposición.
Un modelo completo del campo a la mesa proporciona la mayor parte de la
información relativa a la inocuidad de los alimentos en la gestión de riesgos
(Figura 6). Este tipo de evaluación permite el análisis de una amplia gama de
opciones de gestión de riesgos que podrían aplicarse en una o varias etapas que
pudieran contribuir a el resultado de un riesgo inaceptable. Algunos ejemplos
recientes de este enfoque son cuantitativos para la evaluación de los riesgos tales
como Escherichia coli O157:H7 en carne para hamburguesas, Salmonella
Enteritidis en huevo fresco (Baker et al., 1998) y huevo pasteurizado (Whiting y
Buchanan, 1997) y Listeria monocytogenes en quesos suaves hechos con leche
cruda (Bemrah et al., 1998).
Figura 2.6. Evaluación de la exposición del campo a la mesa (CMMEF, 2001)
CAMPO PROCESO COMERCIALIZACIÓN HOGAR RIESGO
PC PP PC
CC CP CC
Probabilidad de exposición
Probabilidad de infección
Prevalencia
Concentración
21
Sin embargo, la realización de una evaluación desde el campo a la mesa es
compleja y requiere gran densidad de información; en general, exige importantes
aportaciones de expertos en diversas áreas de investigación. Por lo tanto, podría
ser conveniente concentrarse en sólo una parte de la cadena alimentaria, con el
propósito de intentar entender y reducir el riesgo de exposición en ese punto de la
cadena.
2.3.3.1.4. CARACTERIZACIÓN DEL RIESGO
Ésta es la etapa concluyente en la evaluación de riesgos. La caracterización
del riesgo representa la integración de los resultados de etapas previas
(identificación del peligro, la caracterización del peligro y la evaluación de la
exposición) a fin de obtener una estimación del riesgo. Proporciona una
estimación cualitativa y cuantitativa de la probabilidad y gravedad de los efectos
adversos que podrían presentarse en una población dada, incluida la descripción
de las incertidumbres asociadas con estas estimaciones. Tales estimaciones
pueden evaluarse por comparación con datos epidemiológicos independientes que
establecen una relación entre los peligros y la prevalencia de la enfermedad
(PCCRARM, 1997).
La caracterización del riesgo reúne toda la información cualitativa o
cuantitativa de las etapas anteriores a fin de proporcionar una estimación de
riesgos con base sólida para una población dada. Dentro de esta etapa, se debe
de responder al menos a las siguientes cuestiones:
¿Cuál es la naturaleza y magnitud del riesgo?
¿Cuál es la incertidumbre acerca de la naturaleza del riesgo?
¿Qué individuos o grupos de población están en situación de riesgo?
¿Qué tan graves son los efectos adversos en la exposición al peligro?
¿Cuáles son las evidencias y que tan sólidas son?
22
La caracterización del riesgo depende de los datos y opiniones de expertos.
Es posible que el peso de la evidencia obtenida integrando los datos cualitativos y
cuantitativos sólo permita efectuar una estimación cualitativa de los riesgos
(Lammerding et al., 2001).
2.4. TÉCNICAS DE DETECCIÓN DE Salmonella EN LOS ALIMENTOS 2.4.1. DETECCIÓN POR CULTIVO
El análisis de los alimentos para Salmonella requiere de métodos distintos a
los utilizados en los laboratorios clínicos. Generalmente los microorganismos se
encuentran en números bajos en los alimentos, lo que exige el análisis de una
cantidad más grande de muestra en comparación con las que se utilizan con
materiales clínicos.
Emplear una cantidad grande de alimento directamente en un medio de
cultivo selectivo, tiende a reducir su selectividad. Aunado a esto, los
microorganismos generalmente se encuentran en una condición fisiológica de
estrés en los alimentos. Estos dos problemas son eliminados por un
preenriquecimiento de la muestra en un medio no selectivo que permite la
reanimación de microorganismos en condición de estrés (Wallace et al., 2001).
Las características de los patógenos en alimentos, como son su
generalmente baja concentración e incidencia, distribución heterogénea y
condición de estrés, requieren de un procedimiento prolongado (tres a siete días)
para la detección del patógeno. El procesar un gran número de muestras el
aislamiento de Salmonella puede resultar arduo, y consumir mucho tiempo,
equipo, material y medios de cultivo.
La identificación de Salmonella según el Manual de Bergey
(Holt et al., 1994) sigue criterios feno y genotípicos sobre un cultivo axénico
aislado en diferentes materiales. Esta definición continúa siendo el estándar de oro
23
y se ha expresado en procedimientos de identificación validados para una
diversidad de materiales ambientales y especimenes clínicos.
En los alimentos, los métodos de cultivo para la detección de bacterias
patógenas e índice se apoyan en forma casi exclusiva en los métodos de cultivo
de la AOAC y el Bacteriological Analytical Manual (BAM) (Andrews y Hammack,
1998; AOAC, 1984). El análisis es una prueba cualitativa y determina la presencia
o ausencia de Salmonella en una muestra dada. Sin embargo, mediante el análisis
de muestras idénticas en una serie de diluciones, es posible obtener una
estimación cuantitativa, es decir, un número más probable (Wallace et al., 2001).
2.4.1.2. DETECCIÓN POR PCR
Desde su desarrollo en 1983, la Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR, por sus siglas en ingles), ha llegado a ser una herramienta esencial en
biología molecular, y su empleo va en ascenso en la microbiología de alimentos
(Entis et al., 2001).
La introducción de la PCR en el diagnóstico microbiano se ha establecido
en los laboratorios de investigación como una valiosa alternativa a los métodos
tradicionales. Importantes ventajas de esta técnica son la rapidez, selectividad,
especificidad y sensibilidad (Malorny et al., 2003).
La PCR es una técnica que permite la amplificación in vitro de una
secuencia específica de ADN usando un par de oligonucleótidos (para iniciar la
replicación) que hibridiza los extremos opuestos de ambas cadenas del ADN
blanco y delimita la sección del ADN que será repetidamente copiada.
Comúnmente, se selecciona como blanco un gen de secuencia exclusiva a la
especie microbiana de interés, y con frecuencia es un gen de virulencia. Después
del PCR, el producto de amplificación (que es de tamaño definido y contiene la
secuencia de los iniciadores en sus extremos) puede ser detectado de varias
24
formas, siendo la más común, la electroforesis. La PCR puede amplificar
específicamente la secuencia del ADN blanco en una mezcla de ADN de células
asociadas al material analizado (Fratamico, 2001).
2.5 MICROBIOLOGÍA PREDICTIVA
La microbiología predictiva inició como una ciencia puramente empírica,
cuyos fundadores son probablemente Esty y Meyer. En 1922 describieron la
muerte térmica de Clostridium botulinum con un modelo logarítmico lineal, el cual
se emplea para calcular el tratamiento que debe aplicarse en el procesamiento de
productos cárnicos de baja acidez. Este modelo simplemente indica que a una
temperatura determinada la velocidad relativa de muerte de las bacterias es
constante con el tiempo (Baranyi y Roberts, 1994).
El conocimiento de la presencia de agentes patógenos en los alimentos es
el punto de partida para calcular los niveles y probabilidad de exposición de los
potenciales consumidores. Sin embargo, para evaluar el riesgo de enfermedad es
esencial conocer la cantidad actual del patógeno en el alimento al tiempo de ser
consumido. Este problema se intenta resolver a través de la microbiología
predictiva (Buchanan y Whiting, 1996).
La microbiología predictiva es una disciplina científica basada en la premisa
de que el crecimiento, sobrevivencia e inactivación de los microorganismos puede
ser cuantificado y expresado con ecuaciones matemáticas, y que bajo un conjunto
de condiciones ambientales especificas el comportamiento microbiano es
reproducible (Ross y McMeekin, 1994).
2.5.1 MODELO DE BARANYI
El modelo de Baranyi ha sido subsecuentemente citado en más de 300
artículos, y ha llegado a ser el modelo de crecimiento primario más ampliamente
25
utilizado (Baranyi y Roberts, 2004). Aunque es útil para ajustar varias curvas
(semi-sigmoideas, fase lineal precedida o seguida por fases estacionarias) el
principal paso en el modelo fue su origen dinámico. Principalmente describe las
fases de transición, tanto para la situación de crecimiento como para la de muerte
(Baranyi y Pin, 2001), de manera que puede ser también utilizado para un
ambiente fluctuante. El modelo se expresa de la siguiente manera:
Donde: x es el número de células al tiempo t, xmax es la máxima densidad
de población, q(t) representa la concentración del substrato limitante, la cual
cambia con el tiempo. El valor inicial q(0) es una medida del estado fisiológico
inicial de las células. El parámetro m representa la curvatura antes de la fase
estacionaria.
