revista ntics pablo francisco carrasco velástegui
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FCIAL - CARRERA ING. BIOQUÍMICA 1RO BQ ATRANSCRIPT
FCIAL Ingeniería Bioquímica
REVISTA CIENTÍFICA – BIOQUÍMICA
Primera Edición Julio 2014
CONTENIDOS:
DAÑO OXIDATIVO Y ANTIOXIDANTES Pag. 4
BIOTRANSFORMACIÓN DE COMPUESTOS AROMÁTICOS
SUSTITUIDOS MEDIANTE HONGOS FILAMENTOSOS
FITOPATÓGENOS DE LOS GÉNEROS Botryodiplodia Y
Colletotrichum Pag. 10
ALGUNAS PROPIEDADES CINÉTICAS DE UNA L-
AMINOÁCIDO OXIDASA PURIFICADA DEL VENENO DE LA
SERPIENTE PERUANA Bothrops atrox “JERGÓN” Pag. 15
CORROSIÓN DE LOS METALES - INFORME. Pag 18
El universo visible, es decir, la realización o encarnación del pensamiento divino es la
causa ocasional de la ciencia – Juan Valera Escritor Español
CRÉDITOS:
EDITOR:
Pablo Carrasco V.
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Edición y Diseño:
Pablo Carrasco V.
La ciencia se encuentra en todo nuestro alrededor para ello se crean
revistas las cuales nos proporcionan información acerca de las
diferentes actualizaciones que tienen los diferentes científicos de sus
experimentos. Los estudiantes que comienzan sus estudios tienen
varias interrogantes acerca de los nuevos descubrimientos que
ocurren cada día.
A través de este medio lo que se intenta es atraer a la gente en común
y que se informe sobre cómo avanzan diferentes experimentos ya sea
acerca de una cura para el cáncer o como se origina la vida, estos
temas al igual que otros producirá que la gente esté más interesada en
la ciencia y si es el caso se involucre en ella.
Las personas hoy en día se encuentran muy relacionadas ala ciencia
pero ellos no toman en cuenta lo que ocurre a su alrededor ya que la
tecnología avanza y ocupa mucho espacio en la vida diaria de las
personas. Para ellos la ciencia ha tomado la decisión de seguir este
ejemplo y ahora varios laboratorios son equipados con la mejor
tecnología para que los resultados de los experimentos sean correctos
y puedan ser presentadas en revistas científicas como esta.
Para concluir se hace una cordial invitación a que se proceda a leer
esta revista ya que contiene varios artículos de forma científica que
atraerá su atención y se espera que sea de su agrado.
ED
ITO
RIA
L
Universidad Autónoma Metropolitana - Unidad Iztapalapa.
México D.F.
RESUMEN
Para los organismos aerobios el oxígeno es un compuesto
esencial, sin embargo, su reducción secuencial dentro de las
células conduce a la formación de las llamadas especies
reactivas de oxígeno, que son en su mayoría radicales libres. Un
radical libre es una molécula o un átomo que presenta un
electrón no apareado, razón por la cual son sumamente
reactivos. Al formarse pueden interactuar rápidamente con
moléculas orgánicas tales como proteínas, lípidos,
carbohidratos, e incluso con el ADN, provocando en ellas
diversas alteraciones estructurales, que conducen a alteraciones
de tipo funcional, y de esta manera la fisiología de las células y
por consecuencia la de los organismos, se ve afectada. El
estudio de los radicales libres ha permitido relacionarlos
directamente con el desarrollo de diversas enfermedades de tipo
neurodegenerativo (Alzheimer, Huntington, Parkinson), con la
carcinogénesis, y con el envejecimiento. Paralelamente al
estudio de los radicales libres, el estudio de los antioxidantes
constituye actualmente un tema de investigación sumamente
importante, ya que se ha considerado que el conocimiento de
los mecanismos de acción de estas moléculas podría permitir,
en algún momento, la utilización de las llamadas terapias
antioxidantes, para disminuir los efectos biológicos de los
radicales libres.
Palabras clave: radicales libres, antioxidantes, daño oxidativo.
ABSTRACT
Oxygen is an essential molecule for living aerobic organisms,
however its chemical reduction inside the cells produces the
called reactive oxygen species, and most of them are free
radicals. These are atoms, or molecules, with an unpaired
electron. The presence of unpaired electron causes them to be
highly reactive. After its formation, they interact with organic
molecules as proteins, lipids, carbohydrates, and DNA,
producing in them several structural and functional
modifications and alterations. As a result of this damage the
physiology of cells and organisms is also altered.
This kind of damage has been associated with several diseases
as Alzheimer, Huntington, Parkinson, as well as to carcinogenic
and aging processes. Simultaneously, the studies on antioxidant
agents has become a very important research field, since
through the knowledge of their mechanisms of action it might
be possible to counteract the effects of free radicals, in order to
diminish the biological effect of oxidative damage.
Key words: free radicals, antioxidants, oxidative damage.
INTRODUCCION
El oxígeno es un compuesto esencial en el metabolismo de
todos los organismos aerobios, ya que participa en diversas
reacciones de oxidación, incluyendo la respiración. Durante
estos procesos el oxígeno molecular se reduce, dando origen a
las llamadas especies reactivas de oxígeno, las que en su
mayoría son radicales libres.
Un radical libre es una especie química (molécula o átomo) que
presenta al menos un electrón no apareado. La mayoría de los
radicales libres son en extremo reactivos y tienden a asociarse
“apareando” el electrón libre 1. Los radicales derivados del
oxígeno son altamente tóxicos y son capaces de reaccionar con
diversas moléculas orgánicas, mecanismo a través del cual
provocan daño a nivel celular y tisular, con la consiguiente
alteración de su función 2. Recientemente se les ha implicado en
diversos padecimientos como la carcinogénesis 3, el
envejecimiento 4 y con desordenes de tipo neurológico como la
epilepsia, la enfermedad de Huntington 2 y el mal de Parkinson
5.
Los radicales libres se pueden formar en el interior de las células
como producto de sus actividades fisiológicas normales 1 o a
partir de procesos como la hipoxia, en la que se observa un
aumento en la formación de radicales libres, que pueden inducir
lipoperoxidación en la membrana de las células del cerebro y
con esto alteraciones en la función del mismo 6. En el Cuadro 1
se mencionan los sitios de la célula en donde pueden generarse
radicales libres a partir de los procesos fisiológicos normales.
Daño Oxidativo y Antioxidantes
María Cristina González-Torres, Miguel Betancourt-Rule y Rocío Ortiz-Muñiz
Profesores Titulares del Departamento de Ciencias de la Salud. Universidad Autónoma Metropolitana - Unidad Iztapalapa.
Correspondencia: María Cristina González Torres, Departamento de Ciencias de la Salud. Universidad Autónoma Metropolitana - Unidad Iztapalapa. Av. Michoacán y la Purísima. Col. Vicentina. Delegación Iztapalapa. C.P. 09340. México D.F., E-mail: [email protected]
Los radicales libres pueden generarse también a partir de
fuentes exógenas, como las radiaciones ionizante, ultravioleta,
la visible o térmica, drogas antitumorales, algunos productos
químicos carcinogénicos, agentes contaminantes, pesticidas y
humo del cigarro 1,11,12; también diversos medicamentos pueden
inducir la liberación de radicales libres, como el acetaminofén
13,14, la neomicina, la polimixina B, la kanamicina, la
gentamicina 15,16 y el
cloramfenicol 17.
Las especies reactivas de oxígeno se forman por la reducción
secuencial del oxígeno (O2), que primero produce el radical
superóxido (O2 =), y el radical perhidroxilo (HO2),
posteriormente genera el peróxido de hidrógeno (H2O2) y
finalmente el radical hidroxilo (.OH) 11. Otro radical libre que
se forma de la reacción del radical superóxido con el óxido
nítrico es el peroxinitrito (ONOO-). Algunas de estas
reacciones son dependientes de la presencia de metales de
transición, en particular de fierro y cobre 12,18.
Las especies reactivas de oxígeno mas importantes y sus
características fundamentales se presentan en el Cuadro 2.
Aunque en general se considera que los radicales libres tienen
una alta reactividad, esta puede ser variable, siendo
posiblemente los radicales menos reactivos los mas dañinos en
ciertas circunstancias, debido a la posibilidad que tienen de
interactuar con estructuras biológicas alejadas de su sitio de
origen 1, esto es igualmente válido para los productos generados
de la interacción primaria entre un radical libre y una molécula
biológica.
Las consecuencias de las reacciones de los radicales libres con
diferentes materiales celulares pueden ser muy variadas. Los
objetivos celulares frecuentemente atacados son: el ADN, los
lípidos membranales, así como proteínas y carbohidratos. A
nivel de organelos, se ha observado que las mitocondrias son
sumamente sensibles a la presión oxidativa, lo que se refleja en
cantidades elevadas de oxidación en lípidos y proteínas, y en
mutaciones del ADN mitocondrial 22.
DAÑO AL ADN
El daño provocado a nivel del ADN por los radicales libres
puede generar mutaciones somáticas, que llevarían a la síntesis
de proteínas defectuosas, y posiblemente a la generación de
transformaciones malignas.
