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RÉGULATION DE LA PERMÉABILITÉ
ENDOTHÉLIALE VIA LA PHOSPHORYLATION DE
LA TROPOMYOSINE-1 PAR LA DAP KINASE 1 EN
RÉPONSE AU STRESS OXYDANT
Mémoire
BRYAN SIMONEAU
Maîtrise en Biologie cellulaire et moléculaire
Maître ès sciences (M.Sc)
Québec, Canada © Bryan Simoneau, 2013
iii
Résumé
La perte de l’intégrité et de la perméabilité sélective de la barrière endothéliale est un
évènement précoce dans la séquence des lésions oxydatives responsables de
l’athérosclérose, de l’hypertension et de l’épanchement de cellules cancéreuses durant la
dissémination métastatique.
Nous avons déjà démontré que la phosphorylation de la Ser283 de la tropomyosine-1
(Tm1) par la DAPK1, en aval de la voie ERK1/2, est nécessaire à la formation de fibres de
stress dans les cellules endothéliales exposées aux stress oxydant.
La perméabilité endothéliale et la migration transendothéliale de carcinomes du côlon ont
été mesurées par des essais de perméabilité et de migration en chambre de Boyden. L’usage
d’ARNi et des formes sauvages et mutantes de la Tm1 ont permis de démontrer que la
phosphorylation de la Tm1 est un évènement clé nécessaire dans les mécanismes de
protection contre la dysfonction endothéliale lorsque l’endothélium est soumis à un stress
oxydant.
v
Abstract
Loss of endothelial cell integrity and selective permeability barrier is an early event in the
sequence of oxidant-mediated injury and may result in atherosclerosis, hypertension, and
facilitation of transendothelial migration of cancer cells during metastasis.
We already showed that phosphorylation of tropomyosin-1 (Tm1) at Ser283 by DAPK1,
downstream of the ERK1/2 pathway, is necessary to stress fibers formation in endothelial
cells in response to oxidative stress.
Endothelial permeability and transendothelial migration of colon cancer cells were
evaluated by Boyden chamber assays. Use of siRNA and wild-type and mutated forms of
Tm1 provide evidence indicating that phosphorylation of Tm1 is a key event required
inside protection mechanism against endothelial barrier dysfunction associated with
oxidative stress injury.
vii
Remerciements
Voilà! Je suis maintenant rendu à écrire mes dernières lignes de ce mémoire. Cette maîtrise
fut sans aucun doute un voyage extrêmement enrichissant vers le questionnement, le savoir
et un épanouissement personnel. Ce fut un parcours parsemé de défis et de
rebondissements. Dans ce parcours, j’ai réussi à trouver beaucoup de réponses et à me
poser de nouvelles questions. Je ressors grandi de cette expérience et je tiens à remercier
tous ceux et celles qui ont contribué de près ou de loin à ce résultat final qu’est ce mémoire.
Tout d’abord, je tiens à remercier mon directeur de recherche, le Dr. Jacques Huot, qui m’a
donné la chance de travailler en tant qu’étudiant dans sa merveilleuse équipe de
scientifiques extraordinaires. Je vous remercie d’avoir eu confiance en moi depuis mon tout
premier stage d’été, et ce, jusqu’à aujourd’hui. Vos conseils, votre écoute, votre gentillesse
exemplaire et tous vos encouragements m’ont donné les outils nécessaires afin d’en arriver
à ce diplôme. Vous m’avez donné l’occasion d’être le scientifique que je suis aujourd’hui,
merci! J’en suis profondément reconnaissant.
Puis, je remercie François Houle, l’assistant de recherche que tous les laboratoires devraient
avoir! Je suis fier d’avoir travaillé à tes côtés puisque tu es plus qu’un excellent
scientifique. En fait, tu es l’exemple parfait de l’équilibre entre la profession et la vie
familiale. De plus, ta grande expérience scientifique m’a grandement aidé à la réussite de
mon projet. Merci beaucoup pour tous tes conseils ainsi que ta joie de vivre.
Je tiens à remercier Anne-Laure Pin pour m’avoir aidé tout au long de ma maîtrise. Ta
gentillesse, ta spontanéité, ton énergie débordante, tes conseils, tes encouragements et ta
confiance en mon potentiel m’ont été d’une énorme aide afin de viser la réussite et atteindre
mes buts. Merci énormément pour tout!
J’aimerais remercier Maxime Côté pour tous tes conseils et ton aide lors de mes stages et
de ma maîtrise. Même si tu as quitté le laboratoire au début de ma maîtrise, tu as su
m’encourager et tu as continué à me conseiller. Merci aussi pour ta bonne humeur et pour
ton sens de l’humour et du spectacle. Je m’ennuie beaucoup de tes histoires extraordinaires.
Je tiens également à remercier Andrée Poirier qui m’a énormément aidé en génomique
moléculaire. Ton sourire, ta joie de vivre et ta gentillesse étaient toujours au rendez-vous,
merci!
Puis, il y a Nico (Nicolas Porquet), notre oiseau de nuit! Merci énormément pour tes
conseils et nos discussions passionnantes!
Finalement, j’aimerais remercier ma famille ainsi que ma bien-aimée pour votre soutient
constant et vos nombreux encouragements qui m’ont donné le courage et la persévérance
d’aller jusqu’au bout de cette aventure et d’en ressortir gagnant. Vous êtes ma source de vie
et c’est grâce à vous que je réussis!
Cette maîtrise fut mon voyage et une étape de plus dans la poursuite de mon rêve :
«Pour réaliser une chose vraiment extraordinaire, commencez par la rêver. Ensuite,
réveillez-vous calmement et allez d’un trait jusqu’au bout de votre rêve sans jamais vous
laisser décourager.»
(Walt Disney)
Maintenant, installez-vous confortablement et bonne lecture…
ix
Avant-propos
Le présent mémoire comporte l’insertion d’un article scientifique. Le titre de cet article est
le suivant : Régulation de la perméabilité endothéliale de cellules cancéreuses via la
phosphorylation de la tropomyosine-1. Cet article a été soumis le 25 juillet 2012 dans la
revue Vascular Cell. Depuis, l’article a été accepté, révisé, corrigé et le dépôt final a été fait
le 17 novembre 2012. L’article présenté dans le chapitre II consiste en la version finale
publiée dans la revue Vascular Cell et que l’on peut retrouver dans le moteur de recherche
Pubmed [PMID : 23157718]. Le premier auteur de l’article est moi-même et les co-auteurs
sont Dr. Jacques Huot (mon directeur de recherche) et François Houle (l’assistant de
recherche du Dr. Huot). Le projet de recherche qui a permis de pondre cet article a été
élaboré par le Dr. Huot et moi-même, avec la participation de François Houle. J’ai effectué
l’ensemble des expériences présentées dans les principales figures et les figures
supplémentaires. J’ai contribué à l’écriture de l’article en rédigeant la première version et
au montage des figures, et ce, en participant aux remaniements et corrections qui en sont
découlés, sous la direction du Dr. Huot et avec la collaboration de François Houle.
xi
«Seul on va plus vite, mais ensemble on va
plus loin.» (Proverbe africain)
xiii
Table des matières
Résumé .................................................................................................................................. iii Abstract ................................................................................................................................... v Remerciements ..................................................................................................................... vii
Avant-propos ......................................................................................................................... ix Table des matières .............................................................................................................. xiii Liste des figures .................................................................................................................... xv Liste des abréviations ......................................................................................................... xvii Chapitre I ................................................................................................................................ 1
1. Introduction ..................................................................................................................... 3 1.1. La barrière endothéliale .......................................................................................... 3
1.1.1. Les vaisseaux sanguins ................................................................................... 3
1.1.2. Les cellules endothéliales et l’endothélium vasculaire ................................... 6 1.1.3. Les fonctions des cellules endothéliales ......................................................... 7 1.1.3.1. La cascade de coagulation .............................................................................. 8 1.1.3.2. Les échanges de la barrière endothéliale ...................................................... 10
1.1.3.2.1. La perméabilité trans-cellulaire ................................................................ 10 1.1.3.2.2. La perméabilité para-cellulaire ................................................................. 11
1.1.3.2.3. La régulation de la perméabilité para-cellulaire ....................................... 15 1.1.3.3. La régulation du flot sanguin ........................................................................ 17 1.1.3.4. La réponse inflammatoire et la surveillance immunitaire ............................ 21
1.2. Le stress oxydant .................................................................................................. 26
1.2.1. Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) ................................................... 26 1.2.2. Production et métabolisme des ROS dans le système vasculaire ................. 28 1.2.2.1. Les ROS mitochondriaux .............................................................................. 28
1.2.2.2. Les oxydases vasculaires endothéliales NADH/NADPH ............................. 30 1.2.2.3. La xanthine oxydase ..................................................................................... 31
1.2.3. Le peroxyde d’hydrogène (H2O2) ................................................................. 32 1.2.4. La dysfonction endothéliale et les pathologies ............................................. 33 1.2.4.1. L’athérosclérose ............................................................................................ 34
1.2.4.2. L’hypertension .............................................................................................. 36 1.2.4.3. L’épanchement de cellules cancéreuses ....................................................... 37 1.2.4.3.1. Le fertilisant du «soil» .............................................................................. 40
1.2.4.3.2. La formation d’une métastase ................................................................... 44
1.2.4.3.3. La barrière endothéliale et l’invasion tumorale ........................................ 49
1.3. Le cytosquelette et la perméabilité endothéliale ................................................... 52 1.3.1. L’actine ......................................................................................................... 52 1.3.2. Les protéines régulatrices de l’actine ............................................................ 54 1.3.2.1. Les protéines de polymérisation de l’actine-F .............................................. 54 1.3.2.2. Les protéines d’organisation de l’actine-F .................................................... 57
1.3.2.3. Les protéines motrices associées à l’actine-F ............................................... 65 1.3.3. Le remodelage du cytosquelette d’actine et la barrière endothéliale ............ 66 1.3.3.1. Rho, Rac et la régulation de la perméabilité endothéliale ............................ 68 1.3.3.2. Le cytosquelette d’actine en réponse au stress oxydant ............................... 71 1.3.3.2.1. Les voies des MAP-Kinases ..................................................................... 73
1.3.3.2.2. La voie p38 et le stress oxydant ............................................................... 75
1.3.3.2.3. La voie ERK1/2 et le stress oxydant ........................................................ 76
1.4. Les Tropomyosines .............................................................................................. 79 1.4.1. La découverte des tropomyosines ................................................................ 79 1.4.2. Les gènes codant pour les tropomyosines .................................................... 80 1.4.3. La structure des tropomyosines .................................................................... 83 1.4.4. Les multiples fonctions des tropomyosines ................................................. 85
1.4.4.1. La tropomyosine et la contraction musculaire ............................................. 86 1.4.4.2. La tropomyosine et les cellules non musculaires ......................................... 88 1.4.5. La tropomyosine-1 ....................................................................................... 89
Chapitre II ............................................................................................................................ 91 Objectif de l’étude ............................................................................................................ 93
Hypothèse ......................................................................................................................... 93 2. Régulation de la perméabilité endothéliale et de la migration trans-endothéliale de
cellules cancéreuses via la phosphorylation de la tropomyosine-1 ...................................... 94
2.1. Résumé ................................................................................................................. 95
2.2. Article ................................................................................................................... 96 2.2.1. Abstract ........................................................................................................ 97
2.2.2. Introduction .................................................................................................. 98 2.2.3. Materials and Methods ............................................................................... 100 2.2.4. Results ........................................................................................................ 106
2.2.5. Discussion .................................................................................................. 111 2.2.6. Competing interests .................................................................................... 114
2.2.7. Author’s contributions ................................................................................ 114
2.2.8. Authors information ................................................................................... 114
2.2.9. Acknowledgement ...................................................................................... 114 2.2.10. References .................................................................................................. 115
2.2.11. Legends of figures ...................................................................................... 119 2.2.12 Supplemental Data .......................................................................................... 131 2.2.12.1 Legends of figures ........................................................................................ 131
Chapitre III ......................................................................................................................... 141 3. Conclusion et perspectives ............................................................................................. 143
Bibliographie ...................................................................................................................... 155
xv
Liste des figures
Figure 1-1. Représentation simplifiée de l’artère et de la veine. ...................................... 4
Figure 1-2. Représentation simplifiée des trois types de capillaire. ................................. 5
Figure 1-3. Représentation simplifiée de l’endothélium vasculaire. ................................ 7
Figure 1-4. Schéma de la cascade de coagulation. ............................................................. 9
Figure 1-5. La cavéole. ........................................................................................................ 11
Figure 1-6. Structure des jonctions inter-endothéliales. ................................................. 15
Figure 1-7. L’effet d’une variété de conditions pathophysiologiques et pathologiques
sur les sites de phosphorylation du eNOS. ................................................................ 19
Figure 1-8. Les mécanismes impliquant la production de l’oxyde nitrique (NO.) par
l’eNOS dans les cellules endothéliales. ...................................................................... 20
Figure 1-9. Schéma de l’activation de type I des cellules endothéliales. ........................ 23
Figure 1-10. Schéma de l’activation de type II des cellules endothéliales. .................... 25
Figure 1-11. Les voies biochimiques de la production en ROS/RNS. ............................ 27
Figure 1-12. La production des ROS par la mitochondrie. ............................................ 29
Figure 1-13. La structure du NAD(P)H oxydase. ............................................................ 31
Figure 1-14. Développement de l’athérosclérose. ............................................................ 35
Figure 1-15. Les dix caractéristiques essentielles du cancer. .......................................... 39
Figure 1-16. La fertilisation du microenvironnement tumoral via la production de
H2O2. ............................................................................................................................. 42
Figure 1-17. La représentation schématique de l’effet Warburg. .................................. 44
Figure 1-18. Représentation simplifiée du monomère d’actine-G. ................................ 53
Figure 1-19. Schéma de la polymérisation dynamique du filament d’actine. ............... 54
Figure 1-20. Schéma des protéines participant à la dynamique de l’actine-F. ............. 57
Figure 1-21. Les trois types d’architecture de l’actine-F chez la cellule endothéliale. . 59
Figure 1-22. Les quatre types de fibres de stress. ............................................................ 60
Figure 1-23. Schéma des protéines de pontage. ................................................................ 62
Figure 1-24. La structure de la myosine II non-musculaire. .......................................... 66
Figure 1-25. Sentiers de signalisation Rho-dépendant impliqués dans la dynamique et
la formation des fibres de stress d’actine. ................................................................. 70
Figure 1-26. Sentiers de signalisation Rac-dépendant et Cdc42-dépendant impliqués
dans la diminution de la contractilité de l’actomyosine. ......................................... 71
Figure 1-27. La voie canonique des MAP-kinases. .......................................................... 74
Figure 1-28. Co-activation des voies p38 et ERK1/2 en réponse au stress oxydant. ..... 78
Figure 1-29. Les gènes codant pour les tropomyosines et leurs isoformes. ................... 82
Figure 1-30. La structure de la tropomyosine. ................................................................. 84
Figure 1-31. Divers isoformes de Tm pour diverses fonctions biologiques. .................. 85
Figure 1-32. Mécanisme de la contraction musculaire. ................................................... 87
Figure 2-1. Oxidative stress induces actin remodelling, disruption of endothelial layer
integrity and increase of endothelial permeability ................................................ 123
Figure 2-2. Inhibition of the ERK MAP kinase in the presence of H2O2 is associated
with an increase of endothelial permeability .......................................................... 124
Figure 2-3a. The knockdown of human Tm1 induces an increase in endothelial
permeability in response to H2O2 (Part I) .............................................................. 125
Figure 2-3b. The knockdown of human Tm1 induces an increase in endothelial
permeability in response to H2O2 (Part II) ............................................................ 126
Figure 2-4a. Phosphorylation of Tm1 at Ser283 regulates endothelial permeability
(Part I) ....................................................................................................................... 127
Figure 2-4b. Phosphorylation of Tm1 at Ser283 regulates endothelial permeability
(Part II) ...................................................................................................................... 128
Figure 2-5. The knockdown of human Tm1 in endothelial cells is associated with an
increase of transendothelial migration of cancer cells .......................................... 129
Figure 2-6. Phosphorylation of Tm1 at Ser283 is associated with a decrease of cancer
cells migration through the endothelial barrier in response to H2O2 .................. 130
Figure 2-S1. Endothelial cell survival is not decreased by 250µM H2O2 .................... 134
Figure 2-S2. The MEK1 inhibitor PD098059 does not affect endothelial cell
permeability .............................................................................................................. 135
Figure 2-S3. Hs_TPM1_7 small RNA interference-mediated knockdown of human
endogen Tm1 is effective .......................................................................................... 136
Figure 2-S4a. Functionality of lentiviral transgenic expressing vectors (CSII-Venus,
CSII-Venus-Tm1wt, and CSII-Venus-Tm1S283A) [Part I] ................................. 137
Figure 2-S4b. Functionality of lentiviral transgenic expressing vectors (CSII-Venus,
CSII-Venus-Tm1wt, and CSII-Venus-Tm1S283A) [Part II] ............................... 138
Figure 2-S5. Lentivirus-mediated infection does not increase by itself endothelial
permeability .............................................................................................................. 139
Figure 2-S6. Lentivirus-mediated infection does not affect endothelial
cell survival ............................................................................................................... 140
Figure 3-1. Schéma du bilan ............................................................................................ 153
xvii
Liste des abréviations
Générales
ABD : Actin-Binding Domain
Actine-F: Filament d’actine
Actine-G : Monomère d’actine
ADF: Actin Depolymerisation Factor
ADN: Acide désoxyribonucléique
ADP: Adénosine Diphosphate
AJ: Adherens Junction
AKT: v-akt murine thymoma viral oncogene
Ala: Alanine
AMPc : Adénosine Monophosphate Cyclique
AMPK: AMP-activated Protein Kinase
Ang II : Angiotensine II
AP1: Activator Protein 1
ARN : Acide Ribonucléique
ARNi : ARN interférant
ARNm : ARN messager
ARP2/3: Actin-Related Protein 2/3 complex
Asp: Aspartic acid
AT1: Récepteur de l’angiotensine II
ATP: Adénosine Triphosphate
AVP: Arginine Vasopressin
BBB: Blood-Brain Barrier
BH4: Tétrahydrobioptérine
BRB: Blood-Retinal Barrier
Ca2+
: Ion calcium
CaM: Calmoduline
CAV1-2-3: Calvéoline 1-2-3
CMH I-II: Complexe Majeur d’Histocompatibilité de classe I-II
CO2 : Monoxyde de carbone
COX-1: Cyclooxygénase-1
CPA: Cellule Présentatrice de l’Antigène
cPLA2: Cytosolic Phospholipase A2
CXCL8: CXC-Chemiokine Ligand 8
DAPK1: Death-Associated Protein Kinase 1
DR3: Death Receptor 3
DRAK1-2: DAP-Kinase-Related Apoptosis-Inducing Protein Kinase 1-2
DRPK: DAP-Kinase-Related Protein Kinase
ECE: Endothelin-Converting Enzyme
ECM: Extracellular Matrix
ELC: Essential Light Chain
EMT: Epithelial-Mesenchymal Transition
eNOS: Endothelial Nitric Oxide Synthase
ER: Endoplasmic Reticulum
ERK1/2: Extracellular-signal Regulated Kinase 1/2
ERM: Ezrin/Radixin/Moesin proteins
ET-1: Endothéline-1
ETA: Récepteur ET de type A
ETB : Récepteur ET de type B
FAD: Flavine Adénine Dinucléotide
FADH2 : Forme hydroquinone de la Flavine Adénine Dinucléotide
Fe2+
: Ion de fer ferreux
Fe3+
: Ion de fer ferrique
FH1-2-3 : Formin-Homology domain 1-2-3
FIs : Filaments Intermédiaires
FMN: Flavine Mononucléotide
GAPs: GTPase-Activating Proteins
G6P: Glucose-6-Phosphate
xix
GDP: Guanosine Diphosphate
GEFs: Guanine nucleotide Exchange Factors
Glu: Glutamic acid
GLUT: Glucose Transporter
GPCR: G Protein-Coupled Receptor (Récepteur couplé aux protéines G)
GTP: Guanosine-5’-Triphosphate
GuK: Guanylate Kinase
h-CAD: Caldesmone humaine
HDMECs: Human Dermal Microvascular Endothelial Cells
HGF: Hepatocyte Growth Factor
HIF1α: Hypoxia Inducible Factor 1α
HKII: Hexokinase II
HMW: High Molecular Weight
H2O2: Peroxyde d’hydrogène
HOCL: Acide hypochlorique
HPMECs: Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells
HSP27: The 27kDa Heath-Shock Protein
HT-29: Human colon adenocarcinoma grade II cell line
HUVECs: Human Umbilical Vein Endothelial Cells
ICAM -1: Intracellular Adhesion Molecule 1
IEJ: Interendothelial Junction
IgSF: Immunoglobulin Super Family
IL-1β: Interleukine-1β
IL-1R1: Type 1 IL-1 Receptor
iNOS: Inducible Nitric Oxide Synthase
InsP3: Inositol-1, 4, 5-triphosphate
IRAK1-4: IL-1R-Associated Kinase 1-4
JAMs-A-B-C; -4; -L: Junctional Adhesion Molecules-A-B-C; -4; -L
JNK1-2-3: c-jun NH2-terminal Kinases 1-2-3
KSR: Kinase Suppressor of Ras
LDHA: Lactate Dehydrogenase A
LDL: Low Density Lipoprotein
LimK1: Lin-11/Isl-1/Mec-3 domain-containing protein Kinase 1 (Lim Kinase 1)
LKB1: Liver Kinase B1
LMW: Low Molecular Weight
LOOH: Peroxydase lipidique
LPA: Lysophosphatidic acid
LPS: Lipopolysaccharide
MaGuK: Membrane-Associated Guanylate Kinase
MAPK: Mitogen-Activated Protein Kinase
MAPKAPK2/3: MAP Kinase-Activated Protein Kinase 2/3
MARCKS: Myristoylated Alanine-Rich C-Kinase Substrate
MCF-7: A human breast adenocarcinoma cell line
MCP-1: Monocyte Chemoattractant Protein 1
MDA231: A human breast adenocarcinoma cell line
mDia: Mammalian Homologue of Drosophilia diaphanous
MEK: Mitogen-activated protein Kinase Kinase
Mg2+
: Ion magnesium
MH2: Myosin Heavy Chain
MLC: Myosin Light Chain
MLC2: Myosin Light Chain 2
MLCK: Myosin Light Chain Kinase
MLCP: Myosin Light Chain Phosphatase
MORG1: MAPK Organizer 1
MP1: MEK Partner 1
MTs: Microtubules
MtDNA: ADN Mitochondrial
mTOR: Mammalian Target Of Rapamycin
MYC: v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog
MyD88: Myeloid Differentiation primary-response gene 88
MYPT: Myosin Light Chain Phosphatase
NADPH: Nicotinamine Adénine Dinucléotide Phosphate
xxi
NADH: Nicotinamine Adénine Dinucléotide
NF-κB: Nuclear Factor-Kappa B
nNOS: Neuronal Nitric Oxide Synthase
NO: Nitric Oxide
NOS: Nitric Oxide Synthase
NPF: Nucleation Promoting Factor
O2: Dioxygène
O2.-: Anion superoxyde
.OH: radical hydroxyle
ONOO- : Peroxynitrite
Ox-LDL: Oxidized Low Density Lipoprotein
P38 MAPK: P38 Mitogen-Activated Protein Kinase
P53: Protein 53 (Tumor Protein 53)
PAF: Platelet-Activating Factor acetylase
PAK1: p21-Activated Kinase 1
PDGF: Platelet-Derived Growth Factor
PDK: Pyruvate Dehydrogenase Kinase
PDZ: PDZ domain
PECAM1: Platelet-Endothelial Cell Adhesion Molecule 1
PGH2: Prostaglandine H2
PGI2: Prostaglandine I2 (Prostacycline)
PI3K: Phosphoinositide-3-Kinase
PKA/B/C: Protein Kinase A/B/C
PK-M2: M2 form of Pyruvate Kinase
PLCβ: Phospholipase C-β
PMA: PKC activator Phorbol Mysistate Acetate
PPP: Pentose Phosphate Pathway
pRB: Protéine du rétinoblastome
PtdIns(4,5)P2: Phosphatidylinositol-4,5-biphosphate
Rac: Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1
Raf: v-raf-1 murine leukemia viral oncogene homolog
Ras: GTPase Ras
Rho: Ras homolog gene family
RIP1: Receptor-Interacting Protein 1
RLC: Regulatory Light Chain
R-O.: Radical alkoxyle
ROCK: Rho-associated, Coiled-coil containing protein Kinase
ROS: Reactive Oxygen Species
RTK: Receptor Tyrosine Kinase
SAPK2: Stress-Activated Protein Kinase 2
Ser: Serine
SH3: Src Homology 3 domain
SHRs: Spontaneous Hypertensive Rats
TAP: Tip-Associated Protein
TF: Tissular Factor
TFPI: Tissular Factor Pathway Inhibitor
TIRAP: Toll/IL-1 Receptor Accessory Protein
TJ: Tight Junction
Tm: Tropomyosin
Tm1Ser283Ala: Tropomyosin-1 Serine283Alanine
Tm1wt: Tropomyosin-1 wild-type
Tn: Troponine
TNFα: Tumor Necrosis Factor-α
TNFR1: TNF Receptor 1 (CD120a)
TRADD: TNFR-Associated via Death Domain
TRAF2-6: TNFR-Associated Factor 2-6
TSC2: Tuberous Sclerosis protein 2
UV: Ultra-Violet
VCAM-1: Vascular Cell Adhesion Molecule 1
VDAC: Voltage Dependent Anion Channel
VEB: Virus Epstein-Barr (virus de l’herpès 4)
VE-cadhérine: Vascular Endothelial-cadhérine
xxiii
VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor
VEGFR2: Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2
VE-JAM: Vascular Endothelial-JAM
VHB : Virus de l’hépatite B
VPH : Virus du papillome humain
VSM: Vascular Smooth Muscle
WASP: Wiskott - Aldrich syndrome Protein
WAVE: WASP family Verprolin-homologous
WH2: WASP-Homology 2
WPB: Weibel-Palade Body
XO: Xanthine Oxydase
ZIPK: Zipper-Interacting Protein Kinase
ZO: Zonula (Zona) Occludens (Occludins)
Unités
a.a. : acide aminé
b : base
cm: centimètre
Da : Dalton
g : gramme
h : heure
k : kilo
kb : kilo-base
kDa : kilo-Dalton
kg : kilogramme
m: mètre
mm: millimetre
min : minute
M : Molaire
mM : milli-Molaire
nm : nanomètre
N : Newton
µM : micro-Molaire
pb : paire de base
1
Chapitre I
3
1. Introduction
1.1. La barrière endothéliale
1.1.1. Les vaisseaux sanguins
Le système vasculaire sanguin se décompose en trois catégories de vaisseaux hautement
spécialisés qui existent en divers calibres : les artères, les veines et les capillaires.
Le cœur propulse le sang nouvellement oxygéné du ventricule gauche aux artères qui
irriguent toutes les parties du corps. On distingue trois types d’artère : les artères élastiques
pures comme l’aorte, les artères purement musculaires ou distributrices et les artères
musculo-élastiques. En effectuant une coupe transversale d’une artère, on constate que cette
dernière présente trois couches distinctes. De l’extérieur vers l’intérieur, il y a l’adventice,
la media et l’intima (Figure 1-1).
L’adventice est la couche externe de la paroi artérielle qui est composée de tissu conjonctif
et de fibres élastiques. Elle comporte également des vaisseaux capillaires qui assurent la
vascularisation de la paroi artérielle que l’on nomme vasa vasorum et des fibres nerveuses
du système autonome sympathique et parasympathique.
La media est la couche moyenne de la paroi artérielle qui est constituée de collagène et
d’élastine. Au sein d’artères de petit et moyen calibre, la media comporte des fibres
musculaires lisses qui permettent la vasoconstriction.
L’intima est la couche interne de la paroi artérielle qui est formée de l’endothélium
vasculaire reposant sur une couche de tissu conjonctif.
Après avoir alimenté le corps entier, le sang appauvri en oxygène est drainé par les veines
jusqu’au cœur. Histologiquement, les veines présentent une structure similaire à celle des
artères avec les mêmes trois couches qui les composent de l’extérieur vers l’intérieur.
Figure 1.1.1-1. Représentation simplifiée de l’artère et de la veine.
Adapté de (http://cardioanatomy.tumblr.com/post/4672205732/arteries-vs-veins-arteries-arteries-
have-three).
Les capillaires surpassent en nombre les artères et les veines. En effet, ils sont les plus
petits vaisseaux du réseau vasculaire sanguin et relient les veinules aux artérioles formant
des agencements de réseaux arborescents appelés «lits capillaires» qui sont en constante
réorganisation. Les capillaires sont formés d’une simple rangée de cellules endothéliales et
d’une fine lame basale. On retrouve trois types de capillaires sanguins : Les capillaires
continus, les capillaires fenestrés et les capillaires sinusoïdes (Figure 1-2).
Les capillaires continus sont formés de cellules endothéliales jointives constituant alors un
revêtement uni et ininterrompu. Les muscles squelettiques, les muscles lisses, les tissus
conjonctifs et les poumons comportent ce type de capillaire.
Les capillaires fenestrés sont composés d’un endothélium percé de «micropores» d’environ
70 nm de diamètre rendant ces capillaires très perméables aux liquides. On les retrouve
dans les organes impliqués dans la filtration et les échanges de molécules.
5
Les capillaires sinusoïdes comportent une paroi inégale, non linéaire avec de grands
espaces entre les cellules endothéliales. La cohésion des cellules endothéliales est assurée
via les tissus environnants. Ces capillaires sont donc très perméables aux liquides et aux
macromolécules. Le foie, la rate, la moelle osseuse et certaines glandes endocrines sont
irrigués par ces derniers.
Les capillaires constituent la base même des échanges gazeux et de nutriments entre le tissu
sanguin et les tissus périphériques. La paroi perméable des capillaires assurent la nutrition
des cellules et l’évacuation des déchets du métabolisme cellulaire. En effet, l’endothélium
qui les compose participe activement aux transferts d’éléments nutritifs, d’hormones, de
globules blancs etc.
Figure 1.1.1-2. Représentation simplifiée des trois types de capillaire.
A) Capillaire continu; B) Capillaire fenestré; C) Capillaire sinusoïde. Adapté de
(http://antranik.org/blood-vessels/).
1.1.2. Les cellules endothéliales et l’endothélium vasculaire
Les cellules endothéliales tapissent la paroi interne des vaisseaux sanguins, soit la couche
interne des artères et des veines, l’intima (Figure 1-3). De plus, les capillaires sont formés
en majeure partie par les cellules endothéliales qui sécrètent les molécules constitutives de
la lame basale. Cette lame basale assure l’adhésion des cellules endothéliales au tissu
conjonctif sous-jacent et forme une interface importante séparant les cellules du tissu et
l’extérieur. La lame basale est une structure collagénique qui résulte d’un assemblage de
protéines et de glycoprotéines extracellulaires pouvant atteindre une épaisseur de 50 à 200
nm. Cet assemblage des cellules endothéliales recouvrant l’ensemble du système vasculaire
forme l’endothélium.
L’endothélium est un tissu qui dérive du mésoderme embryonnaire. La masse totale de
l’endothélium est de 2 kg et il est considéré comme étant l’organe endocrine le plus
imposant du corps humain [1]. Les cellules endothéliales constituant l’endothélium sont
plates et polarisées, c’est-à-dire que la face apicale se retrouve dans la lumière du vaisseau
sanguin, tandis que la face basale est fixée à la lame basale. Cependant, selon le système
organique, le site anatomique et le type vasculaire (artère, veine, artériole, veinule ou
capillaire), l’endothélium va se spécialiser et adopter des caractéristiques particulières afin
de pouvoir remplir des fonctions spécifiques à l’organe [2]. Morphologiquement, les
cellules endothéliales vont alors se spécialiser en modifiant leur dimension, leur forme, leur
épaisseur et leur nombre [3]. Par exemple, les cellules endothéliales aortiques sont
beaucoup plus minces et couvrent une surface plus petite que celles qui tapissent l’artère
pulmonaire. De plus, les cellules endothéliales microvasculaires du placenta humain en fin
de gestation sont allongées, tandis que celles de la veine du cordon ombilical humain sont
polygonales. Les cellules endothéliales vont également adopter des jonctions précises. En
effet, au sein du système nerveux, les cellules endothéliales sont reliées par des jonctions
serrées assurant une protection du cerveau via la formation d’une barrière hémato-
encéphalique. Toutefois, dans le rein, les cellules endothéliales forment un endothélium
discontinu parsemé de trous de grosseurs variables entre les cellules créant alors une lame
basale fenestrée lui octroyant une fonction de filtre moléculaire [3].
7
Cette très grande plasticité des cellules endothéliales assure un dynamisme crucial à
l’endothélium lui permettant d’accomplir diverses fonctions homéostatiques clés au sein de
l’organisme. Les fonctions biologiques de l’endothélium sont très variées et nombreuses.
En condition normal, l’endothélium forme une barrière active semi-perméable entre le sang
et les tissus sous-jacents régulant les échanges de fluide et de macromolécules avec les
tissus. Il synthétise et sécrète également divers médiateurs chimiques qui régulent et
influencent le flot sanguin, le tonus et l’homéostasie vasculaire, le dépôt et la lyse de
caillots, et les réponses immunitaires [1, 2, 4].
Figure 1-3. Représentation simplifiée de l’endothélium vasculaire.
Adapté de (http://healthnet.net.au/l-arginine-sport-science/).
1.1.3. Les fonctions des cellules endothéliales
Les cellules endothéliales sont impliquées au sein de cinq fonctions physiologiques
primordiales : la conservation du sang dans un état fluide, la régulation des échanges de
fluides et de macromolécules entre le sang et les tissus, le contrôle du flot sanguin, la
régulation de la réponse inflammatoire et la participation aux fonctions de la surveillance
immunitaire.
1.1.3.1. La cascade de coagulation
Afin de conserver le sang dans un état fluide, l’endothélium doit contrecarrer la cascade de
coagulation (Figure 1-4). La cascade de coagulation est formée par deux voies aboutissant
à la synthèse de fibrine. Il y a la voie extrinsèque qui est dépendante du facteur tissulaire
(TF) et la voie intrinsèque. La voie extrinsèque est primordiale pour déclencher l’initiation
de la coagulation. Ainsi, une cascade de coagulation se résume en une série de réactions au
sein desquelles un facteur de coagulation (identifié par un chiffre romain où la forme active
est désignée par la lettre a), c’est-à-dire un zymogène de sérine protéase associé à son
cofacteur glycoprotéique, est activé afin de catalyser la prochaine réaction.
Lorsque l’intégrité de l’endothélium est compromise, le Facteur VIIa (activé) quitte la
circulation sanguine et s’associe avec le TF (un accélérateur catalytique) et forme le
complexe TF-FVIIa. Le complexe TF-FVIIa active le Facteur IX et le Facteur X. De même,
le Facteur IXa peut aussi cliver le facteur X pour le rendre actif (Xa) en utilisant le Facteur
VIIa comme cofacteur. Le Facteur Xa et son cofacteur Va constituent le complexe
prothrombinase qui converti la prothrombine (II) en thrombine (IIa), soit une protéase
active clivant le fibrinogène (I) en fibrine (Ia). Ensuite, les fibres de fibrine s’auto-
assemblent pour renforcer le clou plaquettaire [2].