El modelo se expresa mediante una función que ajusta el estado fisiológico
de las células y la modelación de las fases de crecimiento microbiano de una
forma más continúa; además permite predecir el crecimiento bajo fluctuaciones de
temperatura (Baranyi y Roberts, 1994). Elfwing et al., (2004) validaron de manera
experimental la fase lag descrita matemáticamente en el Modelo de Baranyi, para
lo cual emplearon una cámara de flujo y un analizador automático de imágenes
para posibilitar la observación de divisiones de miles de células individuales y
derivar distribuciones estadísticas de ellas.
26
III. OBJETIVOS GENERAL
Determinar la incidencia y comportamiento de Salmonella en lechuga como
herramienta para estimar el riesgo de enfermar del consumidor.
ESPECÍFICOS 1.- Determinar la incidencia y concentración de Salmonella y E. coli en lechugas
colectadas de sitios de comercialización.
2.- Determinar el comportamiento de Salmonella en lechuga a través de un
modelo de contaminación cruzada.
.3.- Determinar la frecuencia y cantidad de lechuga consumida en diferentes
grupos de población a fin de conocer la exposición a Salmonella.
27
IV. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1 Materiales 4.1.1 Equipo Autoclave eléctrica de mesa, 121 °C (Market-Forge, Sterilimatic)
Balanza analítica digital, 120g x 0.0001g (Sartorius)
Balanza granataria, sensibilidad 0.1 g, Modelo No. CT200-S (OHAUS)
Baño María de precisión de 43 ± 0.2 °C, Modelo 251 (Precision Scientific)
Baño María de precisión de 44.5 ± 0.2 °C Modelo 251 (Precisión Scientific)
Bolsas de polietileno en rollo sin marca comercial diferentes tamaños
Bolsas de polietileno capacidad 500 ml (Whirl - Pack)
Campana de flujo laminar (Alder y Veco)
Centrifuga de mesa (Hermle)
Cuenta colonias (Québec Reichert-Jung)
Higrómetro de bulbo seco y húmedo (cole parmer instrument company)
Homogenizador (Stomacher, Seward 400)
Horno para esterilización (Shel-lab)
Incubadora de 35° (Pecision Scientific, Seward 400)
Incubadora de 22° (Pecision Scientific, Seward 400)
Lámpara de luz U.V. Modelo 56 (Blas-Ray)
Micropipetas 5-1000 μl (Labsystems)
Microscopio. ZEISS. Axiostar plus
Potenciómetro, modelo 410 (Orion)
Vortex, modelo G650 Scientific Industries Inc (Daiger Vortex Genie 2)
4.1.2 Medios de cultivo Agar sulfito bismuto (ASB), (Bioxon)
Agar xilosa lisina desoxicolato de sodio (XLD), (Bioxon)
Agar soya tripticasa (AST), (Bioxon)
Agar soya trpticasa suplementado con rifampicina (100 mg/L) (ASTR)
Agar hierro y triple azúcar (TSI), (Bioxon)
Agar hierro lisina (LIA), (Bioxon)
28
Caldo lactosado (CL), (Bioxon)
Caldo lauril sulfato mas MUG (CLF), (Bioxon)
Caldo selenito cistina (CSC), (Bioxon)
Caldo tetrationato (CTT), (Bioxon)
Caldo Rappaport Vassiliadis (CRV), (Bioxon)
4.1.3 Soluciones Diluyente de peptona 0.1% (Peptona de caseína, Bioxon) (DP)
Solución salina isotónica 0.85% (cloruro de sodio, Productos Químicos Monterrey)
4.1.4 Reactivos Antisuero polivalente A-I & Vi para Salmonella (DIFCO)
4.2 Material biológico Cepas. Se utilizaron tres serovares de Salmonella enterica: S. Agona, S.
Gaminara y S. Montevideo obtenidas de la American Type Culture Collection. Se
obtuvieron mutantes resistentes a rifampicina de los tres serovares siguiendo el
método descrito por Kaspar y Tamplin (1993). Los cultivos se mantuvieron en
tubos con agar base sangre a 4 ºC con transferencias mensuales.
Lechuga. Se obtuvo lechuga romana (Lactuca sativa C) de mercados públicos y
central de abastos de la ciudad de Querétaro.
4.3 Sitios de muestreo.
Las lechugas se colectaron de la central de abastos y dos mercados
públicos de la ciudad de Querétaro. Las hortalizas fueron colocadas en bolsas de
plástico libres de microorganismos de interés sanitario y transportadas al
laboratorio a temperatura ambiente.
29
4.4 Validación de la técnica de cultivo para la determinación de Salmonella
Para el aislamiento de Salmonella se siguió la técnica especificada en el
CMMEF (Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods)
(Andrews et al, 2001). La muestra preenriquecida se utilizó para las dos pruebas
cualitativas (cultivo y PCR), por lo que fue necesario evaluar el caldo de
preenrequecimiento para determinar el desarrollo de Salmonella a niveles
detectables con la técnica de PCR.
El enriquecimiento selectivo se realizó transfiriendo 1 ml de la muestra
preenriquecida a caldo tetrationato y caldo Rappaport-Vassiliadis incubados a
43ºC por 18 a 20 h en un baño de agua de precisión. Para el aislamiento del
patógeno se estrió una asada de cada caldo en dos medios selectivos y
diferenciales: agar xilosa lisina desoxicolato y agar sulfito bismuto.
De cada placa se seleccionaron al menos dos colonias sospechosas de
Salmonella, a las cuales se les realizaron pruebas bioquímicas para su
identificación: fermentación de lactosa y glucosa, descarboxilación de lisina,
producción de acido sulfhídrico y gas. Las cepas aisladas se confirmaron con
antisuero polivalente específico para Salmonella.
4.4.1 Evaluación del caldo de preenrequecimiento en lechuga 4.4.1.1 Preparación del inóculo
La activación de las cepas se realizó transfiriendo una asada de cada una
de las cepas a caldo soya tripticasa suplementado con rifampicina (100 ppm) y se
incubaron a 35ºC por 24 h. se realizaron dos transferencias sucesivas cada 24 h y
a las 18-20 h de incubación del ultimo cultivo, las células se cosecharon por
centrifugación a 3500 X g/ 15 min. Los paquetes celulares se lavaron dos veces
con solución salina isotónica, resuspendiéndose después en esta misma solución.
Se mezclaron volúmenes iguales de cada cepa y se prepararon diluciones
decimales en DP para obtener el nivel de inoculo deseado. El recuento de la
suspensión celular se realizo en AST suplementado con rifampicina (100 ppm)
mediante la técnica de vaciado en placa. Las placas se incubaron a 35ºC por 24 h.
30
4.4.1.2 Determinación del desarrollo de Salmonella en lechuga con 3 caldos de preenrequecimiento
Se inocularon 10 UFC de Salmonella en porciones de 25 g de lechuga.
Posteriormente se preenriquecieron con 225 ml de cada uno de los caldos: caldo
lactosado, caldo soya tripticasa y caldo infusión cerebro corazón. Se incubaron a
35ºC por 24 h y periódicamente se realizaron recuentos en ASTR mediante la
técnica de vaciado en placa.
4.5 Validación de PCR para determinación de Salmonella Se emplearon los iniciadores invA diseñados por Liu y col. (2002). La
técnica fue parcialmente validada en cultivo puro y en la lechuga. El
procedimiento general de la técnica consta de tres partes:
1.- Lisis celular. A partir de la muestra preenriquecida incubaba a 35ºC/20 h se
tomo 1 ml y se centrifugó a 4,500 X g/15 min. El botón resultante fue resuspendido
en 1 ml de agua destilada estéril y se coloco en un baño de agua a 100ºC por 20
min.
2.- PCR. La mezcla de reacción (supermix) fue preparada en un microtubo
introducido en una cama de hielo para evitar la acción exonucleasa de la Taq
polimerasa, una vez finalizada se distribuyeron 19 µl en microtubos y se agregó 1
µl de la muestra lisada. La reacción se llevo a cabo en un termociclador bajo las
siguientes condiciones: 93ºC/5 min; 30 ciclos de 93ºC/ 10 s, 42ºC/ 10 s y 72ºC/ 45
s; y una extensión final a 72ºC/ 10 min.
3.- Electroforesis. Los productos de la amplificación fueron detectados por
electroforesis en gel de agarosa 1.5%, 90 V durante 90 min. El gel se revelo en
bromuro de etidio (10mg/ml) por 20 min. Se empleo un marcador de peso
molecular de 100 pb para determinar el peso molecular de los productos de la
amplificación. La imagen del gel fue capturada con el sistema Kodak EDAS 290.
4.5.1 En cultivo puro Se determino la especificidad de los iniciadores seleccionados con 5
serovares de Salmonella entérica y 14 cepas de especies distintas de Salmonella
31
en cultivo fresco de CST (35ºC/24 h). El limite de detección se determino
realizando diluciones decimales de la suspensión de ADN obtenida de la lisis
celular de un cultivo de S. Gaminara Rif+.