Uno de los componentes de la molécula de ADN que es
susceptible a ser dañado por radicales libres es la
desoxirribosa23, la que al oxidarse puede inducir el rompimiento
del enlace entre este azúcar y el grupo fosfato del siguiente
nucleótido, mecanismo mediante el cual se forman
rompimientos de cadena sencilla, los que son reparados por
medio de las enzimas correspondientes. Cuando gran cantidad
de radicales hidroxilo atacan una parte restringida de la
molécula de ADN, se forman numerosos rompimientos de
cadena sencilla, que por su cercanía podrían conducir a la
formación de rompimientos de cadena doble, los que provocan
daño permanente al material genético 24. La reactividad del
radical hidroxilo hacia los diferentes átomos de hidrógeno de la
desoxirribosa varía considerablemente, siendo los carbonos 4 y
5 los sitios primarios de ataque, ya que en la molécula de ADN
son los que quedan mas expuestos 25.
Los radicales hidroxilo tienen la capacidad de reaccionar
también con las bases nitrogenadas del ADN. El tipo
predominante de alteración que puede observarse a este nivel
son las substituciones, aunque también es frecuente observar
deleciones y con menor frecuencia inserciones. Se ha visto que
las substituciones frecuentemente involucran al par guanina-
citocina con el que los radicales hidroxilo y el oxígeno simple
reaccionan directamente. Las mutaciones se concentran en
regiones específicas del ADN, que se denominan “puntos
calientes”, lo que indica que están relacionadas con las
secuencias de bases púricas y pirimídicas 19.
Es probable que el oxígeno simple reaccione con la guanina
eliminándola del ADN, lo que provoca la formación de
rompimientos de cadena sencilla, o bien, que pueda generar un
gran número de productos de reacción derivados de ella (de los
que se han identificado hasta doce diferentes) los que
constituirán los llamados sitios sensibles al álcali, que se
convertirán en rompimientos después de tratamiento alcalino11.
Uno de los productos formados es la 8-hidroxiguanosina, la que
puede formarse por los radicales libres directamente sobre la
molécula de ADN; o sobre los precursores de la misma, esta
molécula puede identificarse en la orina humana, cuando el
daño al ADN fue reparado 10.
Las mutaciones se establecen cuando una cadena de ADN
dañada es copiada durante la duplicación 26. Otra posibilidad, es
que la duplicación quede bloqueada cuando la ADN polimerasa
encuentra una lesión, o bien, en estos puntos de lesión la enzima
puede leer erróneamente el mensaje de la cadena dañada y
generar una cadena complementaria defectuosa 23.
DAÑO A LIPIDOS MEMBRANALES
La oxidación de los lípidos membranales provoca alteraciones
en la permeabilidad, o la pérdida de la integridad de la
membrana plasmática y la de los organelos celulares. Con
respecto a la permeabilidad se afecta tanto el transporte pasivo
como el activo al alterarse las interrelaciones de fluidez de los
lípidos que forman las membranas biológicas 27.
Los ácidos grasos poli-insaturados, que predominantemente se
ubican en las membranas celulares, son particularmente
susceptibles al ataque de los radicales libres. Cuando los
radicales hidroxilo se forman cerca de la membrana son capaces
de extraer átomos de hidrógeno de los fosfolípidos que la
componen, después de esta reacción aunque el hidroxilo
original se ha inactivado, se forma un radical lipídico, el que
después de un rearreglo molecular (dieno conjugado), puede
reaccionar con el oxígeno para originar el radical peroxilo (R-
OO.), este puede reaccionar con otros ácidos grasos de la
membrana, formando más radicales lipídicos, mientras él
mismo se transforma en hidroperóxido (R-OOH), el que en
presencia de varios complejos metálicos puede descomponerse
en mas radicales, incluyendo entre ellos al radical hidroxilo, lo
que provoca un fenómeno de expansión del daño, en el que se
considera que la peroxidación se ha propagado (Cuadro 3).
En ausencia de iones metálicos los hidroperóxidos pueden
acumularse en la membrana y con esto alterar su función,
pueden transformarse en aldehídos, dentro de los que el mas
estudiado es el malondialdehído y que puede provocar daño a
otras moléculas como el ADN 28. Alternativamente el radical
peroxilo puede dar origen a peróxidos cíclicos, los que pueden
descomponerse para formar radicales lipídicos 1,8. A este
fenómeno globalmente se le denomina lipoperoxidación y en
ausencia de algún proceso que la inhiba puede provocar la
rápida destrucción de la fase lipídica de las membranas 29.
Durante el proceso de lipoperoxidación se forman otros
compuestos (no radicales libres) que afectan otras estructuras
celulares, estos son principalmente hidroxialquenales, siendo el
4-OH-2,3-transnonenal uno de los más tóxicos. Los alquenales
son compuestos que reaccionan con el ADN, inhiben la síntesis
de proteínas y ARN, así como la reparación del ADN y se unen
al glutatión disminuyendose su capacidad protectora dentro de
la célula 30,31.
Dentro del proceso mismo de la lipoperoxidación, los radicales
que se forman pueden causar también daños a las proteínas
membranales, inactivando receptores o enzimas unidas a las
membranas 32.
La lipoperoxidación no sólo daña a las membranas, ya que
también tiene efectos sobre lipoproteínas plasmáticas (p.ej. las
lipoproteínas de baja densidad del plasma sanguíneo) 33.
Un incremento en la lipoperoxidación ha sido también asociado
con el envejecimiento 34.
DAÑO A PROTEINAS Y CARBOHIDRATOS
En proteínas y carbohidratos, los radicales libres pueden inducir
fragmentación con la pérdida de la función de estas moléculas.
Los aminoácidos aromáticos, la cisteína, los enlaces disulfuro y
los enlaces peptídicos son fragmentados por los radicales libres
alterándose su estructura y su función.
El radical hidroxilo es muy reactivo con las proteínas y puede
causar modificaciones en casi todos los residuos de
aminoácidos, pero en particular ataca a la tirosina, fenilalanina,
triptofano, histidina, metionina y cisteína 12, forma
entrecruzamientos de tipo covalente e induce la fragmentación
de la cadena polipeptídica, lo que se traduce en una pérdida de
la función, o en mayor susceptibilidad a las enzimas
proteolíticas. Las proteínas oxidadas son fácilmente degradadas
por enzimas proteolíticas debido a la formación de grupos
carbonilo, a la creación de nuevos grupos N-terminales, o a
cambios conformacionales de la molécula 35. Datos
experimentales muestran que el radical peroxinitrito (ONOO-)
oxida a las proteínas membranales y citoplásmicas, afectando
su naturaleza física y química 21.
Diversas reacciones de oxidación pueden convertir algunos
residuos de aminoácidos, como la prolina, la arginina y la lisina,
a derivados de tipo carbonilo 36. La presencia de este grupo
químico se ha utilizado como un parámetro para evaluar el daño
oxidativo en las proteínas 37,38. De esta manera, se ha estimado
que 2 nmol de grupos carbonilo por miligramo de proteína,
cantidad observada en personas jóvenes, representan un daño
del 10% del total de las proteínas celulares, mientras que en los
ancianos este porcentaje se incrementa a 20 y 30% del total de
las proteínas celulares 39.
En pacientes con envejecimiento prematuro, como la progeria,
la cantidad de grupos carbonilo en sus células es
significativamente mayor que las de individuos normales de la
misma edad 36. Este incremento de proteínas dañadas podría
relacionarse con deficiencias en su eliminación, o con un
incremento en la tasa de oxidación de proteínas durante el
envejecimiento 36,40.
Los radicales libres pueden inducir cambios específicos en la
estructura de algunos aminoácidos, como los atribuidos al
radical hidroxilo, que convierte la fenilalanina a o-tirosina 41, y
al óxido nítrico que transforma la tirosina en nitrotirosina 42.
Estos dos aminoácidos no están presentes normalmente en las
proteínas, por lo que representan marcadores útiles para evaluar
daño oxidativo 40.
En otro proceso el peroxinitrito puede hidroxilar la fenilalanina
y nitrar la tirosina 42. Con respecto a esto se desconocen las
consecuencias biológicas de la nitración de las proteínas in vivo
12, sin embargo se ha observado una abundante nitración de las
proteínas en pacientes con aterosclerosis 43, lo que tal vez podría
tener alguna relación con el padecimiento.
Las alteraciones conformacionales provocadas en las proteínas
por los radicales libres se relacionan con la pérdida de la
actividad catalítica de enzimas tales como la lisosima y la
ribonucleasa 35. La inactivación de enzimas por la oxidación
inducida por medio de radicales libres y la acumulación
intracelular de proteínas oxidadas, podrían jugar un papel
crítico en la alteración de las funciones celulares y en la muerte
celular 38.
La disminución substancial en la concentración de las enzimas
en la fisiología de la célula y la acumulación de cantidades
masivas de proteínas dañadas compromete seriamente la
integridad celular 44. A nivel de la membrana plasmática, las
alteraciones inducidas sobre sus proteínas afectan a los
transportadores, los canales proteicos, los receptores o proteínas
reguladoras y a los inmunorreguladores 27. La combinación de
todas estas alteraciones pueden tener consecuencias letales para
las células.