Les cellules endothéliales inhibent la voie de coagulation à plusieurs niveaux. En premier
lieu, les complexes protéasiques actives doivent s’assembler à la surface membranaire qui
expose des groupements de tête de phosphatidylsérine. Toutefois, les phosphatidylsérines
se retrouvent séquestrées dans le feuillet interne de la membrane plasmique des cellules
endothéliales bloquant ainsi l’accès aux facteurs de coagulation.
En second lieu, sachant que la dégranulation des plaquettes fournit une source importante
de phosphatidylsérines accessibles en surface membranaire, les cellules endothéliales
empêchent la dégranulation en agissant sur trois signaux majeurs d’activation de
plaquettes : elles expriment des ectoenzymes qui dégradent l’ATP et l’ADP actifs (i),
inhibent la thrombine (ii) et préviennent l’exposition du collagène sub-endothélial (iii).
9
En troisième lieu, les cellules endothéliales synthétisent l’inhibiteur de la voie du facteur
tissulaire (TFPI) qui bloque l’activation des Facteurs IX et X via le complexe TF-FVIIa. En
quatrième lieu, les cellules endothéliales expriment la thrombomoduline, c’est-à-dire une
protéine membranaire qui lie la thrombine et altère sa spécificité enzymatique. Par
conséquent, l’activation de la fibrine n’a pas lieu et cède plutôt la place à l’activation de la
protéine C (associée au cofacteur protéique S) qui clive et inactive les Facteurs VIII et V.
En dernier lieu, si de la fibrine intra-vasculaire se forme, alors les cellules endothéliales
déclenchent un processus de dégradation de la fibrine appelé fibrinolyse. Ce processus
débute par la sécrétion du «tissue plasminogen activator» dans la circulation sanguine, soit
une protéase qui s’associe à la fibrine et convertit le plasminogène en plasmine. La
plasmine est une enzyme qui clive et dissous la fibrine [2].
Figure 1.1.3.1-4. Schéma de la cascade de coagulation.
Adapté de (http://fr.wikipedia.org/wiki/Coagulation_sanguine).
1.1.3.2. Les échanges de la barrière endothéliale
L’endothélium constitue une barrière physique continue et semi-perméable qui participe
activement à la régulation des échanges de fluides plasmiques, de protéines, et de cellules
entre le sang et l’espace interstitielle. Une régulation précise de la perméabilité endothéliale
est cruciale afin de maintenir une homéostasie circulatoire et les fonctions physiologiques
des divers organes. Le transport à travers la barrière endothéliale peut s’effectuer via deux
voies différentes : La voie trans-cellulaire et la voie para-cellulaire [2, 5-8].
1.1.3.2.1. La perméabilité trans-cellulaire
La perméabilité trans-cellulaire consiste au transport à travers la cellule endothéliale par le
biais de cavéoles. La cavéole a été identifiée pour la première fois en 1953 par microscopie
électronique et elle a été définie comme étant une fosse de 60 à 80 nm de diamètre au sein
de la membrane plasmique [9]. Il s’agit d’une vésicule résultant de l’invagination de la
membrane plasmique et ayant la forme de flasque où la cavité est reliée au milieu
extracellulaire via le col (Figure 1-5a). Le revêtement granulaire de leur membrane est
composé des extrémités amino et carboxyterminales de molécules de cavéoline. En fait,
cette protéine membranaire insère une boucle hydrophobe dans la membrane plasmique,
mais ne la traverse pas en sa totalité (Figure 1-5b). Il existe trois types de cavéoline :
CAV1, CAV2 et CAV3. CAV1 et CAV2 sont très abondantes au sein de cellules non-
musculaires, alors que CAV3 se retrouve dans les cellules musculaires squelettiques et dans
certaines cellules musculaires lisses. La formation de cavéoles par CAV1 et CAV3
nécessite une oligomérisation ainsi qu’une association avec des micro-domaines de radeaux
lipidiques riches en cholestérol et en glycosphingolipides. La membrane des cavéoles est
également enrichie en protéines intermédiaires de voies signalétiques telles que les
intégrines.
Plusieurs travaux démontrent que les cavéoles sont très nombreuses dans les cellules
endothéliales du système vasculaire. Primordialement, le rôle des cavéoles a été démontré
dans la trancytose, c’est-à-dire une endocytose en absence de clathrine. La trancytose
permet de faire traverser le cytoplasme d’une cellule d’une région extracellulaire à une
autre région extracellulaire à une particule ou à une substance comme le LDL (Low Density
Lipoprotein), l’albumine, le fer, la transferrine, l’insuline et les chimiokines [9].
11
La trancytose est activée par des protéines TAPs (Tip-Associated Protein). Après
bourgeonnement, la cavéole se détache de la membrane plasmique sous l’action de la
dynamine (une protéine G monomérique) qui consomme du GTP. Les microtubules ainsi
que les filaments d’actine du cytosquelette assurent le déplacement des cavéoles grâce à la
liaison des protéines CAV, comme CAV1, au cytosquelette d’actine.
Figure 1.1.3.2.1-5. La cavéole.
A) Micrographie électronique montrant des cavéoles dans des adipocytes dont la surface cellulaire
a été marqué par un marqueur dense d’électrons. B) L’insertion de la cavéoline au sein de la
membrane de la cavéole. Les extrémités N- et C-terminaux de la cavéoline demeurent dans le
cytoplasme tandis que la boucle hydrophobe constituant le domaine intra-membranaire de la
protéine s’enchâsse à l’intérieur de la bicouche de la membrane plasmique. Le domaine
d’échafaudage de la cavéoline est une région fortement conservée présentant des interactions avec
le cholestérol, des résidus basiques et des résidus hydrophobes. Adapté de (Robert G. Parton & Kai
Simons, 2007) [9].
1.1.3.2.2. La perméabilité para-cellulaire
La perméabilité para-cellulaire est régulée par les jonctions cellules-cellules comme les
jonctions inter-endothéliales (interendothelial junctions : IEJ) dont la fonction principale
est de restreindre le libre passage de macromolécules ayant un diamètre égal ou supérieur
de 3 nm et d’assurer le transport des molécules de moins de 3 nm entre les cellules (Figure
1-6). Cette perméabilité dépend des propriétés adhésives des protéines provenant des
jonctions serrées (tight junctions : TJ) et des jonctions adhérentes (adherens junctions :
AJ). Elle assure donc le maintien de l’homéostasie des fluides tissulaires. Les jonctions
inter-endothéliales peuvent s’assembler et se désassembler afin d’augmenter ou non la
perméabilité para-cellulaire [7].
Les AJs sont prédominantes au sein de la barrière endothéliale, alors que l’épithélium
comporte en majorité les TJs. Les VE-cadherines (vascular endothelial cadherins) sont
requises pour assurer la formation des AJs. Les cadhérines proviennent d’une famille de
protéines transmembranaires dotées d’un domaine extracellulaire présentant une répétition
multiple d’un motif cadhérine spécifique. Les VE-cadhérines font partie de la première
sous-famille, soit les cadhérines classiques ou de type I. Ces cadhérines assurent les
adhérences cellule-cellule homotypiques et calcium-dépendantes. Elles se retrouvent dans
les zones d’adhérence où s’établissent les liens avec le cytosquelette d’actine. Le domaine
extracellulaire N-terminal des VE-cadhérines est constitué de cinq répétitions en tandem de
motifs cadhérines comportant une séquence HAV qui est crucial pour l’adhérence cellule-
cellule. Le domaine juxta-membranaire se lie avec la caténine p120 responsable de
l’activation des GTPases de la famille Rho et de la régulation de l’adhérence, de la
perméabilité para-cellulaire et de la migration cellulaire. Le domaine C-terminal hyper-
conservé des cadhérines interagit avec les caténines (α, β et γ) qui assurent la liaison au
cytosquelette d’actine. Les cadhérines s’associent directement avec la β-caténine, la γ-
caténine ou la plakoglobuline. Ces derniers se lient à l’α-caténine qui permet une
association directe ou indirecte avec l’α-actinine, la vinculine ou la ZO-1.
En comparaison avec les AJs, les TJs ne représentent que le 1/5 des jonctions cellule-
cellule au sein de l’endothélium. Néanmoins, ces jonctions sont aussi primordiales que les
AJs pour maintenir l’intégrité de la barrière endothéliale [7]. Les TJs forment une structure
essentielle au niveau des barrières hémato-encéphaliques (blood-brain barrier : BBB) et
hémato-rétiniennes (blood-retinal barrier : BRB) [10]. En effet, la barrière hémato-
encéphalique est constituée de cellules endothéliales formant des TJs au sein des capillaires
qui vascularisent le cerveau. Les TJs sont formées d’une multitude de protéines
13
signalétiques, transmembranaires et d’échafaudage. Il existe trois types de protéines
transmembranaires au sein des TJs : les occludines, les claudines et les JAMs (Junctional
Adhesion Molecules) [10].
L’occludine a été initialement isolée à partir du foie de poussins. Elle comporte une région
cytoplasmique N-terminale, quatre régions transmembranaires, deux boucles
extracellulaires, une boucle intracellulaire et une région cytoplasmique C-terminale.
L’occludine est primordialement exprimée au sein des TJs des cellules endothéliales et
épithéliales. Elle est également retrouvée dans les astrocytes et les neurones in vitro
seulement. L’occludine interagit physiquement avec diverses protéines structurales des TJs
comme les protéines de la famille ZO. Le domaine cytoplasmique C-terminal de
l’occludine se lie à la région GuK de ZO-1, in vitro, et cette liaison sert à l’association de
cette dernière avec le cytosquelette d’actine. ZO-2 et ZO-3 se lient de façon analogue à
l’occudine. L’habilité de l’occludine à promouvoir l’adhésion cellulaire suggère qu’elle
joue un rôle important dans la formation de barrières para-cellulaires [10].
Les claudines font partie d’une large famille de protéines transmembranaires qui
contribuent à la formation des TJs. Il existe 24 membres au sein de la famille des claudines.
Les domaines structuraux des claudines sont similaires à ceux des occludines. Toutefois, la
première région extramembranaire des claudines est hyper hydrophobe et n’est pas riche en
résidus glycine et tyrosine contrairement aux occludines. De plus, la séquence en C-
terminale des claudines comporte un motif YV aux deux derniers acides aminés qui facilite
la liaison avec les membres de la famille ZO. La claudine-1, -5 et -15 sont toutes exprimées
dans les cellules endothéliales. Mais, parmi elles, seule la claudine-5 semble être un
isoforme spécifique à la cellule endothéliale [7]. Il importe de noter que chaque tissu
comporte sa propre composition en claudine selon la constitution cellulaire, ce qui permet
d’engendrer des interactions sélectives entre les divers tissus et de déterminer les propriétés
architecturales d’une barrière. Les claudines sont les premiers régulateurs dans la formation
des TJs et assurent la régulation de la perméabilité de la barrière para-cellulaire [10].
La famille des molécules JAMs (36-41 kDa) provient de la superfamille des
immunoglobulines (IgSF) et se localise dans les TJs ainsi que latéralement sur la membrane
des cellules épithéliales. Les JAMs ont également été découvertes au sein des TJs des
cellules endothéliales et à la surface des leucocytes, des plaquettes et des érythrocytes. Les
JAMs remplissent plusieurs fonctions telles que l’adhésion cellule-cellule, la perméabilité
de la barrière para-cellulaire, la migration de leucocytes, l’activation de plaquettes,
l’angiogénèse et la liaison de virus comme les réovirus [11, 12]. La nomenclature des
JAMs a récemment été déterminée par W.A. Muller. En effet, les trois premières protéines
JAMs se désignent par les lettres A, B et C (JAM-A, -B et -C). Les homologues sont JAM4
et JAML. De plus, JAM-B est également désigné VE-JAM dans certaines publications
puisqu’elle est seulement exprimée dans les cellules endothéliales vasculaires [13]. Les
JAMs ont une courte séquence peptidique en N-terminal, deux domaines extracellulaires Ig,
une courte queue cytoplasmique comportant des sites consensus de phosphorylation et un
domaine de liaison PDZ en C-terminal qui permet une association avec des protéines
d’échafaudage comme ZO-1 [12]. JAM-A facilite la localisation de ZO-1 et des occludines
au site de formation des TJs. JAM-A répond à l’augmentation de la perméabilité via les
cytokines par la dissociation du cytosquelette d’actine et la déstabilisation des jonctions.
JAM-B est sur-régulé dans l’inflammation chronique. JAM-C contrôle la perméabilité para-
cellulaire en induisant une inhibition de la petite GTPase Rap1 afin de provoquer un dés-
assemblement des AJs [7].
La famille des protéines ZO (Zona occludins) se retrouve dans les TJs des cellules
épithéliales et endothéliales. ZO-1 (210-225 kDa) fut la première des protéines des TJs à
être isolée. ZO-2 (180 kDa) et -3 (130 kDa) ont été isolées plus tard par co-précipitation
avec ZO-1. Ces protéines sont des membres homologues de la famille MaGuK (membrane-
associated guanylate kinase) qui contiennent trois domaines PDZ, un domaine SH3 et un
domaine homologue non-catalytique GuK (guanylate kinase). De plus, les protéines ZO
comportent un domaine acide, un domaine basique, un motif leucine zipper dimérisé et une
région C-terminale riche en proline [10].
15
Figure 1-6. Structure des jonctions inter-endothéliales.
Les jonctions inter-endothéliales sont constituées des jonctions serrées (TJs) et des jonctions
adhérentes (AJs) qui assurent l’adhésion des cellules endothéliales entre elles. Les occludines, les
claudines et les JAMs forment les TJs, alors que les VE-cadhérines sont nécessaires à la formation
des AJs. Les domaines extracellulaires des TJs et des AJs permettent le contact cellule-cellule, alors
que les domaines intracellulaires assurent la stabilité des jonctions grâce à leurs liaisons avec le
cytosquelette d’actine via les caténines α, β et γ ou les protéines ZO. La protéine p120 peut réguler
la perméabilité endothéliale avec son association aux protéines p190RhoGAP et Rac1. Adapté de
(Emily Vandenbroucke et al, 2008) [7].
1.1.3.2.3. La régulation de la perméabilité para-cellulaire
La perméabilité para-cellulaire repose sur les mécanismes d’assemblage et de
désassemblage des jonctions d’adhérence et des jonctions serrées qui permettent la
réorganisation du cytosquelette d’actine en vue de contrôler précisément le passage para-
cellulaire de macromolécules. Ainsi, la régulation de la perméabilité endothéliale découle
du dynamisme du cytosquelette d’actine.
Divers médiateurs comme la thrombine, le TNF-α et le LPS stimulent leur propre récepteur
à la surface des cellules endothéliales et déclenchent alors l’initiation d’une signalisation
ayant un impact sur la hausse cytosolique du calcium (Ca2+
) et activent la kinase MLC
(myosin light chain kinase) ainsi que les petites GTPases monomériques RhoA, Rac1 et
Cdc42. L’activation de la MLCK et de RhoA perturbent les jonctions inter-endothéliales,
tandis que Rac1 et Cdc42 promeuvent l’assemblage des jonctions. D’ailleurs, une
augmentation de la perméabilité endothéliale peut être renversée grâce aux «agents de
stabilisation de barrière» (barrier stabilizing agents) comme la sphingosine-1-phosphate et
l’adénosine cyclique monophosphate (cAMP) [7].
Dans les AJs, la fonction d’échafaudage de la caténine p120 sert à réguler les interactions
entre les cadhérines, les kinases, les phosphatases et les GTPases Rho. RhoA et son
effecteur ROCK inhibent l’activité de la phosphatase MLC (MLCP ou PP1), ce qui conduit
à augmenter le potentiel phosphorylatoire de la kinase MLC. La contraction des filaments
d’actine sous l’action de la myosine génère une force contractile centripète qui tire la VE-
cadherine vers l’intérieur la forçant alors à se dissocier des protéines adjacentes. Par
conséquent, l’interaction homotypique de la VE-cadhérine se retrouve perturbée
provoquant la formation d’espaces inter-endothéliaux (interendothelial gaps). Un second
mécanisme conduisant à l’augmentation de la perméabilité endothéliale implique le
désassemblement des microtubules. En effet, une déstabilisation des microtubules
entrainent une contraction RhoA/ROCK dépendante des cellules endothéliales, mais qui est
indépendante de la voie MLCK. La Lim kinase 1 (LimK1), un effecteur en aval de ROCK,
peut éventuellement être un médiateur crucial de l’assemblage de l’actine et des
microtubules. Le désassemblement des microtubules conduit à l’amplification de la
contraction des cellules endothéliales provoquant alors une hausse importante de la
perméabilité endothéliale par l’apparition d’espaces inter-endothéliaux. Néanmoins, une
stabilisation des microtubules empêche la contraction cellulaire et assure une redistribution
des AJs. Par ailleurs, un troisième mécanisme repose sur la phosphorylation de la VE-
cadhérine sur la sérine en position 665 (Ser665) par le VEGF (Vascular Endothelial
Growth Factor). En effet, la phosphorylation induit l’internalisation de la VE-cadhérine et
la perte de l’intégrité de la barrière endothéliale. De plus, la phosphorylation de la caténine
p120 dans sa région N-terminale conduit également à une internalisation de la VE-
cadhérine, ce qui amène, à la longue, une accumulation cytoplasmique de la caténine p120.
Cette accumulation induit une baisse de l’activation de RohA et une hausse de la
stabilisation de la barrière par le biais des GTPases Rac1 et Cdc42. Cette stabilisation de la
barrière endothéliale par Rac1 et Cdc42 provient de la régulation des interactions indirectes
17
entre α-caténine et la VE-cadhérine et de leur implication dans l’assemblage de l’actine en
lamellipode et en filopode au sein de protrusions cytoplasmiques favorisant les contacts
cellules-cellules [7].
Dans les TJs, les petites GTPases Rho sont également impliquées dans le contrôle de la
perméabilité para-cellulaire. En fait, en aval de RhoA, ROCK perturbe les jonctions en
phosphorylant l’occludine, ce qui provoque le désassemblement des TJs. D’ailleurs, il est
suggéré que le VEGF augmente la perméabilité endothéliale en provoquant l’endocytose de
l’occludine. Dans ce modèle, l’occludine contribue à la formation des TJs en s’associant
avec ZO-1. Une activation de la voie de signalisation en aval de VEGFR2 déclenche une
phosphorylation sérine/thréonine de l’occludine et une phosphorylation tyrosine de ZO-1
via PKC. Une phosphorylation de l’occludine induit un changement de conformation de
cette dernière et facilite l’exposition d’autres régions de la protéine susceptibles à des
modifications subséquentes. L’occludine devient alors une cible pour une internalisation
par endocytose où la protéine sera recyclée ou dégradée par le protéasome [10].
1.1.3.3. La régulation du flot sanguin
L’endothélium joue un rôle important dans la régulation de l’homéostasie vasculaire surtout
en ce qui a trait au maintien du tonus vasculaire, c’est-à-dire le débit sanguin. En effet, ce
phénomène repose sur des facteurs qui balancent la vasoconstriction et la vasodilatation du
système vasculaire [2]. Les cellules endothéliales synthétisent et sécrètent divers agents
vasoconstricteurs ou vasodilatateurs en réponse à des stimuli biochimiques ou physiques
[14]. Un déséquilibre au sein de la production de ces agents par l’endothélium vasculaire
conduit à une dysfonction endothéliale où résulte des pathologies cardiovasculaires incluant
l’hypertension, l’athérosclérose et le diabète [2]. Parmi les agents régulant le tonus
vasculaire, on retrouve l’oxyde nitrique (NO : Nitric Oxide) comme vasodilatateur et
l’endothéline-1 comme vasoconstricteur.
L’oxyde nitrique (NO) est synthétisé par une famille d’enzymes appelée les NO synthases
(NOS). Le NOS existe sous trois isoformes chez les mammifères : le NOS endothélial
(eNOS), le NOS inductible (iNOS) et le NOS neuronal (nNOS) [2, 15]. Les trois isoformes
partagent de 50 à 60 % d’homologie en acides aminés (a.a.). Ils comportent un domaine
oxygénase en N-terminal entouré des domaines de liaison à la L-arginine et à la
tétrahydrobioptérine (BH4), une région centrale de liaison à la calmoduline (CaM) et un
domaine réductase en C-terminal avec des sites de liaison au NADPH, au FAD et au FMN.
L’eNOS assure la biodisponibilité de l’oxyde nitrique (NO) qui est contrôlée par le cycle de
synthèse et de dégradation du NO. Les cellules endothéliales libèrent constitutivement du
NO en réponse à l’activation de l’eNOS. Le NO est un membre des radicaux libres et est
également une composante clé responsable de la régulation d’un éventail de processus
physiologiques et cellulaires incluant la migration et la prolifération de cellules
endothéliales, la dégradation de la matrice cellulaire, la relaxation du tonus vasculaire, le
maintien de la pression sanguine, l’agrégation des plaquettes, l’angiogenèse et la
mitogenèse. Ainsi, le NO devient un marqueur important de «l’état de santé» du système
vasculaire et surtout de l’intégrité physiologique du système cardiovasculaire [16].
L’activité de l’eNOS est principalement contrôlée par le biais d’interactions protéine-
protéine et par une multitude de sites pouvant être phosphorylés. En effet, la
phosphorylation de divers résidus sérine (S), thréonine (T) et tyrosine (Y) au sein de
l’eNOS joue un rôle primordial et même pivot concernant la régulation de son activité.
Plusieurs maladies cardiovasculaires découlent d’une perturbation dans la phosphorylation
de l’enzyme (Figure 1-7).
Figure 1-7. L’effet d’une variété de conditions pathophysiologiques et pathologiques
sur les sites de phosphorylation du eNOS.
Adapté de (Gopi Krishna Kolluru et al, 2010) [16].
19
En condition normale, la dimérisation de l’eNOS déclenche la production du NO en
catalysant une réaction d’oxydation qui convertit la L-arginine en L-citrulline par le biais
de sa liaison à un cofacteur, soit le BH4 (Figure 1-8). Le BH4 est essentiel pour l’activité
catalytique des trois isoformes du NOS puisque ce cofacteur agit sur la structure
enzymatique du NOS. Le changement de la conformation protéique de l’eNOS stabilise son
état homodimérique et accentue sa liaison avec la L-arginine [15]. La quantification du
niveau total de BH4 à l’intérieur d’une monocouche vasculaire de cellules endothéliales est
d’environ 60 %. La présence importante de ce composé au sein de l’endothélium révèle
donc son rôle crucial dans la régulation normale des cellules endothéliales et au bon
fonctionnement du système vasculaire. En effet, il y a une corrélation entre la réduction de
la biodisponibilité du BH4 et l’apparition de pathologies vasculaires associées au
dysfonctionnement de l’endothélium comme le diabète, la résistance à l’insuline,
l’hypertension, l’hypercholestérolémie, l’athérosclérose et les désordres reliés au
vieillissement [4]. La production et l’activité de l’eNOS peut être régulée par une multitude
de stimuli comme le stress de cisaillement, le stress oxydant, les hormones (œstrogènes par
exemple), la bradykinine, l’histamine, la thrombine et le glucose. Par ailleurs, le NO est
l’un des éléments impliqués dans la modulation de la perméabilité de l’endothélium
vasculaire. En effet, l’inhibition de la production basale en NO provoque une hausse de la
perméabilité à travers la barrière vasculaire.
Figure 1-8. Les mécanismes impliquant la production de l’oxyde nitrique (NO.) par
l’eNOS dans les cellules endothéliales.
Lorsque l’eNOS est dimérisé, ce dernier est responsable de la production du NO. dans un processus
de conversion de la L-arginine en L-citrulline. Le taux de production de l’anion superoxyde (O2.-)
est normalement bas. La production du NO.
à un taux approprié est nécessaire au bon
fonctionnement de l’endothélium. L’eNOS non-dimérisé est associé à une dysfonction endothéliale
causé par une baisse du NO. et à une hausse de l’O2
.-. Adapté de (A.K. Lund, 2010) [4].
L’endothéline-1 (ET-1), un peptide de 21 a.a., est un puissant vasoconstricteur synthétisé et
libéré primordialement par les cellules endothéliales. Il existe trois isoformes
d’endothéline : ET-1, ET-2 et ET-3. L’ET-1 joue un rôle important au niveau du tonus
vasculaire. L’activité de l’ET-1 est induite par deux types de récepteurs couplés aux
protéines G (GPCRs) du système vasculaire : le récepteur ET de type A (ETA) et le
récepteur ET de type B (ETB). Les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMs) et les
fibroblastes comportent les deux types de récepteur GPCR. Ainsi, la cellule endothéliale
synthétise une préproendothéline (un précurseur de 203 a.a.) laquelle est clivée et convertie
en ET-1 par l’ECE (Endothelin-Converting Enzyme). Cette dernière est alors libérée par la
cellule endothéliale et active les récepteurs ETA et ETB des VSMs lesquels induisent leur
vasoconstriction accompagnée d’une hausse d’un influx de calcium et l’activation de la
phospholipase C. Au même moment, le récepteur ETB de la cellule endothéliale régule leur
vasodilatation par la formation de NO. Des études récentes démontrent qu’une
surexpression de l’ET-1 au sein de l’endothélium provoque une augmentation de la
21
production en ROS, une production en TF (tissue factor) initiant l’agrégation des
plaquettes, une initiation de la circulation et une hausse de l’adhésion de leucocytes au sein
de l’endothélium et une baisse en NO. Cette régulation négative de l’eNOS par l’ET-1
découle d’une hausse de son association à la cavéoline-1. Par conséquent, la surexpression
de l’ET-1 conduit à une dysfonction endothéliale [4].
1.1.3.4. La réponse inflammatoire et la surveillance immunitaire
Les cellules endothéliales participent activement aux processus inflammatoires tant au
niveau de la surveillance qu’au niveau de la réponse immunitaire. Les propriétés des
cellules endothéliales se modifient au cours de la transition entre l’inflammation de courte
durée et l’inflammation chronique [17]. Il en est de même entre l’immunité innée et
l’immunité adaptative. Lorsque l’endothélium est au repos, les cellules endothéliales
vasculaires maintiennent la fluidité du sang, régulent le flot sanguin, contrôlent la
perméabilité de la barrière vasculaire et diminuent la circulation des leucocytes. De façon
générale, les cellules endothéliales au repos n’interagissent pas avec les leucocytes, car
elles présentent une absence de molécules d’attachement à leur surface comme les
sélectines et les VCAM-1 [18].
L’inflammation de courte durée consiste en un recrutement rapide de neutrophiles et
déclenche «l’activation de la cellule endothéliale» de sorte que l’endothélium acquiert de
nouvelles capacités en vue de retrouver son état normal. Cette activation de la cellule
endothéliale se défini en deux réponses : la rapide (l’activation de type I, soit la
stimulation) (Figure 1-9) et la lente (l’activation de type II, soit l’activation) (Figure 1-
10).
La stimulation débute par la liaison de ligands aux domaines extracellulaires de récepteurs
hétérotrimériques couplés aux protéines G (GPCRs) tel que l’histamine sur son récepteur
H1. Le contact ligand-récepteur catalyse l’échange du GDP (état inactif) en GTP (état actif)
sur la sous-unité hétérotrimérique intracellulaire Gαq déclenchant la dissociation de la sous-
unité α de la sous-unité dimérique Gβγ et active donc l’isoforme β de la phospholipase C
(PLCβ). Cette enzyme clive la phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) au
sein de la membrane plasmique, ce qui libère l’inositol-1,4,5-triphosphate (InsP3) lequel
conduit au largage d’ions Ca2+
en provenance du réticulum endoplasmique (ER) à
l’intérieur du cytoplasme. Ce largage d’ions conduit à une élévation cytosolique de Ca2+
, ce
qui active la phospholipase cellulaire A2 (cPLA2) ayant pour rôle de cliver la
phosphatidylcholine, au sein de la membrane, en acide arachidonique et en
lysophosphatidylcholine. Une fois libre, l’acide arachidonique est rapidement et
graduellement transformée par la cyclooxygénase-1 (COX1; aussi connu sous le nom de
prostaglandine H synthase 1 [PGH]) en PGH2 où se dernier est à son tour transformé en
PGI2 par la prostacycline synthase. Ce composé final est un vasodilatateur qui relaxe les
muscles lisses vasculaires des artérioles. Les ions cytosoliques Ca2+
interagissent également
avec une protéine adaptatrice, la calmoduline, qui active l’eNOS afin de produire du NO.
Le NO agit en synergie avec le PGI2 afin d’accentuer la relaxation de la barrière vasculaire.
De plus, le niveau élevé de Ca2+
dans le cytoplasme additionné de la formation du
complexe calmoduline- Ca2+
conduit à la phosphorylation du MLC via l’activation de la
MLCK. La MLC phosphorylée initie la contraction de filaments d’actine rattachés aux
protéines des TJs et des AJs. Par conséquent, cette contraction provoque la formation
d’espaces inter-endothéliaux, c’est-à-dire de «trous» entre les cellules endothéliales
adjacentes. Cela provoque un affaiblissement de la barrière vasculaire augmentant par le
fait même la perméabilité para-endothéliale. Cette hausse de la perméabilité facilite alors
l’entrée dans les cellules endothéliales de protéines en provenance du plasma ce qui leurs
permet de former une matrice provisoire par le biais de leur assemblage. Cette matrice
assure l’attachement, la survie, la migration et l’invasion de neutrophiles. Par ailleurs,
l’accumulation intracellulaire d’ions Ca2+
est également impliquée dans le recrutement de
leucocytes. La très grande majorité des leucocytes traversent la barrière endothéliale entre
les cellules endothéliales adjacentes. Les cellules endothéliales expriment entre leurs
jonctions des molécules d’adhérence comme la PECAM1 (platelet-endothelial cell
adhesion molecule 1; connue également sous le nom de CD31) et le CD99 qui sont
cruciales pour la migration transe-endothéliale de neutrophiles ainsi que de monocytes aux
sites inflammatoires. Afin d’assurer l’adhésion, la migration et l’invasion des leucocytes, la
phosphorylation du MLC induit l’exocytose des corps de Weibel-Palade (WPB) ramenant
la P-sélectine à la surface des cellules. La lysophosphatidylcholine, produite plus tôt, se
retrouve acétylée par la PAF (platelet-activating factor acetylase) produisant une forme
23
acyle de la PAF qui peut générer un signal d’activation de liaison entre la P-sélectine et le
leucocyte au sein de la membrane plasmique, ce qui initie la diapédèse, c’est-à-dire
l’extravasation du leucocyte [17].
Figure 1-9. Schéma de l’activation de type I des cellules endothéliales.
Adapté de (Jordan S. Pober & William C. Sessa, 2007) [17].
Il importe de noter que les signaux produits par les GPCRs n’ont qu’une durée d’environ 10
à 20 minutes après quoi il y a désensibilisation du récepteur. L’activation de type I limite
alors le degré d’inflammation en plus de limiter l’extravasation des leucocytes. Afin de
déclencher l’activation de type II, les cellules endothéliales doivent subir une forme
beaucoup plus persistante de l’inflammation. Les médiateurs typiques de l’activation sont
le TNFα (tumour-necrosis factor α) et l’IL-1β (interleukine-1β). Le TNFα est une cytokine
pléiotropique produite primordialement par des macrophages et des monocytes activés lors
d’un processus inflammatoire [19]. Ce ligand s’associe aux domaines extracellulaires de
son récepteur, soit le TNFR1 (TNF receptor 1; connu également sous le nom de CD120a).
Une fois le récepteur activé, ce dernier recrute des protéines comportant un domaine
TRADD (TNFR-associated via death domain) par le biais de son domaine intracellulaire
«death» (intracellular death domain). Cette association permet alors au domaine TRADD
de recruter la sérine/thréonine kinase RIP1 (receptor-interacting protein 1) et la protéine
TRAF2 (TNFR-associated factor 2) qui est une E3 ubiquitine ligase. L’association
TRADD-RIP1-TRAF2 forme un complexe protéique que l’on nomme «signalosome». Ce
signalosome peut initier diverses cascades de kinase ce qui favorise l’activation de facteurs
de transcription en vue de transcrire le facteur nucléaire-κB (NF- κB) ainsi que la protéine
AP1 (activator protein 1). En ce qui a trait à l’IL-1β, la liaison de ce ligand avec son
récepteur, soit le récepteur de type 1 de l’IL-1 (IL-1R1; type 1 IL-1 receptor), active une
voie de signalisation déclenchée par un complexe de signalisation comprenant MyD88
(myeloid differentiation primary-response gene 88) et TIRAP (Toll/IL-1 receptor accessory
protein; connu aussi sous le nom de MAL) au niveau des régions cytosoliques du récepteur.
Puis, MyD88 se dissocie rapidement du récepteur IL-1R1 afin d’interagir avec trois autres
protéines : IRAK1 (IL-1R-associated kinase 1), IRAK4 et TRAF6. Cette voie de
signalisation conduit à l’activation des mêmes facteurs de transcription que ceux activés par
le TNFα. Ainsi, les deux types de ligand déclenchent une hausse de la perméabilité aux
protéines en provenance du plasma, une réorganisation du cytosquelette d’actine et de
tubuline contribuant à la formation d’espaces inter-endothéliaux entre les cellules
endothéliales adjacentes [17]. En effet, le TNFα est reconnu pour induire des changements
morphologiques au sein des cellules endothéliales et augmenter la perméabilité de
macromolécules in vivo et in vitro. Toutefois, les mécanismes n’ont pas été
considérablement caractérisés [19]. Par ailleurs, l’activation assure un recrutement plus
important de leucocytes comparativement à la stimulation. En fait, le recrutement de
neutrophiles est assuré par les chimiokines tel que le CXCL8 (CXC-chemokine ligand 8;
aussi connu comme l’IL-8) et d’autres molécules d’adhésion des leucocytes comme la E-
sélectine. La E-sélectine est exprimée à la surface des cellules endothéliales via l’activation
de sa synthèse par des cytokines inflammatoires comme l’IL-1β et le TNFα. La fonction
majeure des sélectines se résume en la capture des leucocytes de la circulation sanguine par
les parois vasculaires endothéliales. Cette capture des leucocytes par l’endothélium est très
rapide et est suivie par leur «roulement» sur la barrière endothéliale. Le «roulement» des
leucocytes assure donc leur extravasation ainsi que leur migration au site inflammatoire. En
condition normale, c’est-à-dire en absence d’inflammation, les cellules endothéliales
n’interagissent pas avec les leucocytes en circulation dans le sang. Trois raisons expliquent
cet état de fait. Premièrement, comme il a été déjà mentionné ci-dessus, il y a absence de
molécules d’adhésion à la surface des cellules endothéliales au repos. Deuxièmement, la
25
production basale de NO inhibe l’adhésion des leucocytes ainsi que leur activation.
Troisièmement, le maintien de l’intégrité des jonctions d’adhérence (AJs) et des jonctions
serrées (TJs) au sein de cellules endothéliales n’ayant pas subit d’activation restreint le
passage inter-endothélial de leucocytes [18].
Figure 1-10. Schéma de l’activation de type II des cellules endothéliales.
Adapté de (Jordan S. Pober & William C. Sessa, 2007) [17].