4.5.2 En lechuga 4.5.2.1 Determinación del límite de detección
Se inocularon porciones de 25 g de lechuga con tres niveles de inoculo: 5,
10 y 20 UFC de Salmonella. Las unidades experimentales fueron preenriquecidas
con 225 ml de CST a 35ºC/20 h. Paralelamente se realizó la determinación por
PCR y recuento de la población final en ASTR (35ºC/24 h)
4.6 Comparación del cultivo y PCR para la determinación de Salmonella Veinte muestras de lechuga fueron inoculadas con Salmonella Rif+ y
analizadas mediante las técnicas de cultivo y PCR. Se determino la especificidad,
sensibilidad y el índice Kappa del PCR (Malorny y col., 2003). Este mismo
procedimiento fue llevado a cabo en 300 lechugas colectadas de los diferentes
sitios de comercialización y sin inocular.
4.7 Determinación del NMP de Salmonella en lechuga Se cuantifico Salmonella en muestras de lechuga positivas a PCR. La
combinación de volumen a preenriquecer fue de 20, 20, 20, 10, 1, 1, 1, 1, 0.1 y
0.01 en tubos de caldo lactosado, que permitió una sensibilidad de 0.06 a 65
NMP/g. De cada tubo se siguió el procedimiento descrito en 3.3
4.8 Determinación de E. coli
Las lechugas muestreadas fueron examinadas para la cuantificación de E.
coli mediante el procedimiento descrito por Kornacki y Jonson (2001). Se empleo
la técnica de número más probable (NMP) y los valores fueron calculados
empleando la aproximación de Thomas (Swanson y col., 2001): alícuotas de 20,
10 y 1ml, así como diluciones decimales de las muestras, fueron inoculados en
tubos con CL con campana de Dirham e incubados a 35ºC/24 h.
32
A partir de tubos con producción de gas fueron transferidas alícuotas de 40
µl a tubos con caldo lactosado fluorocult (CL-MUG, BD Difco) e incubados a
44.5ºC/48h en baño de agua de precisión. Los tubos que mostraron producción de
gas, reacción positiva de indol y fluorescencia bajo luz ultravioleta (para evidenciar
actividad de la enzima β-glucoronidasa) fueron consideraras positivas a E. coli.
4.9 Modelo de contaminación cruzada 4.9.1 Preliminares 4.9.1.1 Inoculación de la tabla de madera
El vehículo para inocular la tabla fue jugo de carne. Éste se preparo con
50g de carne de cerdo cruda y 100 ml de DP. Se homogenizó por 2 min en
Stomacher y se filtró con gasa. La tabla fue inoculada con un nivel de inóculo de 5
Log UFC/ml de Salmonella Rif+ sumergiendo una torunda en la suspensión de
jugo de carne. La torunda se deslizó horizontalmente en la superficie de la tabla
hasta cubrir el área de contaminación. Inmediatamente después de contaminar la
tabla se realizó el recuento de UFC de Salmonella en 5 áreas de 3 x 3 cm2
mediante frotación con una torunda en ASTR.
4.9.1.2 Influencia del nivel de inóculo en la recuperación de Salmonella a partir de la tabla de madera
Se inocularon tablas de madera de la manera descrita previamente con tres
niveles de Salmonella: 3.5, 4.5 y 5.5 Log UFC/ml. Para determinar el número de
UFC de Salmonella recuperadas se frotó mediante una torunda 3 áreas de 3 x 3
cm2. El recuento se realizó en ASTR.
4.9.1.3 Determinación de la variabilidad de contaminación de la lechuga por medio de la tabla.
Se inocularon dos tablas de madera con el nivel de inóculo que presento
mayor recuperación de UFC de Salmonella. En cada una de las tablas se
colocaron 100 g de lechuga y se mezclaron de tal manera que la mayor parte de la
lechuga estuviera en contacto con la superficie de la tabla. Este paso se repitió
33
hasta completar 400 g. Finalmente las dos porciones de 400g se mezclaron en un
recipiente y se tomaron 10 porciones de 10g y 10 porciones de 1g para su
recuento en ASTR.
4.9.2 Dinámica de Salmonella en lechuga Se tomaron porciones de 10g de lechuga contaminada como se indicó
anteriormente. Se almacenaron a distintas temperaturas (30, 22 y 4º C) y en dos
diferentes condiciones: sumergida y no sumergida en agua. Periódicamente se
realizaron recuentos en ASTR.
4.10 Estimación del patrón de consumo de lechuga Se realizaron 600 entrevistas a diferentes grupos de población para conocer
con qué frecuencia y qué cantidad de lechuga consumen.
4.11 Análisis estadísticos Se efectuó un análisis de varianza para los valores de velocidad de
desarrollo (µ) resultantes de las diferentes combinaciones de almacenamiento. La
significancia de la diferencia entre las medias de los tratamientos se determino
mediante la prueba de Tukey (Montgomery, 1991) usando el programa JMP 5.1
34
Encuesta sobre el consumo de lechuga 1.- ¿Con que frecuencia consume lechuga? a) nunca b)1 a 2 veces a la semana c) 2 a 3 veces a la semana d) 1 vez al mes 2.- ¿Donde consume la lechuga? a) hogar b) fuera del hogar c) ambos 3.- ¿Cual es el tamaño aproximado de porción consumida? a) menos de 10g b) de 10 a 25 g c) mas de 25 g
4.- ¿Lava o lava/desinfecta la lechuga? a) lavar b) lavar y desinfectar c) ninguno 5.- ¿Cuantas veces al año padece usted de diarrea? a) ninguna b) 1 a 2 veces c) 3 a 6 veces d) mas de 6 veces 6.- Grupo de población en la que se encuentra: a) menor de 6 años b) 6 a 12 años c) 13 a 24 años d) 25 a 64 años e) mayor de 64 años
Figura 4.1 Formato de la encuesta sobre el consumo de lechuga
35
V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5.1 Sitios de muestreo
La lechuga fue monitoreada en mercados públicos y en la central de abastos de
la ciudad de Querétaro. Se realizaron 20 muestreos a lo largo del año, cubriendo de
esta manera dos épocas del año (fría y cálida). Las muestras se colectaron en la
central de abastos de camiones, de establecimientos cerrados e incluso del suelo sobre
pliegos de plástico. En todos los casos, esta hortaliza presentaba suciedad visible, y
ocasionalmente insectos. En los mercados públicos, la lechuga fue adquirida en
establecimientos en donde el producto es manipulado por los comerciantes que
remueven las hojas externas no comestibles, y en la mayoría de los casos el tallo.
Ocasionalmente las lechugas eran muy pequeñas por remoción excesiva de las hojas
externas.
5.2 Validación de la técnica de cultivo para la determinación de Salmonella 5.2.1 Evaluación del caldo de preenrequecimiento en lechuga
Existen varias razones por las cuales es necesario el preenrequecimiento
en la investigación de patógenos en los alimentos. Una de ellas es restaurar a las
células estresadas y otra es permitir el desarrollo de estos microorganismos a
niveles detectables a partir de números iniciales muy bajos.
El Bacteriologycal Analytical Manual (1995) y el Compendium of Methods
for the Microbiological Examination of Foods (2001) recomiendan el caldo
lactosado (CL) para el preenrequecimiento (PE) de Salmonella en frutas y
hortalizas. Sin embargo, como se indicó en la metodología, en este trabajo el PE
se empleo para la detección del patógeno por el método de cultivo tradicional y por
medio del PCR. Por lo tanto se efectuó el estudio de la cinética de crecimiento de
Salmonella en lechuga con tres caldos de PE (BHI, CST y CL), para seleccionar
el que permitiera el desarrollo del patógeno en el menor tiempo, facilitando así la
aplicación de la técnica de PCR. Con los caldos BHI y CST la máxima población
alcanzada después de 24 horas de incubación fue de 7.7 y 7.6 Log UFC/ml,
respectivamente (Figura 5.1). Con el CL el máximo nivel alcanzado fue de 5.9 Log
UFC/ml. Sin embargo, cuando los estudios se llevaron a cabo en cultivo puro
36
(Figura 5.2), no se encontró diferencia significativa (P > 0.05) en el desarrollo del
patógeno con los tres medios de cultivo.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Log
UFC
/g CST
BHI
CL
Figura 5.1 Cinética de Salmonella en lechuga con tres caldos de preenrequecimiento
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Log
UFC
/g CST
BHI
CL
Figura 5.2 Cinética de Salmonella en cultivo puro con tres caldos de
preenrequecimiento
37
5.3 Validación de PCR para la detección de Salmonella en cultivo puro 5.3.1 Especificidad y sensibilidad de los iniciadores para la detección de Salmonella (invA)
Para la validación de la técnica de PCR en cultivo puro se determinó la
especificidad de los iniciadores de Salmonella. Se emplearon cultivos puros de
S. Agona, S. Gaminara, S. Typhimurium, S. Montevideo, S. Thompson y 14 cepas
de otras 11 especies. Todas las cepas de Salmonella presentaron una banda
cercana a 400 pb (Figura 5.3, carril 16 al 20). En el caso de las cepas de géneros
distintos a Salmonella no hubo ninguna amplificación con los iniciadores
empleados (Figura 5.3, carril 2 al 15). La identificación de Salmonella en la
lechuga (siguiendo el protocolo de PCR) requiere de preenriquecimiento de la
muestra; esto implica que el microorganismo de interés (en casos positivos)
encuentre oportunidad para su desarrollo. Si los iniciadores no son los adecuados
pueden generarse amplificaciones inespecíficas.