Los efectos de los radicales libres sobre los carbohidratos, son
poca conocidos, pero se ha establecido que el ácido hialurónico,
la condroitina y el dermatán sulfato, todos ellos polisacáridos
del grupo de los glucosaminoglucanos, son susceptibles a su
degradación en presencia de las especies reactivas de oxígeno,
particularmente a los radicales superóxido e hidroxilo, lo que
probablemente altera la función de los proteoglicanos de los que
forman parte y esto se ha relacionado con la patogenia del
proceso inflamatorio 45.
ANTIOXIDANTES
Las células presentan mecanismos de protección, de manera
que los radicales libres derivados de la activación del oxígeno
pueden ser transformados a productos menos tóxicos o no
tóxicos. La protección de las células contra los radicales libres
derivados del oxígeno comprende no solo la captura de estos
intermediarios agresivos, sino también la prevención de su
formación, la inhibición de su propagación y la reparación de
las lesiones.
La primera línea de defensa del organismo contra los radicales
libres es la prevención, esto implica la acción de procedimientos
que bloquean su formación, como sería la presencia de
proteínas que se unen a metales (en particular hierro y cobre) lo
que controla eficientemente la lipoperoxidación y la
fragmentación del ADN, ya que de esta manera se evita la
participación de estos metales en las reacciones donde se
producen las diferentes especies reactivas de oxígeno 12,28.
Dentro de las proteínas que se ligan a metales se pueden
mencionar la ferritina, transferrina, ceruloplasmina, la albúmina
y las metalotioneínas. En el plasma sanguíneo la mayor acción
protectora es efectuada por la transferrina y la ceruloplasmina.
La ferritina es una proteína intracelular que evita la
acumulación de fierro libre, mientras que la ceruloplasmina es
la encargada de captar aproximadamente el 90% del cobre
extracelular. Su actividad mas importante reside en inactivar el
radical superóxido 46.
La albúmina, que es la proteína mas abundante del plasma
presenta propiedades antioxidativas. Se le considera la
responsable de captar entre el 10 y el 50% del total de radicales
peroxilo que se generan en el plasma humano, además de que
tiene la capacidad de unirse al cobre, y de esta manera inhibe la
formación del radical hidroxilo que se forma a partir del
peróxido de hidrógeno 47.
En un segundo nivel de protección está la acción de los
antioxidantes, que eliminan a los radicales para suprimir su
actividad nociva en la célula. Estos agentes pueden dividirse en
dos categorías: no enzimáticos y enzimáticos.
Los antioxidantes no enzimáticos se unen a los radicales libres,
y los transfieren de sitios donde pueden provocar graves daños
(p. ej. las membranas) a compartimentos celulares donde sus
efectos sean menos drásticos (p. ej. el citoplasma), o bien, los
transforman en radicales menos agresivos. Ejemplos de este
tipo de antioxidantes son: -tocoferol (vitamina E), -
caroteno, ascorbato (vitamina C), glutatión, urato, bilirrubina y
flavonoides entre otros. La vitamina E, el -caroteno y la
vitamina C son los únicos nutrientes esenciales que atrapan
directamente radicales libres. La vitamina C es soluble en agua
y se ubica en el citoplasma celular, mientras que la vitamina E
y el -caroteno son solubles en lípidos 28,48,49.
El -tocoferol está presente en las membranas celulares y en
las lipoproteínas plasmáticas, y se caracteriza por presentar en
su estructura un grupo -OH, del que el átomo de hidrógeno
puede removerse fácilmente. Los radicales peroxilo formados
durante la lipoperoxidación tienen una mayor afinidad por el -
tocoferol, que por las cadenas de los ácidos grasos adyacentes,
la reacción convierte -tocoferol en un radical, que es poco
activo e incapaz de reaccionar con otros ácidos grasos, y de esta
manera detiene la cadena de reacciones de la lipoperoxidación
1,28. En este punto la vitamina C juega un papel importante ya
que regenera la forma antioxidante de la vitamina E, además de
que tiene la capacidad de reaccionar por sí misma con los
radicales superóxido, hidroxilo y perhidroxilo 50.
Se considera que la vitamina C esta en la fase acuosa, y es la
defensa más importante contra los radicales libres 29,
eliminándolos de los compartimentos hidrofílicos de la célula,
de la matríz extracelular y del sistema circulatorio, que es donde
se le puede encontrar, además, participa en la protección de las
moléculas hidrofóbicas como las lipoproteínas del plasma
sanguíneo y de los lípidos membranales. Las evidencias
experimentales muestran que la interacción entre la vitamina C
y la vitamina E permite la regeneración no enzimática del -
tocoferol (TCOH) a partir del radical -tocoperoxil (TCO. ),
que se forma cuando el -tocoferol reacciona con los radicales
peroxilo
(ROO. ), esto por medio del ascorbato (AH-) (Cuadro 4).
Finalmente el ascorbato es regenerado a través de una vía
enzimática 50.
El -caroteno tiene dos funciones: en primer lugar actúa
directamente como atrapador del oxígeno simple y de
lipoperóxidos, y en segundo lugar puede ser transformado a
vitamina A en el intestino humano 1. Tanto el -caroteno como
la vitamina A son antioxidantes solubles en lípidos y tienen la
posibilidad de unirse a las diferentes especies reactivas de
oxígeno, aunque la manera en que lo hacen no se conoce
completamente 51. Se asume que el -caroteno se ubica en el
interior de las membranas, o en las lipoproteínas del plasma 52.
El glutatión juega un papel importante en la protección celular
contra el daño oxidativo de lípidos, proteínas y ácidos
nucleicos. Presenta una interacción sinérgica con otros agentes
antioxidantes como la vitamina C, la vitamina E y las
superóxido-dismutasas 53,54. Actúa como atrapador de radicales
hidroxilo y del oxígeno simple, además de tener la capacidad de
reactivar enzimas que son inhibidas al ser expuestas a altas
concentraciones de oxígeno. En los humanos la incapacidad
para sintetizar glutatión puede provocar anemia hemolítica y
alteraciones neurológicas 55. Así mismo, el glutatión protege
contra el daño oxidativo reduciendo la concentración de
peróxido, lo que es valioso ya que éste, como ocurre en la
lipoperoxidación, amplifica el proceso de daño 53.
Otros ejemplos de antioxidantes no enzimáticos son la
poliamina espermina, la coenzima Q y los flavonoides, la
primera se encuentra normalmente en concentraciones
milimolares en el núcleo y participa directamente como
atrapador de radicales libres, actuando como el mayor
compuesto natural ubicado intracelularmente y que es capaz de
proteger al ADN del ataque de los radicales libres 56. La
coenzima Q funciona como un antioxidante altamente eficiente
en las membranas celulares en que se encuentra 50. Los
flavonoides por su parte actúan como inhibidores de la
lipoperoxidación, además de poder interactuar directamente
con las especies reactivas de oxígeno y como agentes
quelantes para iones divalentes 10.
Con respecto a los antioxidantes enzimáticos se puede señalar
que en las células se presentan tres sistemas principales de
enzimas antioxidativas: las superóxido dismutasas, la catalasa y
las glutatión peroxidasas 10.
Las superóxido dismutasa (SOD) catalizan el cambio del radical
superóxido a peróxido de hidrógeno. La dismutación es una
reacción en la que dos moléculas de sustrato idénticas tienen
destinos diferentes, en este caso una molécula de superóxido se
oxida y la otra se reduce:
2O2 + 2H H2O2 + O2
SOD
Estas son una familia de metaloenzimas, que contienen cobre y
zinc. De ellas se conocen al menos tres formas diferentes, que
se ubican en el citoplasma de la célula, en las mitocondrias y en
los fluidos extracelulares respectivamente 57,58.
La catalasa es una enzima de amplia distribución, que consiste
de cuatro subunidades proteicas, cada una con un grupo hemo
unido a su sitio activo. Se caracteriza además por presentar
una tasa de renovación extraordinariamente elevada (>40 000
moléculas por segundo). Su actividad se localiza básicamente
en los peroxisomas, en donde cataliza la conversión de
peróxido de hidrógeno, en agua y oxígeno molecular en
muchos tejidos 1.
2H2O2 2H2O + O2
Catalasa
La glutatión-peroxidasa (GP) es una enzima que utiliza como
cofactor al selenio, y que se ha encontrado en el citoplasma y
las mitocondrias de los tejidos animales. Cataliza la reacción a
través de la cual el glutatión reducido (GSH) reacciona con
peróxidos para transformarlos en agua y alcohol. Durante el
proceso el glutatión es oxidado (GSSG), para posteriormente
ser regresado a su estado original, por la enzima glutatión
reductasa 59.
2GSH + H2O2 GSSG + 2 H2O GP
Si después de la acción de los antioxidantes el daño persiste, el
último nivel de protección de la célula consiste en la
reparación de las lesiones, lo que reside básicamente en la
actividad de enzimas que repararán el daño inducido por los
radicales libres al ADN, y de otras que destruirán las proteínas
dañadas por los radicales libres ó las que removerán los ácidos
grasos oxidados de las membranas 60.