De surcroît, en plus de leur activité lors de la réponse immunitaire, les cellules
endothéliales participent activement à la surveillance immunitaire. En effet, il importe de
noter que les cellules endothéliales forment une barrière à l’interface entre le sang et le tissu
adjacent. Or, les cellules constituant cette barrière sont positionnées d’une façon
particulière afin de pouvoir alerter, en périphérie, le bassin de cellules T mémoires
(TCD4+) en circulation de la présence de pathogènes étrangers. Cela est possible grâce à
l’acquisition locale de peptides dérivés de pathogène à la surface des cellules endothéliales
via leur complexe majeur d’histocompatibilité (CMH). Le CMH est une structure
polypeptidique servant de système de reconnaissance du soi qui est conservé chez la grande
majorité des vertébrés. Il existe deux classes de molécules de CMH : les CMH de classe I et
de classe II. Toutes les cellules nucléées de notre organisme expriment les CMH de classe I
sauf les neurones, la cornée et les glandes salivaires. Les CMH de classe II se retrouvent
plutôt chez les thymocytes, les cellules dendritiques, les monocytes, les macrophages, les
lymphocytes B et les granulocytes comme les éosinophiles et les basophiles. Dans le cas
présent, les cellules endothéliales agissent en tant que cellules présentatrices de l’antigène
(CPA), c’est-à-dire du non-soi, permettant la présentation du peptide étranger aux
lymphocytes T cytotoxiques (TCD8) et ou aux macrophages en vue d’induire leur
activation. Ainsi, les cellules endothéliales adoptent le rôle de sentinelle pouvant initier une
réponse immunitaire secondaire [18].
1.2. Le stress oxydant
1.2.1. Les espèces réactives de l’oxygène (ROS)
Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) forment une famille de molécules hautement
instables qui sont générées lors du métabolisme normal cellulaire à partir de la réduction
incomplète de molécules d’oxygène [20] (Figure 1-11). Il s’agit de molécules dépourvues
d’une paire complète d’électron sur leur orbite externe [4, 20-22]. C’est la raison pour
laquelle la très grande majorité des membres de la famille ROS sont classifiés en tant que
«radicaux libres» [4, 21]. Ces radicaux libres participent chimiquement à des réactions
d’oxydation/réduction avec d’autres molécules telles que les acides nucléiques, les
protéines, les carbohydrates et les lipides altérant par le fait même leurs fonctions. Parmi
les radicaux libres, on retrouve l’anion superoxyde (O2.-), le radical hydroxyle (
.OH),
l’oxyde nitrique (NO.) et le radical alkoxyle (R-O
.). Toutefois, le groupement ROS
comporte d’autres membres qui ne sont pas classifiés comme «radicaux libres». Il s’agit du
peroxyde d’hydrogène (H2O2), du peroxynitrite (ONOO-), de l’acide hypochlorique
(HOCl), de la peroxydase lipidique (LOOH) et l’oxygène seul (1O2). Même s’ils ne sont
pas des radicaux libres, ces derniers participent également à des réactions d’oxydation et de
réduction.
27
Figure 1-11. Les voies biochimiques de la production en ROS/RNS.
L’oxygène seul (1O2) subit une ou deux réductions en électron afin de produire l’anion superoxyde
(O-2) ou le peroxyde d’hydrogène (H2O2) respectivement. Le H2O2 est également dérivé de la
dismutation de l’O-2
. En présence de métaux comme le fer (Fe2-
) et le cuivre (Cu2+
), le H2O2 subit la
réaction de Fenton formant le radical hydroxyle (OH). Le H2O2 peut également être converti en
acide hypochlorique (HOCl) par le biais de la catalase de la myeloperoxydase (MPO). L’interaction
entre l’O-2
et l’oxyde nitrique (NO) conduit à la production du peroxinitrite (ONOO.) pouvant réagir
avec le CO2 pour former du nitrosoperoxocarboxylate (ONOOCO2-). Adapté de (Adel Boueiz &
Paul M. Hassoun, 2009) [20].
L’être humain est communément exposé à des agents environnementaux et à des agents en
milieu de travail qui sont responsables d’une production de ROS. Les composés polluants
de l’air et l’ozone en sont des bons exemples. La principale source de ROS provient
majoritairement des éléments de combustion comme ceux constituant la fumée de cigarette.
De plus, quelques médicaments utilisés en milieu clinique comportent des propriétés pro-
oxydatives tels que les agents chimio-thérapeutiques [20]. La source de ROS ne se limite
pas à notre environnement extérieur. À vrai dire, une grande partie de la production des
ROS provient des cellules constituant notre corps. Effectivement, il est connu depuis
longtemps que nos cellules endothéliales constituent une source importante de ROS [20,
23]. Ainsi, notre système vasculaire génère des ROS via divers processus métaboliques
oxydatifs comme la phosphorylation oxydative de la chaîne de transport d’électron
mitochondriale et le métabolisme de l’acide arachidonique; et via des enzymes comme les
oxydases NADH/NADPH, la xanthine oxydase, le cytochrome p450s, la NO synthétase, les
peroxydases et autres hémoprotéines [4, 21, 22].
1.2.2. Production et métabolisme des ROS dans le système vasculaire
Plusieurs types de cellules sont impliqués dans la production de ROS au sein du système
vasculaire comme les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC), les cellules
adventitielles et les cellules endothéliales. Ces cellules génèrent une quantité variable de
ROS, et ce, selon des réponses à divers stimuli. Le ROS vasculaire le plus abondamment
produit est nul autre que l’anion superoxyde (O2.-). En plus d’être un élément pivot dans la
synthèse d’autres ROS, ce dernier exerce un impact significatif sur les fonctions du système
vasculaire et, principalement, sur les fonctions des cellules endothéliales [4, 23]. Par
exemple, l’O2.- vasculaire peut interagir avec l’oxyde nitrique (NO) qui est le principal
vasodilatateur du système sanguin. Cette interaction provoque une diminution marquée de
la biodisponibilité du NO et, par conséquent, conduit à l’interruption de la vasodilatation
des vaisseaux sanguins. De plus, l’interaction entre l’O2.- vasculaire et le NO génère un
sous-produit appelé la peroxynitrite (ONOO-) qui est capable d’oxyder et de nitrosyler des
acides nucléiques, des lipides et des protéines, ce qui provoque des dommages aux cellules
[4]. Parmi les diverses sources de ROS dans le système vasculaire, il en sera question de
trois que nous allons détailler : les ROS mitochondriaux, les oxydases vasculaires
endothéliales NADH/NADPH et la xanthine oxydase.
1.2.2.1. Les ROS mitochondriaux
La mitochondrie génère la principale source d’énergie de la cellule, soit l’adénosine
triphosphate (ATP). Il s’agit d’une réaction chimique d’oxydoréduction qui nécessite un
carburant (principalement le glucose) et d’un comburant (le dioxygène). Les produits de la
réaction sont : le dioxyde de carbone (CO2) qui est évacué par la circulation sanguine grâce
à sa dissolution dans le plasma, l’eau (H2O), parfois de l’urée si le carburant contient de
l’azote et 36 ATP accompagnés d’énergie thermique. Ainsi, l’énergie libérée est
emmagasinée sous la forme d’ATP et de NADH. Lors de la respiration cellulaire, un
processus de phosphorylation oxydative se produit. Il se résume par le transfert d’électrons
en provenance du NADH ou du FADH2, formé au cours du déroulement du cycle de Krebs,
à une molécule d’oxygène. Le NADH et le FADH2 cèdent leurs électrons (processus
29
d’oxydation) à une série de complexes qui se retrouvent au sein de la membrane interne de
la mitochondrie : du complexe I (NADH-ubiquinone oxydoréductase), au complexe II
(succinate-ubiquinone oxydoréductase), au complexe III (ubiquinol-cytochrome c
réductase) et finalement au complexe IV (cytochrome c oxydase) (Figure 1-12). La chaîne
de transport d’électrons produit un flux d’électrons qui induit un pompage de protons à
travers la membrane. Cela est important afin d’assurer la production d’un potentiel
électrochimique, c’est-à-dire une force proton-motrice, conduisant à la synthèse d’ATP par
l’ATP synthétase. Environ 98 % des électrons sont impliqués dans la production d’ATP,
tandis que seulement 1 à 2 % des électrons s’échappent de la chaîne pour former de l’O2.-.
Néanmoins, l’O2.- produit est normalement récupéré par la manganèse SOD. Cependant,
dans des conditions physiopathologiques, la production d’O2.- est augmentée. Dans de telles
conditions, l’ADN mitochondrial (MtDNA) subit des dommages en raison de sa proximité
avec la source de ROS générée, de l’absence de protéines protectrices d’histone et d’une
faible activité de réparation des dommages à l’ADN. L’accumulation d’O2.- est donc
associée à une hausse susceptible au développement de l’athérosclérose [22].
Figure 1-12. La production des ROS par la mitochondrie.
Les électrons (e-) du NADH et du FADH2 passent à travers le complexe I et le complexe II,
respectivement, et dans le complexe III via l’ubiquinole. Le cytochrome c transfère les électrons du
complexe III au complexe IV lequel réduit l’O2 pour former du H2O. La circulation des électrons est
accompagnée par le transfert de protons (H+) en traversant la membrane interne mitochondriale à
partir des complexes I, III et IV créant un gradient électrochimique (ΔΨ). Les protons entrent à
nouveau dans la matrice mitochondriale à travers le complexe V lequel utilise la force motrice
protonique afin de générer de l’ATP. La force motrice protonique conduit également à l’échange
ATP-ADP par l’adénine nucléotide translocase (ANT). Les protéines non-couplées (UCPs) suivent
les protons afin de retourner dans la matrice, tandis que le complexe III génère de l’O.-2
à travers la
matrice et l’espace inter-membranaire. Le P66shc
dans l’espace inter-membranaire retranche des
électrons en provenance du cytochrome c pour produire de l’O.-2
. Le superoxyde est dismuté en
H2O2 par le SOD1 (Cu et le ZnSOD) dans l’espace inter-membranaire et par le SOD2 dans la
matrice. Le H2O2 est réduit en H2O par la peroxydase glutathione (GPX) en utilisant du glutathione
réduit (GSH). Puis, le glutathione oxydé (GSSG) retourne à son état réduit par la glutathione
réductase. Adapté de (Nageswara R. Madamanchi & Marschall S. Runge, 2007) [24].
1.2.2.2. Les oxydases vasculaires endothéliales NADH/NADPH
La structure des oxydases vasculaires NADPH est similaire à celle des premières oxydases
NADPH retrouvées chez les phagocytes du système immunitaire. Le corps catalytique de
ces dernières est composé de deux sous-unités transmembranaires, gp91phox (Nox2) et
p22phox, associées à trois sous-unités régulatrices cytosoliques du complexe : p47phox,
p67phox et p40phox (Figure 1-13). De plus, les GTPases rac1 et rac2 participent à
l’assemblage du complexe actif de l’oxydase NADPH [4, 22]. L’oxydase vasculaire
endothéliale NADPH produit un niveau basal constitutif d’O2.-. En effet, l’activation de
cette oxydase dépend d’agonistes comme l’angiotensine II (Ang II), la thrombine, le PDGF
et le TNFα. Chez des lapins souffrant d’hypercholestérolémie, on note une hausse de la
régulation du récepteur de l’Ang II de type AT1, suivi d’une augmentation de l’activité de
l’oxydase vasculaire NADPH provoquant alors une accumulation d’O2.-. Cette
accumulation de ROS a été associée au développement de l’athérosclérose chez ces lapins.
Chez l’humain, un niveau élevé d’agonistes comme la thrombine induit un stress important
appelé «stress oxydant» au sein de plaques d’athéromes. Tout récemment, il a été rapporté
que la sous-unité p22phox de l’oxydase NADPH est spatialement associée à la production
de ROS et d’Ox-LDL (lipoprotéine de basse densité oxydée) par les artères coronaires
humaines. Il importe de noter que la LDL est le transporteur du cholestérol dans le sang.
Lorsque ces transporteurs sont en excès, ces derniers sont oxydés puis phagocytés par les
macrophages afin d’en éliminer le surplus. Toutefois, s’il y a une augmentation du niveau
de ROS dans ces artères, alors il y aura une hausse d’oxydation des LDL. Un taux élevé
d’Ox-LDL provoquera une forte migration de macrophages dans le tissu sous-endothélial
31
et, par conséquent, une augmentation de macrophages spumeux, c’est-à-dire gorgés de
cholestérol et de triglycérides [22]. Il s’agit de l’étape d’initiation de l’athérosclérose.
Figure 1-13. La structure du NAD(P)H oxydase.
L’anion superoxyde (O.-2
) est produit dans le système sanguin, premièrement, via l’activité du
NAD(P)H lequel est impliqué dans la translocation des sous-unités cytosoliques Rac, p67phox
,
p47phox
et p40phox
aux sous-unités gp91phox
et p22phox
, déjà liées à la membrane. Adapté de (A.K.
Lund, 2010) [4].
1.2.2.3. La xanthine oxydase
La xanthine oxydase (XO) est une enzyme catalysant l’oxydation de l’hypoxanthine pour
former de la xanthine. Puis, la XO oxyde la xanthine en vue de produire de l’acide urique.
Dans ce processus, il y a production d’O2.- et d’H2O2 par réduction de molécules
d’oxygène. La XO existe dans le plasma sanguin et dans les cellules endothéliales.
Cependant, elle est absente chez les cellules musculaires lisses. Des facteurs comme
l’angiotensine II et la NADPH oxydase peuvent activer la XO chez les cellules
endothéliales vasculaires aortiques. La XO est une source majeure de stress oxydant
vasculaire sous des conditions physiopathologiques comme l’athérosclérose. En effet, des
études chez des patients souffrant d’hypercholestérolémie démontrent que l’usage de
l’oxypurinole (un inhibiteur de la XO) favoriserait la vasodilatation. De plus, chez de
jeunes individus asymptomatiques ayant de l’hypercholestérolémie familiale, il y a une
hausse de l’activité de la XO vasculaire, soit un évènement précoce de l’athérosclérose [4,
21, 22].
1.2.3. Le peroxyde d’hydrogène (H2O2)
Dans le domaine industriel, le peroxyde d’hydrogène (H2O2), également appelé eau
oxygénée ou perhydrol, se retrouve sous forme d’un liquide clair, un peu plus visqueux que
l’eau, incolore et comportant de puissantes propriétés oxydantes. Le H2O2 est un agent
blanchissant, un désinfectant et a déjà été utilisé comme comburant pour l’aéronautique
dans les années 1940.
À priori, l’ H2O2 existe naturellement chez les être vivants en tant qu’un sous produit de la
respiration cellulaire. Les organismes aérobies comportent des enzymes permettant
«d’éliminer» par décomposition le H2O2 en eau et en dioxygène (O2) grâce aux peroxydases
via une réaction exothermique de dismutation. La réaction de dismutation du H2O2 est la
suivante :
2 H2O2 → 2 H2O + O2 (–23,66 kcal)
De même, cette réaction est constituée par deux demi-équations d’oxydoréduction :
H2O2 + 2 H+ + 2 e
- 2 H2O (où H2O2 est l'oxydant)
H2O2 O2 + 2 H+ + 2 e
- (où H2O2 est le réducteur)
Plusieurs études ont démontré qu’une forte dose d’ H2O2 (> 50 µM) est cytotoxique pour
une large gamme de cellules animales, végétales et bactériennes en culture.
Paradoxalement, en terme chimique, le H2O2 est peu réactif et agit en tant qu’agent oxydant
intermédiaire ou d’agent réducteur intermédiaire. En effet, il n’oxyde pas aussi facilement
les molécules biologiques comme les lipides, les protéines et l’ADN. À vrai dire, le
véritable danger du H2O2 provient de sa conversion immédiate en radical hydroxyle (.OH)
soit par son exposition au rayonnement UV :
H2O2 → 2OH.
Ou par son interaction avec des ions métalliques. La principale interaction in vivo est celle
avec un ion provenant du fer :
Fe2+
+ H2O2 → complexes intermédiaires → Fe3+
+ OH. + OH
-
33
En chimie, cette équation se nomme «la réaction de Fenton». L’un des produits de cette
réaction, soit l’OH., est capable de détruire des biomolécules par oxydation. En effet, ce
radical libre est extrêmement réactif et cause des dommages à l’ADN chez des cellules en
culture. De plus, la myeloperoxydase, une protéine hème sécrétée par les phagocytes, peut
amplifier le potentiel oxydatif du H2O2 puisque leur interaction génère l’acide
hypochlorique (HOCl) qui est un ROS hautement oxydant qui peut réagir avec l’O2.- pour
former l’OH. [22, 25]. Par ailleurs, le H2O2 est généré in vivo par dismutation de l’O2
.-. Il
est également produit par une variété d’enzymes oxydases comme la glycolate, les
oxydases monoamines et la xanthine oxydase [25].
1.2.4. La dysfonction endothéliale et les pathologies
Les ROS sont normalement régulés via la synthèse balancée entre ces derniers et les
antioxydants. L’aspect d’équilibre de l’état redox au sein d’une cellule est extrêmement
crucial puisque, sinon, il y aura l’apparition du stress oxydant. Il y a stress oxydant lorsque
la production de composés pro-oxydants surpasse les mécanismes antioxydants endogènes
d’une cellule donnée. Dans un tel cas, une surproduction prolongée de ROS peut
éventuellement conduire à la propagation significative de «blessures» chez les cellules ainsi
que dans l’ensemble du système vasculaire que l’on nomme «lésions oxydatives» [4, 20,
23]. Un déséquilibre dans la régulation des ROS conduit à l’accumulation de l’O2.-
vasculaire qui, inévitablement, est responsable de l’accumulation du H2O2. Ensemble, ces
derniers provoquent un remodelage des cellules constituant le système vasculaire et
induisent des lésions oxydatives qui, à long terme, déclenchent la «dysfonction
endothéliale» [4]. Comme il a déjà été mentionné plus haut, l’intégrité et le bon
fonctionnement de l’endothélium dépend étroitement de l’équilibre de ses cinq fonctions.
Lorsque cet équilibre est rompu par la forte concentration en ROS, alors il y a dysfonction
endothéliale.
On peut déterminer la gravité de la dysfonction endothéliale par le biais de deux
observations : La hausse de la perméabilité endothéliale et l’augmentation de l’adhésion et
de l’extravasation des leucocytes. En effet, l’une des caractéristiques majeures de la
dysfonction endothéliale est l’altération de la structure de l’endothélium en raison d’une
augmentation de sa perméabilité. Il a déjà été démontré qu’une inhibition du NO produite
par les cellules endothéliales est responsable d’une hausse de la perméabilité à travers
l’endothélium vasculaire [4, 26]. De même, une seconde étude a démontré que l’Ox-LDL,
découlant de l’oxydation du LDL par les ROS, est impliqué dans l’augmentation de la
perméabilité de l’endothélium vasculaire via la formation de fibres de stress d’actine au
sein des cellules endothéliales en mode de stress et de la formation d’espaces inter-
endothéliaux à travers l’endothélium [4, 27]. Ces deux études font référence à un problème
structural important chez l’endothélium vasculaire «souffrant» de dysfonction endothéliale.
Ces lésions deviennent donc des marqueurs aux maladies cardiovasculaires qui précèdent
souvent les symptômes cliniques. À vrai dire, il a été établi que le degré de dysfonction
endothéliale pouvait être utilisé en tant qu’outil diagnostique afin de prédire cliniquement
les évènements cardiovasculaires [4]. L’incapacité de l’endothélium à négocier
efficacement avec le stress oxydant conduit à certaines pathologies cardiovasculaires
comme l’athérosclérose et l’hypertension. De surcroît, la perte de l’intégrité de
l’endothélium est un facteur permissif à l’épanchement de cellules cancéreuses lors de la
dissémination métastatique [23].
1.2.4.1. L’athérosclérose
Les maladies cardiovasculaires figurent parmi l’une des premières causes de mortalité la
plus courante dans les pays industrialisés. Les premiers responsables des maladies
cardiovasculaires sont l’athérosclérose et l’inflammation [28]. Le terme «sclérose» fait
référence à la dégénérescence fibreuse d’un tissu ou d’un organe. Avec le vieillissement,
les artères et les artérioles perdent leur élasticité pour faire place à la rigidité. Ce processus
s’appelle artériosclérose. L’athérosclérose est l’une des causes les plus graves
d’artériosclérose. L’athérosclérose est une inflammation chronique de l’intima de la paroi
artérielle qui s’accompagne de l’épaississement de cette dernière via la formation de
plaques d’athérome qui conduit à la sténose (rétrécissement de l’artère), puis à la thrombose
(obstruction de l’artère par un caillot sanguin) (Figure 1-14). Les plaques d’athérome
découlent de l’accumulation de lipides, de macrophages, de cellules musculaires lisses et de
composantes de la matrice extracellulaire. Plus précisément, la plaque d’athérome est
formée d’un noyau nécrotique, comportant des débris cellulaires, des cristaux de
cholestérol et de calcium. Ce noyau est entouré d’une couche fibreuse constituée de
macrophages spumeux, de cellules musculaires lisses et encore de cristaux de cholestérol.
35
L’évènement précoce dans l’initiation de l’athérosclérose est l’infiltration de cellules du
système immunitaire à travers la barrière artérielle. Comme il a déjà été mentionné plus
haut, les lipides et les molécules de LDL oxydées (Ox-LDL) endommagent les cellules
endothéliales ce qui induit l’expression de molécules d’adhésion comme la P- et la E-
sélectine, la VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1), la ICAM-1 (intracellular
adhesion molecule-1), ainsi que l’expression de molécules chimiotractantes comme la
MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1) et des facteurs stimulant les macrophages.
Les macrophages phagocytent les Ox-LDL afin de les éliminer. Toutefois, puisqu’il y a
trop de lipides à engloutir, alors ces macrophages deviennent spumeux et sécrètent à leur
tour des cytokines inflammatoires et des facteurs de croissance qui, par conséquent,
augmentent le niveau de ROS au sein des lésions et accélèrent la migration des cellules
musculaires lisses de la média vers l’intima [4, 22, 28]. Il y a alors la naissance d’une jeune
plaque d’athérome qui a lieu avant l’âge de 40 ans. Cette plaque va évoluer au cours des
années pour faire place à une plaque d’athérome fibro-lipidique, puis à une plaque
sténosante calcifiée vers l’âge de 60 ans.
Figure 1-14. Développement de l’athérosclérose.
La production de ROS par les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses et les
macrophages oxydant le LDL (dans l’espace subendothélial) aux sites de dommages de
l’endothélium déclenchent les évènements qui conduiront à la formation d’une plaque fibreuse. La
rupture de cette plaque provoque la formation d’un thrombus et une occlusion du vaisseau sanguin.
Adapté de (Nageswara R. Madamanchi et al, 2005) [22].
La hausse de la concentration en ROS est une cause directe du stress oxydant dans le
système vasculaire. Plus précisément, l’un des grands responsables du développement de
l’athérosclérose est le H2O2. En effet, ce dernier se retrouve impliqué dans les voies de
signalisation physiopathologiques de l’athérosclérose. Par exemple, le H2O2 induit des
voies de signalisation qui intensifient l’adhésion et l’invasion de monocytes, stimulent
l’activation de plaquettes sanguines et induisent la migration de cellules musculaires
lissent. Par ailleurs, les molécules de H2O2 induisent l’apoptose ou la nécrose, régulent
l’expression de plusieurs gènes et activent des molécules de signalisation cellulaire comme
le facteur nucléaire de transcription κB (NF-κB) et les MAPKs (mitogen-activated protein
kinases) [28]. Ainsi, le H2O2 agit également en tant que second messager.
1.2.4.2. L’hypertension
Le remodelage des parois du système artériel dépend de la synthèse et de la disponibilité
locale de facteurs de croissance ainsi que d’agents vasoconstricteurs ou vasodilatateurs. De
plus, la capacité du système vasculaire à répondre aux changements chroniques du flot
sanguin et de la pression artérielle dépend essentiellement du remodelage vasculaire. Dans
l’hypertension, le système artériel subit un remodelage structural caractérisé par une
hypertrophie de la paroi artérielle et, par conséquent, une diminution de la dilatation des
vaisseaux [29].
L’aspect moléculaire de l’hypertension est très complexe puisque plus de 50 gènes se
retrouvent impliqués dans la régulation de la pression sanguine. Par exemple, des études
ont démontré que les niveaux des peptides «vasoactifs» comme l’angiotensine II (Ang II),
l’endothéline-1 (ET-1) et l’AVP (arginine vasopressin) sont augmentés chez les modèles
de rats souffrant d’hypertension comme les SHRs (spontaneous hypertensive rats) [30]. La
surexpression de la sous-unité hétérotrimérique intracellulaire Giα fait partie de l’un des
facteurs contribuant à la pathogénèse de l’hypertension. Cette petite protéine G est
impliquée dans la régulation du système de l’adénylate cyclase. L’adénylate cyclase est une
enzyme transmembranaire dont le site catalytique se retrouve au domaine cytoplasmique.
Cette dernière utilise l’ATP et le magnésium (Mg++
) comme substrat afin de transformer
l’ATP en AMPc (adénosine monophosphate cyclique). La régulation «on/off» de
l’adénylate cyclase dépend de deux petites protéines Gα : la sous-unité stimulatrice (Gs) et
37
la sous-unité inhibitrice (Gi). L’AMPc est un second messager qui active la protéine kinase
A (PKA) ayant pour rôle de phosphoryler des protéines impliquées dans la contraction des
filaments d’actine, des protéines sarcoplasmiques et de réguler l’homéostasie intracellulaire
du calcium. La hausse de l’activité de l’Ang II est associée à l’augmentation de
l’expression de la protéine Giα dans les cas d’hypertension. De plus, chez les modèles de
rat SHRs, l’Ang II régule directement le complexe multi-protéique de l’oxydase vasculaire
NADPH en phosphorylant la sous-unité p47phox provoquant sa translocation à la
membrane cellulaire ce qui contribue à une forte production d’O2.- vasculaire. Le stress
oxydant provoqué par les ROS joue un rôle majeur dans les maladies cardiovasculaires
physiopathologiques dont l’hypertension. Chez les rats SHRs, la concentration en ROS est
très élevée. Cette condition s’ajoute à la forte activité de la Giα, à la baisse de production de
l’AMPc et à l’augmentation de l’activité de l’oxydase vasculaire NADPH [22, 29, 30].
1.2.4.3. L’épanchement de cellules cancéreuses
Une personne sur trois recevra le diagnostic d’un cancer au cours de son existence. Environ
un tiers de ces personnes mourront du cancer et, parmi eux, la mort sera causée par la
formation de métastases [31]. En effet, dans la majorité des cas de cancer, la mort de
l’individu est causée par la capacité de la tumeur à métastasier [32]. Le terme métastase
vient du grec et signifie «changement» ou «changer de place». Une métastase se défini
comme étant la croissance d’une cellule tumorale dans un site autre que celui de la tumeur
primaire. Il s’agit donc d’un processus au sein duquel il y a dissémination de cellules
cancéreuses en provenance de la tumeur primaire et migration vers un second site, c’est-à-
dire un nouvel organe cible. La migration peut se produire par la voie sanguine (voie
hématogène) ou par la voie lymphatique via des ganglions lymphatiques métastatiques
(adénopathies).
L’élément déclencheur de la tumorigenèse repose sur six à sept mutations spécifiques qui
affectent les proto-oncogènes ainsi que les gènes suppresseurs de tumeurs. Ces altérations
génétiques sont responsables de la transformation d’une cellule saine en un néoplasme
primaire caractérisé par une prolifération anarchique cellulaire et par une forte tendance à
se détacher de la niche initiale en vue de migrer ailleurs. Plusieurs études ont démontré que
le développement tumoral est étroitement relié à un «cross-talk» entre les cellules
cancéreuses et leurs microenvironnements intracellulaires et extracellulaires [31]. En 2000,
Douglas Hanahan et Robert A. Weinberg ont proposé six caractéristiques essentielles au
développement du cancer qu’ils ont nommé «the hallmarks of cancer». Il s’agit de six
aptitudes distinctives et complémentaires qu’une cellule en transformation doit acquérir
afin d’assurer la prolifération tumorale et la dissémination métastatique. Ainsi, une cellule
cancéreuse doit être apte à soutenir la prolifération cellulaire (1), à échapper aux
suppresseurs de croissance afin de maintenir sa croissance (2), à résister à la mort cellulaire
par apoptose (3), à se répliquer indéfiniment (4), à induire l’angiogenèse (5) et à activer les
mécanismes d’invasion et de formation de métastases (6) [33]. Puis, en 2011, de nouvelles
aptitudes ont fait émergence : éviter l’élimination par le système immunitaire (7), favoriser
les mutations et l’instabilité génétique (8), favoriser l’inflammation dans le tissu tumoral
(9) et déréguler le métabolisme énergétique au profit de la tumeur (10) [34] (Figure 1-15).
Ces quatre caractéristiques additionnelles reposent davantage sur la réponse inflammatoire
et les altérations microenvironnementales.
39
Figure 1-15. Les dix caractéristiques essentielles du cancer.
Cette figure expose les dix caractéristiques essentielles que doit acquérir une tumeur afin qu’elle
puisse se développer et pouvoir enclencher un processus de dissémination métastatique. De plus, on
y retrouve en périphérie de la figure différents agents thérapeutiques capables d’interférer chacune
des dix caractéristiques. Ces agents constituent une liste à titre illustratif du type de thérapie
clinique qui pourrait être développé. (Adapté de Douglas Hanahan & Robert A. Weinberg, 2011)
[34].
La formation de métastases est un processus hautement sélectif, c’est-à-dire que certaines
tumeurs forment préférentiellement des métastases dans certains organes donnés. Par
exemple, le cancer de la prostate métastasie habituellement dans les os, le cancer du côlon
métastasie dans le foie et, chez les femmes, le cancer de l’estomac métastasie généralement
dans les ovaires (tumeur de Krukenberg). En effet, ce phénomène s’explique par
l’hypothèse du «seed and soil» où la graine est la métastase et le sol représente le
microenvironnement. La formation des métastases dépend des interactions spécifiques entre
la cellule cancéreuse, la cellule endothéliale et l’environnement dans lequel elles se
trouvent. Les molécules d’adhérence des cellules endothéliales (sélectines et intégrines)
jouent un rôle crucial dans ces phénomènes d’interaction puisqu’elles sont spécifiques aux
cellules endothéliales de l’organe cible. La cellule cancéreuse doit interagir de façon
synergique avec son environnement afin de former un néoplasme et de coloniser d’autres
organes [31]. De plus, il importe de savoir que le microenvironnement tumoral est un
milieu complexe, dynamique et en continuelle évolution selon la progression de la tumeur.
Les organes-sites de métastases comportent un microenvironnement qui diffère de celui
d’autres organes et de la tumeur primaire. Le patron d’expression génique des cellules
métastatiques est différent des cellules constituant la tumeur primaire puisque l’expression
des gènes d’une tumeur donnée dépendra de son microenvironnement.
1.2.4.3.1. Le fertilisant du «soil»
En 1882, le Dr. Stephen Paget propose l’hypothèse du «seed and soil» (la graine = cellule
cancéreuse et le sol = microenvironnement) afin d’expliquer que les cellules cancéreuses
ont besoin d’un microenvironnement spécifique afin d’assurer leur croissance, leur
propagation et la dissémination métastatique. Dans cette hypothèse, le microenvironnement
tumoral joue un rôle majeur au niveau de la progression du cancer. Plusieurs études
suggèrent que le H2O2 peut être un fertilisant clé du «soil» en agissant comme un accélérant
vis-à-vis au vieillissement, aux dommages de l’ADN, à l’inflammation et au métabolisme
du cancer [35, 36]. Selon la théorie du vieillissement dû aux radicaux libres, l’accumulation
de défauts au sein des fonctions mitochondriales conduit à une augmentation de la
production en ROS, à l’occurrence le H2O2, provoquant alors une accumulation de
dommages à l’ADN [35, 37, 38]. Ces dommages de l’ADN augmentent donc la
susceptibilité, chez un individu donné, à développer un cancer au cours de sa vie. Il est
également suggéré que le passage d’une cellule normale en une cellule cancéreuse peut être
facilité par la production de H2O2. Il s’agit donc d’une transformation néoplasique d’une
cellule donnée via l’activation d’oncogènes due à la présence concentrée de ROS au sein du
microenvironnement cellulaire.
En effet, il importe de savoir que l’activation oncogénique initie précisément la
tumorigenèse puisqu’elle outrepasse directement les programmes physiologiques, ce qui
induit alors une prolifération anarchique en contournant les mécanismes de «checkpoint»
essentiels pour maintenir l’intégrité génomique, le renouvellement et la mortalité
cellulaires. Ainsi, pour qu’une cellule puisse subir une transformation néoplasique, deux
41
étapes sont essentielles. La première étape repose sur la dérégulation de la
prolifération/croissance cellulaire via les oncogènes dominants, c’est-à-dire ceux qui
perturbent l’horloge du cycle cellulaire (dépendance oncogénique), et ce, par des mutations
qui modifient le besoin en facteurs de croissance et des mutations qui ciblent le point de
restriction contrôlé par pRB dans le «late G1 checkpoint». La seconde étape consiste en la
dérégulation des mécanismes intrinsèques de suppression tumorale, soit la dérégulation des
voies pRB/E2F et p53/Arf.
La production de ROS par des bactéries comme H. pylori ou par des virus tels que le virus
de l’hépatite B (VHB), le virus du papillome humain (VPH) et le virus Epstein-Barr (VEB)
ou virus de l’herpès 4 provoque la formation de cancers propres à chacun de ces agents
infectieux. On parle alors du cancer de l’estomac pour H. pylori, du cancer du foie pour le
VHB, du cancer du col de l’utérus pour certains génotypes du VPH et du lymphome de
Burkitt pour le VEB. Il est même possible que la grande consommation de wasabi par les
japonais (un condiment qui produit beaucoup de H2O2) pourrait expliquer le fait qu’on
observe le plus haut taux de cancers gastriques au Japon par rapport au reste du monde
[35].
De ce fait, Michael P. Lisanti et Ubaldo E. Martinez-Outschoorn proposent un modèle à
l’intérieur duquel le H2O2 est un agent cancérigène doté d’un potentiel mutagénique
capable d’initier des évènements tumoraux précoces, et ce, au sein d’un environnement
ayant préalablement subit un stimulus quelconque (la radiation, l’inflammation et le
vieillissement normal, par exemple) qui a provoqué une surproduction de H2O2 (Figure 1-
16). Les cellules cancéreuses produisent et sécrètent également du H2O2 afin de «fertiliser»
le microenvironnement tumoral. Cet environnement induit donc un stress oxydant chez les
cellules adjacentes aux cellules cancéreuses comme les fibroblastes. Par conséquent, les
fibroblastes vont se convertir en myofibroblastes. Ces cellules occupent un rôle significatif
dans la plasticité, la migration et la motilité dans le tissu conjonctif, et ainsi que dans la
propagation d’un signal inflammatoire par le biais d’une production en H2O2. Ce stress
oxydant active deux principaux facteurs de transcription : HIF1α et NFκB. Ces derniers
participent au déclenchement de l’inflammation, de la glycolyse aérobique, de l’autophagie
et de la mitophagie au sein du microenvironnement tumoral. Il s’agit donc de l’implantation
d’un métabolisme stromal servant à produire et à fournir des nutriments hautement
énergétiques aux cellules cancéreuses. Cet état de fait crée et entretient un milieu
mutagénique essentiel afin de favoriser la croissance tumorale, sa progression et la
métastase. Il s’agit du «field effect», c’est-à-dire qu’une zone entière d’un tissu semble
normale, alors qu’elle a été, en fait, «cancérisée» via le stress oxydant et les dommages
reliés à l’ADN.