Figura 5.3 Especificidad de los iniciadores invA para detectar Salmonella en cultivo
puro.
Adicionalmente, la sensibilidad de la técnica de PCR se determinó
utilizando diluciones para obtener desde 9 hasta 3 log UFC/ml del ADN de
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
38
Salmonella Gaminara Rif +. De esta manera la técnica puede detectar Salmonella
desde 4 log UFC/ml, tal como se observa en la Figura 5.4.
Figura 5.4 Sensibilidad de técnica de PCR para la detección de Salmonella en cultivo puro. 5.3.2 Validación de la técnica de PCR para la detección de Salmonella en lechuga
Siguiendo la técnica descrita en la metodología se efectuó su verificación
inoculando tres niveles (5, 10 y 15 UFC/25 g) de Salmonella en 225 ml de CST. El
producto de amplificación de PCR se presentó con los tres niveles de inóculo y la
máxima población alcanzada en los tres casos fue de 6 log UFC/ ml (Figura 5.5).
A B 103 104 105 106 107 108 109
39
15 10 5 UFC/25 g 6 6 6 log UFC/ ml
Figura 5.5 Sensibilidad de iniciadores invA en lechuga.
Se determinó el tiempo mínimo para que el cultivo alcance 6 log/ ml
requeridos en la detección del patógeno por la técnica de PCR y de esta manera,
optimizar el tiempo del preenrequecimiento. Los resultados muestran que
Salmonella alcanza esta población a las 20 horas de incubación (Figura 5.6).
0
1
23
4
5
6
78
9
10
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (h)
Log
UFC
/ml
Salmonella
BMAs
Figura 5.6 Cinética de Salmonella y BMAs en CST a 35 ºC.
40
5.4 Incidencia de Salmonella y E. coli en lechuga Diversos estudios se han reportado con el fin de conocer la incidencia de
patógenos en las frutas y hortalizas (Satchell et al.,1990; Houang et al.,1991;
Castillo et al., 2004; Johnston et al., 2005). Todos ellos coinciden en el bajo
porcentaje detectado. Pese a estos resultados, las frutas y hortalizas en las
últimas décadas, son los alimentos que más enfermedades causan en E.E.U.U.,
colocándose por arriba del pollo, res y mariscos, tal como mostró el estudio de la
CSPI (2007). De ahí el interés por conocer la incidencia de Salmonella en lechuga,
una hortaliza de uso común en la comida mexicana, siendo Querétaro un estado
importante como productor lechuga en nuestro país.
Se analizó un total de 647 muestras, 421 adquiridas de la Central de
Abastos y el resto en dos mercados públicos. Salmonella se encontró en solo
0.6 % de las muestras, todas provenientes de la central de abastos (Tabla 5.1). La
baja incidencia sugiere que las condiciones y lineamientos para su cultivo,
cosecha y transporte de esta hortaliza son aceptables. Debe aclararse que la
porción de lechuga analizada (50 g), fue retirada de la parte externa, es decir, de
las hojas que se encuentran expuestas a una mayor contaminación. Un estudio
similar en hojas extraídas en diferentes niveles de la lechuga ya ha sido realizado
previamente en nuestro laboratorio. Se demostró entonces, que la población de
BMA del nivel superior es estadísticamente diferente al nivel más interno de la
lechuga, disminuyendo de 6 hasta 4 log UFC/g (Ruiz, 2007). En nuestro caso, el
analizar las hojas externas representaría el escenario del peor de los casos.
Dentro del mismo estudio de Ruiz (2007), el patógeno no se detectó en 37
muestras de lechuga colectadas en el campo.
41
Tabla 5.1 Positividad de Salmonella en lechuga de tres sitios de comercialización
Sitio N* n* % Central de Abastos 421 4 0.9 Mercado 1 126 0 0 Mercado 2 100 0 0
Total 647 4 0.6
*N= muestras analizadas; *n= muestras positivas
Por otra parte, la presencia de E. coli se detectó en 14.9% de 368 muestras
(Tabla 5.2). Los mayores porcentajes de positividad se obtuvieron en unidades
colectadas de mercados públicos. Es posible que las hortalizas en este punto del
comercio se encontraran mas expuestas a la contaminación. A diferencia de la
central de abastos, en estos lugares las lechugas eran despojadas de las primeras
hojas, es decir, aquellas que presentaban tierra visible y que generalmente no son
consumidas. Así el comerciante estaría transfiriendo la contaminación de esas
hojas externas a las que visiblemente se encuentran limpias; y que finalmente
fueron las utilizadas para el análisis tanto de E. coli como de Salmonella.
Tabla 5.2 Positividad de E. coli en lechuga de tres sitios de comercialización
Sitio N* n* % Central de Abastos 264 38 1.4 Mercado 1 65 10 1.5 Mercado 2 39 7 18
Total 368 55 14.9 N= Muestras analizadas; n= muestras positivas
42
La cuantificación de coliformes, Enterobacteriaceae, y E. coli en los
alimentos pretende conocer acerca de los antecedentes de las condiciones
higiénicas prevalentes durante la elaboración de los alimentos (Kornacki y
Johnson, 2001). E. coli es considerado como el indicador más confiable de
contaminación fecal en los alimentos (Cox et al., 1988).
Se puede inferir entonces que la presencia de E. coli en estas muestras de
lechuga resulta de una deficiente condición en la higiene de los establecimientos,
incluido el mal manejo del personal. No se descarta en tales condiciones la
contaminación por materia fecal. Hay que destacar que la lechuga en estos puntos
de venta (central de abastos y mercados públicos), no dispone de alguna barrera
de protección, a diferencia de lo que ocurre en los supermercados, donde con
frecuencia se exhiben envueltas individualmente en bolsas de plástico.
En general, la incidencia de E. coli en este estudio fue baja para la central
de abastos y el mercado público 1 (1.4 y 1.5 %, respectivamente). Estos
resultados son próximos a los reportados en España donde se encontró E. coli en
el 3.4 % de muestras de lechuga (Abadias, et al., 2007).
5.5 Contenido de Salmonella y E. coli en lechuga Conocer el número de células de patógenos en los alimentos, sobre todo en
aquellos que se consumen crudos, resulta relevante en la estimación del riesgo de
enfermar al tiempo del consumo.
A fin de poder estimar el nivel de exposición a Salmonella asociada al
consumo de lechuga, se cuantificó su concentración en las muestras positivas
detectadas por PCR. La cuantificación de un patógeno en un producto que se
espera discretamente contaminado, como es el caso de la lechuga requiere de
una técnica de alta sensibilidad como es la de NMP. Típicamente se inoculan
diluciones decrecientes de la muestra en tubos en los que individualmente deberá
43
detectarse la presencia del patógeno o el germen de interés. A mayor abundancia
del microorganismo mayor es el número de tubos positivos inoculados con los
menores niveles de muestra. Alternativamente se recurre a una formula que ofrece
resultados muy próximos a la del NMP por dilución en tubo. Para conseguir la
mayor confiabilidad en el resultado, en cualquier caso es fundamental seleccionar
el número de tubos inoculados o en el caso de la formula la cantidad de muestra
inoculada en los tubos seleccionados. Se trata de evitar que los resultados sean
indeterminados cuando todos los tubos resulten positivos o negativos. Utilizando el
procedimiento de la formula seleccionamos cantidades de muestra en los
diferentes tubos que condujeran a la detección de 0.06 o más, hasta 66 o menos
salmonelas por gramo. Cuatro muestras resultaron positivas a Salmonella, de las
cuales tres mostrarón valores menores a 0.06 NMP/g y solo una (28 NMP/g) se
encontraba dentro de los límites de detección que impusimos al seleccionar el
número de tubos inoculados (Tabla 5.3). De esta manera se obtiene una media de
7 salmonelas/g. Contenido relativamente elevado si se considera que: 1) la
lechuga puede no recibir un tratamiento efectivo de desinfección, 2) que una
persona puede consumir más de un gramo en una ocasión y 3) la dosis mínima
infectante llega a ser 10 células de Salmonella (D´Aoust et al., 1985).