La importancia de la interacción de las diferentes especies
reactivas de oxígeno con moléculas biológicas como el ADN,
los lípidos, las proteínas y los carbohidratos, se traduce en
alteraciones de la estructura, o en la fragmentación de las
biomoléculas, lo que está relacionado con las modificaciones
de la fisiología celular, y por consecuencia, de los organismos
de que forman parte. Por lo anterior se está analizando el papel
de las especies reactivas de oxígeno en el desarrollo de
diversos padecimientos, y la actividad de los agentes
antioxidantes, como medios potenciales para controlar los
efectos de los radicales libres, sobre todo ante la posibilidad de
implementar las “terapias antioxidantes”.
Fuentes: 1, 7, 8, 9 * Oxida el NADP+, con la resultante reducción del oxígeno para formar el radical superóxido, este mecanismo es utilizado por los neutrófilos, monocitos, macrófagos y eosinófilos para eliminar bacterias, proceso durante el cual los tejidos circundantes pueden verse también afectados 10.
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RESUMEN
Los hongos fitopatogenos de los generos Colletotrichum y Botryodiplodia han sido reconocidos por poseer
la habilidad natural de transformar compuestos presentes en las plantas, tanto en su proceso de colonizacion
como para hacer frente a los mecanismos de defensa del huesped (destoxificacion de fitoalexinas).
Asimismo, han demostrado su versatilidad para metabolizar algunas sustancias xenobioticas. Actualmente,
esta clase de microorganismos poseen aplicacion potencial en procesos de biotransformacion para la
sintesis organica de moleculas pequenas, las cuales nutren la industria quimica, farmaceutica, y agricola.
Entre las ventajas que presenta el empleo de los sistemas biologicos para la síntesis organica, se encuentra
el hecho de que son procesos frecuentemente mas regio-, quimio- y estereoselectivos que los metodos de
sintesis clasica y ademas, se llevan a cabo bajo condiciones suaves y amigables con el ambiente. Esta
revision describe algunos de los articulos recientes mas relevantes relacionados con la biotransformacion
de sustratos aromaticos sustituidos y tambien algunas de las aproximaciones que hemos realizado en nuestro
grupo de investigacion, empleando los hongos fitopatogenos de los generos Colletotrichum y
Botryodiplodia como biocatalizadores en la quimica organica sintetica.
Palabras clave Rutas metabolicas, precursores sinteticos, hidroxilacion,1
ABSTRACT
Phytopathogenic fungi of genus Colletotrichum and Botryodiplodia have been recognized for their natural
ability to transform natural compounds from plants, as in their processes of colonization as to counteract to
the defenses mechanisms from the host (detoxification of phytoalexins). Likewise, they have shown
versatility for metabolize some xenobiotics substances. Nowadays, these classes of microorganisms have
potential application in biotransformation processes for the organic synthesis of small molecules, which
feed the chemical, pharmaceutics and agricultural industries. Inside the advantages of the employ of the
biological systems for the organic synthesis is in fact that they are processes frequently more regio-, chemo-
and stereoselectives than the methods of classic synthesis, besides they are carry out under mild and soft
conditions with the environment. This review describe some of the more relevant recent articles related
with the biotransformation of substrates aromatic substituted and also some approximations which we have
developed in our research group, employed the phytopatogenic fungi of the genus and like biocatalyst in
the synthetic organic chemistry.
Key word: Metabolic pathway, synthetic intermediates, hydroxylation, Colletotrichum, gloeosporioides C.
acutatum Botryodiplodia theobromae
INTRODUCCIÓN
La bioconversion es el proceso por el cual se produce la transformacion de un compuesto quimico en otro
mediante el uso de un sistema biologico, que puede ser un organismo completo, o una enzima o sistema
enzimatico. Si la conversion quimica de la sustancia se lleva a cabo con la ayuda de una enzima libre o
inmovilizada, se emplea el termino biocatalisis. Por su parte, si se lleva a cabo con la ayuda de una celula
completa (usualmente) conteniendo la enzima necesaria, se habla de biotransformacion . Debido a que esta
clase de procesos biotecnologicos, son una alternativa limpia y economica para la obtencion de productos
quimicos, se han catapultado al interior del sector quimico especializado, donde el escenario de trabajo y
las caracteristicas de sus productos exigen óptimas condiciones de operacion.
En la ultima decada, las biotransformaciones han recibido un interes creciente y actualmente, se han
constituido en una de las areas mas promisorias de investigacion cientifica, debido a su posible aplicacion
en la obtencion de materias primas y productos utiles en diferentes procesos industriales y en sectores tan
trascendentes como el farmaceutico, el quimico, el de los alimentos y el agricola; de ahi que en el mundo
se destinen altas inversiones para su desarrollo . Se considera que de los 134 procesos industriales
reconocidos que utilizaroneste tipo de procesos en el ano 2002, mas de la mitad aparecieron en los ultimos
BIOTRANSFORMACIÓN DE COMPUESTOS AROMÁTICOS SUSTITUIDOS
MEDIANTE HONGOS FILAMENTOSOS FITOPATÓGENOS DE LOS GÉNEROS
Botryodiplodia y Colletotrichum
Rodrigo Velasco B., Diego L. Montenegro M., John F. Velez S., Carlos M. Garcia P. ,
Diego L. Durango R.
10 anos, y la tendencia aumento notoriamente en el pasado trienio . De estos procesos, la mayor parte
corresponden al sector farmaceutico, con un 55%, y tienen como finalidad obtener fármacos quirales
enantiomericamente puros. En esta industria la modificacion estructural de compuestos esteroidales
tambien es una prioridad.
Las ventajas que los procedimientos de biotransformacion tienen sobre los metodos quimicos, se basan en
que las reacciones catalizadas por enzimas son frecuentemente mas regio-, quimio- y estereoselectivas .
Muchas biotransformaciones no solo son regio- y
estereoespecificas sino tambien enantiespecificas, permitiendo la produccion de productos quirales a partir
de mezclas racemicas . Las condiciones para las biotransformaciones en la mayoria de los casos no
requieren de la proteccion de otros grupos funcionales . Ademas, las caracteristicas que gobiernan su
regioespecificidad difieren de aquellas que controlan la especificidad quimica, ya que la caracteristica
dominante en una biotransformacion es la relacion topologica entre el sustrato y el sitio activo de la enzima.
De esta manera, las biotransformaciones encuentran especial aplicacion en la preparacion de algunos
compuestos en los que la transformacion quimica es, hasta ahora, imposible . Por ejemplo, es posible
realizar biotransformaciones en centros que son no reactivos quimicamente, como la oxidacion de enlaces
C-H de hidrocarburos para la obtencion de compuestos oxifuncionalizados . Desde el punto de vista
comercial, algunas biotransformaciones pueden ser mas economicas y directas que sus analogas quimicas,
y adicionalmente, las transformaciones proceden bajo condiciones que son normalmente reconocidas como
amigables con el ambiente, ya que tienen lugar principalmente en agua y los subproductos son
biodegradables o reutilizables, lo que constituye una contribucion a la generacion de una "quimica verde",
de bajo impacto ambiental . Adicionalmente, cuando el biocatalizador, microorganismo o enzimas aisladas,
estan inmovilizados se pueden reciclar varias veces sin perdida significativa de sus propiedades cataliticas .
Aunque la principal aplicacion de las biotransformaciones en sintesis organica esta en la preparacion de
compuestos enantiopuros, estas tambien se usan para efectuar transformaciones de grupos funcionales
aquirales; ya que las biotransformaciones se llevan a cabo, generalmente, a temperatura ambiente y presion
atmosferica, evitandose con ello el uso de condiciones de reaccion extremas, las cuales pudieran causar
isomerizaciones, racemizaciones, epimerizaciones o transposiciones . Estas ventajas significativas resultan
mas importantes aun si consideramos que los productos obtenidos tendran aplicacion en la vida humana ya
sea directamente en el uso de medicamentos o indirectamente, en el caso de los agroquimicos, a traves de
los alimentos ingeridos .
BIOCATALIZADOR
En las bioconversiones, el agente biologico que activa o acelera la reaccion química (biocatalizador) puede
ser una enzima o sistema enzimatico aislado, o bien el organulo, celulao tejido completo en el que este
sistema se encuentra . El procedimiento mas comunmenteempleado en procesos de bioconversion involucra
el uso de celulas completas, en donde toda la maquinaria enzimática esta disponible. De otro lado, las
preparaciones enzimáticas incluyen extractos enzimaticos de microorganismos, plantas, protozoarios,
insectos, entre otros; muchas de estas preparaciones se encuentran actualmente disponibles o son
relativamente faciles de aislar, al menos, en forma bruta . Se pueden emplear, ademas, enzimas puras,
aisladas de microorganismos, muchas de las cuales estan disponibles comercialmente .No obstante, cada
aproximacion presenta sus ventajas y desventajas. Asi el procedimiento de emplear celulas completas es
frecuentemente mas economico de usar que los sistemas enzimaticos aislados, aunque se tiende a generar
mas de un producto, lo cual puede o no ser una ventaja . El uso de celulas completas, en crecimiento o
celulas en reposo
(resting cells), sinembargo, puede verse afectado cuando se dificulta el paso de los sustratos y productos
desde la disolucion a traves de las membranas y paredes celulares. Las enzimas puras pueden ser estables
y faciles de usar, conduciendo frecuentemente a la obtencion de productos unicos y con buen grado de
pureza. Para muchas reacciones hidroliticas, no es necesario el empleo de cofactores. Sinembargo, para
reacciones redox, en las cuales se usan cofactores, la necesidad de regenerar este cofactor puede presentar
una complicación adicional.