Figure 1-16. La fertilisation du microenvironnement tumoral via la production de
H2O2.
Des cellules cancéreuses produisent et sécrètent du H2O2 provoquant un stress oxydant chez les
fibroblastes adjacents aux cellules cancéreuses. Il y a alors une fertilisation du microenvironnement
tumoral par la différentiation des myofibroblastes et l’activation de deux facteurs de transcription
majeurs, c’est-à-dire HIF1α (glycolyse aérobique) et NFκB (inflammation). Ces facteurs de
transcriptions contribuent à l’induction de l’autophagie et de la mitophagie. Par ailleurs, cette
fertilisation par les ROS comporte un effet mutagénique sévère. Adapté de (Michael P. Lisanti et al,
2011) [35].
Le métabolisme de toutes les cellules en prolifération, y compris les cellules cancéreuses,
utilisent la glycolyse aérobique afin de produire de l’énergie (ATP) et d’incorporer les
nutriments nécessaires à la biomasse (nucléotides, acides aminés et lipides) en vue de
produire une nouvelle cellule. Il s’agit de «l’effet Warburg», un processus par lequel les
cellules en prolifération convertissent la majeure partie du glucose en lactate (Figure 1-17).
La glycolyse aérobique est beaucoup moins efficace que la phosphorylation oxydative
43
(chez les tissus différenciés) dans la production d’ATP, car ~10 % du glucose est dévié
dans les voies de biosynthèse en amont de la production de pyruvate [39]. Néanmoins, ce
mécanisme est plus rapide que la phosphorylation oxydative. Les voies métaboliques en
action dans la prolifération cellulaire sont directement régulées par le biais de voies de
signalisation impliquant des oncogènes et des suppresseurs de tumeurs. Ainsi, «l’effet
Warburg» est contrôlé par les voies suivantes : PI3K/AKT (PKB), mTOR/HIF (hypoxia-
inductible factor), p53, MYC, AMPK (AMP-activated protein kinase) et LKB1 (liver
kinase B1). La voie de signalisation PI3K régule l’assimilation du glucose et son utilisation
par l’hyper-activation de mTOR. Cette signalisation assure la translocation du glucose par
l’expression de transporteurs, rehausse la capture du glucose par l’hexokinase (à la
membrane plasmique des cellules normales) qui phosphoryle immédiatement le glucose en
glucose-6-phosphate (G6P) après son entrée dans la cellule, ce qui assure l’initiation de la
cascade glycolytique et stimule l’activité de la phosphofructokinase. Les tumeurs malignes
modifient l’expression de l’hexokinase II (HKII) par des altérations génétiques
(amplifications) et épigénétiques (méthylations), ce qui favorise la sortie de l’ATP hors de
la mitochondrie via l’association de HKII avec VDAC (voltage dependent anion channel) à
la surface mitochondriale. Une fois hyperactivée par l’inhibition de son régulateur négatif
(TSC2), mTOR active le facteur de transcription HIF1 qui amplifie la transcription des
gènes encodant les transporteurs du glucose (GLUT) et les enzymes glycolytiques. De plus,
HIF1 active PDK (pyruvate dehydrogenase kinase) qui bloque l’entrée du pyruvate (un
dérivé du glucose) dans le cycle de Krebs. HIF1 collabore également avec MYC afin
d’activer la LDHA (lactate dehydrogenase A) pour transformer le pyruvate en lactate.
MYC exprime préférentiellement la forme embryonnaire M2 du pyruvate kinase (PK-M2)
au sein des cellules tumorales puisqu’elle est requise dans la prolifération des cellules
cancéreuses dans un contexte de glycolyse aérobique. En effet, la PK-M2 dirige le carbone
vers des voies complémentaires (comme la PPP et la synthèse du glycérol) afin de produire
des macromolécules précurseurs nécessaires à la prolifération cellulaire.
Figure 1-17. La représentation schématique de l’effet Warburg.
Warburg a observé que les cellules cancéreuses ont tendance à convertir la plupart du glucose en
lactate même en présence d’oxygène. En effet, en présence d’oxygène, les tissus différentiés
métabolisent premièrement le glucose en pyruvate grâce à la glycolyse, puis le pyruvate est oxydé
dans la mitochondrie durant la phosphorylation oxydative. Lorsque les cellules se retrouvent
limitées en oxygène, le pyruvate généré par la glycolyse est alors transformé en lactate (glycolyse
anaérobique). Toutefois, l’effet Warburg (glycolyse aérobique) est beaucoup moins efficace que la
phosphorylation oxydative pour générer de l’ATP. Adapté de (Matthew G. Vander Heiden et al,
2009) [39].
1.2.4.3.2. La formation d’une métastase
La métastase tumorale consiste en un processus en plusieurs étapes séquentielles et inter
reliées au cours desquelles des cellules malignes se propagent d’une tumeur primaire vers
un organe cible [31, 34, 40-42]. À chacune des étapes de la genèse d’une métastase, on
retrouve des mécanismes de défense et de régulation qui peuvent empêcher ou permettre la
dissémination métastatique selon qu’ils sont fonctionnels ou défaillants [40]. Tout d’abord,
il existe plusieurs différences entre une tumeur bénigne et une tumeur maligne. En effet, la
croissance des tumeurs bénignes est généralement lente. Elles se retrouvent enfermées à
l’intérieur d’une sorte de capsule fibreuse, elles sont non-invasives et ressemblent
morphologiquement à leurs cellules précurseures. À l’opposé, les tumeurs malignes sont
45
rarement encapsulées, elles ont une croissance rapide, elles sont capables d’envahir les
tissus adjacents, elles comportent des anormalités morphologiques par rapport aux cellules
constituant le tissu d’origine et elles peuvent métastasier [41]. Il importe de savoir que les
étapes de la genèse métastatique sont généralement les mêmes pour toutes les tumeurs
malignes. Toutefois, seulement quelques tumeurs primaires sont aptes à donner naissance à
une métastase. À vrai dire, les néoplasmes primaires sont biologiquement hétérogènes et
contiennent des sous-populations de cellules tumorales qui diffèrent entre elles au niveau
génotypique et phénotypique. C’est la raison pour laquelle seulement un faible pourcentage
de cellules cancéreuses réussi à passer à travers toutes les étapes du processus métastatique
[40, 41] Le processus métastatique comporte dix étapes :
1. La formation d’une tumeur primaire. Comme il a été mentionné précédemment,
il s’agit de la transformation d’une cellule normale en une cellule tumorale via la
somme de diverses altérations génétiques. Ces dernières permettent à la cellule
tumorale en transformation d’acquérir des caractéristiques morphologiques et
fonctionnelles spécifiques, et ce, selon les dix aptitudes essentielles au
développement du cancer établi par Hanahan et Weinberg [33, 34].
2. La prolifération et l’angiogenèse. L’angiogenèse consiste en la formation de
nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants. Chez l’adulte, ce
phénomène est réprimé sauf dans certains cas comme le développement tumoral et
le processus métastatique, par exemple. Lorsqu’une tumeur est irriguée, elle peut
croître exponentiellement en raison d’un apport accru en nutriments/oxygène et ce
réseau pourra servir à la dissémination de cellules cancéreuses lors de la métastase.
La vasculature dans un cancer diffère de la normalité, c’est-à-dire que les vaisseaux
sanguins sont tortueux, irréguliers avec une mince paroi comportant des fuites. De
plus, ils sont déficients en péricytes et expriment des molécules dites pro-
angiogéniques comme le VEGF-A humain. Lorsqu’il y a une absence d’irrigation
au centre de la tumeur, cette dernière est alors exposée au phénomène d’hypoxie, ce
qui enclenche l’activation d’un processus appelé «switch angiogénique» qui
caractérise normalement l’état d’équilibre de la régulation de l’angiogenèse par les
facteurs pro- ou anti-angiogéniques. La réponse des cellules endothéliales aux
VEGF-A provoque plusieurs étapes : la vasodilatation et l’étalement, la dégradation
de la matrice extracellulaire, la prolifération et la migration, et l’assemblage ainsi
que la maturation.
3. L’invasion du tissu de soutien et l’intravasation (l’entrée de la cellule tumorale
dans la lumière du vaisseau sanguin). À cette étape, il y a perte de l’adhésion
intercellulaire et d’attachement au substrat. Il y a alors détachement de la cellule
cancéreuse du néoplasme primaire. Il s’agit d’une étape clé dans l’initiation du
processus métastatique. Cet évènement est étroitement relié à la transition épithélio-
mésenchymateuse (EMT : epithelial-mesenchymal transition), c’est-à-dire un
processus morphogénique au cours duquel les cellules épithéliales perdent leurs
caractéristiques et acquièrent de nouvelles propriétés dites mésenchymateuses
durant la progression du cancer. Cela facilite la migration ainsi que l’invasion de la
cellule tumorale dans un tissu distant. Après leur détachement, les cellules
cancéreuses entre dans un vaisseau sanguin ou lymphatique préexistant ou
nouvellement formé afin de disséminer. Il s’agit de l’intravasation. Afin de faciliter
l’accès au système sanguin/lymphatique à la cellule tumorale, il y a dégradation de
la matrice extracellulaire par la cellule motile qui lui permet de se diriger
progressivement vers la vasculature.
4. La préparation à la migration. Il importe de savoir qu’une cellule cancéreuse en
circulation dans le système sanguin ne s’implantera pas nécessairement dans un
organe cible. En fait, la plupart d’entre elles vont être éliminées rapidement dès leur
entrée dans la circulation sanguine. Effectivement, la cellule cancéreuse doit se
protéger afin de survivre aux multiples agressions comme la pression sanguine, la
friction dans les capillaires, le système immunitaire etc. Pour réussir, ces dernières
recrutent des plaquettes qui s’agrègent autour d’elles, ce qui permet de les protéger
contre le stress mécanique et les leucocytes.
47
5. Le transport par le flot sanguin. Les cellules tumorales entrent dans la circulation
sanguine directement ou indirectement par le biais du système lymphatique. À cette
étape, la cellule cancéreuse voyage à travers le réseau vasculaire grâce au flot
sanguin. Cependant, il importe de prendre en considération qu’il n’y a aucune
corrélation entre le nombre de cellules tumorales en circulation et la probabilité de
succès du processus métastatique. En vérité, seulement un très faible pourcentage de
cellules cancéreuses en circulation réussit à compléter le processus métastatique,
soit de 0.01 % [31].
6. L’arrêt dans un organe cible. Les cellules tumorales en circulation ayant réussi à
survivre aux divers stress vont profiter du ralentissement du flot sanguin afin de
pouvoir s’agréger à un organe cible, à s’y fixer afin de pouvoir s’y développer.
Ainsi, l’arrêt d’une cellule cancéreuse dans un site spécifique dépend de plusieurs
facteurs : la circulation depuis la tumeur primitive, la taille du lit capillaire de
l’organe cible, les facteurs de croissance tissulaire et la surveillance immunitaire.
Par ailleurs, depuis quelques années, un nouveau modèle a fait son apparition dans
la littérature scientifique et permettrait d’expliquer le «choix préférentiel» de
certaines cellules cancéreuses à métastasier dans un organe cible x plutôt que dans
un organe y. Il s’agit du «homing» où des cellules métastatiques sont positivement
attirées de manière chimiotactique à des organes spécifiques. Ces organes
particuliers expriment des chimiokines qui servent physiologiquement de
mécanisme d’autoguidage, et ce, au moyen de récepteurs situés en surface des
métastases. L’équipe du Dr. Kang a déterminé que l’expression du gène CXCR4
chez les cellules cancéreuses du sein constitue une signature d’expression génique
clé propre aux cellules métastatiques des os. Effectivement, CXCR4 (CXC-
chemokine receptor 4) est un récepteur pour la protéine chimiotactique CXCL12
(CXC-chemokine ligand 12). Cette chimiokine est préférentiellement exprimée par
les cellules stromales des organes cibles des métastases du sein. Parmi les organes
cibles exprimant la chimiokine CXCL2, on retrouve la moelle osseuse, le cerveau,
le foie, les ganglions lymphatiques et les poumons. Dans un tel contexte, l’organe
cible serait beaucoup plus réceptif à l’implantation de la métastase et permettrait
une meilleure colonisation et prolifération de l’envahisseur. Par exemple, le
carcinome du sein comporte une plus grande affinité à métastasier dans la moelle
osseuse, aux poumons et dans les tissus du cerveau, tandis que le carcinome
colorectal et pancréatique métastasient préférentiellement au foie et au poumon [41,
43, 44].
7. L’adhérence à la paroi vasculaire interne. L’interaction adhésive entre les
cellules cancéreuses et les cellules endothéliales est une condition préalable pour
assurer l’extravasation des cellules tumorales en circulation ainsi que leur
dissémination métastatique. L’adhérence à la paroi vasculaire interne nécessite des
interactions spécifiques entre les récepteurs d’adhésion présents à la surface des
cellules endothéliales vasculaires et leurs ligands ou contre-récepteurs à la surface
des cellules cancéreuses. Par exemple, la E-sélectine est un récepteur d’adhésion
spécifique aux cellules endothéliales qui sont activés par un stimulus pro-
inflammatoire. En condition normale, la E-sélectine assure l’adhésion des
leucocytes à l’endothélium en vue de permettre leur extravasation au sein des tissus
enflammés. Toutefois, lors du processus métastatique, les cellules tumorales
s’emparent du système inflammatoire et interagissent avec la E-sélectine pour
extravasaser à l’intérieur des organes cibles. La liaison de la cellule cancéreuse à la
E-sélectine implique la présence d’un contre-récepteur spécifique au récepteur
d’adhésion. Ce contre-récepteur est constitué de déterminants carbohydrates sialyl
Lewis-a/x qui sont supportés par des protéines ou lipides transporteurs à la surface
de la cellule cancéreuse. La liaison est dépendante au calcium (Ca2+
) et elle est
permise par le domaine lectine en N-terminal de la E-sélectine. Diverses études ont
démontré que l’adhésion de la cellule cancéreuse à la E-sélectine stimule
l’activation d’une signalisation de retour (reverse signaling) vers l’intérieur de la
cellule tumorale provoquant la modulation du potentiel métastatique de cette
dernière. En effet, il a déjà été rapporté que la liaison entre le contre-récepteur DR3
(Death receptor 3), présent à la surface de cellules cancéreuse du colon (HT-29), et
la E-sélectine déclenche l’augmentation de la perméabilité endothéliale habilitant la
49
migration transendothéliale ainsi que le potentiel de survie de la cellule tumorale via
l’activation des voies p38/ERK MAPK et PI3K/NFκB [31, 42, 45, 46].
8. L’extravasation de la cellule cancéreuse au sein de l’organe cible. À cette étape,
la cellule cancéreuse ayant réussi à s’adhérer à la paroi vasculaire interne irriguant
l’organe cible migre à l’intérieur du tissu en passant à travers la barrière
endothéliale affaiblie via une hausse de la perméabilité para-cellulaire [31, 47, 48].
9. L’adaptation au microenvironnement (la colonisation). Une fois installée à
l’intérieur de l’organe cible, la cellule tumorale doit obligatoirement s’adapter à son
nouvel environnement. La croissance de cette dernière dépend de la compatibilité
entre la cellule métastatique et son microenvironnement. Il s’agit encore du principe
du «seed and soil». En effet, la plupart des cellules cancéreuses nouvellement
implantées mourront par apoptose initiée via un microenvironnement hostile à la
cellule colonisatrice. Ainsi, seulement un faible pourcentage d’entre elles seront
capables d’initier la division cellulaire en vue de produire des micrométastases.
Toutefois, de récentes études suggèrent que le foyer métastatique peut être
préalablement formé par le néoplasme primaire. En fait, la tumeur primaire produit
des facteurs (intégrines, cytokines et VEGFR1, par exemple) afin d’induire la
formation d’un microenvironnement permissif à l’ensemencement de cellules
métastatiques au sein de l’organe cible. Il s’agit du principe de la niche pré-
métastatique [41].
10. La formation d’une tumeur secondaire. À cette étape, la cellule métastatique est
apte à former un néoplasme secondaire au sein d’une nouvelle niche. Ainsi, cette
nouvelle tumeur reproduira le même schéma que celui de la tumeur primaire [14].
1.2.4.3.3. La barrière endothéliale et l’invasion tumorale
La malignité d’un néoplasme dépend principalement de sa grosseur, de sa localisation
tissulaire, de sa capacité à se propager au sein des tissus adjacents et de sa capacité à
métastasier vers un second organe cible. Toutefois, au cours du processus métastatique, la
cellule tumorale interagit à deux reprises avec les cellules endothéliales vasculaires, soit
lors de l’intravasation et de l’extravasation. Il s’agit de deux étapes critiques dans la
formation d’une métastase. L’impact de l’interaction entre les cellules endothéliales et les
cellules cancéreuses par rapport à l’invasion de ces dernières au sein de la matrice
extracellulaire tridimensionnelle (3D-ECM : Three-Dimensional Extracellular Matrix)
demeure largement méconnu [32, 49]. En effet, deux questions fondamentales doivent être
élucidées : L’intravasation et l’extravasation des métastases sont-elles des processus actifs
ou passifs? Les cellules cancéreuses traversent-elles la barrière endothéliale via les
jonctions cellules-cellules (la perméabilité para-cellulaire) ou à travers le corps cellulaire
(la perméabilité trans-cellulaire)? Ces deux questions nous conduisent donc à s’interroger
plus globalement sur le rôle de l’endothélium face au cancer.
Comme il fut mentionné précédemment, l’endothélium est une barrière dynamique semi-
perméable à l’interface du sang et des tissus sous-jacents assurant une régulation
minutieuse de ses cinq fonctions biologiques. Il est donc constitué de cellules endothéliales
dotées d’une grande plasticité. Plusieurs études ont démontré que l’endothélium agit en tant
que barrière contre l’invasion des cellules cancéreuses [49]. De plus, il importe de
considérer que la migration transendothéliale et l’invasion des cellules cancéreuses sont des
processus très complexes et qui dépendent beaucoup des propriétés biomécaniques et
biochimiques de la barrière endothéliale et des tissus connexes. Ainsi, le
microenvironnement tumoral et la métastase elle-même peuvent avoir un impact important
dans la régulation des propriétés biomécaniques et biochimiques de l’endothélium.
Une étude récente a permis de visualiser et de quantifier en temps réel les interactions entre
les cellules tumorales et une monocouche endothéliale dans un système en trois
dimensions, et ce, dans un contexte d’invasion et d’intravasation tumorales [50]. Le
système utilisé est l’essai microfluidique in vitro qui permet de mesurer précisément
l’impact des facteurs micro-environnementaux et tumoraux sur une barrière endothéliale
dans une perception tridimensionnelle. Selon les résultats, la modulation de la perméabilité
de la barrière endothéliale par l’addition de facteurs biochimiques comme le TNFα ou par
les macrophages facilitent l’intravasation des cellules MDA231 (carcinomes du sein; le
51
modèle tumoral utilisé) entre les cellules endothéliales. L’étude a également démontré
qu’une surexpression du VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) par les cellules
cancéreuses provoque une perturbation de la barrière endothéliale, ce qui facilite leur
migration transendothéliale. Dans des conditions normales, les cellules MDA231
demeurent de façon prédominante à la surface basale de l’endothélium. Cependant, lorsque
la perméabilité endothéliale est en hausse, le nombre de cellules cancéreuses en migration
se retrouve alors augmenté. Cela suggère donc que, dans des conditions particulières, les
interactions entre les cellules cancéreuses et les cellules endothéliales sont favorisées. À
partir de leurs observations, l’équipe suggère également que la hausse de l’intravasation
tumorale et des interactions cellules cancéreuses/cellules endothéliales peut être associée à
un remodelage physique de la barrière endothéliale. Effectivement, il ne faut pas perdre en
vue que la barrière endothéliale est un système dynamique répondant à tout genre de
stimulus. Ainsi, l’intravasation et l’extravasation des métastases semblent être des
évènements actifs. De surcroît, la migration transendothéliale tumorale semble se faire
selon une perméabilité dite para-cellulaire.
Une seconde étude à propos des interactions entre des cellules cancéreuses et l’endothélium
a démontré que les cellules tumorales invasives altèrent les propriétés biomécaniques des
cellules endothéliales [49]. Afin d’étudier les interactions entre la barrière endothéliale et
les cellules cancéreuses invasives, deux lignées de cellules cancéreuses du sein chez
l’humain ont été utilisées : la lignée MCF-7 (cellules tumorales faiblement invasives) et la
lignée MDA-MB-231 (cellules tumorales fortement invasives). Ces deux lignées
cancéreuses ont été cultivées en présence de trois types d’endothélium : la première avec
des cellules HUVECs (human umbilical vein endothelial cells), la seconde avec des cellules
HPMECs (human pulmonary microvascular endothelial cells) et la dernière avec des
cellules HDMECs (human dermal microvascular endothelial cells). Selon les résultats,
seulement les cellules cancéreuses fortement invasives sont capables de réguler les
propriétés biomécaniques de la barrière endothéliale. En effet, les observations suggèrent
que les cellules MDA-MB-231 diminuent la rigidité mécanique de l’endothélium en
induisant la déformation des cellules endothéliales via l’activation du remodelage
dynamique du cytosquelette d’actine afin de pouvoir transmigrer à travers la monocouche
endothéliale [32, 49]. Cette modulation physique de la barrière endothéliale doit avoir un
impact majeur sur la perméabilité para-cellulaire du système.
1.3. Le cytosquelette et la perméabilité endothéliale
1.3.1. L’actine
L’actine est la composante majeure du cytosquelette cellulaire. Elle se retrouve dans toutes
les cellules du corps humain. Il s’agit donc d’une protéine ubiquitaire. L’actine est une
protéine dite bi-globulaire et représente jusqu’à 15 % de la masse totale en protéine d’une
cellule. Au cours de l’évolution chez les eucaryotes, l’identité isotypique de l’actine entre
l’humain et la levure, comme S. cerevisiae, a été fortement conservée, soit plus de 90 %.
Cette protéine est primordiale pour l’architecture et les mouvements cellulaires surtout chez
les cellules endothéliales.
Il existe six grandes isoformes de l’actine chez l’humain : α1, α2, αc, β, γ1 et γ2. Chacune
de ces isoformes ne se distingue que par quelques acides aminés. Il existe deux grandes
classes d’actine : la classe I et la classe II. La première classe comprend les formes non-
musculaires de l’actine. On y retrouve la forme β dans les protrusions des cellules motiles
et la forme γ1 qui est plus éloignée de la membrane plasmique. La seconde classe
comprend les formes musculaires de l’actine. On y retrouve les isoformes α1, α2 et αc.
L’isoforme α1 fait partie des cellules musculaires squelettiques et participe donc à la
contraction musculaire ainsi qu’à la formation des myofibrilles. L’isoforme α2 est présente
au sein des cellules musculaires lisses vasculaires et la dernière, αc, figure dans les cellules
musculaires cardiaques. Toutefois, l’isoforme γ2 chevauche les deux classes, car on la
discerne à la fois chez les cellules non-musculaires et chez les cellules musculaires lisses.
53
Figure 1-18. Représentation simplifiée du monomère d’actine-G.
Il existe deux configurations possibles de l’actine au sein d’une cellule : le monomère
d’actine (l’actine-G) et le filament d’actine (l’actine-F). L’actine-G est une sous-unité de 43
kDa qui possède la propriété de pouvoir s’organiser en une structure filamenteuse
hélicoïdale, c’est-à-dire l’actine-F. L’actine-G est constitué de trois principaux domaines :
une extrémité pointue, une extrémité barbée et un centre doté d’un site de liaison de type
ADP/ATP selon l’état de phosphorylation du nucléotide (Figure 1-18). Le monomère
d’actine est également associé à un cation divalent comme le Ca2+
ou le Mg2+
. L’hydrolyse
de l’ATP par le biais d’une activité ATPase intrinsèque catalysée via les ions magnésium
permet la polymérisation du filament d’actine. L’assemblage de l’actine-F est un processus
dynamique que l’on peut comparer à celui d’un tapis roulant qui maintient un équilibre
constant entre la polymérisation et la dépolymérisation du filament d’actine (Figure 1-19).
En effet, les monomères d’actine-G associés avec un ATP et le Mg2+
sont incorporés à
l’extrémité pointue (+) du filament, puis il y a hydrolyse de l’ATP à l’extrémité barbue (-)
de l’actine-F libérant un phosphate inorganique (Pi) et provoquant ainsi la dissociation du
monomère d’actine-G/ADP du polymère. Tel un cycle, ce dernier sera incorporé à nouveau
au filament lors de son chargement en ATP assurant l’élongation à l’extrémité pointue de
l’actine-F [51].
Figure 1-19. Schéma de la polymérisation dynamique du filament d’actine.
Ce schéma représente «l’effet du tapis roulant» que subit le filament d’actine lorsque la
concentration en actine-G est supérieure au seuil de polymérisation de l’extrémité (+), mais
inférieure à l’extrémité (-).
1.3.2. Les protéines régulatrices de l’actine
L’assemblage des filaments d’actine ainsi que la régulation et l’organisation de ces
filaments nécessitent la participation de plusieurs protéines régulatrices de l’actine. Il en
existe trois classes : Les protéines modulant la polymérisation de l’actine-F, les protéines
modulant l’organisation des filaments et les protéines motrices.
1.3.2.1. Les protéines de polymérisation de l’actine-F
L’initiation spontanée de l’assemblage du filament d’actine requiert la formation d’un
noyau dimérique ou trimérique d’actine-G dans un processus appelé «nucléation». De façon
spontanée, ces structures sont instables. Cependant, trois principales classes de protéines
outrepassent le besoin d’une nucléation spontanée et induisent l’initiation de la
polymérisation d’un nouveau filament. Ces protéines nucléatrices sont les complexes
ARP2/3 (actin-related protein-2/3), les Spires et les formines. Chacune d’entre elles induit
une nucléation via un mécanisme distinct.
Le complexe ARP2/3 humain est constitué de sept protéines : Arp2 et Arp3, p40-arc, p34-
arc, p21-arc, p20-arc et p16-arc. Il se retrouve généralement dans le front de migration des
cellules, là où il y a un taux élevé de polymérisation de l’actine. ARP2/3 se fixe à
55
l’extrémité barbée (-) des dimères ou des trimères d’actine-G afin de les stabiliser et ainsi
provoquer l’initiation de l’assemblage d’un nouveau filament d’actine. Toutefois, lorsqu’il
est seul, ARP2/3 est incapable d’avoir une activité de polymérisation de l’actine-F. Il doit
être associé avec un NPF (Nucleation Promoting Factor), c’est-à-dire une protéine qui
permet de promouvoir l’initiation de l’assemblage d’un filament branché. Par exemple, les
protéines de la famille WASP (Wiskott-Aldrich Syndrome Protein) et de la famille WAVE
(WASP family Verprolin-homologous) sont les activateurs principaux du complexe
ARP2/3. ARP2/3 se localise aux points d’embranchement d’un réseau d’actine-F
préexistant. Ainsi, ce complexe favorise la formation de nouvelles «branches d’actine»
(filaments fils) à partir d’un filament initial (filament mère) [52-54].
Les protéines Spires ont été récemment découvertes en tant que nucléatrices de la
polymérisation de l’actine-F. Ces protéines ont une longueur de 17 à 27 acides aminés et
comportent des motifs de liaison à l’actine appelés «les répétitions WH2» (Wasp-homology
2). Il y a quatre répétitions WH2 chez Spire désignées par les quatre premières lettres de
l’alphabet : A, B, C et D. Chaque répétition est capable de lier un monomère d’actine.
Ainsi, Spire agit comme une protéine d’échafaudage permettant la polymérisation d’un
nouveau filament d’actine à partir d’un tétramère d’actine-G [55].
Les formines, comme mDia (mamalian homologue of Drosophilia diaphanous), sont
impliquées au sein de plusieurs fonctions cellulaires comme la polarité cellulaire, la
cytokinèse en favorisant l’assemblage de filaments d’actine au sein de l’anneau
cytokinétique et la migration cellulaire en participant à la formation des points focaux
d’adhérence, des jonctions d’adhérence et de filopodes. Elles ont été caractérisées comme
étant des nucléateurs de filaments non-branchés d’actine. Les formines comportent trois
domaines FH (formin-homology domain; FH1, FH2, FH3) dont FH1 et FH2 ont été
fortement conservés chez les eucaryotes. In vitro, le domaine FH2 est suffisant pour
amorcer la nucléation de l’actine-F, tandis que, in vivo, c’est le domaine FH1 qui est requis
pour la nucléation et la liaison de la profiline. Les domaines FH1 et FH2 de mDia1
accélèrent l’hydrolyse de l’ATP à l’intérieur des filaments d’actine augmentant de 15 fois
le taux de polymérisation aux extrémités barbées. Contrairement au complexe ARP2/3 et
aux Spires, les formines demeurent associées à l’extrémité (-) des filaments [53, 54].
En plus des protéines de nucléation de l’actine-F, il existe d’autres protéines impliquées
dans le mécanisme de polymérisation (Figure 1-20). En effet, il y a la profiline qui est un
facteur d’échange ADP-ATP du monomère d’actine qui accélère l’échange du nucléotide
d’un facteur de 104. De plus, on retrouve la thymosine β4 qui agit à titre de protéine
tampon. Plus précisément, elle séquestre l’actine-G/ATP puisqu’elle a 100 fois plus
d’affinité avec l’ATP qu’avec l’ADP. Il existe une compétition entre la thymosine β4 et la
profiline. Étant donné que la profiline possède une plus grande afinité pour l’ATP, seul le
surplus d’actine-G/ATP se lie à la thymosine β4. En agissant de la sorte, la thymosine β4
empêche une polymérisation non-désirée de filaments.
Puis, il y a les protéines de coiffe. Ce type de protéine s’associe soit à l’extrémité (-) du
filament, comme CapZ ou CapG, ou à l’extrémité (+) telles qu’ARP2/3 et la
tropomoduline. En coiffant l’une ou l’autre extrémité du filament, la protéine de coiffe
favorise la polymérisation ou la dépolymérisation. Il existe également des protéines de
coiffe possédant une activité de coupure, la gelsoline par exemple. Cette dernière modifie
sa structure protéique lorsqu’il y a une forte concentration d’ions calcium. Elle se fixe alors
au filament d’actine et procède à une coupure locale de celle-ci. Après la coupe, la
gelsoline demeure fixée à l’extrémité (+) du microfilament en vue d’empêcher sa re-
polymérisation. La cofiline ou ADF (actin depolymerisation factor) comporte une activité
de coupure, mais ne figure pas parmi les protéines de coiffe. Cette protéine se fixe
préférentiellement sur l’actine-F/ADP afin de pouvoir couper l’extrémité (-) du filament.
Ceci catalyse l’activité de tapis roulant de l’actine-F en favorisant l’assemblage de
l’extrémité (+) grâce au désassemblage de son opposé, et ce, tant et aussi longtemps que
l’actine-G est présent. Cependant, l’absence de monomères d’actine provoque une
dépolymérisation nette lors de la coupure du filament d’actine par la cofiline.
57
Figure 1-20. Schéma des protéines participant à la dynamique de l’actine-F.
Une fois activé, le complexe ARP2/3 favorise la nucléation branchée des filaments d’actine. Les
protéines de chapeautage contrôlent la demi-vie du filament en bloquant l’extrémité (+).
L’ADF/cofiline promeut la dissociation de l’actine-ADP du filament à l’extrémité (-) et coupe des
filaments préexistant afin de générer de nouveaux bouts pointus. La profiline catalyse l’échange
ADP/ATP sur les monomères d’actine-G lesquels deviennent alors aptes à être incorporés aux
filaments d’actine. Adapté de (A. Disanza et al, 2005) [53].
1.3.2.2. Les protéines d’organisation de l’actine-F
Dans les cellules non-musculaires, l’actine-F peut s’organiser en deux types de filaments :
Les fibres de protrusion membranaire et les fibres de stress ou câbles d’actine.
Chez les fibres de protrusion membranaire, on retrouve les filopodes et les lamellipodes
(Figure 1-21 a et b respectivement). Les filopodes forment des projections de la
membrane plasmique cellulaire agissant comme des senseurs dans le microenvironnement
entourant la cellule. Ils servent alors à explorer le milieu via la perception d’un stimulus
motile. La polymérisation des filopodes est classiquement régulée par l’activation de la
petite GTPase Cdc42 qui s’associe avec les protéines WASP. En fait, PMA (PKC activator
Phorbol Mysistate Acetate), un activateur de PKC (Protein Kinase C), stimule le
recrutement membranaire de Cdc42 lié avec un GTP. PKC phosphoryle le facteur
d’échange de nucléotides GDP/GTP permettant alors à Cdc42 de recruter et d’activer N-
WASP.
Les lamellipodes forment un réseau d’actine fibrillaire aux extrémités protrusives des
cellules en étalement ou en migration. Dans ce type de réseau d’actine, la protéine ARP2/3
assure l’architecture spatiale des filaments d’actine en induisant la croissance d’une
nouvelle fibre à 70° d’un filament mère. Plus précisément, le taux d’assemblage des fibres
formant le lamellipode dépend essentiellement de la petite GTPase Rac. De plus,
l’initiation du processus d’assemblage et la localisation précise du site d’assemblage sont
principalement régulées par Cdc42. Tant in vivo qu’in vitro, les protéines de la famille
WAVE comme WAVE1 et WAVE2 s’assemblent en un complexe (WAVE[1-2]-Abil-
Nap1-PIR121/Sra1) permettant de stimuler la machinerie de nucléation de l’actine,
ARP2/3, et de diriger spatialement l’assemblage du réseau, et ce, en réponse à Rac1 [51,
53]. Les protrusions découlant de la formation du réseau fibrillaire ont une largeur
d’environ 1 à 5µm et une épaisseur de 2 µm [51, 56].
Les fibres de stress sont des regroupements de filaments contractiles d’actomyosine
retrouvés dans de nombreuses cultures de cellules non-musculaires (Figure 1-21c). Ces
dernières possèdent un rôle central dans l’adhésion cellulaire ainsi que dans la
morphogenèse cellulaire. Dans les tissus animaux, les fibres de stress sont principalement
abondantes au sein des cellules musculaires lisses, des cellules endothéliales, des
myofibroblastes, des cellules épithéliales et de certaines lignées de cellules cancéreuses.
Chez les cellules non-motiles, les fibres de stress sont généralement denses et relativement
stables. Or, les cellules fortement motiles comportent spécifiquement des fibres de stress
plus dynamiques et beaucoup plus minces. Les fibres de stress sont constituées de plusieurs
paquets de 10 à 30 filaments d’actine de polarité inverse, lesquels sont reliés entre eux par
l’α-actinine, et ce, dans un arrangement antiparallèle. Ces regroupements d’actomyosine
sont souvent ancrés dans les points focaux d’adhérence, ce qui assure une connexion du
cytosquelette d’actine avec la matrice extracellulaire. Il importe de souligner le fait que les
59
fibres de stress adoptent diverses morphologies selon le type cellulaire et la dynamique de
la cellule en fonction de sa réponse aux différents stimuli. Il existe donc quatre catégories
de fibres de stress : les fibres de stress dorsales et ventrales, les arcs transversaux et les
coiffes d’actine péri-nucléaire [57-59] (Figure 1-22). Les fibres de stress dorsales sont
ancrées dans les points focaux d’adhérence à l’une de leurs extrémités et leurs filaments
d’actine ne contiennent pas de myosine II. Ainsi, ces fibres de stress ne peuvent pas se
contracter. Toutefois, ces dernières servent de plateforme permettant l’assemblage d’autres
types de fibres de stress [59, 60]. Les arcs transversaux sont formés de plusieurs
regroupements de filaments d’actine recourbés en demi-cercle. Ces filaments sont rattachés
par le biais du complexe protéique α-actinine-myosine. Ces fibres sont donc contractiles,
mais elles ne sont pas ancrées directement dans les points focaux d’adhérence. Elles se
retrouvent plutôt attachées à la plateforme de fibres de stress dorsales. Les fibres de stress
ventrales sont constituées de plusieurs paquets de filaments d’actomyosine contractiles et
elles sont reliées à chacune de leurs extrémités par des points focaux d’adhérence. Il s’agit
de la principale machinerie contractile de la cellule et elles se retrouvent souvent dans la
région postérieure cellulaire afin de faciliter le déplacement de la cellule lors de sa
migration. Finalement, la coiffe d’actine péri-nucléaire est une structure d’actine constituée
de fibres de stress recouvrant le noyau cellulaire. Cette structure récemment identifiée sert à
réguler la forme du noyau et à stabiliser sa position à l’intérieur de la cellule [59].