Existen escasos estudios de cuantificación de patógenos en frutas y
hortalizas. La mayoría se enfoca a determinar su presencia o ausencia. Sin
embargo, con esa información es posible tan solo especular acerca del riesgo a la
salud que existe al consumir el alimento, es decir, que si una muestra resulta
positiva a Salmonella, esta puede ser positiva lo mismo con una célula que con
cien, y el riesgo de enfermar por supuesto será mayor con la segunda cifra. En un
estudio realizado en E.E.U.U, se encontró que el nivel promedio de Salmonella en
un brote de salmonelosis fue de 1.3 NMP/ 100g en almendras (Danyluk et al.,
2006).
44
Tabla 5.3 Contenido de Salmonella en lechuga de tres sitios de comercialización
Sitio N n
Central de Mínimo < 0.06 Abastos 421 4 Mediana < 0.06 Máximo 28 Mercado 1 126 0 ND Mercado 2 100 0 ND
N= muestras analizadas; n= muestras positivas
ND= no determinado
La técnica que hemos utilizado para la detección de E. coli ofrece algunas
ventajas. A partir de la muestra preenriquecida en caldo lactosado, y
posteriormente en diluciones decimales sobre caldo florocult, es posible disponer
de información sobre el contenido de células de E. coli (NMP/g o ml) en el
alimento, sin necesidad de aislar la bacteria. Los límites de detección que
seleccionamos fueron de 0.2 a 70 NMP/g. Se observaron niveles discretos de E.
coli en los tres sitios de comercialización estudiados con una mediana de 4 y
limites de 0.2 a 9 NMP/g. Solamente en el caso de la central de abastos se
obtuvo una población elevada en una muestra de lechuga (62 NMP/g), lo cual
sugiere una contaminación masiva puntual (Tabla 5.4).
En el estudio previo de Ruiz (2007), los valores de E. coli en 37 muestras
de lechuga durante su cultivo, se encontraron por debajo del limite de detección
(<3 NMP/g). En E.E.U.U., Valentín-Bon (2007) reportó que de 39 muestras de
lechuga, 9 resultaron positivas para E. coli con niveles de 3 a 9.2 NMP/g.
45
Tabla 5.4 Contenido de E. coli en lechuga de tres sitios de comercialización
Sitio N n Medida NMP/g
Central de Mínimo 0.2 Abastos 264 38 Mediana 4 Máximo 62 Mínimo 1 Mediana 4 Mercado 1 65 10 Máximo 9 Mínimo 3 Mediana 4 Mercado 2 39 7 Máximo 9
5.6 Asociación entre la detección de Salmonella y E. coli Idealmente, microorganismos índice como E .coli, mostrarían en el alimento
la eventualidad de la presencia concurrente de un patógeno intestinal como
Salmonella. Esta pretención generalmente no existe, y es posible estar ante
muestras de alimento en los que se demuestra la presencia de E. coli y no de
Salmonella (Miskimin, et al., 1976; Silliker y Gabis, 1976; Solberg, et al., 1977); la
situación contraria también es observable: detección de Salmonella en ausencia
de E. coli. En cualquier caso el empleo de E. coli sugiere, como no lo encontramos
en otros microorganismos índice, la presencia de materia fecal en el material
analizado (Brodsky, 1995).
En nuestros estudio, el hallazgo de E. coli estuvo correlacionado en tres de
las cuatro muestras positivas a Salmonella (Tabla 5.5), de manera que, 86% de
los resultados fueron coherentes (considerando ambos negativos o ambos
positivos). No obstante, estas muestras no son representativas para afirmar que E.
coli es un adecuado indicador de Salmonella.
46
El problema central no consiste en detectar E. coli en ausencia de
Salmonella, lo cual constituye una situación práctica nada extraña, sino el hallazgo
del patógeno en ausencia del indicador.
Tabla 5.5. Asociación entre la detección de Salmonella y de E. coli en lechuga
* Número de muestras analizadas 5.7 Incidencia de Salmonella y E. coli en función de la época del año
El muestreo de la lechuga se llevó a cabo entre octubre de 2007 y junio de
2008, lo cual nos permitió valorar la incidencia de estos microorganismos en dos
temporadas del año. Los porcentajes de positividad para E. coli fueron de 1.4 y
25.3 para la temporada fría y cálida, respectivamente, mientras que para
Salmonella fueron de 0 y 1.9 % (Figura 5.7). Entre los valores para cada
microorganismo se observa una diferencia significativa (p< 0.05), lo cual refleja
(como era de esperar) que el aumento de la temperatura ambiental influye
positivamente en la sobrevivencia de los microorganismos. Resultados similares
reportaron en diferentes grupos de hortalizas Ruiz (2007) y García-Villanova
(1987).
Salmonella / E. coli
N* +/+ +/- -/+ -/- 368 3 1 52 312
% de frecuencia 0.8 0.3 14 85
47
Figura 5.7 Salmonella y E. coli en muestras de lechuga durante dos épocas del año.
48
5.8 Comportamiento de Salmonella en lechuga a través de un modelo de contaminación cruzada
La seguridad alimentaria sigue siendo una preocupación de los
consumidores y punto de atención para la industria alimentaria y organismos
reguladores, según el consejo internacional de información alimentaria (Brewer y
Rojas, 2007). Datos de numerosos estudios provenientes de diferentes ciudades
de E.E.U.U. muestran la presentación de brotes que se originan en los hogares
(Knabel, 1995; Scott, 1996; Beumer et al., 1998; Mead et al., 1999). Una
manipulación inapropiada de los alimentos en los hogares, deficientes practicas de
preparación y consumo (FSAI, 1998; Bryan, 1988; Gorman et al., 2002), prácticas
de higiene inadecuadas, tales como el mal lavado de manos (Cogan et al., 2001),
uso de utensilios mal higienizados (Altekruse et al., 1995; Knabel, 1995; Beumer y
Giffel, 1999), consumo de comida cruda o insegura (CAST, 1994; Redmond y
Griffiths, 2003), así como contaminaciones cruzadas a través de superficies
manipuladas con alimentos crudos (Roberts, 1982; Ryan et al., 1996), son algunos
factores y prácticas que han estado implicadas en brotes por alimentos
preparados en los hogares.
El conocimiento de la presencia de agentes patógenos en los alimentos es
el punto de partida para evaluar los niveles y probabilidad de exposición de los
potenciales consumidores. Sin embargo, para evaluar el riesgo de enfermedad es
esencial conocer la cantidad actual del patógeno en el alimento al tiempo de ser
consumido. Por lo tanto, el propósito de este estudio consistió en reproducir una
práctica cotidiana que ocurre en las cocinas de hogares y restaurantes, que
permitirá estimar el grado de exposición a Salmonella entre los consumidores. El
escenario se inicia con la carne cruda de cerdo contaminada con Salmonella,
condición que no es extraña en este tipo de carne. Se ha reportado una incidencia
de 3.3% en Irlanda (Prendergast et al., 2008), 4.9% en Italia (Busani et al., 2005),
9.6% en E.U. (Duffy et al., 2001), 1.7% en Taiwan (Kuang-Sheng et al., 2005),
93.3% en Brasil (Borowsky, et al., 2007), 73.3% en Alemania (Sinell, et al., 1990) y
91.8% en México (Escartín, 1995). Ya en el sitio de preparación del alimento la
49
carne es manipulada en una tabla de madera, se retira y se corta la lechuga en
esta misma tabla sin ningún tratamiento de lavado o desinfección previo. En
algunos casos, la lechuga se conserva sumergida en agua. Así permanece
durante toda la jornada del servicio de alimentos en una fonda o restaurantes.
Dentro de este mismo escenario, la lechuga puede almacenarse en refrigeración
(en el mejor de los casos), o bien a temperatura ambiente. Se puede llegar al
abuso de temperatura si el recipiente que contiene la lechuga se encuentra cerca
de las parrillas o estufas. La evaluación del peligro implicado requiere de un
modelo en el que se siga el comportamiento de la Salmonella desde la carne
hasta la hortaliza.
5.8.1 Estudios preliminares
La primera etapa en este estudio consistió en definir una metodología
confiable para determinar el comportamiento de Salmonella dentro este modelo.
Se evaluaron diversos factores a fin de lograr reproducir estos resultados en el
experimento definitivo. El primer factor a evaluar se refiere a la forma de
inoculación del patógeno a la tabla de madera. Se sumergió una torunda de gasa
en el jugo de carne inoculado con 5 Log UFC/ml de una mezcla de Salmonella
Rif+ (4.8.1.2) y se extendió horizontalmente hasta cubrir el área de contaminación
(15 x 20 cm2). Inmediatamente después, se frotaron cinco cuadros de 3 x 3 cm2
por medio de torundas, las cuales se colocaron en 5 ml de DP para el recuento de
Salmonella. Este estudio se realizó por duplicado simultáneamente.