El uso de microorganismos (por ejemplo, bacterias y hongos) como biocatalizadores ha despertado un
interes particular, en parte como consecuencia de su habilidad para producir grandes cantidades de biomasa
y una amplia variedad de enzimas diferentes en corto tiempo. Ademas, muchos microorganismos pueden
crecer bajo condiciones diversas y en una amplia variedad de sustratos. Esta flexibilidad metabolica exige
que los microorganismos posean la capacidad de producir enzimas diferentes para toda clase de reacciones .
Adicionalmente, diversas enzimas, requeridas para llevar a cabo la transformacion requerida, pueden estar
presentes en las celulas completas de un microorganismo y actuar simultaneamente sin generar
interferencias entre ellas .
En el caso de las enzimas (biocatalisis) pueden usarse de varias maneras: pueden ser de tipo salvaje,
recombinadas, o geneticamente modificadas para incrementar su actividad o especificidad.
Alternativamente, las enzimas pueden estar en solucion, en un reactor de membrana, como suspension,
“cross-linked” o inmovilizadas . El medio de reacción puede ser acuoso, organico o en dos fases . Ademas,
con los avances en la modificación estructural de las enzimas se posibilita la creacion de nuevas moleculas
proteicas con actividades cataliticas hechas a la medida de las necesidades; por ejemplo, la preparacion de
enzimas termoestables o estables a cierto pH, por medio de la mutagenesis aleatoria o dirigida .
INMOVILIZACIÓN DEL BIOCATALIZADOR
En los procesos de inmovilizacion, las celulas completas o las enzimas son confinadas en una porcion de
espacio con retencion de sus actividades cataliticas, las cuales pueden ser usadas repetida y continuamente .
Esta definicion se ha ampliado al proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de
libertad de movimiento de enzimas, organulos, celulas, etc., por su union a un soporte . La inmovilizacion
puede extender la vida del biocatalizador, facilitar su recuperacion y reutilizacion. Cuando las celulas son
usadas como los agentes biocataliticos, el sistema permite velocidades adecuadas de penetracion y difusion
de los reactivos y productos al interior de la celula; mientras que en las reacciones con enzimas la formacion
de subproductos indeseables o la degradacion de los productos deseados, son inhibidos o minimizados . Se
ha demostrado que la inmovilizacion de las enzimas y en especial de aquellas insolubles en agua, aumenta
su estabilidad considerablemente, ademas de permitir la separacion de la enzima de los productos y
sustratos con un menor costo al requerido mediante tecnicas de separacion, y con su posterior reutilizacion,
o bien, estableciendose un proceso continuo con el que se obtienen mejoras evidentes. Adicionalmente, el
uso de celulas o enzimas inmovilizadas es mas ventajoso, puesto que permite en uso de concentraciones
mayores de compuestos que, normalmente les son toxicos, aunado a que la densidad celular es superior, lo
que implica una mayor proporción de bioconversion y se evita la perdida de biocatalizadores en el caldo de
extraccion . Es de anotar, sinembargo, que la naturaleza heterogenea del catalizador, como es el caso de las
enzimas, impone limitaciones de difusion que reducen y afectan su actividad; la alteracion de la
conformacion de la enzima de su estado nativo conlleva una perdida de la actividad durante el proceso de
inmovilizacion. Ademas, la enzima inmovilizada presenta un costo superior con respecto a la forma nativa
de la enzima.
En los procesos de inmovilizacion, la retencion puede ser por via fisica o quimica, dependiendo del tipo de
interaccion presente en la inmovilizacion. Diferentes revisiones enfocadas en los procesos de
inmovilizacion de biocatalizadores pueden encontrarse en la literatura reciente .
INGENIERÍA GENÉTICA
Las perspectivas de la biotransformacion son teoricamente buenas; el numero de tecnologías disponibles
actualmente y la ingenieria genetica aceleraran el impacto de las biotransformaciones en la sintesis
organica. Con los avances en la ingenieria genetica, las enzimas pueden sobreexpresarse en los organismos
(por ejemplo, los microorganismos), haciendo los procesos de biotransformacion mas economicos y
eficientes. Asi, una vez una enzima ha sido encontrada y su secuencia de aminoacidos (o la secuencia de
acidos nucleicos que codifica la proteina) analizada, se puede hacer uso de la precision quirurgica de la
ingenieria genetica o el clonado de genes.
Cuando la ingenieria genetica se aplica a la modificacion de las proteinas se utiliza el termino de ingenieria
de proteinas. De la misma manera, cuando de lo que se trata es de modificar un proceso metabolico se
emplea el termino de ingenieria metabolica . Las herramientas de la ingenieria de proteinas y de la
metabolica se han desarrollado no solo para ampliar el conocimiento de la bioquimica, sino que hoy en dia,
mediante estas herramientas, se optimizan muchos procesos biocataliticos para producir compuestos de
interes quimico y sobre todo farmaceutico. Junto con estas herramientas se han desarrollado nuevos
conceptos y metodologias, como la evolucion dirigida o la genetica combinatorial en sus distintas versiones,
que pretenden conseguir nuevas formas de proteinas o de sistemas metabólicos mediante la inclusion al
azar en un organismo de distintos genes o librerias genicas (biblioteca o conjunto de genes clonados en un
vector). La posterior seleccion del organismo recombinante mediante el empleo de sistemas robotizados de
cribado masivo de muestras permite obtener en poco tiempo la proteina o el organismo deseado .
BIOTRANSFROMACIÓN DE SUSTRATOS AROMÁTICOS SUSTITUIDOS
Los compuestos aromaticos alquilsustituidos han sido empleados como sustratos en diferentes procesos de
biotransformacion, con el objeto de obtener productos con valor agregado a partir de sustratos economicos
y disponibles comercialmente . La biotransformacion de compuestos ha permitido la obtencion de
moleculas pequenas mediante procesos economicos de bajo impacto ambiental, tales como los alcoholes
secundarios enantiomericamente puros, los cuales han sido utilizados como precursores en la industria
quimica, farmaceutica y para la obtencion de sabores, fragancias y cristales liquidos . Frecuentemente, la
aplicacion de estos procesos pretende aprovechar el alto grado de selectividad, e incluso especificidad, que
poseen los sistemas enzimaticos para la obtencion de materiales especializados, como los ciclohexadieno-
-dioles; sintones quirales valiosos enla sintesis de una amplia variedad de productos naturales y moleculas
de interes biologico . Asimismo, se ha empleado la biorresolucion en diversos sustratos aromaticos
sustituidos, para la obtencion de sintones opticamente activos a partir de mezclas racemicas, con el objetode
obtener productos de sintesis final con caracteristicas espaciales determinadas; lo anterior con el animo de
evitar la formacion de productos con alguna actividad biologica indeseable, o potenciar las caracteristicas
del producto de interes. Este tipo de aplicacion ha recibido un interes particular para la preparacion de
aromatizantes y saborizantes . En la tabla 1, se mencionan algunas de las biotransformaciones que se han
llevado a cabo en los ultimos anos empleando algunos sustratos aromaticos sustituidos; un amplio numero
de estos trabajos emplean como biocatalizador celulas completas de hongos y levaduras. Otros trabajos han
sido reportados empleando celulas vegetales y algas rojas para efectuar modificaciones sobre este tipo de
sustratos Entre los compuestos mas utilizados en las modificaciones biocataliticas se encuentran la
acetofenona y el benzaldehido. El primer sustrato permite, mediante biorreduccion asimetrica, la obtencion
de un sinton quiral de amplio uso en la sintesis de farmacos, aromas y productos naturales . La
biotransformacion del benzaldehido, por su parte, conduce a la formacion de fenilacetilcarbinol, un
intermedio quiral en la produccion de compuestos farmaceuticos como la efedrina y pseudoefedrina.
BIOTRANSFORMACIONES CON HONGOS FITOPATÓGENOS
Entre los organismos que mas se han explorado por su capacidad transformadora, se destacan por su
eficiencia los hongos fitopatogenos. Estos, ademas de poseer la habilidad natural de modificar compuestos
presentes en las plantas (por ejemplo, terpenos, coumarinas, estilbenos, fenilpropanos y flavonoides) en su
proceso de colonizacion, y en algunas ocasiones para hacer frente a los mecanismos de defensa del huesped
(destoxicacion de fitoalexinas); tambien pueden metabolizar algunas sustancias xenobioticas, tales como
pesticidas y colorantes, entre otros . Las celulas completas de los hongos fitopatogenos se emplean
frecuentemente debido a su habilidad para mediar en muchas reacciones diferentes, incluyendo
transformaciones oxidativas, reductivas, e hidroliticas sobre un amplio rango de sustratos . Debido a lo
anterior, las biotransformaciones con esta clase de microorganismos permiten generar diversidad estructural
en los productos metabolicos, de manera que puedan llevarse a cabo evaluaciones de estructura-actividad
biologica sobre una quimioteca particular.