Figure 1-21. Les trois types d’architecture de l’actine-F chez la cellule endothéliale.
A) les filopodes; B) les lamellipodes; C) les fibres de stress d’actine. Adapté de (Laurent Lamalice
et al, 2007) [51].
Figure 1-22. Les quatre types de fibres de stress.
Il existe quatre catégories de fibres de stress chez les cellules animales en culture : 1) les fibres de
stress dorsales qui sont ancrées aux points focaux d’adhérence à l’une des extrémités; 2) les arcs
transversaux qui sont des fibres de stress contractiles formant des demi-cercles et qui connectent
avec les fibres de stress dorsales; 3) les fibres de stress ventrales qui sont ancrées aux deux
extrémités aux points focaux d’adhérence et qui constituent la principale machinerie contractile de
la cellule; 4) les coiffes d’actine péri-nucléaire qui régulent la forme du noyau de la cellule. Inspiré
de (Sari Tojkander et al, 2012) [59].
Afin d’assurer le maintien des différentes structures du cytosquelette d’actine, plusieurs
protéines d’organisation de l’actine-F sont nécessaires. Ces dernières sont divisées en trois
catégories : les protéines de pontage, les protéines d’ancrage et les protéines de liaison et de
stabilisation.
Parmi les protéines de pontage, on retrouve l’α-actinine, la fimbrine, la filamine et la
fascine (Figure 1-23). L’α-actinine est un homodimère asymétrique antiparallèle. Chaque
monomère est constitué d’un domaine en tige comportant quatre répétitions de spectrine
avec un domaine de liaison à l’actine (ABD : acting-binding domain) à l’une de ses
extrémités. La formation de l’homodimère résulte de la liaison antiparallèle de deux
domaines en tige où le domaine ABD de chacun des monomères est à l’opposé l’une de
l’autre. L’α-actinine lie les filaments d’actine en vue de former des paquets d’actine-F et la
liaison entre deux filaments est lâche, ce qui permet l’intercalation d’une protéine motrice,
61
soit la myosine II, au sein de l’assemblage de la structure. Ainsi, cette protéine de pontage
forme des structures d’actine-F contractiles et on la retrouve surtout au sein des fibres de
stress [58, 59, 61, 62]. La fimbrine est une protéine monomérique de 68 kDa comportant
deux domaines ABDs en tandem. Cette seconde protéine de pontage assemble les filaments
d’actine en paquets très denses et serrés. Ainsi, les structures d’actine résultant de la
fimbrine ne comportent pas de myosine II et sont donc non-contractiles. Ce type
d’organisation de l’actine-F est calcium-dépendant [61, 62]. La filamine est une large
protéine de pontage formant des dimères parallèles constitués de deux domaines ABDs
séparés par des domaines en tige qui se répètent. Le dimère comporte des régions flexibles
qui favorisent les liaisons en croisé. La structure en «Y» de la filamine permet de lier
perpendiculairement un filament d’actine à chacune de ses deux branches. In vivo,
l’interaction entre la filamine et la kinase sérine/thréonine PAK1 (p21-activated kinase-1),
en aval des petites GTPases Rac1 et Cdc42, induit le réarrangement cytosquelettique
polarisé des lamellipodes et des filopodes régulant ainsi la motilité cellulaire. Il est question
d’une interaction réciproque entre PAK1 et la filamine. En effet, l’association des deux
protéines provoque la phosphorylation de la filamine par PAK1 et la liaison de la filamine
induit l’activation de PAK1 [62]. La fascine est une protéine de 57 kDa et il s’agit d’un
monomère. À la moitié de l’extrémité C-terminale de la protéine, il y a un domaine ABD.
La fascine induit la formation dynamique de protrusions membranaires comme les
filopodes et les «ruffles». La phosphorylation de la Ser39 de la fascine par PKCα inhibe sa
capacité à se lier à l’actine et, par conséquent, empêche la formation des protrusions
membranaires [61, 62].
Figure 1-23. Schéma des protéines de pontage.
Adapté de (Céline Revenu et al, 2004) [62].
Les protéines d’ancrage assurent la fixation du cytosquelette d’actine-F au sein de la
membrane plasmique. Parmi ces dernières, on retrouve la dystrophine, les protéines ERM
et les protéines MARCKS. La dystrophine est une protéine de 427 kDa située du côté
cytosolique de la membrane plasmique des cellules musculaires. On la retrouve dans tous
les tissus musculaires. Son ancrage à la membrane est assuré grâce à un complexe
protéique. La dystrophine et son complexe sont cruciaux pour maintenir la stabilité
mécanique de la membrane plasmique lors de la contraction musculaire et permettre la
résistance des fibres musculaire lors de l’étirement. Au sein de la dystrophine, on dénombre
quatre domaines majeurs : la portion N-terminale agissant comme domaine de liaison à
l’actine, la portion centrale revêtant la forme d’une tige hélicoïdale doté d’une propriété
élastique, un domaine riche en cystéines se liant à la β-dystroglycane qui joue le rôle de
pont transmembranaire entre les protéines intracellulaires et extracellulaires, et la portion
C-terminale servant de domaine de liaison aux autres membres du complexe. Le complexe
associé à la dystrophine sert de charnière trans-sarcolemmale liant le cytosquelette d’actine
à la matrice extracellulaire. L’absence de la dystrophine et de son complexe conduit à une
instabilité membranaire des fibres musculaires provoquant en bout de ligne une
63
dégénérescence musculaire progressive, soit la dystrophie musculaire de Duchenne [63].
Les protéines ERM (Ezrine/Radixine/Moésine) partagent une structure organisationnelle
commune, c’est-à-dire un domaine FERM à l’extrémité N-terminale suivit d’une région
riche en hélices alpha et un domaine de liaison à l’actine situé à l’extrémité C-terminale. Le
domaine FERM assure l’association de la protéine avec la membrane plasmique. Les
protéines ERM se concentrent dans les structures cellulaires riches en actine puisqu’elles
permettent l’ancrage des filaments d’actine à la membrane plasmique. Elles sont donc
impliquées dans la formation de microvilli (un type de protrusion membranaire), dans
l’adhésion cellule-cellule, dans la conservation de la forme cellulaire, dans la motilité
cellulaire et dans le trafique membranaire. De plus, les protéines ERM participent
également à la formation de plateformes membranaires de signalisation intracellulaire en
réponse aux signaux extracellulaires. Le domaine C-terminal des protéines ERM, surtout
celui de la protéine ezrine, est capable de lier le cytosquelette d’actine cortical et les fibres
de stress. De surcroît, de récentes études à propos des protéines ERM ont démontré que ces
dernières peuvent être des substrats aux récepteurs de facteur de croissance (growth factor
receptor). De même, il existe une corrélation entre la phosphorylation de résidus tyrosines
de protéines ERM et la modification morphologique de cellules stimulées par les facteurs
de croissance. Par exemple, le HGF (Hepatocyte Growth Factor), un facteur de croissance,
et son récepteur c-Met occupent un rôle primordial dans la dispersion, la motilité et la
morphogenèse des cellules épithéliales nécessitant un remodelage important des complexes
d’adhésion cellulaires. Par ailleurs, les protéines ERM semblent être également impliquées
dans le processus d’invasion tumorale ainsi que dans la dissémination métastatique.
Effectivement, une hausse de l’expression de la protéine ezrine a été observée chez des
carcinomes métastatiques humains en provenance de divers origines [64, 65]. Enfin, les
protéines MARCKS (Myristoylated Alanine-Rich C-Kinase Substrate) furent les premiers
substrats de PKC à être caractérisés en 1982. Les MARCKS sont des protéines d’ancrage
membranaire d’environ 87 kDa. Elles jouent un rôle important dans la régulation de la
morphologie cellulaire, de la motilité cellulaire, de la sécrétion, du transport
transmembranaire et dans la régulation du cycle cellulaire. Les MARCKS sont des
protéines acides comportant une forte proportion en alanine, en glycine, en proline et en
acide glutamique. Ces protéines sont constituées d’un domaine de liaison à la membrane
plasmique spécifique aux domaines lipidiques riches en PI(4,5)P2 (Phosphatidylinositol
4,5-bisphosphate) à leur extrémité N-terminale et d’un domaine central polybasique. Dans
leur forme non-phosphorylée, les MARCKS se lient aux filaments d’actine. Leur
phosphorylation par la protéine kinase C ou leur association avec le calcium-calmoduline
inhibent leur association avec l’actine-F et avec la membrane plasmique provoquant alors
une accumulation de ces dernières dans le cytoplasme [66].
Les protéines de liaison et de stabilisation, quant à elles, sont responsables de l’organisation
et de l’interconnexion entre les divers systèmes filamentaires de polymère d’actine, de
tubuline ou des filaments intermédiaires en vue de créer le réseau cytosquelettique complet
de la cellule eucaryote. De plus, elles assurent la stabilisation du réseau filamentaire lors
des divers processus cellulaires incluant la morphologie cellulaire, l’adhésion, la motilité, le
trafic intracellulaire, la division cellulaire et la communication inter- et intracellulaire.
Parmi toutes les protéines que renferme cette catégorie, il sera plus précisément question,
dans le présent texte, de la plectine et de la tropomyosine. La plectine est une protéine de
très haut poids moléculaire, soit d’environ 500 kDa, responsable de l’association de
l’actine-F, des microtubules (MTs) et des filaments intermédiaires (FIs) entre eux. Elle fait
partie de la famille protéique des plakines qui sont des organisateurs versatiles de
l’architecture du cytosquelette. La plectine est exprimée dans une très large variété de
cellules et de tissus dont la peau et les muscles striés. Il existe onze isoformes de plectine
dont leur niveau d’expression fluctue selon le type cellulaire. Ces isoformes peuvent donc
interagir avec diverses composantes cellulaires comme la mitochondrie, le noyau, les points
focaux d’adhérence, les desmosomes et les hémidesmosomes. La structure de la plectine
comprend un domaine de liaison à l’actine (ABD) en N-terminal, d’un domaine plakine,
d’une région centrale en tige et d’une série de domaines en répétition plakine (plakin repeat
domain) en C-terminal. L’architecture allongée et flexible formée par les domaines plakines
confère l’élasticité et la stabilité des tissus sujets aux stress mécaniques comme la peau et
les muscles striés [67, 68]. En ce qui concerne la tropomyosine, cette dernière sera étudiée
beaucoup plus en détail dans une section ultérieure de l’introduction.
65
1.3.2.3. Les protéines motrices associées à l’actine-F
Jusqu’à présent, il a été question de protéines assurant la polymérisation des filaments
d’actine ainsi que de protéines capables d’organiser ces filaments en diverses structures
modulant l’architecture cytosquelettique des cellules, et ce, en réponse à divers stimuli
intra- ou extracellulaire. L’assemblage des filaments d’actine en structures protrusives
(filopodes et lamellipodes) et contractiles (fibres de stress) permet aux cellules de pouvoir
répondre à différents processus vitaux comme la prolifération, l’apoptose, l’adhésion et la
migration. Pour répondre adéquatement à ces processus, la cellule doit générer des forces
mécaniques qui nécessitent la participation de la machinerie contractile de l’actomyosine.
Cette machinerie implique l’association des filaments d’actine avec la myosine. Les
myosines sont des moteurs moléculaires actine-dépendant capables de convertir l’énergie
chimique potentielle de l’ATP en force mécanique. La superfamille des myosines régulent
des fonctions cellulaires basiques comme le trafique intracellulaire, la division cellulaire,
l’apoptose, l’adhésion, la migration, la phagocytose, l’exocytose et la contraction. Le
principale moteur de la machinerie contractile de l’actomyosine, tant dans les cellules
musculaires que dans les cellules non-musculaires, est la myosine II. Cette protéine est un
hexamère constitué d’une paire de chaînes lourdes (MHCII) associée à deux paires de
chaînes légères, soit une paire de chaînes légères essentielles (ELC) et une paire de chaînes
légères régulatrices (RLC) (Figure 1-24). L’extrémité C-terminale du MHCII est une
structure rigide en bâtonnet résultant du surenroulement en hélice α des deux chaînes
lourdes alors que l’extrémité N-terminale comporte les domaines moteurs globulaires ATP-
dépendant. Les RLCs stabilisent le long bâtonnet en hélice α à proximité du domaine N-
terminal formant la tête de la myosine II, soit, plus précisément, dans la région du «cou»
agissant en tant que bras de levier. Les myosines II s’assemblent en filaments bipolaires
antiparallèles via des interactions électrostatiques entre les domaines en bâtonnet de chaque
molécule. Le domaine moteur de chaque myosine II se retrouve associé avec la fin d’un
filament d’actine où l’actine-F de l’une des deux myosines II est orienté dans le sens
opposé de la seconde. En rattachant deux filaments d’actine ensemble, la myosine II
dimérique produit des forces de tensions [69, 70].
De surcroît, il existe trois isoformes non-musculaires de la myosine II ayant été identifiées
chez les cellules de mammifères : la myosine II-A, B et C. L’expression tissulaire en ARN,
la localisation intracellulaire, les propriétés biochimiques et les modes de régulation
diffèrent entre les trois isoformes. Par exemple, chez les souris «knockout» en myosine II-
A, il y a un défaut d’adhésion cellule-cellule se répercutant dans l’organisation tissulaire
durant l’embryogenèse précoce. En ce qui concerne la myosine II-B, elle se retrouve
exprimée dans les tissus du cœur et du cerveau. Une absence de cette protéine provoque des
défauts cardiovasculaires et neuronaux majeurs [69].
Figure 1-24. La structure de la myosine II non-musculaire.
Les deux domaines moteurs globulaires forment la tête de la myosine II et constituent le centre de
liaison de l’actine, de l’ATP et du Mg2+
. Les deux chaînes légères, la chaîne légère essentielle
(ELC) et la chaîne légère régulatrice (RLC), régulent l’activité ATPase de la tête. Ces dernières sont
liées à la chaîne lourde qui adopte la forme d’une tige boucle. La queue est la portion non-
hélicoïdale de la chaîne lourde. Adapté de (Miguel Vicente-Manzanares et al, 2009) [70].
1.3.3. Le remodelage du cytosquelette d’actine et la barrière
endothéliale
La polymérisation et la restructuration du cytosquelette d’actine sont cruciales à la cellule
afin qu’elle puisse répondre adéquatement à son environnement. Le bon fonctionnement de
l’endothélium vasculaire est étroitement lié au remodelage du cytosquelette d’actine. En
effet, la barrière endothéliale n’est pas une structure passive. Au contraire, elle est plutôt
dynamique et ce dynamisme est important au sein de l’endothélium vasculaire puisqu’il
assure un équilibre homéostatique par rapport à ses cinq fonctions, surtout en ce qui a trait à
la perméabilité endothéliale. Le cytosquelette se retrouve donc au cœur de la régulation de
67
la perméabilité de la barrière endothéliale. La régulation de cette perméabilité dépend
fortement de la grande plasticité des cellules constituant l’endothélium et elle prend origine
dans la machinerie modulatoire du cytosquelette d’actine. La perméabilité endothéliale est
contrôlée par une très grande variété de stimuli chimiques en provenance du sang ou des
tissus environnants et par le stress mécanique généré par le flot sanguin. Un changement
structural dans l’intégrité de la barrière endothéliale est essentiel pour favoriser la
réparation, les réponses inflammatoires ou autres processus physiopathologiques, et ce, en
réponse aux signaux environnementaux comme des agonistes physiologiques ou des stimuli
de stress. Dans le cas présent, on fait référence au principe de «l’activation des cellules
endothéliales» visant à moduler structuralement le cytosquelette d’actine afin de réguler la
perméabilité de l’endothélium dans un but précis. Toutefois, si l’induction de ces
changements n’est pas régie dans un contexte approprié, cela peut contribuer à la rupture de
l’intégrité endothéliale conduisant au développement d’éventuelles pathologies comme le
choc septique, l’athérosclérose, l’hypertension ou le cancer [4, 23, 71].
Dans la littérature scientifique, il existe un «paradoxe» entourant la perméabilité
endothéliale et l’assemblage des fibres de stress d’actine. Dans un premier cas, lorsqu’il y a
rupture de l’intégrité de l’endothélium, il y a une hausse de la perméabilité endothéliale
provoquée par une augmentation de la tension centripète générée par la contraction de
l’actomyosine et de la diminution de l’adhésion intercellulaire. Il s’agit du «cellular
tensegrity concept» selon lequel les fibres de stress sont responsables de la hausse de la
perméabilité endothéliale [71, 72]. Dans un deuxième cas, l’assemblage des fibres de stress
ne corrèle pas toujours avec une hausse de la perméabilité endothéliale. Cette organisation
typique du cytosquelette d’actine servirait plutôt à instaurer une extension communicante
du réseau de fibres de stress à travers l’endothélium de façon à maintenir une cohérence
structurale de la barrière vasculaire et, par conséquent, induire une augmentation de la
résistance au stress en réduisant la perméabilité endothéliale [71, 73, 74]. Dans les deux
cas, les sentiers de signalisation intracellulaire diffèrent puisque le stimulus est distinct.
D’un côté, il est question de substances vasoactives impliquant l’inflammation et des
toxines ou des exo-enzymes bactériennes, tandis que de l’autre il s’agit plutôt de stimuli de
stress tel que le stress oxydant.
1.3.3.1. Rho, Rac et la régulation de la perméabilité endothéliale
La hausse de la perméabilité endothéliale est une réponse vasculaire à l’inflammation ou à
plusieurs agents vasoactifs comme la thrombine, le TNF-α, la bradykinine, l’histamine et
l’acide lysophosphatidique (LPA : lysophosphatidic acid). Il en résulte alors un
affaiblissement de la paroi vasculaire conduisant à une dysfonction de la barrière
endothéliale. La voie de signalisation RhoA/Rho kinase contribue à cette dysfonction de
l’endothélium via un mécanisme contractile de l’actomyosine [71, 75].
Les petites GTPases Rho font partie de la superfamille Ras. Trois sous-familles de Ras sont
des régulateurs clés du cytosquelette d’actine : Rho, Rac et Cdc42. La sous-famille Rho
comporte trois isoformes : RhoA, RhoB et RhoC. Seulement RhoA et RhoC sont impliqués
dans la contractilité du cytosquelette par le biais de la formation de fibres de stress d’actine.
Les protéines Rho oscillent entre l’état actif (lien-GTP) et l’état inactif (lien-GDP) où ces
deux formes sont régulées par deux classes de protéines : la GTPase-activating proteins
(GAPs) et la guanine nucleotide exchange factors (GEFs). La GAPs promeut l’hydrolyse
du lien Rho/GTP afin d’activer la petite GTPase causant ainsi une accumulation de la
forme Rho/GDP. Quant à GEFs, cette dernière favorise l’échange GDP à GTP, ce qui
amène à une accumulation de la forme active de Rho. Parmi les petites GTPases Rho,
RhoA est le régulateur majeur de la formation des fibres de stress d’actine, du moins, il est
le plus connu au sein de la littérature scientifique [71] (Figure 1-25).
RhoA comporte deux effecteurs en aval appelés la kinase Rho (ROCK/ROK) et mDia1.
ROCK-1 et ROCK-2 sont des kinases sérines/thréonines qui favorisent la conversion des
filaments d’actine en fibres de stress une fois qu’elles sont activées par RhoA. Dans sa
forme activée, ROCK peut phosphoryler quatre cibles dans la voie signalétique régulant
l’activité ou la formation des fibres de stress. Premièrement, ROCK phosphoryle
directement la Ser19 du MLC2 (Myosin Light Chain 2) de la myosine II. Cette
phosphorylation provoque une contraction des fibres de stress en raison d’une activité
ATPase de la myosine II. La MLC kinase phosphoryle aussi la MLC2 en vue de générer la
contraction de l’actomyosine. Deuxièmement, ROCK peut également phosphoryler MBS,
c’est-à-dire la sous-unité régulatrice de la phosphatase MLC2 (MYPT : Myosin Light Chain
69
Phosphatase; MYPT1 chez les cellules endothéliales comme les HUVECs), sur la Thr696
ou la Thr853. Cette phosphorylation assure l’inhibition de MYPT favorisant alors la
phosphorylation de MLC2 et provoquant, par conséquent, une hausse de la formation des
fibres de stress. Troisièmement, la phosphorylation de CPI-17, un inhibiteur de MYPT se
retrouvant surtout dans les cellules musculaires lisses, par ROCK permet d’induire une
augmentation de la contraction de l’actomyosine. Finalement, ROCK peut phosphoryler la
protéine ZIPK (Zipper-interacting protein kinase) et, une fois activé, cette dernière inhibe
l’activitée phosphatase de MYPT en phosphorylant la Thr696 ou elle peut favoriser
l’activation de CPI-17 via la phosphorylation de sa Thr38. De plus, ZIPK peut également
phosphoryler directement MLC2 à la fois sur sa Thr18 et sa Ser19. Tout compte fait,
ROCK est un pivot de la contraction de l’actomyosine, mais elle ne peut pas agir seule. En
effet, dans une telle situation, ROCK est incapable de générer de grosses fibres de stress
parallèles. La participation de mDia1 est nécessaire puisque cette protéine possède une
activité nucléatrice qui facilite la polymérisation de l’actine-F en de longs filaments
parallèles et assure l’ancrage des fibres de stress dans la cellule [58, 59, 71, 75].
Par ailleurs, il importe de considérer le fait que ROCK possède un double rôle vis-à-vis la
régulation de la barrière endothéliale. D’une part, l’activité de ROCK est essentielle pour
maintenir l’intégrité de la barrière et, d’autre part, la même kinase promeut la contraction
cellulaire par le biais des fibres de stress, ce qui provoque alors la dissociation des contacts
cellules-cellules et favorise l’apparition d’espaces inter-endothéliaux. L’explication de ce
rôle contradictoire réside dans le niveau d’activité de ROCK. En d’autres mots, si ROCK
comporte une activité basale, alors son rôle sera de contribuer au maintien de l’intégrité de
l’endothélium par la régulation de la VE-cadhérine. Toutefois, s’il y a une hausse de
l’activité de ROCK, en raison de l’action d’agents vasoactifs par exemple, alors son rôle
sera d’induire la contractilité de la machinerie de l’actomyosine provoquant la dissociation
de l’interaction homotypique de la VE-cadhérine au niveau des jonctions d’adhérence [7,
75].
Figure 1-25. Sentiers de signalisation Rho-dépendant impliqués dans la dynamique et
la formation des fibres de stress d’actine.
En réponse à l’inflammation ou à plusieurs agents vasoactifs, la petite GTPase Rho active ROCK
qui devient alors le centre pivot de 4 voies de signalisation aboutissant à un seul et même objectif.
Associé avec mDiA, ROCK permet alors la formation de fibres de stress et une hausse de leur
contractilité.
Contrairement à Rho, Rac et Cdc42 assurent la polymérisation de l’actine-F par
l’intermédiaire du complexe ARP2/3 associé à WAVE (dans le cas de Rac) ou N-WASP
(dans le cas de Cdc42) (Figure 1-26). Rac et Cdc42 partagent une cible commune : PAK
(p21 activated kinase). L’association de cette kinase au GTP de Rac ou de Cdc42 induit son
activation et lui permet alors de cibler d’autres protéines kinases en aval de la voie de
signalisation. La LIMK (LIM domain kinase) et la MLCK font parties de ses cibles ayant
71
un effet sur la régulation du cytosquelette d’actine. En phosphorylant la LIMK, PAK
permet l’assemblage du filament d’actine puisque la LIMK en mode fonctionnel inhibe
l’activité de coupure de la cofiline/ADF en phosphorylant sa Ser3. Puis, la phosphorylation
de MLCK par PAK contribue à empêcher la contractilité cellulaire. De ce fait, l’intégrité de
la barrière endothéliale est alors conservée.
Figure 1-26. Sentiers de signalisation Rac-dépendant et Cdc42-dépendant impliqués
dans la diminution de la contractilité de l’actomyosine.
Représentation schématisée de différentes voies de signalisation activées par les petites GTPases
Rac et Cdc42 responsables de la baisse de la contractilité de l’actomyosine.
1.3.3.2. Le cytosquelette d’actine en réponse au stress oxydant
Étant continuellement en contact avec des radicaux oxydants, les cellules endothéliales
vasculaires possèdent généralement l’équipement nécessaire pour résister aux effets
toxiques et pour produire les bonnes réponses physiologiques [76]. Effectivement, de
nombreuses expériences in vitro ont démontré que des cellules non musculaires de
mammifères sous l’influence du stress oxydant subissent de profondes modifications de
leur morphologie ainsi que de l’architecture du cytosquelette d’actine provoquant souvent
l’apparition d’un «blebbing» membranaire [77]. Cette manifestation morphologique
cellulaire est la conséquence de la toxicité du stress oxydant qui est associé à une rupture de
l’intégrité de la barrière endothéliale autant in vivo qu’in vitro [23, 78].
Chez des organismes aérobiques en santé, la production de ROS est balancée par
l’intermédiaire d’un système de défense d’antioxydants. De plus, à un niveau basal, les
ROS agissent en tant que molécules de signalisation participant alors à la régulation des
fonctions fondamentales cellulaires. Cependant, rien n’est toujours parfait et, dans certaines
occasions, il peut y avoir une surproduction en ROS provoquant alors un déséquilibre du
système. Le débalancement entre la production en ROS et de l’activité des antioxydants
conduit dangereusement la cellule vers un état oxydant qui résulte au déclenchement d’un
stress oxydant. Dans cet état de stress, la cellule subit des dommages important au niveau
de l’ensemble de ses molécules biologiques dont l’ADN, les protéines et les lipides. Les
premières cibles des agents oxydants dépendent du type cellulaire, de la nature du stress, du
site où le stress a été généré (intra- ou extracellulaire), de la proximité du substrat cellulaire
par rapport au stress et de l’intensité du stress. La déplétion en ATP, l’augmentation
intracellulaire en ions Ca2+
, la fragmentation du cytosquelette d’actine, l’augmentation de la
peroxydation de la membrane plasmique, la hausse de la perméabilité et la libération de
composantes cytosoliques dans l’espace extracellulaire sont des exemples des
conséquences causées par le stress oxydant [77]. Si la cellule endothéliale est incapable de
fournir une réponse lui permettant de résister adéquatement à ce stress, alors il y aura
dysfonction endothéliale conduisant éventuellement à l’apparition de pathologies.
Il importe de noter que dans la plupart des types cellulaires, le cytosquelette d’actine est
une cible précoce de la toxicité des ROS. Dans les cellules endothéliales, par exemple, le
H2O2 induit une réorganisation majeure du cytosquelette incluant la formation rapide de
complexes focaux d’adhérence à la face basale cellulaire, ce qui cause la disparition du
«blebbing» membranaire via la rupture de la F-actine corticale et l’assemblage d’un réseau
très dense de fibres de stress transcytoplasmiques. Cette réponse physiologique cellulaire
73
résulte de la forte activation des voies de signalisation SAPK2/p38 MAPK (Stress-
Activated Protein Kinase-2/p38 Mitogen-Activated Protein Kinase) et ERK1/2
(Extracellular-signal Regulated Kinase 1/2). En inhibant l’activité de p38 avec le
SB203580, un inhibiteur chimique de la voie p38, et de MEK (Mitogen-activated protein
Kinase Kinase), en amont de ERK1/2, avec le PD098059, il y a disparition des complexes
focaux d’adhérence et des fibres de stress, et réapparition du «blebbing» membranaire où
les «blebs» peuvent rompre à tout moment et causer la mort cellulaire par nécrose [23, 76-
78]. Ces observations indiquent que l’activation de ces voies de signalisation et la réponse
physiologique qui s’en découle font partie d’un mécanisme de résistance des cellules
endothéliales au stress oxydant. Ce type de défense semble renforcir l’endothélium
vasculaire afin de limiter la rupture de la barrière endothéliale. L’intégrité de cette barrière
est donc étroitement régulée par la co-activation balancée des voies p38 et ERK [23, 48].
1.3.3.2.1. Les voies des MAP-Kinases
Les voies des MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) ont été hautement conservées
durant l’évolution, de la levure jusqu’à l’humain. Ces voies de signalisation se retrouvent
impliquées dans une panoplie de processus biologiques cellulaires dont la prolifération, la
différentiation, le métabolisme, la motilité, la survie et l’apoptose [79, 80]. La régulation
ainsi que la transduction de ces nombreux signaux passent principalement par quatre sous-
familles de MAPK : ERK1/2, c-Jun NH2-terminal kinases (JNK1,-2 et -3), la kinase p38
(α, β, γ et δ) et les grosses MAPK (BMK ou ERK5). L’activation des MAPK requiert une
double phosphorylation du motif Thr-X-Tyr à l’intérieur d’une boucle de régulation. Le
«X» du motif Thr-X-Tyr peut être une glycine, une proline ou l’acide glutamique. La
mécanistique typique de la voie de signalisation des MAPK consiste en une cascade de
phosphorylation en trois échelons (Figure 1-27). Du premier niveau jusqu’au dernier, et ce,
dans l’ordre, il y a la phosphorylation d’une MAP kinase kinase kinase (MAPKKK,
MAP3K, MEKK ou MKKK), qui phosphoryle une MAP kinase kinase (MAPKK, MAP2K,
MEK ou MKK) où cette dernière phosphoryle à son tour une MAP kinase (MAPK). Cette
cascade assure la transduction, l’amplification, la modulation et la spécificité du signal en
fonction du type de stimulus. De plus, au tout début du signal, il est fréquent de retrouver
une MAPKKK kinase (MAPKKKK, MAP4K ou MKKKK) qui peut être liée à la
membrane plasmique en s’associant avec une petite GTPase ou un lipide comme Ste20
(chez la levure), PKC, PAK MAPKKKK et Raf MAPKKK. Les MAPKKK comportent un
large domaine de régulation pouvant interagir en amont avec Rho ou Ras. Les MAPKK,
quant à elles, possèdent des petits domaines de régulation qui sont activés par le biais d’une
double phosphorylation des résidus sérine et thréonine à l’intérieur d’une boucle
d’activation du domaine catalytique. Puis, les MAPK, activées selon le même procédé que
les MAKK, peuvent phosphoryler des substrats sur leurs sérines ou thréonines au sein d’un
motif consensus Pro-X-Thr/Ser-Pro. Par ailleurs, la spécificité de ces voies de signalisation
dépend de divers facteurs comme l’interaction kinase-kinase et kinase-substrat, la co-
localisation des kinases via les protéines d’échafaudage et l’inhibition du «cross-talk» par
les MAPK eux-mêmes [79, 80].
Figure 1-27. La voie canonique des MAP-kinases.
Les voies des MAP-kinases constituent une signalisation en cascade permettant l’activation
successive de kinases afin de transmettre et amplifier un signal quelconque, et ce, d’une manière
très spécifique au plan spatial. Il existe donc trois échelons dans la transduction d’un signal via ces
voies : l’activation d’une MAP-kinase-kinase-kinase (1) qui active une MAP-kinase-kinase (2) qui à
son tour active une MAP-kinase (3). Cette dernière kinase comporte un rôle de médiateur assurant
la transduction du signal par le biais de l’activation de divers substrats au sein de la cellule. Adapté
de (Beth A. Rose et al, 2010) [80].
75
1.3.3.2.2. La voie p38 et le stress oxydant
La voie de signalisation de la kinase p38 fait partie d’une sous-famille des SAPK (Stress-
Activated Protein Kinase) au sein de la grande famille des MAP-kinases. Les SAPK
regroupent les cascades de MAPK activées par les stimuli de stress comme les radiations
UV, les dommages à l’ADN, le stress oxydant, la chaleur, le choc osmotique, les
pathogènes et les cytokines inflammatoires. Il existe quatre isoformes de p38 : p38α, p38β
(SAPK2), p38γ (SAPK3) et p38δ (SAPK4). Les kinases p38α et β sont ubiquitaires, alors
que p38γ se retrouve primordialement dans les muscles squelettiques et que p38δ a été
trouvée dans les poumons, les reins, les testicules, le pancréas et le petit intestin. Les
kinases p38 sont impliquées dans un très grand nombre de réponses biologiques et
principalement dans la réponse immunitaire où elles favorisent l’expression de cytokines
pro-inflammatoires, l’expression de molécules d’adhésion, la régulation de la prolifération
et de la différentiation des cellules. Elles jouent également un rôle important dans
l’apoptose, la survie cellulaire, la régulation du cycle cellulaire, la sénescence, la croissance
et la migration cellulaires [23, 80].
Une fois que p38 est activée, cette kinase peut, soit induire la transcription de gènes à
l’intérieur du noyau comme ATF-2, c-Myc, SRF, MEF2 A/C, c-Fos, AP-1 et GATA4 par
l’intermédiaire de facteurs de transcription tels que CHOP, CREB et ATF-1, ou soit
demeurer dans le cytoplasme et phosphoryler directement la MAPKAP-K2/3 (MAP
Kinase-Activated Protein Kinase 2/3) ou activer des cytokines inflammatoires. La
MAPKAP-K2/3 est une sérine/thréonine kinase qui phosphoryle une protéine de choc
thermique appelée HSP27 (the 27 kDa Heat-Shock Protein)
dans le cytoplasme cellulaire [76, 77, 81].
Les protéines de choc thermiques se retrouvent dans plusieurs tissus. La hausse de leur
expression favorise la survie des cellules qui sont exposées à de nombreux agents stressant
comme le choc thermique et le stress oxydant [77]. La HSP27 a tendance à s’accumuler
dans la cellule lorsque cette dernière est soumise à un traitement hyperthermique. Dans une
telle condition, la HSP27 permet d’instaurer un état de thermo-résistance cellulaire [82].
Par ailleurs, la phosphorylation de HSP27 est impliquée dans la régulation du dynamisme
de la F-actine en réponse aux facteurs de croissances ainsi qu’à divers types de stress. Étant
donné que le réseau du cytosquelette d’actine est une cible précoce du stress oxydant, la
phosphorylation de la HSP27 est fortement induite par les ROS dont le H2O2, et ce, surtout
dans les cellules endothéliales. Ainsi, le déclenchement de la phosphorylation de la HSP27
assure une protection de la cellule face au stress oxydant en conférant une résistance contre
la fragmentation du cytosquelette d’actine provoquée par le H2O2. En effet, durant le stress,
il y a un changement de conformation protéique de HSP27 lorsque cette dernière subit une
phosphorylation sérine-dépendante. Elle se retrouve alors en de petits agrégats qui agissent
en tant que protéines de liaison à l’actine. En se liant aux filaments d’actine, elle prévient la
dépolymérisation et promeut l’assemblage de fibres de stress afin de générer une réponse
adaptative à la condition stressante [76, 77, 81, 82].