En la Figura 5.8 se muestra la media en Log UFC/ml de Salmonella de los
cinco recuadros muestreados en cada una de las tablas. Se observó una ligera
diferencia en la recuperación de la salmonela (3.4 y 3.2 log UFC/ 9 cm2) entre las
tablas, aunque no significativa (p<0.05). En consecuencia, la forma de inocular
descrita para la tabla quedó establecida para los ensayos subsecuentes.
50
Tabla 1
Tabla 1 Tabla 2
Figura 5.8 Recuperación de Salmonella en tablas de madera.
Se ha demostrado que la penetración y capacidad de absorción de un
material que se inocula con un microorganismo influye en los recuentos
bacterianos (Schönwälder et al., 2002). Las fibras de madera poseen propiedades
capilares, y la penetración de un inóculo líquido arrastra las células bacterianas al
interior de la estructura de madera, facilitando así la adhesión a la matriz de la
madera (Abrishami et al., 1994; Boucher et al., 1998) Diversos autores sugieren
que la absorción de la suspensión del medio al momento de tener contacto con la
superficie conduce a la desecación del ambiente celular, el cual juega un papel
importante en la reducción de la viabilidad de las células, particularmente en las
superficies porosas (De Cesare et al., 2003; Kusumaningrum et al., 2003; Moore et
al., 2003). Por otra parte, se ha planteado que la presencia de sustancias
antimicrobianas de la madera afecta los niveles de la población viable del
microorganismo (Ak et al., 1994; Schönwälder et al., 2002). Así mismo, se ha
demostrado que mientras más largo sea el tiempo de contacto con la superficie,
un número menor de microorganismos será recuperado (Moore et al., 2007).
0
1
2
3
4
5 log/ml 5 log/ml
Log
UFC
/9cm
A A
51
5.8.1.1 Efecto del nivel de inóculo en la recuperación de Salmonella en las tablas de madera
Se consideró de interés evaluar este factor, ya que constituye de hecho la
fuente única de contaminación de la Salmonella a la lechuga. Se utilizaron niveles
bajo, medio y alto (3.5, 4.5 y 5.5 log UFC/ml) en el jugo de carne. La tabla se
inoculó en la forma descrita y se recuperaron las células de Salmonella como se
mencionó en 4.8.1.2 y 4.8.1.3. Para cada nivel de inóculo en la Figura 5.9 la
primera barra representa la población inicial de bacterias depositadas en la tabla.
El porcentaje de recuperación de las salmonelas fue de 29, 56 y 76% para
los niveles bajo, medio y alto respectivamente, que representan la media de los
cinco recuadros muestreados en cada tabla, considerando la mayor consistencia
una menor dispersión de los valores. Debido a esto, se decidió utilizar el inóculo
alto para el experimento final. Este estudio adquiere mayor consistencia ante
niveles más altos de recuperación con la menor varianza.
0
1
2
3
4
5
6
Bajo Medio Alto
Nivel de inóculo
Log
UFC
/g
Nivel inoculado en la tabla Población recuperada
Figura 5.9 Influencia del nivel de inóculo en la recuperación de Salmonella en tabla de madera
29% 56%
76%
52
5.8.1.2 Contaminación de la lechuga
Una vez establecidas la forma y nivel de inóculo en la tabla, la siguiente
etapa consistió en determinar la homogeneidad de la contaminación de la lechuga
por exposición a la tabla contaminada. Se emplearon 800 g de la hortaliza
manipuladas para su contaminación en dos tablas. En consecuencia, se consideró
conveniente colocar 100 g (máxima cantidad que se podía manejar en la tabla) y
se frotó sobre la superficie aproximadamente 30 segundos, se retiró y se repitió
esta operación hasta completar la contaminación de 400 g en cada una de las dos
tablas. El nivel de inóculo en el jugo de carne fue de 7 log UFC/ ml. Después de
contaminar 800 g de la hortaliza se mezclaron en un recipiente las ocho porciones
de 100 g. A partir de esta mezcla se retiraron porciones de 10 g para el recuento
de Salmonella. Los resultados mostraron que la lechuga quedó contaminada con
un nivel medio de 4.2 log UFC/g y con un máximo y mínimo de 4.12 y 4.29 log
UFC/g respectivamente (Tabla 5.6). Entre estas 10 porciones no se observó una
diferencia significativa (p<0.05), lo que significa que la metodología propuesta para
la contaminación de la lechuga es homogénea y el nivel de salmonelas por gramo
resulta muy apropiado para iniciar el estudio de su comportamiento.
53
Tabla 5.6 Recuentos de Salmonella en lechuga contaminada a partir de la tabla de madera.
5.8.2 Comportamiento de Salmonella en lechuga sumergida y no sumergida en agua
Las oportunidades de contaminación cruzada durante la preparación de
alimentos en las cocinas son muy amplias, siendo un factor principal como
determinante de la presencia de microorganismos patógenos en los alimentos que
se preparan en el hogar y restaurantes (Fernández, 2001). Sin embargo, y a pesar
de que la contaminación en sí ya es un hecho indeseable, el peligro se incrementa
si el patógeno es capaz de sobrevivir y desarrollar en el alimento prevalente. En
consecuencia el objetivo de este estudio consistió en determinar el
comportamiento de Salmonella en función de los factores ambientales. La lechuga contaminada se almacenó como se indicó anteriormente;
encontrándose sumergida o no en agua tanto a 30 como a 22 y 4 ºC. El tiempo de
almacenamiento se definió en función del eventual deterioro de la lechuga. A
30 ºC la hortaliza conservó sus características organolépticas durante un tiempo
Réplica Log UFC/g
A 4.19ª*
B 4.25ª
C 4.29ª
D 4.21ª
E 4.28ª
F 4.12ª
G 4.18ª
H 4.19ª
I 4.16ª
J 4.22ª
*Letras iguales indican que no existe diferencia significativa.
54
menor que a las otras dos temperaturas. La mejor condición de almacenamiento
se observó a las 24 h a T de 4 ºC.
Los datos obtenidos se ajustaron usando el programa DMFit. Este
programa tiene como base el modelo primario de Baranyi (Baranyi y Roberts,
1994). Mediante este modelo se obtuvieron los parámetros de crecimiento:
velocidad de desarrollo (μ) y máxima población alcanzada. En general el ajuste del
modelo para la lechuga sumergida (Fig. 5.10) y sin sumergir (Fig. 5.11) fue bueno,
ya que el error estándar del ajuste fue de 0.158.
A 4 ºC no se observó desarrollo del patógeno. Este hecho ya se ha
demostrado en diversos estudios, en alimentos como huevo (Clay y Board, 1993),
productos cárnicos (Goepfert y Chung, 1970) y queso (Tucker et al., 1946); en
donde se consigna que a temperaturas inferiores a 6 ºC la salmonela tan solo
sobrevive. Incluso en un estudio en fresas congeladas se demostró que diversos
serovares de Salmonella, incluyendo Typhi, sobrevivieron hasta por 14 meses a -
18 ºC (McCleskey y Cristopher, 1941).
Por otro lado, a 22 y 30 ºC la Salmonella incrementó su población hasta
cerca de 1.5 y 3 log UFC/g respectivamente. Estos resultados coinciden con los
reportados por Koseki e Ikobe (2005), quienes empleando el modelo de Baranyi
estudiaron el comportamiento de Salmonella y E. coli O157:H7 en lechuga. Así,
las curvas de crecimiento mostraron que Salmonella puede llegar a desarrollar
hasta 2.5 log UFC/g en 20 horas a 25 ºC. En otro estudio realizado en col
almacenada a 20 ºC se observó que S. Hadar incrementó su población hasta en
2.5 log UFC/g en 24 h. (Piagentini, 1997). Existen además otras investigaciones
donde se reporta un comportamiento similar de Salmonella en diversas frutas y
hortalizas, tales como: mango (Branquinho et al., 2006), jitomate (Asplund y
Nurmi, 1991), papaya, sandia y jícama (Fernández et al., 1989).
55
Figura 5.10 Comportamiento de Salmonella en lechuga picada sumergida en agua y almacenada a diferentes temperaturas. Las marcas azules representan los datos obtenidos y la línea roja el ajuste del modelo de Baranyi.
SGG_LH_22_2(22, soaked i)
0
2
4
6
8
0 5 10 15 20 25
SGG_LH_30_2(30, soaked i)
0
2
4
6
8
0 5 10 15 20 25
SGG_LH_4_1(4, soaked i)
0
2
4
6
8
0 5 10 15 20 25
4 ºC 22 ºC
30 ºC
Tiempo (h)
56
Figura 5.11 Comportamiento de Salmonella en lechuga picada sin sumergir en agua y almacenada a diferentes temperaturas. Las marcas azules representan los datos obtenidos y la línea roja el ajuste del modelo de Baranyi.