Los hongos en medio liquido pueden crecer, como micelio libre en una forma filamentosa, o permanecer
en forma agregada como “bolitas” (pellet/floc). Estos patrones morfológicos regulan fuertemente la
produccion de metabolitos; sinembargo, los efectos que dichas variaciones morfologicas fungicas pueden
tener sobre las biotransformaciones continúan siendo oscuras.
BIOTRANSFORMACIONES MEDIANTE ESPECIES DEL GÉNERO
Botryodiplodia
Las especies de este genero de hongos filamentosos fitopatogenos han sido poco explotadas en cuanto a su
capacidad biotecnologica ; los estudios realizados comprenden la obtencion de metabolitos propios del
patogeno, que como en el caso del acido jasmonico y sus derivados, poseen potencial aplicacion como
reguladores del crecimiento de especies vegetales . Desde este punto de vista, la especie , mas conocida
como, ha demostrado una alta capacidad para elaborar esta clase de sustancias, catalogandose como fuente
promisoria para la produccion a escala industrial. Esta especie se clasifica como un organismo eucariota;
en sus condiciones naturales se encuentra en los estados imperfecto (anamorfo) con el nombre de
Botryodiplodia y perfecto oteleomorfo con el de Botryosphaeria. Son minimos los reportes en los cuales se
consideran estos microorganismos o sus sistemas enzimaticos para la conversion de sustratos organicos,
dentro de los cuales se reporta la tendencia del fitopatogeno a producir hidroxilaciones alquilicas, las cuales
pueden ser efectuadas sobre las cadenas de algunos esteroides . Este hecho hace que la dinamica de
transformar este tipo de metabolitos secundarios mediante especies del genero Botryodiplodia sea atractiva.
Del mismo modo, se ha publicado la biotransformacion de la sesquiterpenlactona zaluzanin-D, sustancia
reconocida por sus actividades antifungicas, antitumorales y de regulacion del crecimiento de insectos .
Debido a la facilidad de manipulacion de este genero en cultivos artificiales, rápido crecimiento e
importancia que ha venido adquiriendo como patogeno en los procesos de poscosecha de frutas y verduras,
entre otros, amerita que se estudie mas detalladamente su dinamica metabolica. En la tabla 2 se compilan
algunos trabajos que se encuentran en la literatura cientifica sobre biotransformaciones con especies del
genero Botryodiplodia.
BIOTRANSFORMACIONES DE SUSTRATOS AROMÁTICOS
SUSTITUIDOS CON Botryodiplodia theobromae
En investigaciones preliminares realizadas en nuestro grupo de investigacion, exploramos la dinamica de
las reacciones enzimaticas que produce la especie , con el objeto de determinar su viabilidad en la reduccion
de grupos carbonilo, y las posibles preferencias para la hidroxilacion de cadenas alquilicas o sistemas
aromaticos en sustratos aromáticos sustituidos . En los procesos se utiliza medio de cultivo liquido Czapeck-
Dox, sustituyendo sacarosa por glucosa en la formulacion original y conservando la misma proporcion por
litro del medio. El proceso se realizo en un ambiente aerobico en erlenmeyers de 1,0 litros taponados con
tarugos de algodon conteniendo 500 ml del medio. La inoculacion se realizo con trozos de cultivos con
edad no superior a 10 dias. El proceso de biotransformacion se extendio por un periodo maximo de 7 dias,
procurando biotransformar la mayor parte del sustrato de partida, y la obtencion de una gama amplia de
compuestos de biotransformacion, que incluyeran metabolitos de oxidacion iniciales y los provenientes de
procesos de oxidaciones mas avanzadas.
BIOTRANSFORMACIONES MEDIANTE ESPECIES
DEL GÉNERO Colletotrichum
Este es un genero de hongos filamentosos fitopatogenos que tienen gran incidencia económica sobre la
produccion agricola de los paises tropicales y en las zonas templadas. Normalmente se encuentra como
saprofito en residuos de cultivos y sus ataques se ven favorecidos por las condiciones de alta humedad y
temperatura, las cuales prevalecen en los tropicos durante gran parte del ano y en la mayoria de las zonas
de produccion . Las enfermedades que ocasionan se conocen comunmente con el nombre de antracnosis y
se presentan tanto en los cultivos como en las labores de poscosecha; los ataques se observan en mayor
proporcion en las partes aéreas de las plantas y ocasionan la caida prematura de hojas, flores y frutos, y en
muchas ocasiones pueden causar su muerte. Las especies de Colletotrichum pueden causar infecciones
latentes, en las cuales el hongo contamina la fruta verde en el campo y permanece inactivo hasta que la
fruta madura, en cuyo caso reanuda su crecimiento pudiendo infectar a las demas que estén alrededor
durante el almacenamiento. En la literatura cientifica se encuentran un buen numero de trabajos de
investigacion relacionados con las biotransformaciones realizadas por el hongo Colletotrichum
gloeosporioides (Glomerella cingulata ); la mayor parte de los estudios se compilan en la revision
bibliografica presentada por Garcia y otros . En la tabla 3, se citan algunos de los trabajos mas recientes
sobre biotransformaciones con especies del genero Colletotrichum.
CONCLUSIONES
Con base en la revision presentada y los trabajos realizados en el grupo de investigacion sobre
biotransformacion con hongos fitopatogenos de los generos Colletotrichum y Botryodiplodia, se concluye
que dichos microorganismos presentan una marcada tendencia hacia la introduccion de grupos hidroxilo
sobre las cadenas sustituyentes; igualmente, se aprecia la tendencia hacia la reduccion de grupos carbonilo
de cetonas y aldehidos, ademas de reacciones de acetilacion sobre grupos hidroxilo. Lo anteriormente
expuesto, puede considerarse como una alternativa adecuada para la obtencion de alcoholes y esteres de
tipo acetato con estructuras novedosas.
AGRADECIMIENTOS
Los autores quieren agradecer a la Universidad Nacional de Colombia, sede Medellin, por el apoyo
brindado en el transcurso de los proyectos de investigacion relacionados con el tema.
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RESUMEN
Se han determinado las principales propiedades cinéticas de una L-aminoácido oxidasa (LAO) purificada
del veneno de B. atrox , usando diferentes aminoácidos como sustratos, tales como: L-leucina, L-
fenilalanina, L-metionina y L-arginina. Previamente se establecieron las curvas de pH óptimo para L-AO
en función de cada aminoácido y luego se calcularon los valores de K ,V ,K yK /K a pH 7,5 y 8,5.Asimismo,
se determinaron los valores deK al emplearse inhibidores específicos tales como: ácido antranílico, ácido
benzoico, ácido sulfanílico y ácido salicílico. Entre los sustratos ensayados a pH 8,5, la L-AO presentó
mayor actividad específica sobre L-fenilalanina, y luego sobre L-leucina, L-metionina y L-arginina, siendo
los valores de pH óptimo de 8,1 con L-metionina; 8,9 con L-arginina, y 8,2 con Lfenilalanina. De acuerdo
a la eficiencia catalítica, la L-leucina fue el mejor sustrato a 7,5 (K /k = 40,90 x 10 s M ) y pH 8,5 (Km y
Vmax (K /k = 71,21 x 10 s M ).Asimismo, en los estudios de inhibición enzimática se encontró que el ácido
antranílico tuvo el menor valor de K ( 008 mM), ajustándose al modelo de inhibición no competitiva, en
tanto que el ácido benzoico fue considerado un inhibidor competitivo y los ácidos salicílico y sulfanílico se
comportaron como inhibidores de tipo mixto.
Palabra Clave: L-aminoácido oxidasa, Bothrops atrox, parámetros cinéticos, inhibición enzimática,K.
SUMMARY
We have determined main kinetic properties of a L-amino acid oxidase (L-AO) purified from Bothrops
atrox venom, on different aminoacids as L-leucine, L-phenylalanine, L-methionine and L-arginine.
Previously optima pH curves were establish for each aminoacid and then K , V , K y K /K values at pH 7,5
and 8,5 were calculated. Furthermore K values using anthranilic, benzoic, sulphanylic and salycilic acids
were obtained. Between substrates assayed at pH 8,5, L-AO showed higher specific activity on L-
phenilalanine, followed by Lleucine, L-methionine and L-arginine, being optimum values of 8,1 for L-
metionine, 8,9 for L-arginine, and 8,2 for L-fenilalanine. According to catalytic efficiency, L-leucine was
the best substrate atpH7,5 (K /k = 40,90 x 10 s M ) and 8,5 (K /k = 71,21 x 10 s M ).Onthe other hand,
enzymatic inhibition assays showed that anthranilic acid had the lowest K value ( 008 mM), fitting it to a
non-competitive model. Benzoic acid was considered a competitive inhibitor, while salicylic and
sulphanylic acid showed mixed-type inhibition.