1.3.3.2.3. La voie ERK1/2 et le stress oxydant
ERK1 et ERK2 sont des kinases d’environ 43 et 41 kDa respectivement. Elles sont
ubiquitaires et leur expression relative est variable dans les tissus. ERK1/2 régulent
plusieurs fonctions cellulaires et physiologiques dont le cycle cellulaire, la progression, la
prolifération, la cytokinèse, la transcription de gènes, la différentiation, la sénescence, la
mort cellulaire, la migration, la formation d’espaces inter-endothéliaux, les réseaux d’actine
et de microtubules et l’adhésion cellulaire [80, 83]. Comme il a été mentionné
préalablement, l’activation des kinases ERK1/2 a lieu au troisième niveau de la cascade de
phosphorylation au sein du sentier de signalisation MAP-kinase. L’activité de cette voie
peut être initiée par des stimuli intra- ou extracellulaires comme des facteurs de croissance,
du sérum, des cytokines, ou des agents stressant tels que le choc thermique et les ROS [80,
82].
Lorsqu’un ligand se lie aux récepteurs de surface cellulaire tyrosine kinase (RTK : Receptor
Tyrosine Kinase) ou aux récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) ou lors de l’entrée
massive d’ions Ca2+
à travers leur canal ionique respectif dans le cytoplasme de la cellule
(en condition de stress oxydant, par exemple), il y a activation de la petite GTPase Ras.
C’est alors que Ras/GTP recrute Raf (MAP3K) à la membrane plasmique et induit son
activation. La famille de la kinase Raf est constitué de trois isoformes : A-Raf, B-Raf et
Raf-1 (ou C-Raf). Chacun des membres de cette famille possède trois domaines conservés :
77
CR1, CR2 et CR3. CR1 et CR2 se situent dans la région N-terminale et ils sont impliqués
dans la régulation du domaine catalytique de Raf. Quant à CR3, ce dernier comporte le
domaine kinase. Raf-1 est ubiquitaire, B-Raf se retrouve principalement dans les tissus
neuronaux et les testicules, tandis qu’A-Raf est plutôt localisé dans le tissu urogénital. La
kinase Raf-1 peut également être phosphorylée par d’autres protéines kinases comme Src,
PKC, PAK et AKT. Ensuite, la kinase Raf phosphoryle en aval MEK1/2 (MAP2K) qui, à
son tour, active ERK1/2 via une double phosphorylation sur les résidus thréonine (Thr202)
et tyrosine (Tyr204) présents dans le motif conservé TEY (Thr-Glu-Tyr) à l’intérieur de la
boucle de régulation de cette MAP-kinase. L’interaction entre MEK1/2 et ERK1/2 peut être
facilitée grâce à l’intervention de protéines d’échafaudage comme KSR (Kinase Suppressor
of Ras), MP1 (MEK Partner 1), MORG1 (MAPK Organizer 1) et β-arrestine. Puis, ERK1/2
peut cibler des facteurs de transcription tels AP-1 et NFκB, mais également d’autres
kinases comme Rsk et DAPK-1 [79, 80, 83, 84].
Lorsque le sentier de signalisation est déclenché en condition de stress oxydant au sein de
cellules endothéliales, Ras phosphoryle Raf-1 sur sa Ser338 (Figure 1-28). Puis, la kinase
Raf-1 procède à une double phosphorylation de MEK1/2 (Ser217 et Ser221). La protéine
d’échafaudage MP1 assure la rencontre de MEK1 avec ERK1/2. Dans sont état actif,
ERK1/2 cible directement une protéine kinase nommée Death-Associated Protein Kinase 1
(DAPK-1) et la phosphoryle sur sa Ser735. Cette dernière comporte un domaine kinase qui
est étroitement relié aux membres de la famille des MLCKs. La DAPK-1 est une Ser/Thr
kinase dépendante de Ca2+
et de la calmoduline. La famille des DAPKs est constituée de
quatre autres membres : la Zip Kinase (Zipper-Interacting Protein Kinase), la DRP kinase
(DAP-Kinase-Related Protein Kinase) et les DRAK-1 et -2 (DAP-Kinase-Related
Apoptosis-Inducing Protein Kinase 1 and 2). Ensuite, la DAPK-1 phosphoryle une protéine
de liaison d’actine, la tropomyosine-1 (Tm1), sur sa Ser283. Autant in vitro qu’in vivo, la
phosphorylation de la Tm1 est essentielle pour l’induction de la formation de fibres de
stress d’actine chez les cellules endothéliales en réponse au H2O2 [23, 84]. En effet, avant
même la découverte du lien étroit existant entre la DAPK-1 et la Tm1 en condition de stress
oxydant, l’équipe du Dr. Jacques Huot avait identifié, par spectrométrie de masse, la Tm1
en tant que la phosphoprotéine sensible au stress oxydant chez les cellules endothéliales
[78]. Ces découvertes ont permis d’établir un rôle fort important de la Tm1 phosphorylée
dans la régulation de fonctions endothéliales associées au remodelage du cytosquelette
d’actine.
Figure 1-28. Co-activation des voies p38 et ERK1/2 en réponse au stress oxydant.
Il s’agit d’une représentation schématique de la signalisation balancée des voies MAP-kinases
SAPK2/p38 et ERK1/2 régulant la réponse au stress oxydant chez les cellules endothéliales. Ces
deux voies de signalisation sont des régulateurs majeurs du remodelage du cytosquelette d’actine au
sein des cellules endothéliales soumises au stress provoqué par les ROS. D’un côté de la balance,
l’activation de HSP27 par la voie p38 favorise la polymérisation de l’actine. De l’autre côté de la
balance, l’activation de ERK1/2 conduit à la phosphorylation de la tropomyosine-1 sur sa Ser283 en
aval de la voie. Cette dernière contribue fortement à assemblage des points focaux d’adhérence et
des filaments d’actine en fibres de stress. Si l’équilibre de cette balance est rompu, alors la cellule
endothéliale adoptera un état toxique et il y aura formation d’un blebbing membranaire. Inspiré de
(François Houle et Jacques Huot, 2006) [23].
79
1.4. Les Tropomyosines
1.4.1. La découverte des tropomyosines
Au début des années 1940, la myosine était la seule protéine du système musculaire
contractile ayant été isolée et caractérisée. La procédure d’isolation de cette protéine qui fut
employée à cette époque consistait à effectuer une dénaturation sélective des myofibrilles
avec un solvant organique. Straub a été le premier à appliquer cette même méthode pour
isoler l’actine en 1942. Puis, en 1946, Bailey utilisa une stratégie similaire et a réussi à
obtenir la tropomyosine (Tm). La Tm a été cristallisée pour la première fois en 1948 par
l’équipe de Bailey. Le résultat exposa une protéine ayant une structure asymétrique,
formant de fragiles plaques et contenant environ 90 % d’eau. En raison de quelques
similitudes sur le plan de la composition en acide aminé, des propriétés physiques et de sa
grande présence dans les muscles des jeunes animaux, Bailey croyait que la Tm était un
précurseur de la myosine d’où le préfixe «tropo» et le suffixe «myosine» de sa nouvelle
protéine [85, 86]. Des recherches subséquentes ont démontré que cela n’était pas le cas et
que la Tm est plutôt un produit d’une famille de gènes indépendants de la myosine.
En 1948, les études de diffraction au rayon-x de la protéine par l’équipe de Astbury a
permis de classifier la Tm dans la famille des protéines en hélice-α qui comporte les
kératines, les myosines, les épidermines et les fibrinogènes, soient les classes k-m-e-f
protéiques. En 1953, afin d’expliquer les caractéristiques typiques de diffraction de ces
protéines, Francis Crick avait proposé un modèle reposant sur le regroupement de deux ou
trois hélices-α formant une super-hélice ou une structure en tige-boucle. Selon ce modèle,
les hélices sont fixés à l’opposé l’une de l’autre en raison des interactions hydrophobiques
entre les résidus localisés dans les régions où les hélices sont en contact. En 1975, l’équipe
de Smillie a réussi à déterminer la structure primaire d’une Tm en provenance du muscle
squelettique de lapin. Cette Tm de 284 a.a. comportait des arrangements périodiques
d’acides aminés hydrophobiques au sein de la chaîne polypeptidique de la protéine. La
structure primaire protéique étudiée a confirmé le modèle de Francis Crick, c’est-à-dire une
tige-boucle spiralée dimérique en hélice-α [85, 86].
1.4.2. Les gènes codant pour les tropomyosines
Chez les mammifères, il existe quatre gènes codant pour les Tms : α, β, γ et δ (Figure 1-
29). Chez l’humain, ces gènes sont formellement connus sous les noms suivants : TPM1
(α), TPM2 (β), TPM3 (γ) et TPM4 (δ). Leur localisation chromosomique est 15q22, 9p13,
1q22 et 19p13 respectivement. La très grande diversité des isoformes de Tm dépend
principalement de l’épissage alternatif. En effet, chez les mammifères, il y a plus de 40
isoformes de Tm dont 18 d’entre eux sont exprimés dans les cellules non musculaires.
L’épissage alternatif de ces quatre gènes, l’utilisation d’une multitude de protomères et le
choix des sites de polyadénylation conduit à l’expression d’au moins 22 différentes Tms
chez l’humain. D’ailleurs, parmi les Tms humaines, on retrouve cinq isoformes majeures :
hTm1-5 (ou hTM1-5 ou TM1-5 ou Tm1-5). Les hTm1, les hTm2 et les hTm3 sont
exprimées de façon prédominante dans les cellules musculaires lisses des intestins et dans
les cellules endothéliales tapissant la paroi vasculaire interne des vaisseaux sanguins. Les
hTm4 sont plutôt localisées dans la membrane basale des épithéliums. En ce qui concerne
les hTm5, ces dernières sont principalement exprimées dans l’épithélium du côlon, de la
vésicule biliaire et de la peau. Par ailleurs, deux types de Tms sont générés par différents
protomères : les isoformes de haut poids moléculaire (HMW; High Molecular Weight) et
les isoformes de faible poids moléculaire (LMW; Low Molecular Weight). Les Tms HMW
ont un poids variant de 40 à 43 kDa, comportent une longueur d’environ 284 a.a. et
contiennent 7 régions de liaison à l’actine. Les Tms LMW ont un poids variant de 28 à 32
kDa, comportent une longueur d’environ 248 a.a. et contiennent 6 régions de liaison à
l’actine [78, 87-89].
Le gène Tm-α est le plus étudié des gènes de la Tm. Il est d’une longueur de 28 Kb,
contient 15 exons, deux promoteurs alternatifs, deux exons mutuellement exclusifs (2a/2b
et 6a/6b) et 4 exons en 3’ permettant un épissage alternatif (9a/9b/9c/9d) dont les protéines
qui en résultent comportent différentes extrémités en C-terminal. Ce gène code pour des
Tms de cellules musculaires squelettiques, lisses et non musculaires. On retrouve donc la
Tmskα chez les cellules musculaires squelettiques et la Tmsmα chez les cellules
musculaires lisses. Dans les tissus cardiaques humains, il y a deux isoformes propres au
cœur que l’on ne retrouve nulle part ailleurs : la hTmskα1 et la hTmskα1-1. Au sein des
81
cellules non musculaires, il y a la Tm1 (ou Tmα1 ou Tmα), Tm2, Tm3, Tm5a et Tm5b en
plus de 3 autres isoformes de Tm spécifiques aux tissus neuronaux, soient la TmBr1,
TmBr2 et TmBr3 [78, 84, 87, 88].
Le gène Tm-β est d’une longueur de 8 à 10 Kb. Il contient 11 exons, un seul promoteur, un
exon mutuellement exclusif (6a/6b) et deux exons différents en C-terminal (9a/9b). Ce gène
produit deux types de Tm-β, c’est-à-dire une Tm-β dans les muscles squelettiques et la
seconde se retrouve dans les muscles lisses et se nomme Tm1 (ou Tm-β). Ces isoformes
comportent tous 284 acides aminés [88].
Le gène Tm-γ est d’une longueur de 42 Kb. Il contient 13 exons, deux exons alternatifs
(6a/6b) et quatre exons en C-terminal (9a à 9d). Ce gène code pour une Tm des muscles
squelettiques appelée le slow twitch isoform of skeletal muscle α-Tm (TMskα2). De plus, ce
gène code pour au moins 11 isoformes de Tm dans les cellules non musculaires chez la
souris : TmNM-1 à -11 ou Tm5NM-1 à -11 [87, 88].
Le gène Tm-δ est d’une longueur de 16 à 18 Kb. Il code pour une seule Tm, soit la Tm4 (ou
TM4). Contrairement aux autres gènes de Tm, ce dernier ne subit pas d’épissage alternatif
chez le rat et la souris. Toutefois, chez l’humain, il existe un épissage alternatif de la Tm4
produisant alors la Human HMW Product [87, 88].
Figure 1-29. Les gènes codant pour les tropomyosines et leurs isoformes.
Les divers isoformes des Tms sont générés via la combinaison de divers gènes et de l’épissage
alternatif de leurs ARN messagers. Les quatre gènes de Tm chez l’humain sont TPM1(α), TPM2(β),
TPM3(γ) et TPM4(δ). Adapté de (Peter Gunning et al, 2008) [87].
83
1.4.3. La structure des tropomyosines
Au niveau structural, la Tm est une molécule allongée formée de deux chaînes en hélice-α
adoptant une architecture en rouleau spiralé flexible lui permettant de pouvoir s’enrouler
autour d’un filament d’actine, et ce, sur une certaine distance (Figure 1-30). Une molécule
de Tm est configurée de la façon suivante ; il s’agit d’une répétition d’heptapeptide où
chaque heptapeptide comporte sept positions adoptant le motif a-b-c-d-e-f-g. Chaque
position (désignée par une lettre de l’alphabet) du motif correspond à un acide aminé. Un
motif heptapeptidique fait deux tours d’hélice-α et les résidus sont disposés selon un axe
azimutal. Ainsi, au sein d’une molécule de Tm de 284 résidus, par exemple, il y aura
environ 40 répétitions d’heptapeptide et environ 20 tours d’hélice. À l’intérieur d’un
heptapeptide d’une première hélice-α (la chaîne I), on distingue des acides aminés
hydrophobiques non-polaires dans les positions centrales (core positions), a et d, qui
s’imbriquent avec leurs positions correspondantes (a’ et d’) sur la seconde hélice-α (la
chaîne II) afin de former un centre comble qui se resserre. Puis, il y a deux positions
internes (inner positions), e et g, sur chacune des deux chaînes en hélice-α, qui sont
fréquemment occupées par des résidus acides et basiques afin de pouvoir former des
interactions ioniques et des ponts de sel entre les positions e-g’ et e’-g favorisant la
stabilisation de la structure. Les positions externes (outer positions), b, c, f et b’, c’, f’, sont
impliquées dans la formation de la double hélice et peuvent interagir avec d’autres
molécules. En effet, l’analyse de la séquence en acides aminés de la Tm a révélé la
présence de sept groupes équidistants de résidus acides (Asp et Glu) aux positions externes
des répétitions heptapeptidiques qui pourraient jouer un rôle dans la liaison de la Tm à
l’actine-F. Ainsi, une molécule de Tm est capable de lier 6 à 7 monomères d’actine. De
plus, les interactions entre la Tm et le filament d’actine requièrent trois notions
importantes : 1) la flexibilité structurale de la Tm afin qu’elle puisse s’ajuster à la
géométrie de surface de la molécule cible, soit l’actine fibrillaire; 2) la spécificité
d’interaction entre les deux molécules; et 3) les interactions des domaines terminaux entre
les molécules de Tm. Par ailleurs, il importe de considérer le fait que plusieurs molécules
de Tm vont se lier en tandem au filament d’actine afin de former un «complexe en bout à
bout» (end-to-end complex) sur toute la longueur du filament. Il s’agit du polymère de Tm.
Pour ce faire, le domaine C-terminal d’une première molécule de Tm doit s’écarter pour
former une clé à l’intérieur de laquelle le domaine N-terminal d’une seconde molécule de
Tm se lie en chevauchant onze résidus du domaine C-terminal de la première Tm [85, 86,
88, 90, 91].
Figure 1-30. La structure de la tropomyosine.
A) Représentation de la structure de la Tmα (modèle à une taille de 7 Å). Il s’agit d’une double
chaîne en hélice-α flexible comportant sept répétitions périodiques de sept résidus. B)
Représentation schématique de face de la double hélice-α d’une Tm. Le schéma expose les
positions des acides aminés (représentés par des lettres de l’alphabet : a, b, c, d, e, f et g) au sein
d’une seule répétition heptapeptidique. Les résidus a-a’ et d-d’ sont non-polaires (N) et forment le
cœur de l’architecture de la structure. Les résidus acides (A) et basiques (B) se retrouvent dans les
positions e-e’ et g-g’. Ces derniers peuvent former des interactions ioniques. Les résidus externes
des hélices (X), soit b, c, f et b’, c’, f’, sont généralement, mais pas toujours, ioniques ou polaires.
C) Représentation linéaire des chaînes I et II montrant les positions des acides aminés avec leurs
interactions. Adapté de (Sarah E. Hitchcock-DeGregori et Abhishek Singh, 2010; S.V. Perry, 2001)
[85, 91].
85
1.4.4. Les multiples fonctions des tropomyosines
Les animaux, du nématode jusqu’aux mammifères, comportent une multitude d’isoformes
de Tm favorisant la très grande diversité de cette protéine. Comme il fut mentionné
préalablement, cette diversité découle de la combinaison de plusieurs gènes dont certains
possèdent des promoteurs alternatifs et d’autres procèdent à un épissage alternatif du
transcrit primaire de leurs ARNm. La grande question à cet état de faits est la suivante :
Pourquoi y-a-t-il autant d’isoformes de cette même protéine? En fait, la réponse à cette
question réside dans une variété d’aspect comprenant la structure protéique, l’architecture
du cytosquelette d’actine, les multiples fonctions biologiques des cellules et le
développement de diverses maladies comme le cancer chez l’humain. Effectivement,
chaque groupe d’isoformes est spécifique à un type cellulaire afin de pouvoir répondre
convenablement à des fonctions cellulaires spécifiques (Figure 1-31). De plus, la capacité
de la Tm à répondre aux diverses fonctions dépend de la régulation spatiale et temporelle
de l’expression de ses isoformes [87, 88, 92].
Figure 1-31. Divers isoformes de Tm pour diverses fonctions biologiques.
En collaboration avec les protéines de liaison à l’actine (ABPs) et l’activation de certaines voies de
signalisation, les Tms sont capables de former des populations distinctes de filament d’actine où
chacune d’entre elles comporte des isoformes spécifiques de Tm. Ces populations d’actine
fibrillaire sont définies pour des fonctions cellulaires spécifiques. Adapté de (G.M. O’Neill et al,
2008) [93].
1.4.4.1. La tropomyosine et la contraction musculaire
Ayant été découverte dans les cellules musculaires squelettiques, la Tm a donc permis de
résoudre le processus de la réponse physiologique de l’excitation/contraction des muscles
squelettiques et cardiaques. Au sein de ce mécanisme, on retrouve l’actomyosine et son
activité ATPase responsable de la contraction musculaire. Toutefois, d’autres composantes
interviennent dans ce procédé, soit la Tm et le complexe de la troponine (Tn). Le complexe
de la Tn est constitué de trois sous-unités : 1) la troponine-I (TnI) qui inhibe l’activité
ATPase de la myosine; 2) la troponine-T (TnT) qui assure la liaison du complexe Tn à la
Tm, et; 3) la troponine-C (TnC) qui permet la liaison des ions calcium [88, 92].
La contraction musculaire est le raccourcissement des sarcomères provoqué par le
glissement relatif des filaments d’actine et de myosine (Figure 1-32a). Le sarcomère est un
segment de myofibrille compris entre deux stries Z successives et représente l’unité de
contraction élémentaire. Globalement, lors de la contraction, les deux disques Z qui
délimitent un sarcomère se rapprochent l’un de l’autre, et ce, de façon simultanée pour tous
les sarcomères de la cellule conduisant, par conséquent, à un raccourcissement général de la
cellule musculaire dans un axe longitudinal.
Ce mécanisme dépend d’une activation par le calcium et des trois états de la Tm par rapport
au filament d’actine (Figure 1-32b). En effet, lorsque la TnC n’est pas lié à du calcium,
alors la TnI inhibe l’interaction actine/myosine puisque le site d’interaction entre les deux
molécules se retrouve occupé par la Tm. Il s’agit de l’état de blocage de la Tm (blocked
state). La liaison du calcium sur la TnC provoque un changement de conformation du
complexe de la Tn, ce qui entraîne le déplacement de la Tm démasquant alors les sites de
liaison actine/myosine. Il s’agit de l’état fermé de la Tm (closed state). Dans le dernier état
de la Tm, soit l’état ouvert (open state), les têtes de la myosine vont se lier à l’actine. Il y
aura alors hydrolyse de l’ATP induisant un changement de conformation de la myosine,
c’est-à-dire une diminution de 90° à 45° de l’angle que fait la tête de la myosine avec sa
queue allongée. La diminution de l’angle engendre un mouvement relatif entre les filaments
fins et les filaments épais, ce qui provoque la contraction de la cellule musculaire. Puis, la
liaison d’une nouvelle molécule d’ATP sur la tête de la myosine conduit à sa dissociation
87
du filament d’actine. Ainsi, le mécanisme repose sur la flexibilité de la Tm qui modifie
l’affinité de l’actine pour la myosine [88, 94].
Figure 1-32. Mécanisme de la contraction musculaire.
A) Représentation simplifiée d’un sarcomère. B) Les protéines impliquées dans les étapes de la
contraction musculaire. La Tm bloque les sites de liaison à l’actine et de la myosine. Le complexe
de la troponine est responsable de la régulation cytoplasmique de la contraction musculaire.
Lorsque la troponine C est saturée en calcium, alors l’effet inhibiteur de la troponine I est levé
permettant le déplacement de la Tm sur le filament d’actine, ce qui assure la liaison de la myosine à
l’actine-F. L’activité ATPasique des domaines moteurs de la tête de la myosine déclenche un
changement de conformation de la protéine provoquant, par conséquent, la contraction du
sarcomère. Adapté de (http://www.gymsante.eu/blog/excentrique-bases-anatomie-1309/) et de
(http://edoc.hu-berlin.de/dissertationen/kabaeva-zhyldyz-2002-11-11/HTML/kabaeva-ch1.html).
Chez les cellules musculaires lisses, le processus est légèrement différent. À vrai dire, le
complexe de la troponine est remplacé par la caldesmone (h-CAD). La Tm et la h-CAD
agissent de façon opposée sur l’activité ATPase de l’actomyosine. Contrairement à la Tm
des cellules musculaires squelettiques, celle des muscles lisses favorise l’activité
enzymatique de l’actomyosine. En fait, la flexibilité de la Tm induit un changement dans la
structure même des filaments d’actine augmentant ainsi la liaison de la myosine à l’actine
et stimule beaucoup plus efficacement l’activité ATPase de cette dernière. La h-CAD,
quant à elle, inhibe l’activité ATPase de la myosine. Des études ont dévoilé deux modèles
afin d’expliquer le mécanisme inhibiteur de la h-CAD/Tm sur la contraction musculaire
lisse : le modèle allostérique coopératif (cooperative allosteric model) et le modèle de la
compétition (competition model). Dans le premier modèle, il n’y a que deux positions
possibles pour la Tm sur le filament d’actine, c’est-à-dire la position ouverte (ou activée) et
la position bloquée (ou inhibée). Ces deux positions permettent ou non la liaison de la
myosine sur l’actine-F, et ce, au dépend de la h-CAD. Cependant, le passage en position
bloquée par la Tm via la h-CAD ne provoque pas nécessairement la dissociation de la
myosine. En effet, cela dépendrait plutôt de la fluctuation de la concentration en h-CAD
dans la cellule. Cela nous conduit donc au second modèle qui suggère que la h-CAD
rivalise avec la myosine pour se lier à l’actine en présence d’ATP. Il importe de considérer
que les sites de liaison pour les deux molécules sur l’actine se chevauchent [88, 95].
1.4.4.2. La tropomyosine et les cellules non musculaires
Les cellules non musculaires comportent également un système de contraction de l’actine-F
où la régulation de ce mécanisme diffère selon le type cellulaire et diverge du procédé
d’excitation/contraction des muscles squelettiques et cardiaques. Tout comme les cellules
musculaires lisses, les cellules non musculaires sont dépourvues du complexe de la
troponine. Ainsi, les processus contrôlant les interactions entre la myosine et l’actine dans
ces cellules nécessitent la présence d’au moins deux molécules : la MLCK et la CAD. Dans
les cellules non musculaires, seulement l’isoforme raccourci de la CAD est exprimé, soit la
I-CAD. La I-CAD et la Tm travaillent de concert dans la régulation de l’assemblage et de
l’organisation du cytosquelette d’actine. Contrairement aux cellules musculaires, l’activité
du cytosquelette des cellules non musculaires ne se limite pas qu’à la contraction.
Effectivement, le cytosquelette se retrouve au cœur d’une panoplie de fonctions cellulaires
qui sont étroitement associées à la diversité des Tms d’une même cellule et au remodelage
architectural des filaments d’actine. Plusieurs structures distinctes du cytosquelette d’actine
sont impliquées dans les réponses aux diverses fonctions cellulaires comme les fibres de
stress, les lamellipodes, les filopodes, l’anneau contractile et les microvilli. Les Tms sont
donc impliquées dans la morphologie cellulaire, la motilité, la signalisation, la prolifération
89
cellulaire, la survie cellulaire, l’endocytose et le trafic intracellulaire, la dégradation de la
matrice extracellulaire et le processus métastatique chez les cellules tumorales.
Traditionnellement, on pensait que les Tms n’occupaient qu’un rôle très simpliste reposant
sur la stabilisation des filaments d’actine afin d’empêcher leur dépolymérisation à partir du
bout pointu et particulièrement contre les protéines de coupures comme la gelsoline, la
villine et l’ADF/cofiline. Aujourd’hui, on constate que les Tms occupent un rôle beaucoup
plus large et, avec la collaboration des protéines de liaison de l’actine couplée à l’activation
de différentes voies de signalisation, les Tms sont capables de former des populations
distinctes de filaments d’actine lesquels comportent des isoformes spécifiques de Tm afin
de répondre à des fonctions particulières. De plus, ces fonctions cellulaires nécessitant un
remodelage du cytosquelette d’actine requièrent également une modification post-
traductionnelle de la Tm. Par exemple, l’acétylation d’une très grande majorité de Tms,
dont la Tmα, sur la première méthionine de leur extrémité N-terminale est cruciale pour
enclencher leur dimérisation et favoriser leur interaction avec l’actine-F. De surcroît, la
phosphorylation de plusieurs Tms du cytosquelette est impliquée dans la régulation de la
formation de fibres de stress en réponse à l’acétylcholine dans les cellules musculaires
lisses. La phosphorylation de la Tm1 (du gène TPM2) sur sa Ser61 en aval de la voie PI3K
(Phosphoinositide 3-Kinase) est importante pour permettre l’internalisation du récepteur β-
adrénergique lors d’une étape tardive de l’endocytose. La phosphorylation de la Tm1 (du
gène TPM1) sur sa Ser283 en aval de la voie ERK est nécessaire à la régulation de
l’assemblage de fibres de stress d’actine et à la formation de points focaux d’adhérence, et
ce, en réponse au stress oxydant [48, 78, 84, 85, 87, 88, 92, 93, 96].
1.4.5. La tropomyosine-1
La tropomyosine-1 alpha humaine (Tm1 ou Tmα ou Tm1α ou TM1) est une protéine codée
par le gène TPM1 (ou Tm-α) situé sur le chromosome 15q22. Il s’agit de l’isoforme 1 du
gène et son ARNm linéaire comporte 855 pb. C’est une protéine de 284 a.a. faisant partie
de la famille des Tms HMW. La Tm1 contient 14 sérines et 7 thréonines pouvant être
phosphorylées. Comme il a déjà été mentionné, la phosphorylation de la Tm1 sur sa Ser283
en C-terminal chez les cellules endothéliales, lors d’un stress oxydant, est nécessaire à la
formation de fibres de stress et à leur ancrage dans la membrane plasmique via les points
focaux d’adhérence. Cette phosphorylation semble être très importante pour le maintien de
l’intégrité de la barrière de l’endothélium vasculaire en présence d’une dysfonction
endothéliale causé par une forte concentration extracellulaire en ROS [23, 78, 84].
91
Chapitre II
93
Objectif de l’étude
Le but général de ce projet de maîtrise visait à déterminer l’implication de la
phosphorylation de la tropomyosine-1 sur la Ser283 via la DAPK1, en aval de la voie ERK,
dans la régulation des mécanismes cellulaires assurant le maintien de l’intégrité de la
barrière endothéliale en réponse au stress oxydant.
Les objectifs spécifiques consistaient à :
Évaluer l’effet du stress oxydant sur l’intégrité de la barrière endothéliale.
Déterminer si l’expression de la Tm1 est nécessaire au maintien de l’intégrité de
l’endothélium en réponse au stress oxydant.
Déterminer le rôle de la Tm1 phosphorylée (P~Ser283) dans la régulation de la
perméabilité endothéliale, et ce, en condition de stress oxydant et de dysfonction
endothéliale.
Déterminer l’implication de la Tm1 phosphorylée (P~Ser283) dans la régulation de
la migration trans-endothéliale de cellules cancéreuses, et ce, en condition de stress
oxydant et de dysfonction endothéliale.
Hypothèse
La phosphorylation de la Tm1, sur la Ser283, joue un rôle important au sein des
mécanismes cellulaires qui assurent la régulation de la perméabilité endothéliale en réponse
au stress oxydant contribuant ainsi au maintien de l’intégrité de l’endothélium et permettant
de limiter la migration de cellules cancéreuses à travers la paroi vasculaire.
Le chapitre qui suit présente, sous la forme d’un article soumis dans la revue Vascular Cell,
les résultats obtenus à l’issue de mon projet de recherche de maîtrise.
2. Régulation de la perméabilité endothéliale et de la
migration trans-endothéliale de cellules cancéreuses
via la phosphorylation de la tropomyosine-1
Cet article a été soumis le 25 juillet 2012 dans la revue Vascular Cell. Depuis, l’article a été
accepté, révisé, corrigé et le dépôt final a été fait le 17 novembre 2012. L’article présenté
dans le chapitre II consiste en la version finale publiée dans la revue Vascular Cell et que
l’on peut retrouver dans le moteur de recherche Pubmed [PMID : 23157718]. Le projet de
recherche qui a permis de pondre cet article a été élaboré par le Dr. Huot et moi-même,
avec la participation de François Houle. J’ai effectué l’ensemble des expériences présentées
dans les principales figures et les figures supplémentaires. J’ai contribué à l’écriture de
l’article en rédigeant la première version et au montage des figures, et ce, en participant aux
remaniements et corrections qui en sont découlés, sous la direction du Dr. Huot et avec la
collaboration de François Houle.
Cet article fait suite aux découvertes effectuées par le Dr. Huot, François Houle, Simon
Rousseau, Mario Luc et Andrée Poirier à propos :
1. De la réorganisation de l’actine induite par le stress oxydant via l’activation de la
voie SAPK2/P38 (Jacques Huot et al., 1997) [76].
2. Du rôle de la tropomyosine-1 phosphorylée et de la formation des points focaux
d’adhérence dans le remodelage du cytosquelette d’actine en fibre de stress, et ce,
en réponse au stress oxydant via l’activation de la voie ERK (François Houle et al.,
2003) [78].
3. Du rôle de la tropomyosine-1 phosphorylée dans la régulation de la formation des
fibres de stress en condition de stress oxydant directement via l’activation de la
DAP Kinase en aval de la voie ERK (François Houle et al., 2007) [84].
95
2.1. Résumé
Contexte : La perte de l’intégrité et de la perméabilité sélective de la barrière endothéliale
est un évènement précoce dans la séquence des lésions oxydatives responsables de
l’athérosclérose, de l’hypertension et de l’épanchement de cellules cancéreuses durant la
dissémination métastatique. Nous avons démontré que l’intégrité des cellules endothéliales
est étroitement régulée via la co-activation balancée des voies p38 et ERK. Plus
précisément, nous avons montré que la phosphorylation de la tropomyosine-1 (tropomyosin
alpha-1 chain = Tm1) sur la Ser283 par la DAP kinase, en aval de la voie ERK, peut être
un évènement clé nécessaire au maintien de l’intégrité et de la fonction normale de
l’endothélium en réponse au stress oxydant.
Méthodes : La perméabilité endothéliale a été mesurée par le suivi de la diffusion du
Dextran-FITC à travers une monocouche confluente de cellules HUVEC à l’intérieur de
chambres de Boyden. La dynamique et la distribution de l’actine et de la Tm1 ont été
évaluées par immunofluorescence. Nous avons modulé l’expression de la Tm1 par
interférence à l’ARN et par l’expression du type sauvage et d’une forme mutante de la
Tm1, tous les deux insensibles aux siRNAs, et ce, par infection lentivirale. La migration
transendothéliale de cellules cancéreuses HT-29 du colon a été effectuée dans des chambres
de Boyden en employant les mêmes conditions que celles en perméabilité.
Résultats : Nous avons démontré l’évidence indiquant que la phosphorylation de la Tm1
sur la Ser283 est essentielle pour réguler la perméabilité endothéliale en condition de stress
oxydant via sa capacité à moduler la dynamique de l’actine. De plus, la migration
transendothéliale de cellules cancéreuses du colon est également régulée par la
phosphorylation de la Tm1 sur la Ser283.
Conclusion : Notre découverte supporte fermement le rôle de la phosphorylation de la Tm1
endothéliale sur la Ser283 dans la prévention de la dysfonction de la barrière endothéliale
associée aux lésions oxydatives.
2.2. Article
Regulation of Endothelial Permeability and Transendothelial Migration
of Cancer Cells by Tropomyosin-1 Phosphorylation
Bryan Simoneau, François Houle and Jacques Huot
Centre de recherche en cancérologie de l’Université Laval et Centre de recherche du
CHUQ, Hôtel-Dieu de Québec, 9 rue McMahon, Québec G1R 2J6, Canada
Running title: Tropomyosin-1 phosphorylation regulates endothelial barrier functions
Corresponding author: Dr. Jacques Huot
Tel: (418) 525-4444 15553
Fax: (418) 691-5439
97
2.2.1. Abstract
Background: Loss of endothelial cell integrity and selective permeability barrier is an
early event in the sequence of oxidant-mediated injury and may result in atherosclerosis,
hypertension and facilitation of transendothelial migration of cancer cells during metastasis.
We already reported that endothelial cell integrity is tightly regulated by the balanced co-
activation of p38 and ERK pathways. In particular, we showed that phosphorylation of
tropomyosin-1 (tropomyosin alpha-1 chain = Tm1) at Ser283 by DAP kinase, downstream
of the ERK pathway might be a key event required to maintain the integrity and normal
function of the endothelium in response to oxidative stress.
Methods: Endothelial permeability was assayed by monitoring the passage of Dextran-
FITC through a tight monolayer of HUVEC grown to confluence in Boyden chambers.