La µ es uno de los parámetros de crecimiento más importantes que
describen el comportamiento de un microorganismo en un ambiente determinado
y su cálculo es un elemento importante para poder hacer una estimación objetiva
del riesgo. Algunos de los factores que afectan este parámetro son la temperatura,
la humedad relativa y la disponibilidad de nutrientes, entre otros. Con el propósito
de comparar el efecto de la temperatura y del tipo de almacenamiento empleado
se efectúo el análisis de varianza de las velocidades de desarrollo obtenidas. La
SGG_LS_4_1(4, no soake)
0
2
4
6
8
0 5 10 15 20 25
4 ºC B D SGG_LS_22_2(22, no soake)
0
2
4
6
8
0 5 10 15 20 25
SGG_LS_30_3(30, no soake)
0
2
4
6
8
0 5 10 15 20 25
30 ºC
Tiempo (h)
22 ºC
57
temperatura resulto ser el factor determinante en el desarrollo del microorganismo
(p < 0.05), mientras que mantener la lechuga sumergida o no en agua no fue
trascendente (p > 0.05) (Tabla 5.7). El desarrollo de Salmonella en lechuga picada
indica que este alimento es un buen substrato, ya que posee un alto contenido de
agua (Aa de 0.97) y nutrientes disponibles. Sin embargo es importante mencionar
que el jugo de carne que se utilizó como vehículo de los microorganismos también
puede ser una fuente de nutrientes.
Tabla 5.7. Valores de F y significancia estadística en el análisis de varianza para la variable “velocidad de desarrollo” de los factores de estudio y su interacción
Factor F* Valor de P Inmersión (a) Temperatura (b) Interacción a x b
0.2121
34.89 2.74
0.653 0.0001* 0.104
1 Media de 3 replicas * Valores menores a 0.05 indican diferencia significativa
Se efectúo la comparación de las medias (Tabla 5.8) de las velocidades de
desarrollo obtenidas para las diferentes temperaturas y tipo de almacenamiento
(sumergida y sin sumergir en agua) mediante la prueba de Tukey. De forma
esperada, la µ de Salmonella aumenta conforme se incrementa la temperatura de
almacenamiento. La velocidad máxima observada correspondió a la lechuga no
sumergida en agua y almacenada a 30 ºC. A excepción de la temperatura de 4 ºC,
las µ para 22 y 30 ºC en lechuga no sumergida en agua fueron ligeramente
mayores que para las sumergidas. Esto podría deberse a que los nutrientes que
se encuentran en el jugo de carne que se utilizó como vehiculo de las bacterias se
diluyen en el agua de inmersión de la lechuga. Otro factor que pudo haber
afectado los niveles del patógeno es la técnica de recuento, ya que la
recuperación de Salmonella únicamente se realizó en la hortaliza y no en el agua
de inmersión, dando como resultado ese ligero decremento en las poblaciones.
58
Tabla 5.8 Velocidad de desarrollo de Salmonella en lechuga picada sumergida y sin sumergir en agua y almacenada a 4, 22 y 30 ºC Tipo de almacenamiento Temperatura
(ºC) µ1
(Log UFC/ h) Sumergida en agua
No sumergida en agua
4
22
30
4
22
30
0.04622 d
0.2112 c
0.3065 b
0.0023 d
0.3115 b
0.4480 a
1 µ= velocidad de desarrollo 2 Media de tres réplicas. Valores seguidos de letras diferentes son estadísticamente significativos.
El comportamiento de S. enterica en otros productos ha sido reportado por
algunos investigadores. Nutt et al. (2003), evaluaron la capacidad de desarrollo de
una cepa de S. Typhimurium inoculada en extractos de vegetales frescos
incubados a 37 ºC. Las velocidades de desarrollo más altas se observaron en
extractos de chile jalapeño, seguido de los extractos de brócoli, lechuga, jitomate y
pimiento. La capacidad de S. Typhimurium para desarrollar en extractos de
pimiento y brócoli es consistente con otros estudios donde se ha demostrado que
E. coli O157:H7 sobrevive en pimiento y brócoli picados (Richert et al., 2000).
El desarrollo de bacterias patógenas como E. coli O157:H7, Salmonella spp
y L. monocytogenes en trozos de lechuga iceberg fue evaluado por Koseki e Isobe
(2005). En uno de los experimentos que realizaron se estudio el comportamiento
de los patógenos a temperatura constante de 5 a 25 ºC, obteniendo los
parámetros de desarrollo (fase lag, µ y máxima población alcanzada) mediante el
modelo primario de Baranyi; la µ observada fue de 0.5037 log UFC/h para trozos
de lechuga almacenados a 25 ºC.
59
Las μ para Salmonella en lechuga que se obtuvieron en nuestro estudio son
inferiores a la reportada por Koseki e Isobe (2005). Esta diferencia podría deberse
en parte a las cepas de Salmonella utilizadas en los estudios, al tipo de flora nativa
de la lechuga y a la flora microbiana presente en el jugo de carne (vehículo
utilizado en nuestro estudio). Está demostrado que el número y tipo de
microorganismos puede retrasar y/o limitar el desarrollo de microorganismo
patógenos (Fernández, 2001).
Estos comportamientos ponen de manifiesto los riesgos en los que se
puede incurrir con las frutas y hortalizas en condiciones que propicien una
contaminación cruzada al preparar los alimentos, o directamente por el manejador
de alimentos portador del patógeno.
5.9 Estimación del patrón de consumo de lechuga
El patrón de consumo de un alimento es necesario para estimar el nivel de
exposición a un patógeno contaminante. Por ejemplo, en E.E.U.U. se determinó la
exposición y el riesgo de enfermar por S. Enteriditis por consumo de huevo. La
estimación se realizó sobre la base de que una persona consume 190 huevos al
año y de que se registran 30 brotes asociados al consumo de huevo debidos a S.
Enteritidis. Se concluyó que en ese país ocurre un brote por cada 1.38 mil millones
de huevos consumidos (Mason, 1994).
Sin embargo en nuestro país existe escasa información acerca del consumo
per capita de un alimento en particular. Se intentó disponer de información
mediante un estudio de campo que incluyó 600 entrevistas directas entre la
población de la ciudad de Querétaro. El objetivo consistió en estimar el nivel de
consumo de lechuga como recurso para estimar la probabilidad de la exposición a
Salmonella por la ingesta de esta hortaliza, conociendo el nivel de contaminación
en el alimento.
60
Los cuestionamientos en la entrevista se referían a la frecuencia, cantidad,
sitio de consumo y tratamientos de lavado y desinfección aplicados a la lechuga, y
finalmente la frecuencia de episodios de diarrea que las personas manifestaron
padecer al año.
Como toda encuesta que se realiza sobre la población acerca del patrón de
consumo de un alimento, encontramos diversas variables que pueden afectar los
resultados. Se incluyen el tiempo disponible, así como la concentración, seriedad y
confianza que muestren los encuestados al responder. Por tal razón, se tuvo el
cuidado de discriminar las respuestas de las personas que no reunían estas
características y por tanto desechar a tales personas en el computo final. Solo 500
de 600 entrevistas cumplieron con dichas condiciones.
La edad de los entrevistados se agrupó en seis categorías (Tabla 5.12). Las
respuestas obtenidas de las dos primeras, es decir, menores de 6 años y de 6 a
12 años, fueron atendidas por el padre o madre de la familia. El 43% de las
entrevistas fueron aplicadas a personas de entre 26 a 64 años de edad.
61
Tabla 5.9 Porcentajes de frecuencia sobre la encuesta de consumo de lechuga cruda
Factor Frecuencia (%)
Genero Mujer 62.3 Hombre 37.7 Edad < 6 años 10.0 6 – 12 años 9.6 13 – 24 años 26.6 25 – 64 años 43.2 > 64 años 10.6 Frecuencia de consumo Nunca 0.00 1 – 2 veces / semana 51.0 3 – 4 veces / semana 12.6 1 al mes 36.4 Tamaño por porción < 10 g 24.4 10 – 25 g 60.2 > 25 g 15.4 Sitio de consumo Hogar 21.0 Fuera del hogar 42.0 Ambos 37.0 Tratamiento antes de su consumo Lavado 18.4 Lavado y desinfectado 39.0 Ninguno Desconocido Frecuencia del tratamiento Ninguna 1-10 11-19 20
2.6 40.0 1.8 2.6 4.4 48.6
Cuadros diarreicos al año Ninguno 22.0 1-2 40.0 3-6 20.0 >6 18.0
62
0
50
100
150
200
250
<6 años 6–12años
13–24años
25–64años
>64años
Figura 5.12 Grupos de población entrevistadas, según edad.
La tendencia sobre el sitio donde mayoritariamente se consume la lechuga
en la población encuestada correspondió a restaurantes, fondas, comedores
industriales, mercados y puestos ambulantes, entre otros (Figura 5.13). Es
pertinente destacar que, en un estudio realizado en E.E.U.U se observó que en un
periodo de 15 años, 50% de los brotes ocasionados por frutas y hortalizas
ocurrieron en restaurantes y establecimientos de comida (CSPI, 2007).