Key Words: L-amino acid oxidase, Bothrops atrox , kinetics parameters, enzyme inhibition,K
INTRODUCCIÓN
El veneno de las serpientes es considerado una mezcla de toxinas, enzimas y péptidos, los cuales inducen
diversos efectos en sus víctimas. Su función primaria es la captura de sus presas; sin embargo, puede ser
usado como defensa, causando daños severos a sus agresores, entre ellos los seres humanos . Debido a su
composición, los venenos de serpiente son objeto de numerosos estudios orientados a: 1) aislar una o más
sustancias activas del veneno, que en bajas concentraciones puedan presentar efectos farmacológicos de
gran interés para el desarrollo de medicamentos; 2) tener una mejor comprensión de la función de las
sustancias aisladas del veneno de serpientes en el proceso del envenenamiento; y 3) verificar si existe algún
principio activo, sintético o natural que pueda inhibir la acción del veneno y de algunas proteínas aisladas
del mismo. En este aspecto, el veneno de las serpientes de la familia
Viperidae presenta una composición más compleja que la de otras familias, pues contienen un gran número
de proteínas bioquímica y farmacológicamente activas .
En el Perú existe una fauna ofídica muy variada habiéndose reportado hasta la fecha 47 especies de
serpientes venenosas, de las cuales 24 pertenecen al género Bothrops . Entre ellas se destaca la especie
Bothrops atrox , perteneciente a la familia Viperidae , por ser la causante del 90% de mordeduras, lo cual
ALGUNAS PROPIEDADES CINÉTICAS DE UNA L-AMINOÁCIDO OXIDASA
PURIFICADA DEL VENENO DE LA SERPIENTE PERUANA Bothrops atrox
“JERGÓN”
Nora Ruiz , Christian Solís , Gustavo A. Sandoval , Fanny Lazo , Edith Rodríguez y Armando Yarlequé
constituye un problema de salud pública muy importante . Dentro de los principales componentes del
veneno de B. atrox, estudiado en el Laboratorio de Biología Molecular de la Facultad de Ciencias
Biológicas encontramos a la L-aminoácido oxidasa o L-AO (EC 1.4.3.2), la cual es una flavoproteína
responsable del color amarillo de los venenos y es específica para la desaminación oxidativa de un L-
aminoácido hasta un ácido con la consiguiente producción de amoniaco y peróxido de hidrógeno . Además,
se han aislado y caracterizado otras L-aminoácido oxidasas como las de Lachesis muta y Bothrops brazili.
En cuanto al estudio de L-AO de B. atrox Lazo et al. aislaron y determinaron varias características
bioquímicas de esta enzima, como el peso molecular y la determinación de azúcares asociados. Así, también
se determinó su acción biológica, encontrándose que presenta efecto antimicrobiano in vitro sobre
microorganismos patógenos, efecto in vitro contra promastigotes Leishmania braziliensis braziliensis de y
contra epimastigotes Trypanosoma cruzi,de, además de un marcado efecto edemático . Dado el potencial
biotecnológico de la L-aminoácido oxidasa del veneno de la serpiente de mayor interés médico en Perú,
Bothrops atrox , es necesario evaluar sus principales propiedades cinéticas.
Por lo tanto, el objetivo del presente trabajo fue estudiar experimentalmente la cinética enzimática de esta
L-AO para evaluar el efecto que tiene sobre ella, la naturaleza química de los sustratos, como también
ensayar posibles inhibidores, evaluando el grado y la naturaleza de la interacción, para seleccionar así los
mejores inhibidores candidato lo que permitirá establecer posibles mecanismos de regulación de esta
enzima.
CONCLUSIONES
La presente investigación ha permitido establecer que la L-aminoácido oxidasa del veneno de la serpiente
peruana Bothrops atroxes capaz de hidrolizar diversos L-aminoácidos; siendo más activo sobre los L-
aminoácidos hidrofóbicos y aromáticos. Esta afinidad por determinados sustratos servirá de base para el
diseño de moléculas sintéticas con residuos aromáticos y sustituyentes con carga negativa y positiva que
puedan inhibir esta enzima, reduciendo así sus efectos tóxicos.
AGRADECIMIENTOS
El presente trabajo fue parte de la Tesis de Biólogo con mención en Biología Celular y Genética de la Blga.
Nora Ruiz.Ademas, los autores del presente trabajo agradecen al Consejo Nacional de Ciencia, Tecnología
e Innovación Tecnológica (CONCYTEC) por el apoyo financiero brindado para llevar a cabo esta
investigación (Proyecto PROCYT Nº 161-2006-
CONCYTEC-OAJ).
REFERENCIAS
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3. Carrillo, N. e Icochea, J. Lista taxonómica preliminar de los reptiles vivientes del Perú Publicaciones del
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4. Loja, D., Avilés, R., Necochea, Y., Vilca, M. y Castro, J. Ofidismo . por Bothrops atrox: estudio clínico-
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oxidasa del veneno de la serpiente Bothrops brazili “Jergón shushupe” Rev Peru Biol 1999; 6(1): 75-
84.
RESUMEN
En la presente práctica se realizó conjuntamente con 4 latas las cuales se procedió en 3 de ellas a rasparlas
en el fondo de ellas para poder retirar la capa protectora de estas, una vez que se raspa el metal se expone
y en las 2 primeras una que no está raspada y la otra que si esta raspada, se coloca agua corriente, en las
restantes raspadas se coloca agua salada y en una de las latas que se coloca el agua salada se coloca una
granalla de Zn para poder observar resultados 2 días y 4 días después.
En el segundo día se percibe un olor a podrido como resultado de las reacciones y se observa que las lata
se oxidan en la parte que está raspada con el agua corriente y el agua salada, la lata que no se raspó y esta
con agua corriente esta como al principio, en la lata que se encuentra la granalla esta se encuentra oxidada
en una mínima parte. Al cuarto día el olor casi desaparece y en cada lata excepto en las que no se raspó se
han oxidado con un contorno negro en cada lata. En la lata con la granalla de Zn esta se ha oxidado casi la
mitad del mismo ya que como es metal este reacciona con el agua salada.
ABSTRACT
In the present practice was carried out jointly with 4 cans which you proceeded in 3 of them to rasp them
in the bottom of them to be able to move away the layer protector of these, once the metal is rasped it is
exposed and in 2 cans, the first one that is not rasped and the other one that if this rasped, average water is
placed, in the remaining ones rasped salted water is placed and in one of the cans that the salted water is
placed a shot of Zn it is placed to be able to observe results later 2 days and 4 days.
In the second day a scent is perceived to rotten as a result of the reactions and it is observed that the can is
oxidized in the part that is rasped with the average water and the salted water, the can that was not rasped
and this with water current this I eat at the beginning, in the can that is the shot this it is oxidized in a
minimum part. To the fourth day the scent almost disappears and in each can except in those that it was not
rasped they have been oxidized with a black contour in each can. In the can with the shot of Zn this it has
been oxidized since almost half of the same one like it is metal this it reacts with the salted water.
INTRODUCCIÓN
CORROSIÓN DE METALES.
Se denomina corrosión al proceso de destrucción de los metales y sus aleaciones, provocado por la acción
química o electroquímica.
CORROSIÓN DE LOS METALES - INFORME
PABLO CARRASCO
La corrosión causa un enorme daño a la economía de los países. Esto se manifiesta en la pérdida irreversible
anualmente de millones de toneladas de metales. Por ejemplo, a causa de la corrosión se pierde cerca del
10% de todo el metal ferroso producido.
En una serie de industrias, aparte de las pérdidas, los óxidos de los metales formados como resultado de la
corrosión, impurifican los productos. Para evitarlo se generan gastos adicionales, especialmente en la
industria alimenticia y en la fabricación de reactivos químicamente puros etc.
Naturaleza de la corrosión
La corrosión se subdivide en:
1. Química.
2. Electroquímica.
Corrosión química.
Por corrosión química se entiende la destrucción del metal u otro material por la acción de gases o líquidos
no electrolíticos (gasolina, aceites etc.).
Un ejemplo típico de corrosión química es la oxidación química de metales a altas temperaturas.
En la corrosión química, sobre la superficie del metal se forma una película de óxidos. La solidez de esta
película es diferente para los diferentes metales y aleaciones. En las aleaciones de hierro con carbono, la
película de óxidos es débil, se destruye con facilidad y la oxidación continua realizándose hacia el interior
de la pieza.
En otros metales y aleaciones las películas de óxido son muy resistentes. Por ejemplo, al oxidarse
el aluminio, sobre su superficie se origina una película firme de óxidos que protege el metal contra la
oxidación ulterior.
Corrosión electroquímica.
Se denominan así a los procesos que se desarrollan por acción de electrólitos sobre el metal.
Los procesos electrolíticos pueden ser muy complejos en dependencia de la naturaleza del metal y del
electrólito, pero en general corresponden a una reacción de oxidación -reducción, en la que el metal sufre
un proceso de oxidación y se destruye (se disuelve). Al mismo tiempo el hidrógeno presente en la solución
acuosa se reduce y se desprende oxígeno elemental de la disolución que corroe adicionalmente el metal.
Las aguas naturales que contienen sales, el aire húmedo, las soluciones ácidas, de álcalis o salinas son los
electrólitos más comunes con los que entran en contacto los metales en la práctica.
La tendencia de los metales a ceder a la disolución sus iones, se llama presión de disolución. Cada metal
tiene su propia presión de disolución. A consecuencia de esto, si se colocan diferentes metales dentro de un
mismo electrólito, cada uno adquiere diferente potencial eléctrico y forman pares galvánicos.