Actin and Tm1 dynamics and distribution were evaluated by immunofluorescence. We
modulated the expression of Tm1 by siRNA and lentiviral-mediated expression of wild
type and mutated forms of Tm1 insensitive to the siRNA. Transendothelial migration of
HT-29 colon cancer cells was monitored in Boyden chambers similarly as for permeability.
Results: We provide evidence indicating that Tm1 phosphorylation at Ser283 is essential to
regulate endothelial permeability under oxidative stress by modulating actin dynamics.
Moreover, the transendothelial migration of colon cancer cells is also regulated by the
phosphorylation of Tm1 at Ser283.
Conclusion: Our findings strongly support the role for the phosphorylation of endothelial
Tm1 at Ser283 to prevent endothelial barrier dysfunction associated with oxidative stress
injury.
KeyWords: Tropomyosin phosphorylation, permeability, oxidative stress, transendothelial
migration.
2.2.2. Introduction
By gating the traffic of molecules and cells across the vessel wall, vascular endothelial cells
play an active role in regulating cardiovascular and systemic homeostasis and in modulating
physiopathological processes such as inflammation and immunity [97-99]. The functions of
endothelial cells are regulated by physiological agonists and stress stimuli in a process called
endothelial cell activation. This process is associated with the induction of intracellular
signalling pathways that converge on the stimulation of constitutive functions of the
endothelium, the synthesis and release of mediators of inflammation, the induction of adhesion
molecules, and with structural changes in the actin cytoskeleton that govern motility and
permeability [45, 51, 100]. Dysfunction of the regulatory systems of the endothelium and its
incapacity to cope with its physicochemical surrounding lead to disruption of endothelial
integrity and genesis of cardiovascular pathologies including atherosclerosis, hypertension and
coagulation abnormalities [101, 102].
Endothelial cells are heavily exposed to Reactive Oxygen Species (ROS) and these latter are
major regulators of physiological and pathological processes involving the endothelium.
Notably, endothelial cells produce ROS in response to ischemia-reoxygenation. In turn, ROS
contribute to the modulation of several signalling pathways including calcium-dependent
signalling as well as pathways regulating vascular permeability [103-106]. Importantly, loss of
endothelial cell integrity and selective permeability barrier is an early event in the sequence of
oxidant-mediated injury and may result in atherosclerosis, hypertension and facilitation of
transendothelial migration of cancer cells (TEM) during metastasis [29, 107-109]. It is thus of
high clinical importance to better understand how ROS regulate endothelial permeability in
normal and pathological situations. Along these lines, the current paradigm is that endothelial
cell permeability is regulated by the opposing centripetal-centrifugal forces associated with
cytoskeletal dynamics [110]. The equilibrium between the centripetal and centrifugal forces is
under the regulation of different signalling pathways. Notably, we reported that endothelial cell
integrity is tightly regulated by the balanced co-activation of p38 and ERK pathways [23]. In
particular, we showed that in response to E-selectin activation, endothelial cell permeability and
TEM of cancer cells are regulated by the formation of stress fibers by p38-dependent actin
99
polymerization and myosin light chain phosphorylation and by ERK-dependent regulation of
the VE-cadherin-catenin complex at the adherens junctions [100]. In oxidative stress
conditions, the strong actin-polymerizing activity generated through the p38/MAKAP kinase-
2/HSP27 axis is associated with membrane blebbing when the ERK pathway is inhibited [76,
78]. The blebbing activity caused gaps in the endothelium layers, which were due to an
impairment of the phosphorylation of tropomyosin-1 (RecName: Full= Tropomyosin alpha-1
chain, herein named Tm1) at Ser283 by DAP kinase, downstream of the ERK pathway [78, 84].
This suggests that ERK-mediated phosphorylation of Tm1 might be a key event required to
maintain the integrity and normal function of the endothelium in response to oxidative stress. In
particular, phosphorylation of Tm1 at Ser283 is required for the formation of stress fibers and
thereby contraction of the endothelial cells. On the other hand, phosphorylation of TM2 at S61
occurs downstream of the PI3K pathway and is required for the internalization of the beta-
adrenergic receptor [111]. Moreover, Tm1 kappa, a splice variant of Tm1 gene, is increased in
patients with chronic dilatated cardiomyopathy and it modulates the sensitivity of the
myofilaments in a phosphorylation-dependent manner [112]. The in vivo functions of Tms are
not necessarily direct and may require other actin binding proteins such as caldesmon and
HSP27 [113].
In the present study, we investigated the role of Tm1 in regulating endothelial cell permeability
and TEM of colon cancer cells in response to oxidative stress. We show for the first time that
phosphorylation of Tm1 at Ser283 is a major regulator of both endothelial cell permeability and
TEM in response to oxidative stress. In particular, we provide evidence indicating that
phosphorylated Tm1 contributes to maintain the integrity of the endothelium under oxidative
stress condition by its crucial participation to the remodelling of actin cytoskeleton into stress
fibers. These finding strongly support the role for the phosphorylation of Tm1 at Ser283 to
prevent oxidative stress injury associated with endothelial barrier dysfunction.
2.2.3. Materials and Methods
Chemicals
H2O2 and endothelial cell growth supplement (ECGS) were from Sigma-Aldrich (Oakville,
On, Canada). PD098059 was purchased from Calbiochem (San Diego, CA) and was diluted
in DMSO to make stock solutions of 20mM. Histamine and NaF were purchased from
Sigma-Aldrich. Histamine was diluted in water to make stock solutions of 5 mM.
Chemicals for electrophoresis were obtained from Bio-Rad (Mississauga, On, Canada) and
Fisher Scientific (Montréal, Qc, Canada).
Cells
HUVECs were isolated by collagenase digestion of umbilical veins from undamaged
sections of fresh cords [76]. The cords were obtained after approbation by the CRCHUQ
ethical committee. Subcultures were maintained in EGM2 media (LONZA, Allendale, NJ,
USA). Replicated cultures were obtained by trypsinization and were used at passages <5.
Human Embryonic Kidney cells (HEK293T) were cultivated in DMEM containing 10 %
foetal bovine serum (FBS) and antibiotics. Human colorectal adenocarcinoma cells (HT29)
were cultivated in McCoy’s 5A medium supplemented with 10 % FBS. Cultures were
maintained at 37°C in a humidified atmosphere containing 5 % CO2.
Antibodies
Anti-tropomyosin (clone TM311) monoclonal and anti-α-tubulin mouse monoclonal (clone
B-512) antibodies were purchased from Sigma. Anti-living color (GFP) rabbit polyclonal
antibody was purchased from BD Biosciences (Mississauga, On, Canada). Anti-mouse-
IgG-horseradish peroxidase (HRP) and anti-rabbit-IgG-HRP antibodies were from Jackson
Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Anti-ERK2 is a rabbit polyclonal antibody raised
against a synthetic peptide that corresponds to the 14 C-terminal amino acids of rat ERK2
[76].
101
Plasmids and small interfering RNA (siRNA)
Tropomyosin-1 cDNA (RecName : Full= Tropomyosin alpha-1 chain, herein named Tm1)
was cloned by PCR amplification from IMAGE clone 562592 (ATCC) into pIRES-
hrGFP2a [84]. The tropomyosin-1 S283A was generated by PCR site-directed mutagenesis
on pIRES-hrGFP2a-tropomyosin-1 construct using the primers 5’-
ATGACTGCTATATAACTCGAGTACCCATATGACG-3’ and 5’-
TTATATAGCAGTCATATCGTTGAGAGCGTGG-3’ [84]. Validated Tm1 siRNA #7
(Hs_TPM1_7) was purchased from QIAGEN (Mississauga, On, Canada) and was designed
to target the mRNA of human Tm1 (GenBankTM accession no. NM_ 000366.1). The
target sequence of Tm1 siRNA #7 is as follows: sense, 5’-
GAGUGAGAGAGGCAUGAAATT-3’ and antisense, 5’-
UUUCAUGCCUCUCUCACUCTC-3’. Non-targeting silencer negative control siRNA #1
was purchased from Ambion (Austin, TX, USA). The tropomyosin-1 wild-type (Tm1wt)
and tropomyosin-1 S283A (Tm1S283A) constructs were rendered insensitive to Tm1
siRNA #7 by PCR-mediated mutagenesis at the sites indicated in bold in the mutagenic
oligonucleotides: 5’-GAGCGAGCGAGGGATGAAGGTCATTGAG-3’ (sense) and 3’-
GTCTACTCTCGCTCGCTCCCTACTTCC-5’ (reverse). Plasmids necessary for lentiviral
particles production were a kind gift of Dr. Manuel Caruso (Laval University, Qc, Canada).
CSII-EF-MCS-IRES2-Venus (CSII-Venus) vector was a kind gift of Dr. Hiroyuki Miyoshi
(RIKEN Tsukuba Institute, Japan). Tm1S283A insensitive to siRNA #7 was subcloned in
CSII-Venus vector using NotI and BamHI restriction sites (CSII-Venus-Tm1S283A). The
CSII-Venus-Tm1wt construct insensitive to siRNA #7 was generated by PCR site-directed
mutagenesis on CSII-Venus-Tm1S283A construct using the following primers: sense, 5’-
TATGACTTCCATATAAGGATCCGCCCCTCTCCCTCCCCC-3’ and antisense, 5’-
GCGGATCCTTATATGGAAGTCATATCGTTGAGAGCGTGGTCCAG-3’. KOD Hot
Start DNA polymerase was used according to the manufacturer protocol (EMD,
Philadelphia, PA, USA).
Lentiviral particle preparation
HEK293T were plated at 3X106 per 100 mm Petri dish in 10ml DMEM supplemented with
10 % FBS. Co-transfection was performed by Ca2+
phosphate-mediated transfection using
2.5 µg of pRSV-Rev, 6.5 µg of pMDLg-pRRE, 3.5 µg of pMD2.G together with 10 µg of
transgene expressing vectors (CSII-Venus, CSII-Venus-Tm1wt or CSII-Venus-
Tm1S283A). After overnight incubation, media were replaced with 5 ml lentiviral particle
collection media (M199 medium containing 20 % heat-inactivated FBS, ECGS, L-
glutamine, heparin and antibiotics). After 24 hours, the media were collected and
centrifuged at 1200 g, for 5 minutes at 4°C. The supernatant was stored in aliquots at -
80°C. The Multiplicity of Infection (MOI), known as the ratio of infectious virus particles
per cell, was determined after a 48 hours transduction of HUVECs in cascade dilution
experiment. The percentage of GFP positive cells was determined by FACS using EPICS-
XL-MCL flow cytometer (Beckman-Coulter, Ramsey, MN, USA) [114, 115].
Transfection and transduction
HUVECs and HEK293T were transfected with siRNA or plasmid vectors using X-
tremeGene HP Transfection Reagent obtained from Roche (Laval, Qc, Canada) according
to the manufacturer’s protocol or by electroporation [84]. HUVECs were transduced or not
with CSII-Venus (empty vector) or CSII-Venus-Tm1wt (Tm1 wild-type vector) or CSII-
Venus-Tm1S283A (non-phosphorylatable Tm1 mutant vector) using lentivirus-mediated
infection in the presence of 8µg/ml hexadimethrine bromide (Sigma-Aldrich, Oakville, On,
Canada).
Western Blotting
After treatment, cells were lysed using SDS-PAGE loading buffer. Equal amounts per well
of total proteins were separated by SDS-PAGE, and the gels were transferred onto
nitrocellulose membranes for western blotting. After incubating nitrocellulose membranes
with the appropriate primary antibodies, antigen-antibody complexes were detected with an
anti-IgG antibody coupled to horseradish peroxidase and then revealed using an enhanced
chemiluminescence kit. Quantification of immunoreactive bands was done by
densitometric scanning using the Image J software.
103
Endothelial permeability assay
Permeability across endothelial cell monolayers was measured using gelatin-coated
Transwell units (Boyden chambers) [6.5 mm diameter, 0.4 µm pore size polycarbonate
filter; Corning Costar; Pittston, PA, USA]. Transfection and transduction--First day,
HUVECs were plated at a density of 3x105 cells per 60 mm Petri dishes and were cultured
for 24 hours. Second day, exponentially growing HUVECs were transduced or not with
CSII-Venus (empty vector) or CSII-Venus-Tm1wt (Tm1 wild-type vector) or CSII-Venus-
Tm1S283A (non-phosphorylatable Tm1 mutant vector) using lentivirus-mediated infection
in the presence of 8 µg/ml hexadimethrine bromide. After 24 hours, infected or non-
infected HUVECs were transfected or not (controls) with Tm1 siRNA #7 using X-
tremeGene HP Transfection Reagent according to the manufacturer’s protocol. The next
day, HUVECs were plated at a density of 0.6x105 cells (or 1x10
5 in the case of transduced
cells) per well (upper chamber) and were cultured for 3 days until the formation of a tight
monolayer. Endothelial permeability was determined by measuring the passage of FITC-
labelled dextran (1 mg/ml of fluorescein isothiocyanate-dextran, molecular mass: 40 kDa;
Sigma-Aldrich) through the HUVEC monolayer. Thereafter, NAF (1 mM for 1 hour) was
added to the incubation medium (upper chamber) to inhibit phosphatases and allow the
accumulation of phosphorylated tropomyosin-1. Then, H2O2 was added to the upper
chamber in the presence of 1 mg/ml FITC-labelled dextran. After 30 minutes of treatment,
100 µl was collected from the lower compartment and fluorescence was evaluated using a
Fluoroskan Ascent Microplate Fluorometer following manufacturer’s protocol (Thermo
Scientific, Mtl, Qc, Canada).
Transendothelial cell migration assay
Cancer cells migration through endothelial barrier in response to H2O2 was studied in
Boyden chambers (6.5 mm diameter, 5.0 µm pore size polycarbonate filter; Corning Costar;
Pittston, PA, USA). HUVECs transduced and transfected as mentioned above (see section
Endothelial permeability assay) were plated at a density of 1.0x105 per well and were
cultivated for 3 days until the formation of a tight monolayer. Thereafter, H2O2 was added
to the upper chamber for 30 minutes. Then, EGM2 medium was removed and replaced by
migration buffer (199 medium, 10 mM HEPES pH 7.4, 1 mM MgCl2, and 0.5 % bovine
serum albumin). HT-29 were harvested with trypsin, counted, centrifuged, and resuspended
at 1x106 cells/ml in McCoy’s medium (McCoy’s 5A medium supplemented with 10 %
FBS). Then, HT-29 were stained with calcein (500 nM) for 30 minutes at 37°C, were
centrifuged, and were resuspended at 1.5x106 cells/ml in migration buffer. Cancer cells
were added on the HUVEC monolayer at a density of 1.5x105 cells per well. After 4 hours
and a half of migration, cells in the upper chamber were removed with a cotton swab. Then,
HT-29 cells that crossed the membrane of the Boyden chamber were counted in five
different fields using a Nikon TE300 fluorescence microscope equipped with a 20x
objective.
Cell Viability Assay
Cell viability has been determined by using the Quick Cell Proliferation Assay Kit from
BioVision. This cell proliferation and viability assay is based on the enzymatic cleavage of
the tetrazolium salt WST-1 to formazan dye by cellular mitochondrial dehydrogenases that
are active in viable cells only. The formazan dye produced by viable cells is quantified by
measuring the absorbance of the dye solution at 440 nm. The exact procedure that was
followed was as described in the BioVision protocol sheet.
Fluorescence Microscopy
Confocal microscopy was used for immunofluorescence visualization of F-actin,
tropomyosin-1 and EGFP. HUVECs were plated on gelatine-coated microscope cover
slides into 35 mm Petri dishes. After treatment, cells were fixed with 3.7 % formaldehyde
and permeabilized with 0.1 % saponin in phosphate buffer, pH 7.5. F-actin was detected
using Alexa-488-phalloidin (Invitrogen, Carlsbad, CA) diluted 1:400 in phosphate buffer.
Tropomyosin-1 was detected using an anti-tropomyosin (clone TM311) mouse monoclonal
antibody. Living color rabbit antibody was used for EGFP staining. The antigen-antibody
complexes were detected with Alexa-568-mouse-IgG or Alexa-568-rabbit-IgG secondary
antibodies. The cells were examined using Nikon Eclipse 600 microscope equipped with
20x and 40x objectives.
105
Statistical Analysis
Results are expressed as mean values ± SEM. Unless specified, the figures present results
that were obtained from a representative experiment of at least three distinct experiments.
The n value means the total number of replicates in this experiment. Unpaired Student t test
was used for comparison between two means. A p-value <0.05 was considered as
statistically significant.
2.2.4. Results
H2O2 induces the formation of transcytoplasmic stress fibers and increases endothelial
cell permeability
In response to oxidative stress, activation of the p38 pathway favours actin polymerization
which contributes to cytoskeletal remodelling into stress fibers, which in turn, are required
to regulate endothelial permeability [76, 110]. Accordingly, inhibition of ROS-induced p38
activation dampens the increased in endothelial cell permeability [116]. Intriguingly, in the
presence of ERK inhibition, the strong actin polymerization generated via the p38 pathway
induced by ROS is associated with membrane blebbing, an early toxic manifestation of
oxidative stress [23, 117]. We provided evidence indicating that ROS-induced membrane
blebbing resulted in an inhibition of ERK-dependent phosphorylation of Tm1 downstream
of Death Associated-Protein Kinase-1 (DAPK1) [23, 76, 84, 117 ]. This suggested that
activation of the ERK-Tm1 axis might be a key determinant in maintaining the integrity of
the endothelium in response to oxidative stress. In this context, we investigated herein the
role of the ERK-Tm1 axis in regulating endothelial cell permeability in response to ROS.
We first ascertained whether oxidative stress induced an increase in endothelial cell
permeability. HUVEC cultivated as tight monolayers in Boyden chambers were treated or
not with 250 µM H2O2 for 30, 60 and 90 minutes. Thereafter, permeability was determined
by measuring the passage of FITC-labelled dextran (molecular mass: 40 kDa) across
endothelial cell monolayers. Results showed that H2O2 as well as histamine, taken as a
positive control, increased endothelial permeability in a time-dependent manner (Fig.2-1A).
In both cases, ROS- and histamine-induced increase in endothelial cell permeability were
associated with formation of actin stress fibers, which is consistent with the key role played
by these structures in regulating endothelial cell integrity (Fig.2-1B). Interestingly, the
cytoskeletal remodelling induced by H2O2 and histamine was accompanied by an increase
in the width of interendothelial spaces, which reflects cellular contraction that favours
permeability to Dextran (Fig.2-1B). However, the 30 min treatment with 250 M H2O2 did
not influence cell viability as measured by the cleavage of WST-1 tetrazolium salt in
formazan by mitochondrial dehydrogenase activity of viable cells (Supplemental Fig.2-
S1).
107
Next, we evaluated the role of the ERK pathway in maintaining endothelial integrity in
response to H2O2. First, we found that H2O2 enhanced by 4-fold the activation of ERK after
30 min (Fig.2-2A). Then, we set up an endothelial permeability assay in which we inhibited
the ERK pathway at the level of MEK1/2 using PD098059 [118] (Fig2-2A). Results
showed that the H2O2-induced endothelial cell permeability was still further increased by
1.4-fold at 30 min when ERK was inhibited. Indeed, the increased endothelial cell
permeability when the ERK pathway was inhibited was augmented by 1.8-fold in
comparison to 1.3-fold when the ERK pathway was functional (Fig.2-2B). Interestingly,
PD098059 did not affect by itself endothelial cell permeability for exposure times up to 90
min (Supplemental Fig.2-S2).
These findings are strong evidence in support that the ERK pathway is a major regulator of
endothelial permeability and that its deregulation in the presence of ROS is associated with
disruption of the endothelial barrier functions.
Tropomyosin-1 regulates endothelial barrier integrity in response to oxidative stress
We previously reported that ROS-induced phosphorylation of Tm1 at Ser283 by DAP
Kinase-1, downstream of ERK, is required to secure the formation of stress fibers and
protects endothelial cell against early membrane blebbing [78, 84]. Based on these findings,
we decided to investigate next the involvement of Tm1 in maintaining the endothelial
barrier integrity in response to oxidative stress. To this end, we proceeded to experiments in
which we knocked down the expression of endogenous Tm1 by means of siRNAs (Fig.2-
3A and Supplemental Fig.2-S3). HUVECs were co-transfected for 72 hours with
siRNA7Tm1 or with a non-targeting siRNA (Silencer, Negative Control #1). Monolayers
of endothelial cells were treated with 250 µM H2O2 for 30 minutes and permeability was
assessed as above. As shown in Figures 3A and S3, siRNA7Tm1 almost completely
inhibited (by 80 %) the expression of Tm1, as determined by densitometric analysis of the
western blots performed on cell samples extracted just before the permeability assays. This
siRNA-mediated knockdown of Tm1 was associated with a ~2.0-fold increase in
endothelial permeability to H2O2 (Fig.2-3B). In contrast, the endothelial permeability to
FITC-labelled dextran was only ~1.4-fold in H2O2-treated HUVEC monolayers expressing
non-targeting siRNA. Of note, the knockdown of Tm1 by itself was associated with a ~1.4-
fold increase in endothelial cell permeability, which is associated with a decreased
formation of stress fibers (Fig.2-3C, Panel j-l). In both cases, this is in line with the fact
that Tm1 is an essential component of the endothelial cell integrity. Consistent with the role
of Tm1 in stress fiber formation and with the contribution of these latter in maintaining the
integrity of the barrier, we found that the knockdown of Tm1 was associated with a loss of
stress fibers and with interendothelial spaces when the cells were treated with 250 µM
H2O2 for 30 minutes (Fig.2-3C: see notably panels j-l vs m-o).
Together, these results constitute the first proof indicating that endogenous human Tm1 is
required to maintain the integrity of the endothelial layer in response to ROS.
Phosphorylation of Tm1 at Ser283 regulates endothelial permeability
The inhibition of the ERK pathway is associated with a decrease in Tm1 phosphorylation at
Ser283, which is accompanied by the disappearance of the H2O2-mediated formation of
stress fibers [78, 84]. These effects result in breaking the delicate equilibrium between the
balanced activation of the ERK and p38 pathways required for the formation of stress fibers
and for the normal functioning of endothelial cells in the presence of ROS [23]. In addition,
they suggest that phosphorylation of Tm1 at Ser283 downstream of ERK is important to
regulate the selective endothelial permeability under oxidative stress. Accordingly, we next
verified whether phosphorylated Tm1 at Ser283 plays a role in permeability regulation in
response to H2O2. To this purpose, we used an approach based on knocking down
endogenous Tm1 with siRNA in cell expressing different forms of Tm1-insensitive to the
knockdown. Briefly, we first introduced, via lentiviral-mediated infection, a wt form or a
Ser283Ala mutated form of Tm1 that are insensitive to siRNA7Tm1 (Supplemental Fig.2-
S4). Twenty-four hours later, the cells were transfected for another 24 hours with
siRNA7Tm1 to knock down endogenous Tm1. Then, endothelial cells were cultivated as
monolayers in Boyden chambers, and permeability in the presence or not of 250 M H2O2
for 30 and 60 min was assayed as above. As shown in figure 2-4A, we found a significant
109
26 % (30 min) and 22 % (60 min) increases in endothelial permeability in HUVEC
monolayers transduced with CSII-Venus-Tm1S283A. In contrast, there were strong 86 %
(30 min) and 85 % (60 min) decreases of endothelial permeability in HUVEC monolayers
transduced with CSII-Venus-Tm1wt. Moreover, consistent with the key role played by
phosphorylation of Tm1 at Ser283 for the formation of stress fibers and with the role of
these latter in permeability, we found that the introduction of wt form of Tm1 is associated
with an increase formation of stress fibers in response to H2O2 (Fig.2-4B: panels j-l). In
contrast, the introduction of the mutated Tm1S283A is associated with absence of stress
fibers (Fig.2-4B: panels m-o), with interendothelial gaps and thereby increased endothelial
permeability to H2O2 (Fig.2-4B: panels p-r). Interestingly, our results revealed that
lentivirus-mediated infection did not increase by itself endothelial permeability and did not
affect cell viability (Supplemental Fig.2-S5 and 2-S6).
Altogether, these results indicate for the first time that phosphorylation of Tm1 at Ser283 is
essential to maintain the normal regulation of endothelial permeability in response to
oxidative stress.
Phosphorylation of Tm1 at Ser283 regulates transendothelial migration of HT-29
colon cancer cells
Transendothelial migration (TEM) of circulating cancer cells is a key determinant of the
metastatic process [109]. Along these lines, TEM and metastasis are both importantly
dependent on the integrity of the endothelium and are both affected by ROS [119]. As we
reported above, phosphorylation of Tm1 at Ser283 is a major mechanism that confers
protection against ROS-induced damage to the endothelial layer. Hence, we next
investigated whether phosphorylation of Tm1 at Ser283 regulates TEM under oxidative
stress. To ascertain the role of Tm1 in regulating transendothelial permeability under
oxidative stress conditions, we first knocked down the expression of endogenous Tm1 via
siRNA. Thereafter, cells were cultivated as tight monolayers on a 5.0 µm pore size
gelatinized polycarbonate membranes separating the two parts of a 6.5 mm Boyden
chambers. The cells were then treated or not with H2O2 (250 M) for 30 min. H2O2-
containing media were then removed and were replaced by fresh media containing calcein
labeled HT-29 cells in suspension. After 4 hours and a half, the number of HT-29 cells that
have crossed the endothelial layer was counted. Consistent with the role of Tm1 in
regulating endothelial permeability, we found that transendothelial migration of HT-29
cells was increased by ~2-fold when HT-29 cells were added to a layer of HUVEC in
which Tm1 has been knocked down (Fig.2-5).
Given that the Tm1-mediated effect on endothelial integrity depends on its phosphorylation
at Ser283, we next verified the role of Tm1 phosphorylation on TEM. The approach used
was analogous to that used to investigate the role of Tm1 phosphorylation in regulating
endothelial permeability. Briefly, a wild type form or a Ser283Ala mutated form of Tm1
that are insensitive to siRNA7Tm1 were first introduced in the cells, via lentiviral-mediated
infection, (Supplemental Fig.2-S4). Twenty-four hours later, the cells were transfected for
another 24 hours with siRNA7Tm1 to knock down endogenous Tm1. Endothelial cells
were then cultivated as monolayers in Boyden chambers and then were treated in the
presence or not of H2O2 (250 µM) for 30 min. Then, media were removed and replaced
with fresh media containing HT-29 cells labelled with calcein. After 4 hours and a half, the
number of cells that have crossed the layer was counted. The results showed that the re-
introduction of the wt form of Tm1 rescued the increased transendothelial permeability in
untreated condition as well as in the presence of H2O2. In contrast, TEM of HT-29 cells
was markedly increased in cells expressing Tm1 Ser283Ala. This increase was observed
either in endothelial cells that have been treated or not with H2O2. Yet the effect was more
pronounced in this latter case (Fig.2-6).
Overall, these results are consistent with the hypothesis that increased endothelial
permeability is a permissive event for transendothelial migration of cancer cells and that
phosphorylation of Tm1 at Ser283 is importantly involved in regulating these events.
111
2.2.5. Discussion
It is now accepted that circulating ROS can cause endothelial barrier dysfunction, which
may lead to several pathologies, notably atherosclerosis. However, the molecular
mechanisms involved are still poorly understood. We previously suggested that the
phosphorylation of Tm1 could contribute to maintain endothelial integrity during oxidative
stress. In the present study, we now firmly demonstrate the crucial importance of the Tm1
phosphorylation in the regulation of endothelial permeability and transendothelial
migration of cancer cells (TEM).
The major finding of our study is that we show that Tm1 expression is important to
maintain the endothelial barrier integrity in response to oxidative stress. Two experiments
support these new findings. First, permeability assays confirm that the knockdown of Tm1
by small RNA interference in HUVEC monolayers is tightly associated with a heavy
increase of endothelial permeability and TEM of cancer cells in response to oxidative
stress. Second, in immunofluorescence assays, HUVEC in which Tm1 was decreased with
siRNA7Tm1 under oxidative stress conditions display a marked disappearance of stress
fibers, a high level of inter-endothelial gaps and membrane blebbing.
Another major accomplishment of the present study is to show that Tm1 phosphorylation at
Ser283, downstream of ERK is a crucial mechanism that contributes to maintain the
selective transendothelial permeability in response to oxidative stress. This finding is
supported by two principal observations. First, HUVEC monolayer expressing human non-
phosphorylatable Ser283Ala Tm1 insensitive to siRNA7Tm1 and in which human
endogenous Tm1 is knocked-down, are characterized by a strong increase of
transendothelial permeability under oxidative stress conditions. In contrast, the ectopic
expression of human wild-type Tm1 is rather accompanied by an acute decrease of
transendothelial permeability in response to oxidative stress. Second, when the expression
of human endogenous Tm1 is knocked-down in cells expressing an exogenous
nonphosphorylatable Ser283Ala Tm1 insensitive to the knockdown, the endothelium shows
important toxic features such as strong shrinkage, high level of inter-endothelial gaps,
presence of membrane blebbing, and a total absence of stress fibers. In contrast, the over-
expression of human exogenous wild-type Tm1 in similar condition plays a protective role
on the endothelial barrier exposed to oxidative stress.
It has been proposed that actin polymerization and remodelling are important regulators of
the endothelial permeability barrier [19, 23]. Along these lines, our results confirm a strong
reorganization of F-actin into transcytoplasmic stress fibers in HUVEC monolayers treated
with H2O2. Almost all cells were elongated with thick actin stress fibers, which traversed
the cells in the direction of cell elongation. Moreover, we distinguished an acute presence
of inter-endothelial gaps suggesting an H2O2-mediated retraction of the cells. We also
noticed the same typical morphological pattern with histamine treatment, a potent inducer
of endothelial and vascular permeability [120]. Based on these findings, the H2O2 and
histamine-mediated changes in the organization of actin seem to be a fast and strong
response that contributes to increase stress resistance. In this context, the actin
depolymerising toxin cytochalasin D decreases endothelial barrier function [121, 122].
Hence by its participation to the formation and stabilization of stress fibers, the
phosphorylation of Tm1 may regulate the actin-based contraction/retraction of endothelial
cells that controls the permeability of the endothelium. Along these lines, other proteins
known to modulate actin dynamics and stress fiber formation, such as the small GTPase
RhoA, are also known to regulate endothelial cell permeability and TEM [71, 123, 124].
The tightness of the vessel walls represents a functional barrier that contributes to limit
cancer cell TEM and ultimately metastasis. In that regard, dysfunction of the endothelial
integrity is associated with metastasis [47, 109, 125]. Notably, certain breast, bladder, and
kidney cancer cells induce alterations of endothelial mechanical properties to ease their
TEM [126]. Given the determinant role played by Tm1 phosphorylation at Ser283 in
maintaining the integrity of endothelial cell in response to oxidative stress, one could
expect that this mechanism may also protect against metastasis. This is, indeed, supported
for the first time by our results. First, in response to H2O2, TEM of colon cancer HT-29
cells through HUVEC monolayers in which endogenous Tm1 expression is knocked-down
by siRNA7Tm1 shows a higher number of transmigrating cells than through control
113
HUVEC monolayer expressing endogenous Tm1. Second, the ectopic expression of human
nonphosphorylatable Ser283Ala Tm1 insensitive to siRNA7Tm1 in HUVEC monolayer in
which expression of human endogenous Tm1 is knocked-down is associated with an
increased level of transendothelial migrating HT-29 cells in response to H2O2. In contrast,
the expression of human exogenous wild-type Tm1 in similar conditions is associated with
an acute decreased level of transendothelial migrating HT-29 cells. These results strengthen
the point that phosphorylation of Tm1 at Ser283 is crucial to restrict the transendothelial
migration of cancer cells under oxidative stress conditions.
In conclusion, we propose that Tm1 is required to maintain the endothelial barrier integrity
against molecules as well as against cancer cells both under unstimulated conditions as well
as under oxidative stress conditions. We also propose that the phosphorylation of Tm1 on
Ser283, downstream of ERK, is a key event for the regulation of endothelial permeability
by modulating the contraction/retraction of the endothelial cells via remodelling of the actin
cytoskeleton dynamics. These finding strongly support the role for the phosphorylation of
Tm1 at Ser283 to prevent endothelial barrier dysfunction associated with oxidative stress
injury.
2.2.6. Competing interests
The authors declare that they have no competing interests.
2.2.7. Author’s contributions
BS has performed the experiments. BS, FH and JH wrote the manuscript. All authors read
and approved the final version.
2.2.8. Authors information
Bryan Simoneau, François Houle and Jacques Huot are from « Le Centre de recherche en
cancérologie de l'Université Laval and l’Axe Oncologie du Centre de recherche du CHU de
Québec, l'Hôtel-Dieu de Québec, 9 rue McMahon, Québec G1R 2J6 Canada ».
2.2.9. Acknowledgement
The authors thank Dr. Karim Ghani and Dr. Manuel Caruso for their help in preparing the
lentiviral vectors. They also thank Dr. Anne-Laure Pin for helpful discussion and Dr.
Hiroyuki Miyoshi (Riken Institute Tsukuba, Japan) for providing the Venus construct. This
study was supported by grants to JH from the Canadian Institutes for Health Research
(CIHR) and The Heart Stroke Foundation of Canada (HSFC). BS received a studentship
from CRCHUQ. This manuscript is dedicated in memoriam to Madam Cécilia Verreault-
Huot, the mother of Dr. Jacques Huot.
115
2.2.10. References
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119
2.2.11. Legends of figures
Figure 2-1: Oxidative stress induces actin remodelling, disruption of endothelial layer
integrity and increase of endothelial permeability. A) HUVECs were plated in the upper
part of a Boyden chamber at a density of 0.6x105 per well and were cultivated for 3 days
until the formation of a tight monolayer. Then, FITC-labelled dextran was added (1 mg/ml)
together or not with H2O2 (250 µM) or histamine (10 µM) for the indicated periods of time.
The data represent the permeability changes obtained in a representative experiment and are
expressed as the mean fold increase (± SEM) in treated cells relative to untreated cells (n=4
for each condition). p value was determined by using unpaired Student t test. B)
Exponentially growing HUVECs were left untreated (a) or were treated with H2O2 (250
µM; b) or histamine (10 µM; c) for 30 minutes. Cells were then fixed, were permeabilized,
and were stained for F-actin using Alexa 488-phalloidin. A representative field is shown for
each condition. Pictures were captured using a Nikon Eclipse 600 fluorescence microscope
(40X).
Figure 2-2: Inhibition of the ERK MAP kinase in the presence of H2O2 is associated
with an increase of endothelial permeability. A) Exponentially growing HUVECs were
pretreated with vehicle (0.25 % DMSO) or with PD098059 (50 µM) for 60 minutes.
Thereafter, HUVECs were treated or not with H2O2 (250 µM) for 30 minutes. Proteins
were extracted, were separated by SDS-PAGE, and were transferred onto nitrocellulose
membrane. Inhibition of ERK pathway was revealed by western blot using phospho-ERK
specific antibody (upper panel). Total ERK (ERK2) and tubulin-α expression levels were
determined as loading controls (middle and lower panels, respectively). A representative
blot is shown. B) HUVECs were plated at a density of 0.6x105 per well in the upper part of
a Boyden chamber and were cultivated for 3 days until the formation of a tight monolayer.
Then, the monolayers were pretreated with vehicle (0.25 % DMSO) or with PD098059 (50
µM) for 60 minutes, and then they were treated or not with H2O2 (250 µM) for 30 minutes.