0
50
100
150
200
250
Hogar Fuera del Hogar Ambos Figura 5.13 Frecuencia de sitios de consumo de lechuga cruda
63
La mayor frecuencia de consumo osciló entre una y dos veces por semana.
En ningún caso se obtuvo la respuesta de nunca (Figura 5.14).
0
50
100
150
200
250
300
nunca 1 vez al mes 1‐2 veces/semana 3‐4 veces/semana
Figura 5.14 Frecuencia de consumo de lechuga cruda
Otro factor motivo de exploración fue la cantidad de lechuga consumida en
cada ocasión. Para facilitar la respuesta nos auxiliamos de una imagen a escala
con diferentes cantidades de lechuga correspondientes a 10, 25 y 50g.
Evidentemente en algunos casos la lechuga se consumía en forma de ensalada,
pero en otra era un ingrediente de otros alimentos tales como: enchiladas, pozole,
tortas y hamburguesas. La mayoría de las personas (60.2%) aseguro consumir
entre 10 y 25 g de lechuga (Figura 5.15).
64
0
50
100
150
200
250
300
350
<10 g 10‐25 g >25 g
Figura 5.15 Frecuencia de cantidad de lechuga cruda consumida por ocasión
El 39% de los entrevistados de entre los 300 que la consumían en el hogar
en forma regular o esporádica afirmaron que la lechuga era objeto de lavado y
desinfección. La respuesta la consignamos a sabiendas de la imposibilidad de
verificar el cumplimiento de este señalamiento. Similar situación se aplica a la
respuesta sobre la frecuencia de la presentación de cuadros diarreicos entre las
personas encuestadas, en donde la respuesta predominante fue de una a dos
cuadros diarreicos al año (Figura 5.16).
0
50
100
150
200
250
Ninguna 1‐2 3‐6 >6
Figura 5.16 Frecuencia de padecimientos de diarrea al año por persona
65
5.10 Estimación del riesgo de enfermar por Salmonella asociado al consumo de lechuga.
La estimación de la exposición a la Salmonella asociado a la ingesta de
lechuga se realizó considerando la incidencia del patógeno en la lechuga, la
frecuencia y cantidad de consumo. Puede expresarse mediante la ecuación:
incidencia (I) * frecuencia (F) * cantidad (C)= Probabilidad de exponerse a la
ingesta de salmonelas cuando se consume lechuga.
La incidencia encontrada fue de 4/647 en porciones de 25g, la frecuencia
de consumo se refirió a una a dos, tres a cuatro veces por semana y una vez al
mes. Para el cálculo de la frecuencia de consumo se consideró el número de
veces que las personas manifestaron consumir la lechuga y la cantidad consumida
que seleccionaron fue de 10, 25 y 50g. Cuando este cálculo se realizó para cada
persona se obtiene una respuesta como la que muestra la Figura 5.18, en la cual
se relaciona el número de personas y la probabilidad de exposición a Salmonella
en la forma señalada. La figura ilustra en que términos se distribuyen las
probabilidades de exposición al patógeno entre las 500 personas entrevistadas.
De las 500 personas encuestadas, para 187 la probabilidad de exponerse a
Salmonella es de 1 en 1000. En el otro extremo, la probabilidad mas baja de
exposición al riesgo (0.00003) se observó en 14 personas.
Si bien el cálculo anterior tiene un principio racional, debido al bajo número
de positivos entre el total de muestras analizadas, es de esperar márgenes
amplios de variabilidad en estudios similares repetidos. El valor práctico del
cálculo es limitado. Adicionalmente, las respuestas pueden considerarse poco
consistentes en las condiciones en las que se llevaron a cabo las entrevistas.
Por otra parte, se dispone de un dato cuantitativo acerca del contenido de
salmonelas en las muestras de lechuga; como se indicó la media es de 7
salmonelas/g de manera que en porciones de 25 g (base del cálculo en la
66
ecuación anterior) la cantidad de salmonelas sería de 175 células. Esta cifra
puede integrarse al cálculo anterior si se multiplica por la cantidad de lechuga
ingerida. Ante las personas que consumieron, por ejemplo para el nivel máximo de
exposición (0.002355) correspondería una ingesta de 350 células por 25 g de
alimento consumido.
Existen ciertas limitaciones en los países en desarrollo que afectan la
capacidad de llevar a cabo una evaluación de riesgos. Para que la implementación
de este sistema sea factible es indispensable contar con una serie de condiciones.
Desafortunadamente, los sistemas de inocuidad de los alimentos se encuentran
aún en etapas muy tempranas de desarrollo, o en todo caso, son inexistentes.
Como consecuencia, estos sistemas presentan ciertas debilidades, tales como: la
falta de organización, programas incompletos e ineficaces que afectan de manera
negativa la inocuidad y calidad de los alimentos. Otras limitaciones incluyen la falta
o insuficiencia de tecnología, infraestructura, recursos humanos y financieros,
capacitación técnica, y laboratorios bien equipados (Cahill y Jouve, 2004).
En México no existe la suficiente información acerca de la incidencia y
concentración de patógenos en los alimentos, una vigilancia epidemiológica y
mucho menos los patrones de consumo de la población. Por lo que realizar una
evaluación de riesgos, como las que ya se han realizado en países
industrializados (Cuadro 5.1), es algo que todavía esta fuera de nuestro alcance.
Sin embargo nuestro estudio arroja información que puede contribuir a las futuras
investigaciones de la evaluación de riesgos.
67
Cuadro 5.1 Algunos estudios de Evaluación de Riesgos Microbiológicos realizados
en países desarrollados
• E. coli Enterohemorragica (ECEH) en carne y productos cárnicos
• Salmonella en huevo y pollos para asar
• Listeria monocytogenes en alimentos listos para su consumo
• Vibrio parahaemolyticus en ostras crudas consumidas en Japón, Nueva
Zelanda, Canadá, Australia y E.E.U.U.
• Vibrio parahaemolyticus en almejas rojas consumidas en Tailandia
68
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0.000029 0.000073 0.000235 0.000471 0.000588 0.001177 0.002355
Probabilidad de exposición a Salmonella
Núm
ero
de p
erso
nas
Figura 5.17 Probabilidad de exposición a Salmonella en función de su incidencia, frecuencia y cantidad de lechuga consumida.
69
VI. CONCLUSIONES
* De 647 muestras de lechuga adquiridas en mercados la incidencia de Salmonella
fue 0.06%, mientras E. coli se detectó en 14.9 % de 368 muestras.
* La media de salmonelas en las muestras positivas fue de 7 NMP/g. La de E. coli
fue de 4 NMP/g
* Una mezcla de tres serovares de Salmonella mostró una cinética de desarrolló
similar en CST, BHI y CL. En la lechuga pre-enriquecida en el CL el desarrollo fue
discretamente menos pronunciado.
* La técnica de PCR utilizando como iniciador invA permitió una nítida reacción en
el gel de electroforesis específica para Salmonella. Así mismo, permitió detectar
por lo menos 5 UFC de Salmonella en 25 g de lechuga.
* La incidencia tanto de Salmonella como de E. coli en la lechuga mostró un mayor
nivel en la época calurosa que en la fría con un porcentaje de 1.9 y 25.3%
respectivamente.
* El modelo de contaminación cruzada de la lechuga a partir de jugo de carne
contaminado en el laboratorio condujo a resultados consistentes, con variaciones
menores entre los replicados.
* Los porcentajes de recuperación de Salmonella en las tablas contaminadas se
incrementaron en proporción directa con el nivel de inóculo inicial; 29% para 3.5
log UFC/ Salmonella y 76% para 5.5 log UFC/Salmonella.
* Una vez contaminada la lechuga por contacto con la Salmonella inoculada en las
tablas, la mezcla de salmonelas no modificó su numero a 4ºC después de 24 h.
70
Almacenada a 30 y 22º el microorganismo desarrolló hasta cerca de 3 y 1.5 log
UFC/g, respectivamente.
* No se observó diferencia entre la capacidad de desarrollo del patógeno en
lechuga escurrida o sumergida en agua almacenada a las tres temperaturas.
* La población encuestada (aparentemente entre niveles económicos de clase
media baja y clase media alta), manifestó en general una frecuencia de consumo
de lechuga de una a dos veces por semana en cantidades variables entre 10 y
25 g.
* La estimación de la exposición a la Salmonella por concepto de consumo de
lechuga no conduce a resultados consistentes fundamentalmente debido a dos
factores: la baja incidencia de Salmonella en las muestras analizadas (0.06%), y la
pobre credibilidad de las respuestas de las personas encuestadas en los términos
en los que se realizó el estudio.
71
VI. BIBLIOGRAFÍA
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