REVIVIENDO UNA ENZIMAEn 1950 los cientficos descubrieron que el AND mantena un cdigo que permita que las protenas se sintetizaran. Sin embargo, como una cadena de aminocidos se dobla en una protena completamente funcional, con su estructura tridimensional, sigue siendo un misterio. Debe existir un mecanismo que asegure el correcto plegamiento de la protena. Pero de dnde vino esa informacin? En 1957, Christian Anfinsen public la primera evidencia de que la informacin necesaria para el correcto plegamiento de la protena se encuentra dentro de la misma protena.TRASFONDOLas protenas estn hechas de una combinacin de 20 aminocidos que se doblan en estructuras complejas. La cadena de aminocido desdoblado (revelado, desplegado) se llama estructura primaria. Para tener una estructura biolgica, la protena debe doblar en una segunda y tercera estructura. Estas estructuras se mantienen juntas a travs de interacciones qumicas entre las cadenas laterales de los aminocidos, incluyendo enlaces de hidrogeno, interacciones hidrofbicas y, a veces, los enlaces covalentes. El cmo se forman estas grandes estructuras ha sido un misterio. Se dobla correctamente la protena a medida que se sintetiza o necesita de la accin de otras protenas para plegarse correctamente? Puede la protena doblarse correctamente por s sola de manera espontnea? En la dcada de 1950, el bioqumico Anfinsen estaba interesado en el tema del correcto doblamiento de las protenas. Especficamente, investigaba sobre la formacin de los puentes de disulfuro, los cuales son los enlaces covalentes entre las cadenas lateras cistena, que se desempean como uno de las mayores adherentes para mantener juntas las estructuras que secretan protenas. l crea que le protena, por s sola, tena toda la informacin necesaria para el correcto doblamiento de la misma. As, propuso la Hiptesis de la termodinmica, la cual seala que la estructura biolgicamente activa de la protena es tambin la ms estable termodinmicamente dentro de una condicin in vivo. En otras palabras, si la condicin intracelular pudiera ser imitada dentro de un tubo de ensayo, entonces la protena podra naturalmente doblarse dentro de su conformacin activa. Anfinsen comenz su investigacin en una enzima secretada, ribonucleasa pancretica bovina, y estudi la habilidad de sta para plegarse correctamente fuera de la clula.

EL EXPERIMENTO Las protenas realizan una gran variedad de funciones en la clula. Independientemente de su funcin, una protena necesita plegarse correctamente para llevar a cabo su funcin biolgica. Para estudiar el doblamiento de protenas lo mejor es estudiar una encima cuya actividad biolgica pueda ser fcilmente monitoreada in vitro. Anfinsen eligi una pequea protena secretada: enzima ribonucleasa, en la cual l pudo monitorear su correcto plegamiento ensayando su capacidad para catalizar la escisin de ARN. La Ribonucleasa, es una protena secretada que se activa a travs de la oxidacin y en condiciones in vitro. La estructura terciaria de la ribonuclease activa se mantiene unida bajo cuatro puentes de disulfuro. Aadiendo un agente reductor que reduce el enlace de disulfuro de dos cadenas laterales de cistena en dos grupos libres de sulfhidrilo que puede interrumpir esta interaccin covalente. Para tener una desnaturalizacin completa de ribonucleasa es necesario un tratamiento con agente reductor. Anfinsen monitore la reduccin de la ribonucleasa a travs de la medicin de los nmeros de grupos libres de sulfhidrilo que estn presentes en la protena. En el estado de oxidacin, no hay grupos libres de sulfhidrilos dentro de la ribonucleasa porque cada residuo de cistena est involucrado en un enlace de disulfuro. Por otra parte, en el estado de completa reduccin, la ribonucleasa contiene ocho grupos libres de sulfhidrilo. Anfinsen aprovech esa diferencia para evaluar el grado de reduccin usando el ensayo del espectrofotomtrico para valorar el nmero de grupos de sulfhidrilo.Para estudiar el plegamiento de las protenas fuera de la clula, lo primero que se debe hacer es desnaturalizar la protena. Lo cual se logra fcilmente a travs del calor o una alteracin mecnica como un temblor y/o a travs de tratamientos qumicos. Las protenas con puentes de disulfuro requieren una medicin adicional del tratamiento con el agente reductor para poder romper y separar los enlaces covalentes. As, para desnaturalizar la ribonucleasa, Anfinsen primero redujo los puentes de disulfuro con cido tiogliclico. Luego, la desnaturaliz mediante el uso de una gran concentracin de urea y encubando la solucin a temperatura ambiente. Con esto, l demostr que ese tratamiento quit la enzima inactiva mostrando que la ribonucleasa ahora era incapaz de catalizar la escisin de ARN. Mediante el uso del ensayo espectrofotomtrico, Anfinsen demostr que la ribonucleasa inactiva contena ocho grupos de sulfhidrilos que correspondan a los cuatros puentes de disulfuros rotos. Y, con una protena completamente reducida y desnaturalizada, Anfinsen se pregunt: Puede una encima desnaturalizada plegarse correctamente in vitro y ser activa nuevamente?Para encontrar la respuesta, Anfinsen permiti que una solucin reducida de ribonuclease desnaturalizada se oxidara. Y le quit la urea de la enzima desnaturalizada mediante precipitaciones. Luego, re-suspendi la ribonucleasa desnaturalizada sin urea en una solucin tamponada y la incub por dos a tres das. Y la exposicin al oxigeno molecular de la atmsfera oxid los residuos de cistena. Con eso, l compar la actividad de la ribonuclease re-naturalizada con la de la enzima original. En los experimentos iniciales, el 12%-19% de las previamente protenas inactivas fueron capaces de catalizar la escisin de ARN nuevamente. Las protenas se agregaban en concentraciones altas, lo que dificulta que se plieguen (doblen) correctamente. As, al disminuir las concentraciones generales de la ribonucleasa en una solucin, Anfinsen demostr que hasta un 94%de las protenas podan plegarse nuevamente (ver foto de la tabla 3.1). La enzima haba podido plegarse nuevamente en su conformacin activa fuera de la clula, demostrando que la informacin del plegamiento/doblamiento de la protena se encuentra dentro de la misma protena.

DISCUSINA travs de experimientos muy cuidadosos, Anfinsen demostr que la informacin requerida para el correcto plegamiento de la protena estaba en su secuencia primaria. Su anlisis qumico de este proceso respondi una pregunta fundamental de la biologa. Luego l demostr el re-plegado (re-doblamiento) de otras enzimas libres de clulas, incluyendo las protenas que carecen de puentes de disulfuro. Si bien es posible plegar correctamente una serie de protenas fuera de la maquinaria de procesamiento normal de las protenas en la clula, este proceso se acelera enormemente in vivo por una serie de enzimas. Anfinsen continu con estudiando sobre los problemas presentes en el plegamiento de las protena. Y, aunque la Hiptesis termodinmica no resulta para todas las protenas, la demostracin de Anfinsen sobre el re-doblamiento de la ribonucleasa libre de clulas, marc (fue un hito) el campo de la bioqumica. Y, en 1972, l recibi el Premio Nobel de Qumica por su trabajo.