Passage of FITC-labelled dextran through the monolayer of HUVECs was measured
immediately after treatment. The results represent the permeability changes obtained in a
representative experiment and are expressed as the mean fold increases (± SEM) in treated
cells relative to untreated cells (n=3). p value was determined by using unpaired Student t
test.
Figure 2-3: The knockdown of human Tm1 induces an increase in endothelial
permeability in response to H2O2. A) HUVECs were electroporated or not with
Hs_TPM1_7 siRNA (siRNA7Tm1) or non-targeting silencer negative control siRNA.
Three days later, proteins were extracted, were separated by SDS-PAGE, and were
transferred onto nitrocellulose membrane. Tm1 level was revealed by western blot using
anti-tropomyosin mouse monoclonal antibody (upper panel). Tubulin-α level was measured
as loading control (lower panel). The siRNA7Tm1-mediated knockdown of Tm1 has
evaluated as 80 % following densitometric quantification of the bands. A representative
blot is shown. B) HUVECs transfected as in A using X-tremeGene HP Transfection
Reagent were plated at a density of 0.6x105 per well in the upper part of a Boyden chamber
and were grown for 3 days until the formation of a tight monolayer. Passage of FITC-
labelled dextran through the monolayer of HUVECs was measured after exposure to H2O2
(250 µM) for 30 minutes. The data represent permeability expressed as the mean fold
increases in treated cells (± SEM) relative to untreated cells (n=3 for each conditions). p
value was determined by using unpaired Student t test C) HUVECs were transfected or not
(a-c) with siRNAs that specifically target human Tm1 mRNA (j-o) or with non-targeting
negative control siRNA (d-i). The next day, HUVECs were plated at a density of 2x105
cells on gelatine-coated microscope cover glasses into 35 mm Petri dish for each condition
and were grown for 2 days until the formation of a tight monolayer. Thereafter, cells were
treated or not with H2O2 (250 µM) for 30 minutes (g-i and m-o). Then, cells were fixed,
were permeabilized, and were stained for F-actin using Alexa 488-phalloidin (a, d, g, j and
m), and for Tm1 using anti-tropomyosin mouse monoclonal antibody (b, e, h, k and n). A
merged picture is shown for each condition (c, f, i, l and o). A representative field for each
condition was captured using a Nikon Eclipse 600 fluorescence microscope (40X).
Figure 2-4: Phosphorylation of Tm1 at Ser283 regulates endothelial permeability.
Exponentially growing HUVECs were transduced or not with CSII-Venus (empty vector;
MOI of 30.2) or CSII-Venus-Tm1wt (Tm1 wild-type vector; MOI of 7.59) or CSII-Venus-
121
Tm1S283A (non-phosphorylatable Tm1 mutant vector; MOI of 6.66) using lentivirus-
mediated infection. These Tm1 constructs are insensitive to siRNA7Tm1. After 24 hours,
infected HUVECs were transfected with siRNA7Tm1. In A) HUVECs were plated at a
density of 1x105 cells per well in the upper part of a Boyden chamber and were cultivated
for 3 days until the formation of a tight monolayer. Thereafter, NaF (1 mM for 1 hour) was
added to the incubation medium (upper chamber) to inhibit phosphatases and to allow the
accumulation of phosphorylated tropomyosin-1. Then, H2O2 (250 µM for 30 or 60 minutes)
was added to the upper chamber in the presence of 1mg/ml FITC-labelled dextran. Passage
of FITC-labelled dextran through the monolayer of HUVECs was measured immediately
after exposure of HUVEC to H2O2. The data represent permeability expressed as the mean
fold increase (± SEM) relative to untreated cells (n=4 for each condition obtained from a
representative experiment out of 4). p value was determined by using unpaired Student t
test. In B) HUVECs were plated at a density of 2x105 cells on gelatine-coated microscope
cover glasses into 35 mm Petri dish per condition and were cultivated for 2 days until the
formation of a tight monolayer. Thereafter, cells were treated with H2O2 (250 µM) for 30
minutes (d-f, j-l and p-r) or were left untreated (a-c, g-i and m-o). Then, cells were fixed,
were permeabilized, and were stained for F-actin using Alexa 488-phalloidin (a, d, g, j, m
and p), and for Tm1 using anti-tropomyosin monoclonal mouse antibody (b, e, h, k, n and
q). A merged picture is shown for each condition (c, f, i, l, o, and r). A representative field
for each condition was captured using a Nikon Eclipse 600 fluorescence microscope (40X).
Figure 2-5: The knockdown of human Tm1 in endothelial cells is associated with an
increase of transendothelial migration of cancer cells. Exponentially growing HUVECs
were transfected or not with siRNA7Tm1 or with non-targeting negative control siRNA.
The day after, HUVECs were plated at a density of 0.6x105 per well in the upper part of a
Boyden chamber and were cultivated for 3 days until the formation of a tight monolayer.
Thereafter, H2O2 (250 µM) was added or not to the upper chamber for 30 minutes. Then,
the medium was removed and replaced by migration buffer. HT-29 cells previously stained
with calcein were added on the upper chamber at a density of 1.5x105 cells per well. After 4
hours and a half, HT-29 cells that crossed the membrane of the Boyden chamber were
counted in five different fields using a TE300 Nikon fluorescence microscope (20X). In
each condition, the number of HT-29 trans-migrating cells was calculated from triplicate
samples of a representative experiment (mean ± SEM). p value was determined by using
unpaired Student t test.
Figure 2-6: Phosphorylation of Tm1 at Ser283 is associated with a decrease of cancer
cells migration through the endothelial barrier in response to H2O2. Exponentially
growing HUVECs were transduced with CSII-Venus (empty vector; MOI of 30.8) or CSII-
Venus-Tm1wt (Tm1 wild-type vector; MOI of 10.4) or CSII-Venus-Tm1S283A (non-
phosphorylatable Tm1 mutant vector; MOI of 9.9) using lentivirus-mediated infection.
These Tm1 constructs were insensitive to siRNA7Tm1 that was transfected 24 hours later
in each condition. The next day, HUVECs were plated at a density of 1.0x105 per well in
the upper part of a Boyden chamber and were cultivated for 3 days until the formation of a
tight monolayer. Thereafter, H2O2 (250 µM) was added or not to the upper chamber for 30
minutes. Then, the medium was removed and replaced by migration buffer. HT-29 cells
previously stained with calcein were added on the upper chamber at a density of 1.5x105
cells per well. After 4 hours and a half, HT-29 cells that crossed the membrane of the
Boyden chamber were counted in five different fields using a TE300 Nikon fluorescence
microscope (20X). In each condition, the number of HT-29 trans-migrating cells was
calculated from triplicate samples of a representative experiment (mean ± SEM). p value
was determined by using unpaired Student t test.
123
Figure 2-1. Oxidative stress induces actin remodelling, disruption of endothelial layer
integrity and increase of endothelial permeability
Figure 2-2. Inhibition of the ERK MAP kinase in the presence of H2O2 is associated
with an increase of endothelial permeability
125
Figure 2-1a. The knockdown of human Tm1 induces an increase in endothelial
permeability in response to H2O2 (Part I)
Figure 2-3b. The knockdown of human Tm1 induces an increase in endothelial
permeability in response to H2O2 (Part II)
127
Figure 2-2a. Phosphorylation of Tm1 at Ser283 regulates endothelial permeability
(Part I)
Figure 2-4b. Phosphorylation of Tm1 at Ser283 regulates endothelial permeability
(Part II)
129
Figure 2-5. The knockdown of human Tm1 in endothelial cells is associated with an
increase of transendothelial migration of cancer cells
Figure 2-6. Phosphorylation of Tm1 at Ser283 is associated with a decrease of cancer
cells migration through the endothelial barrier in response to H2O2
131
2.2.12 Supplemental Data
2.2.12.1 Legends of figures
Figure 2-S1: Endothelial cell survival is not decreased by 250M H2O2. HUVECs were
cultivated to confluence in a 96-well plates. They were left untreated or were treated for 30
min with 250 M H2O2. Medium containing H2O2 was removed and fresh medium was
added. Then, cells were processed for WST-1 assay. Thereafter, absorbance of the samples
was determined at 420-480 nm to evaluate the mitochondrial dehydrogenase activity of
viable cells as measured by the formation of formazan dye from WST-1. Results are
expressed as the mean DO values (+/-SEM) of viable cells from triplicates samples in each
condition and are from a representative experiment. p value was determined by using
unpaired Student t test.
Figure 2-S2: The MEK1 inhibitor PD098059 does not affect endothelial cell
permeability. HUVECs were plated in the upper part of a Boyden chamber at a density of
0.6x105 per well and were cultivated for 3 days until the formation of a tight monolayer.
Then, FITC-labelled dextran was added (1 mg/ml) together with DMSO (0.25 %) alone or
with PD098059 (50 µM) for the indicated period of time. The data represent the
permeability changes in the presence of PD098059 over changes by DMSO alone. They
were obtained in a representative experiment and are expressed as the mean fold increase (±
SEM) in treated cells relative to untreated cells (n=4 for each conditions). p value was
determined by using unpaired Student t test.
Figure 2-S3: Hs_TPM1_7 small RNA interference-mediated knockdown of human
endogen Tm1 is effective. A) HUVECs were transfected or not (a-b) with siRNAs that
specifically target human Tm1 mRNA (siRNA #7; e-f) or with non-targeting negative
control siRNA (c-d) along with plasmid expressing pEGFP-C1. Thereafter, cells were
fixed, were permeabilized, and were stained for nuclei using DAPI, for GFP using anti-
GFP rabbit antibody, and for Tm1 using an anti-tropomyosin mouse monoclonal antibody.
A representative field for each condition was captured using a Nikon Eclipse 600
fluorescence microscope (20X). Arrowheads indicate GFP positive cells. B) Fifteen
independent fields from each condition were captured in A and GFP positive cells were
counted. Cells containing a decrease in Tm1 expression were evaluated. The percentage of
Tm1 knocked down cells is shown. p value was determined by using unpaired Student t
test.
Figure 2-S4: Functionality of lentiviral transgenic expressing vectors (CSII-Venus,
CSII-Venus-Tm1wt, and CSII-Venus-Tm1S283A). A) Exponentially growing HUVECs
were transduced with CSII-Venus (empty vector; MOI of 30.8) or CSII-Venus-Tm1wt
(Tm1 wild-type vector; MOI of 10.4) or CSII-Venus-Tm1S283A (non-phosphorylatable
Tm1 mutant vector; MOI of 9.9) using lentivirus-mediated infection. HUVECs were
cultivated for 4 days until the formation of a tight monolayer for each condition.
Endothelial layers were visualized at 20x magnification by phase contrast (a, d, and g) and
by fluorescence microscopy (b, e, and h). A representative field for each condition was
captured and a merged picture is shown for each condition (c, f, and i). B) Four
independent fields were captured from each lentivirus-mediated infection condition and
VENUS positive cells were counted. The percentage of lentiviral-mediated infection from
HUVECs monolayer is shown. C) Exponentially growing HUVECs were transduced with
CSII-Venus (empty vector; MOI of 30.2) or CSII-Venus-Tm1wt (Tm1 wild-type vector;
MOI of 7.59) or CSII-Venus-Tm1S283A (non-phosphorylatable Tm1 mutant vector; MOI
of 6.66) using lentivirus-mediated infection. After 24 hours, infected HUVECs were
transfected or not with siRNA7Tm1. Four days later, proteins were extracted from cells,
were separated by SDS-PAGE, and were transferred onto nitrocellulose membrane. Tm1
level was revealed by western blot using anti-tropomyosin mouse monoclonal antibody
(lower panel). Tubulin-α level was measured as loading control (upper panel). D) Relative
Tm1 protein levels from C were quantified (Tm1/Tubulin-α) by densitometry analysis
using Image J software and is shown. The experiments are performed at least in triplicates.
Figure 2-S5: Lentivirus-mediated infection does not increase by itself endothelial
permeability. Exponentially growing HUVECs were transduced or not with CSII-Venus
133
(empty vector; MOI of 30.2) using lentivirus-mediated infection. After 24 hours, infected
or non-infected HUVECs were transfected or not (controls) with siRNA7Tm1. The next
day, HUVECs were plated at a density of 1x105 cells per well in the upper part of Boyden
chambers and were cultivated for 3 days until the formation of a tight monolayer.
Thereafter, NaF (1 mM for 1 hour) was added to the incubation medium (upper chamber)
to inhibit phosphatases and to allow the accumulation of phosphorylated tropomyosin-1.
Then, H2O2 (250 µM) was added for 30, 60, and 90 minutes to the upper chamber in the
presence of 1 mg/ml FITC-labelled dextran. Passage of FITC-labelled dextran through the
monolayer of HUVECs was measured immediately after exposure of HUVEC to H2O2. The
data represent permeability expressed as the mean fold increases (± SEM) relative to
untreated cells (n=4). p value was determined by using unpaired Student t test.
Figure 2-S6: Lentivirus-mediated infection does not affect endothelial cell survival.
Exponentially growing HUVECs were transduced or not with CSII-Venus vectors (empty
vector; MOI of 30.8; CSII-Venus-Tm1 wild type vector, MOI of 10.4; CSII-Venus-
Tm1S283A mutant vector, MOI of 9.9) using lentivirus-mediated infection. After 24 hours,
infected or non-infected HUVECs were cultivated to confluence in a 96-well plates. They
were left untreated or were treated for 30 min with 250 M H2O2. Medium containing H2O2
was removed and fresh medium was added. Then, cells were processed for WST-1 assay.
Thereafter, absorbance of the samples was determined at 420-480 nm to evaluate the
mitochondrial dehydrogenase activity of viable cells as measured by the formation of
formazan dye from WST-1. Results are expressed as the mean DO values (+/-SEM) of
viable cells from triplicates samples in each condition and are from a representative
experiment. p value was determined by using unpaired Student t test.
Figure 2-S1. Endothelial cell survival is not decreased by 250µM H2O2
135
Figure 2-S2. The MEK1 inhibitor PD098059 does not affect endothelial cell
permeability
Figure 2-S3. Hs_TPM1_7 small RNA interference-mediated knockdown of human
endogen Tm1 is effective
137
Figure 2-S4a. Functionality of lentiviral transgenic expressing vectors (CSII-Venus,
CSII-Venus-Tm1wt, and CSII-Venus-Tm1S283A) [Part I]
Figure 2-S4b. Functionality of lentiviral transgenic expressing vectors (CSII-Venus,
CSII-Venus-Tm1wt, and CSII-Venus-Tm1S283A) [Part II]
139
Figure 2-S5. Lentivirus-mediated infection does not increase by itself endothelial
permeability
Figure 2-S6. Lentivirus-mediated infection does not affect endothelial cell survival
141
Chapitre III
143
3. Conclusion et perspectives
L’intégrité structurale et fonctionnelle de l’endothélium vasculaire est d’une importance
cruciale puisqu’elle permet à l’endothélium de conserver et d’assurer son rôle fondamental
en tant que barrière dynamique et semi-perméable à l’interface entre le sang et les tissus
sous-jacents [1, 2, 4, 20]. Parmi ses nombreuses fonctions biologiques, la barrière
endothéliale vasculaire contrôle les échanges de fluides plasmiques, le trafique moléculaire
et le passage de cellules entre le sang et l’espace interstitielle, et ce, selon une perméabilité
trans-cellulaire ou une perméabilité para-cellulaire [2, 5-8, 23, 127]. Aux sites d’infection et
d’inflammation, il y a un enrichissement local du microenvironnement cellulaire en
cytokines, chemiokines et en ROS comme le H2O2 [72]. In vivo, l’endothélium est en
contact constant avec des ROS et, lors d’une inflammation, par exemple, il peut y avoir une
surproduction prolongée de ROS ce qui provoque des lésions oxydatives chez les cellules
endothéliales ainsi que dans l’ensemble du système vasculaire [4, 20, 23, 72, 76]. Ces
lésions oxydatives sont responsables du bris de l’intégrité de l’endothélium vasculaire et
enclenchent un stress oxydant majeur. Un stress oxydant intense et chronique entraîne la
déstabilisation du bon fonctionnement de la barrière endothéliale et, tel un «effet domino»,
la rupture de l’équilibre entre les cinq principales fonctions de l’endothélium conduit
inévitablement vers une dysfonction endothéliale [4, 23, 72]. La réponse de l’endothélium
vis-à-vis cette «attaque» du stress oxydant est un facteur décisif afin qu’il puisse réussir à
conserver sa propre intégrité. Si l’endothélium est incapable de gérer efficacement cet état
de crise, alors la dysfonction endothéliale à long terme conduira au développement de
certaines pathologies cardiovasculaires comme l’athérosclérose et l’hypertension [1, 23, 72,
127]. De même, le stress oxydant crée un environnement très favorable à l’épanchement de
cellules cancéreuses dans le processus de la dissémination métastatique [23, 48].
Par ailleurs, il importe de souligner que le bon fonctionnement de la barrière endothéliale
est étroitement relié au dynamisme du cytosquelette d’actine. La polymérisation et la
restructuration de l’architecture du cytosquelette d’actine assure la grande plasticité des
cellules endothéliales et confère un équilibre homéostatique crucial aux cinq fonctions de
l’endothélium : (1) le maintien du sang dans un état fluide, (2) la perméabilité, (3) la
régulation du flot sanguin, (4) la régulation de la réponse inflammatoire et (5) la
participation aux fonctions de la surveillance immunitaire. La perméabilité endothéliale est
un exemple parfait de la relation d’équilibre entre la structure dynamique du cytosquelette
d’actine et le fonctionnement de l’endothélium. D’un point de vue cellulaire, il s’agit de
l’influence mutuelle fondamentale qui existe entre la structure et la fonction. La
dysfonction de la barrière endothéliale résulte d’une exposition au stress oxydant ayant
déclenchée un remodelage du cytosquelette d’actine. En effet, le cytosquelette d’actine est
l’une des cibles majeures de la toxicité des ROS. L’équipe du Dr. Jacques Huot avait
préalablement démontré l’apparition rapide d’un réseau très dense de fibres de stress
transcytoplasmiques dans les cellules endothéliales soumises au stress oxydant [23, 76].
Les travaux antérieurs de la même équipe ont démontré que cette réponse physiologique
provient de la co-activation rapide des voies de signalisation SAPK2/p38 MAPK et
ERK1/2 [23, 76, 78]. Ces deux sentiers de signalisation intracellulaire jouent un rôle
important dans la régulation du cytosquelette d’actine en réponse au stress oxydant.
Effectivement, chacune d’entre elles comporte une protéine clé ayant un impact direct sur
la machinerie modulatoire du cytosquelette d’actine. L’activation de la voie SAPK2/p38
par le H2O2 conduit à la phosphorylation de la protéine de choc thermique HSP27 qui évite
la dépolymérisation des filaments d’actine et promeut l’assemblage de fibres de stress [76].
De même, le H2O2 déclenche l’activation séquentielle de Ras/Raf-1/MEK1-2/ERK1-
2/DAPK-1 qui conduit à la phosphorylation de la Ser283 de la Tm1 [23, 78, 84].
La Tm1 fait partie de la très grande famille des tropomyosines (Tms). Les Tms sont des
protéines de liaison d’actine capables de former des populations distinctes d’actine
fibrillaire, et ce, via une multitude d’isoformes spécifiques de Tms. Grâce à leur grande
diversité et spécificité, les Tms se retrouvent donc impliquées dans une vaste gamme de
fonctions biologiques aussi importantes les unes que les autres. Des publications
antérieures de l’équipe du Dr. Huot avaient proposé que la phosphorylation de la Tm1 sur
sa Ser283 via la DAPK-1, en condition de stress oxydant, promeut l’assemblage des points
focaux d’adhérence et participe, de concert avec la HSP27, à une augmentation de la
145
polymérisation de filaments d’actine et à leur conversion en fibres de stress
transcytoplasmiques [23, 78, 84]. En effet, après sa phosphorylation, la Tm1 co-localise
avec l’actine fibrillaire sur toute la longueur de la fibre de stress provoquant, par
conséquent, une hausse de la tension cellulaire qui initie le recrutement de protéines
impliquées dans l’assemblage des points focaux d’adhérence servant de points d’ancrage
membranaires aux fibres de stress. L’inhibition des voies ERK1/2 et SAPK2/p38, chez des
cellules endothéliales en présence d’un stress oxydant, se caractérise par une absence de co-
localisation de la Tm1 avec l’actine-F, par une incapacité de l’actine-F à former des fibres
de stress, par une accumulation accrue de l’actine-F à la périphérie cellulaire provoquant la
formation de «blebbing» membranaires qui fragilise considérablement la membrane
plasmique et par une incapacité de la cellule à assembler des points focaux d’adhérence
[78]. La somme de ces problèmes aboutit à une perturbation du remodelage du
cytosquelette d’actine en réponse au stress oxydant qui se résume en un défaut
d’assemblage du réseau d’actine fibrillaire et à une dégradation alarmante de l’état de la
cellule endothéliale en présence de ROS. Cette détérioration des cellules endothéliales
conduit inévitablement à des dommages permanents de l’endothélium, soit à l’apparition de
lésions oxydatives aboutissant en bout de ligne à une dysfonction endothéliale. Ainsi, la
perte de la co-activation coordonnée des voies ERK1/2 et SAPK2/p38 est associée avec la
rupture de l’intégrité de la barrière endothéliale en condition de stress oxydant. Cette
découverte met donc en lumière l’existence possible d’un mécanisme de défense qui
permettrait aux cellules endothéliales de pouvoir résister au stress oxydant et ainsi assurer
le maintien de l’intégrité structurale et fonctionnelle de la barrière endothéliale vasculaire.
La régulation du dynamisme du cytosquelette d’actine et la régulation de la réponse de la
cellule endothéliale au stress oxydant par l’activation des voies MAP kinases sont
étroitement associées afin de pouvoir gérer les diverses fonctions de l’endothélium
vasculaire dont la perméabilité endothéliale [23, 77]. De surcroît, d’autres études ont
démontré que la réorganisation du cytosquelette d’actine via l’activation des voies ERK1/2
et SAPK2/p38 est associée avec la régulation de la perméabilité endothéliale et la
régulation de la migration de cellules tumorales à travers l’endothélium [128, 129].
Les travaux de recherche décrits dans le présent mémoire visaient à mieux comprendre la
corrélation entre la phosphorylation de la Ser283 de la Tm1, la formation de fibres de stress
d’actine transcytoplasmiques, la régulation de la perméabilité endothéliale et la régulation
de la migration transendothéliale de cellules cancéreuses du colon. L’article scientifique
inclus dans ce mémoire met en lumière, pour la première fois, l’importance cruciale de la
phosphorylation de la Tm1 dans la régulation de la perméabilité endothéliale et de la
migration transendothéliale de carcinomes du colon [48].
Premièrement, nous avons démontré que l’expression même de la Tm1 est importante afin
de maintenir l’intégrité de la barrière endothéliale en réponse au stress oxydant. En effet,
des essais de perméabilité en chambre de Boyden confirment que la perméabilité
endothéliale d’une monocouche étanche de cellules HUVECs est fortement augmentée en
présence d’un ARNi ciblant l’ARNm de la Tm1 humaine. De plus, des essais en
immunofluorescence sur des monocouches étanches de cellules HUVECs ayant subit un
«knockdown» de la Tm1 via un ARNi (siRNA7Tm1) en condition de stress oxydant
exposent une absence de fibres de stress d’actine, un niveau élevé d’espaces inter-
endothéliaux et du «blebbing» membranaire. Ces résultats confirment l’existence d’une
réelle corrélation entre l’expression de la Tm1, la formation de fibres de stress
transcytoplasmiques et la variation de la perméabilité endothéliale, et ce, lors d’un stress
oxydant.
Deuxièmement, la phosphorylation de la Tm1 sur la Ser283 suivant l’activation
séquentielle de Ras/Raf-1/MEK1-2/ERK1-2/DAPK-1, en présence d’un stress oxydant,
démontre que ce mécanisme moléculaire est essentiel au maintien d’une perméabilité
sélective et basale de l’endothélium. Des essais en chambre de Boyden avec des
monocouches de cellules HUVECs exprimant une Tm1 mutante non-phosphorylable
insensible aux siRNA7Tm1 (Tm1 Ser283Ala) et ayant subit un «knockdown» de la Tm1
endogène humaine expose une forte perméabilité endothéliale lorsque les monocouches
cellulaires subissent un stress oxydant. Toutefois, en utilisant une monocouche de cellules
HUVECs exprimant une Tm1 humaine sauvage exogène insensible aux siRNA7Tm1
(Tm1wt) dans les mêmes conditions expérimentales, nous obtenons un résultat
147
complètement opposé. L’expression de la Tm1wt permet de diminuer considérablement la
perméabilité endothéliale. Sur un plan morphologique, l’immunofluorescence de
monocouches de cellules HUVECs exprimant le mutant exogène Tm1Ser283Ala où
l’expression de la Tm1 endogène est fortement diminuée en présence du siRNA7Tm1
dévoile d’intenses caractéristiques toxiques comme un important rétrécissement cellulaire,
un plus grand nombre d’espaces inter-endothéliaux et une absence de fibres de stress
faisant plutôt place à la présence d’un «blebbing» membranaire. Ces résultats nous
exposent donc les faits suivants : (1) lorsqu’une monocouche de cellules endothéliales subit
un stress oxydant, la phosphorylation de la Ser283 de la Tm1 humaine permet de protéger
l’intégrité de la barrière endothéliale en abaissant sa perméabilité et ainsi conserver une
perméabilité beaucoup plus contrôlée; (2) la présence d’un réseau dense de fibres de stress
d’actine à l’intérieur des monocouches endothéliales sur-exprimant la Tm1 sauvage, en
condition de stress oxydant, nous confirme donc l’implication des fibres de stress dans le
rôle protecteur de la Tm1 phosphorylée.
Comme il a été mentionné dans la chapitre I, il y a un «paradoxe» à propos du rôle des
fibres de stress d’actine au niveau de la perméabilité endothéliale. En fait, plusieurs études
appuient le «cellular tensegrity concept» où les fibres de stress provoquent une hausse de la
perméabilité endothéliale en raison de la contraction de l’actomyosine et de la baisse de
l’adhésion intercellulaire [71, 72]. Ce type de réponse est typique de l’activation de la voie
RhoA/ROCK-1-2 par des agents vasoactifs [71, 75]. Toutefois, cela n’est pas toujours le
cas puisque l’assemblage des fibres de stress sert également à instaurer un réseau
cytosquelettique global qui assure une communication continue entre les cellules
endothéliales, et ce, à travers l’endothélium. Ce super réseau de fibres de stress permet de
renforcer et de conserver l’intégrité structurale de l’endothélium vasculaire et ainsi réussir à
résister au stress en contrôlant la perméabilité. Il s’agit, ici, d’une nouvelle structure
architecturale cytosquelettique de l’actine dont fait mention l’équipe du Dr. Anne J. Ridley
[73, 74]. Effectivement, leurs travaux indiquent que des monocouches de cellules
endothéliales stimulées avec du TNFα comportent une forte augmentation de fibres de
stress. Les fibres de stress d’une cellule endothéliale se connectent physiquement avec les
fibres de stress des cellules voisines, et ce, à travers la monocouche cellulaire selon un axe
longitudinal par le biais de «AJs discontinues» (discontinuous AJ) [73]. Nos travaux
témoignent l’observation d’une structure similaire dans une monocouche de cellules
HUVECs ayant subit un «knockdown» de la Tm1 humaine endogène et sur-exprimant la
Tm1wt exogène, et ce, en réponse au stress oxydant (Fig.2-4B, panneaux j-l) [48]. Ce
super réseau de fibres de stress est-il exactement le même que celui décrit dans les travaux
de l’équipe du Dr. Anne J. Ridley? La réponse à cette question reste à être déterminée par
de nouvelles expériences qui pourraient caractériser plus précisément l’interconnexion des
fibres de stress entre les cellules endothéliales. Toutefois, une chose est sûre, les
monocouches de cellules HUVECs en absence de la Tm1 humaine endogène et sur-
exprimant la Tm1S283Ala ne présentent aucune structure architecturale cytosquelettique de
ce genre puisqu’il y eu disparition des fibres de stress, ce qui conduit alors à une
dysfonction endothéliale majeure.
De surcroît, il importe de souligner que les points focaux d’adhérence jouent un rôle
important dans la résistance de la barrière endothéliale au stress oxydant. En effet, les
cellules des organismes pluricellulaires adhèrent à leurs cellules voisines directement ou via
un réseau fibrillaire, soit la matrice extracellulaire (ECM) [130]. Cette adhésion est un
réseau dynamique complexe régulée par les interactions cellulaires et par la signalisation
croisée (cross-talk) entre les cellules et leur environnement. Les travaux antérieurs de
l’équipe du Dr. Huot avaient démontré que la phosphorylation de la Tm1 sur la Ser283 est
associée avec l’assemblage des points focaux d’adhérence lesquels promeuvent la
formation des fibres de stress d’actine chez les cellules endothéliales en réponse au stress
oxydant [23, 78, 84]. Les points focaux d’adhérence maintiennent une adhésion étroite
entre la membrane plasmique et la ECM, et entre la membrane plasmique et le
cytosquelette d’actine. En condition de stress oxydant, les points focaux d’adhérence
assurent l’ancrage des fibres de stress à la membrane et aux intégrines, ce qui est crucial
pour la réorganisation correcte du cytosquelette d’actine et ainsi conserver l’intégrité de
l’endothélium [78].
Par ailleurs, diverses études montrent que la polymérisation des filaments d’actine ainsi que
le remodelage du cytosquelette occupent une place importante dans la régulation de la
149
migration endothéliale de cellules cancéreuses durant le processus métastatique. De façon
intéressante, la perméabilité endothéliale et la diapédèse de cellules tumorales sont
étroitement associées avec l’ouverture d’espaces inter-endothéliaux [23, 129, 131]. De plus,
la dysfonction endothéliale est associée avec la dissémination métastatique, sans compter
que certaines cellules cancéreuses du sein, de la vessie et du rein provoquent la rupture des
propriétés biomécaniques de l’endothélium en vue de faciliter leur migration
transendothéliale [31, 32, 47, 125]. Les résultats de nos travaux démontrent, pour la
première fois, que le rôle joué par la phosphorylation de la Ser283 de la Tm1 dans le
maintien de l’intégrité de la barrière endothéliale en réponse au stress oxydant est
également impliqué dans la protection contre l’intravasation et l’extravasation de
métastases, c’est-à-dire les étapes du processus métastatique où il y a interaction entre la
cellule tumorale et l’endothélium vasculaire. D’une part, dans un contexte de stress
oxydant, des essais de migration transendothéliale de cellules de carcinomes du colon HT-
29 à travers une monocouche de cellules HUVECs où il y a eu un «knockdown» de
l’expression de la Tm1 endogène humaine révèlent un nombre très élevé de cellules HT-29
ayant migrées à travers cette monocouche comparativement à la monocouche cellulaire
contrôle ayant conservée l’expression de la Tm1 endogène. D’autre part, une monocouche
de cellules HUVECs ayant subit un «knockdown» de l’expression de la Tm1 endogène et
exprimant la Tm1Ser283Ala exogène comporte également un nombre très élevé de cellules
HT-29 ayant migré à travers la monocouche en réponse au stress oxydant. Cependant,
l’expression de la Tm1wt exogène dans une monocouche de cellules HUVECs dans les
mêmes conditions expérimentales expose un résultat complètement opposé.
L’ensemble de ces découvertes supporte fortement le rôle de la phosphorylation de la Tm1
sur la Ser283 en tant que protecteur de la barrière endothéliale vasculaire contre les lésions
oxydatives afin d’éviter une dysfonction de l’intégrité structurale et fonctionnelle de
l’endothélium qui, sinon, pourrait conduire à une hausse incontrôlée de la perméabilité
endothéliale et ainsi faciliter la diapédèse de cellules tumorales au cours du processus
métastatique. Ces découvertes s’ajoutent aux travaux antérieurs du laboratoire du Dr.
Jacques Huot qui ont permis d’établir, chez les cellules endothéliales, les mécanismes
moléculaires d’activation des voies intracellulaires SAPK2/p38 et ERK1/2 et de leur
implication dans la polymérisation de fibres de stress d’actine et dans l’assemblage des
points focaux d’adhérence, et ce, en condition de stress oxydant. À partir de ces données,
nous proposons un modèle (Figure 3-1) permettant d’expliquer le processus séquentiel de
la phosphorylation de la Tm1 par l’activation de la voie MAP-kinase ERK1/2 via un stress
oxydant jusqu’à son implication comme protecteur de l’intégrité de la barrière endothéliale
contre la hausse démesurée de sa perméabilité et contre la migration transendothéliale de
cellules tumorales grâce à la polymérisation accrue de fibres de stress d’actine
transcytoplasmiques agissant comme une sorte de «bouclier» vis-à-vis les impacts néfastes
des ROS.
En somme, la réalisation de ce projet de recherche ouvre la voie à de nouvelles études. Il
serait intéressant d’approfondir l’étude mécanistique du rôle de la Tm1 phosphorylée
concernant la protection de la barrière endothéliale vasculaire contre la migration de
cellules cancéreuses dans un processus métastatique en réponse au stress oxydant, et ce,
selon des modèles in vitro et in vivo. D’une part, concernant l’étude in vitro, nous pourrions
employer trois modèles dynamiques d’étude : la chambre à flux laminaire (laminar flow
chamber), le «tissue-engineered human blood vessel» et l’essai microfluidique in vitro en
trois dimensions [50, 129]. Pour les trois modèles, nous aurions l’occasion de visualiser et
de quantifier en temps réel la dynamique de la réponse de la barrière endothéliale vis-à-vis
la circulation de cellules cancéreuses HT-29 en réponse à un stress oxydant à partir : (1)
d’endothéliums ayant subit un «knockdown» de l’expression de la Tm1 endogène, (2)
d’endothéliums exprimant la Tm1 mutante exogène, Tm1Ser283Ala, tout en respectant la
condition expérimentale en (1), et (3) d’endothéliums exprimant la Tm1wt exogène
additionnés de la condition expérimentale en (1). D’autre part, pour l’étude in vivo, il serait
important, dans un premier temps, de vérifier le rôle de la phosphorylation de la Tm1 au
niveau de la régulation de la perméabilité endothéliale vasculaire en condition de stress
oxydant à partir de modèles de souris «knock-out» pour la Tm3, c’est-à-dire l’orthologue de
la Tm1 humaine, et de souris transgéniques exprimant le mutant orthologue
Tm1Ser283Ala. Puis, dans un second temps, nous pourrions étudier l’interaction entre la
dissémination de cellules cancéreuses et la Tm1 phosphorylée dans un contexte d’invasion
151
et d’intravasation tumorales à partir des mêmes modèles de souris développés
précédemment.
153
Figure 3-1. Schéma bilan.
En condition de stress oxydant, il y a la co-activation des voies intracellulaires de p38/SAPK2 et de
ERK1/2 chez la cellule endothéliale. La Tm1 est phosphorylée sur la Ser283 en aval du sentier
ERK1/2 via la DAPK-1. En agissant de concert avec la HSP27 phosphorylée en aval du sentier
p38/SAPK2, la Tm1 phosphorylée promeut la polymérisation de fibres de stress d’actine
transcytoplasmiques. Ces fibres de stress assurent une protection de l’endothélium contre les lésions
oxydatives en maintenant la perméabilité endothéliale à un niveau basal, ce qui contribue à
renforcer la barrière endothéliale et à limiter ainsi la migration de cellules cancéreuses à travers la
paroi vasculaire.
155
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