En estos pares el metal con potencial más bajo (mayor presión de disolución), pasa a ser él; ánodo y se
destruye, es decir se oxida o pasa a la disolución. El segundo metal con potencial mayor actúa como cátodo
y no se disuelve.
Con esto se explican los procesos que se desarrollan durante la corrosión electroquímica de los metales
técnicos (aleaciones). Al sumergir tal metal en el electrolítico, sus diferentes partes adquieren diferentes
potenciales y como en el interior del metal estos componentes están en corto circuito, entonces este sistema
se puede considerar como un conjunto de múltiple pares galvánicos conectados.
La destrucción del metal comienza desde la superficie del sistema metal-medio y se propaga paulatinamente
dentro del metal.
Tipos de corrosión
Las destrucciones por corrosión pueden dividirse en los siguientes tipos principales:
1. Corrosión uniforme.
2. Corrosión local.
3. Corrosión intercristalina.
Corrosión uniforme.
El metal se destruye en forma uniforme por toda la superficie. Este tipo de corrosión se observa con más
frecuencia en metales puros y en aleaciones del tipo de solución solida homogéneas, dentro de medios muy
agresivos, que impiden la formación de la película protectora.
Corrosión local.
En este caso, la destrucción se produce en algunas regiones de la superficie del metal. La corrosión local
aparece como resultado de la rotura de la capa de protección de óxidos u otra; de los puntos afectados, la
corrosión se propaga al interior del metal. Este tipo de corrosión es más común en aleaciones de múltiples
componentes. Los defectos de la superficie (rasguños, rebabas etc.) favorecen el desarrollo de la corrosión
local.
Corrosión intercristalina.
Se trata de la destrucción del metal o la aleación a lo largo de los límites de los granos. La corrosión se
propaga a gran profundidad sin ocasionar cambios notables en la superficie y por eso puede ser causa de
grandes e imprevistas averías.
Problemática de la Corrosión
Como se dijo en la definición de la Corrosión, ésta se presenta solamente en Metales. Por lo mismo, una de
las mayores problemáticas es que la corrosión afecte principalmente a esta clase de elementos. Ello implica
muchos tipos de problemas, de los cuales la mayoría son bastante serios, a los que nos referiremos más
adelante, ya que primero conviene conocer las diversas clases de corrosión existentes. Aun así,
mencionemos que este proceso en sus variadas formas (dentro de las cuales se puede presentar) va
produciendo un deterioro considerable en las clases de metales que afecta, los cuales con el tiempo, si no
son tratados, inducen a su completa destrucción, lo cual implica también enormes pérdidas económicas y
de producción.
MATERIALES:
4 latas grandes 1 destornillador plano
REACTIVOS:
1 aglomerado de Zn
Solución acuosa de NaCl al 3.5%
PROCEDIMIENTO
Grafico N°1. Corrosión de Metales
Corrosión de
metales
Raspar
Retirar
Preparar
Llenar
Llenar
Llenar
Llenar
Anotar
3 de las 4 latas Una seccion de 5 cm
Revestimiento de estaño Base de hierro
100 ml de soluciónDe NaCl con agua
corriente
Lata sin raspado Agua corriente
Lata con raspado Agua corriente
Lata con raspado Agua salada
Ultima lata raspadaAgua salada + granalla de
Zn
observaciones Durante 5 días
Elaborado por: CARRASCO P, (2014)
Fuente: Laboratorio Química Básica FCIAL
CALCULOS Y RESULTADOS
Primera Lata:
𝐹𝑒(𝑠) + 𝐻2𝑂(𝑙) → 𝐹𝑒𝑂 + 𝐻2 (𝑔)
No muestra oxidación visible, esta existe si se observa en un microscopio, la reacción espontánea es entre
el Fe y el O que forma en FeO
Segunda Lata:
𝐹𝑒(𝑠) + 𝐻2𝑂(𝑙) → 𝐹𝑒𝑂 + 𝐻2 (𝑔)
La oxidación del Fe es más visible ya que la velocidad de esta reacción es más violenta, la reacción
espontánea es la misma que en la primera lata con la diferencia de que esta es más rápida
Tercera Lata:
𝐹𝑒(𝑠) + 𝑁𝑎𝐶𝑙(𝑎𝑐) → 𝐹𝑒𝐶𝑙 + 𝑁𝑎+ (𝑔)
La producción del FeCl hace que se oxide con la ayuda de la solución acuosa la cual producirá que iones
Na+ en la solución final, la reacción espontánea es entre el Fe y el NaCl para producir FeCl rápidamente.
Cuarta Lata:
𝐹𝑒(𝑠) + 4𝑁𝑎𝐶𝑙(𝑎𝑐) + 𝑍𝑛(𝑠) → 𝐹𝑒𝐶𝑙2 + 𝑍𝑛𝐶𝑙2 + 4𝑁𝑎+ (𝑔)
La reacción entre el Fe y Zn ocurre gracias a la ayuda del NaCl y por ello se oxida, la reacción espontánea
ocurre entre el Fe y el NaCl para producir FeCl e iones Na+
Tabla No. 1 Cambios en las latas con relación a los días
Día
No. Lata
Lunes Miércoles Viernes
1ra. Lata Agua Corriente Presencia de Burbujas
en la lata
Presencia de burbujas
no hay mayor cambio
2da. Lata Raspado con agua
corriente
Se oxida en la parte
raspada presencia de
oxígeno con bordes
negros alrededor del
óxido
Aumento de oxidación
con aumento de bordes
negros en la oxidación
3ra. Lata Raspado con agua
salina
Mayor oxidación, el
agua cambia de color
Mínimo cambio en la
oxidación, agua con
mayor color
4ta. Lata Raspado con agua
salina y granalla de Zn
Óxido en poca
presencia y en la
granalla de Zn u poco
óxido
Aumento de oxidación
en la parte raspada y el
la granalla de Zn
Elaborado por: CARRASCO P, (2014)
Fuente: Laboratorio Química Básica FCIAL
DISCUSIÓN:
En la práctica durante el cambio de días los resultados variaron en las latas que estaban raspadas esto es
porque al momento de rasparlo se expone el Fe a los cambios que puede ejercer la naturaleza en él. Como
observamos los cambios en el agua ya sean salada o corriente ya que estas tienen electrolitos los cuales
cambian las características del metal, ya sea oxidándolo o dañándolo.
En la práctica mientras pasaban los días se podían ver las reacciones que sucedían y como se oxidaba el
metal, en el transcurso de los días el óxido que era presente en las latas obtenía un contorno negro a causa
del oxígeno que reaccionaba y formaba el FeO.
En la lata que no estaba raspada y se colocó agua común y solo se observó que en los días siguientes solo
hay presencia de burbujas a causa de que el H en forma de gas se desprende del O y este último se unía con
el Fe y se oxidaba pero como el Fe estaba cubierto por una capa de Sn, este no se podía oxidar y observar
pero si se analizaba en un microscopio habría una pequeña posibilidad de encontrar moléculas de oxidación.
CUESTIONARIO:
1.- Explique el papel de las soluciones salinas en el proceso de corrosión
Las aguas naturales que contienen sales, el aire húmedo, las soluciones ácidas, de álcalis o salinas son los
electrólitos más comunes con los que entran en contacto los metales en la práctica.
La tendencia de los metales a ceder a la disolución sus iones, se llama presión de disolución. Cada metal
tiene su propia presión de disolución. A consecuencia de esto, si se colocan diferentes metales dentro de un
mismo electrólito, cada uno adquiere diferente potencial eléctrico y forman pares galvánicos.
En estos pares el metal con potencial más bajo (mayor presión de disolución), pasa a ser él ; ánodo y se
destruye, es decir se oxida o pasa a la disolución. El segundo metal con potencial mayor actúa como cátodo
y no se disuelve. (SABELOTODO.ORG, 2013)
2.- Explique en qué consiste la protección catódica
La protección catódica es un método electroquímico cada vez más utilizado hoy en día, el cual aprovecha
el mismo principio electroquímico de la corrosión, transportando un gran cátodo a una estructura metálica,
ya sea que se encuentre enterrada o sumergida. Para este fin será necesario la utilización de fuentes de
energía externa mediante el empleo de ánodos galvánicos, que difunden la corriente suministrada por un
transformador-rectificador de corriente. (GARCÍA, 2010)
3.- Enuncie tres métodos empleados para evitar la corrosión
1. Utilice acero inoxidable en lugar de acero normal. Acero inoxidable es acero normal mezclado
con otros metales como níquel y cromo. Sin embargo, el coste del acero inoxidable hace que éste
no sea práctico para un uso diario, excepto para pequeños elementos de ajuste como pernos y
tuercas.
2. Pinte el acero normal con pinturas especiales. El pintar el acero utilizando pinturas especiales es
el método más común de proteger grandes estructuras de acero. Las superficies que se van a pintar
se deberán limpiar cuidadosamente con un cepillo de acero (o preferiblemente mediante un chorro
de arena). La capa inferior deberá consistir en un imprimador basado en zinc. La segunda y tercera
capas deberán consistir en una pintura de epoxi sobre base de brea.
3. Proteja el acero con ánodos de zinc (protección catódica). Los ánodos de zinc se utilizan para
prolongar más aún la vida útil de estructuras de acero sumergidas en agua del mar como, por
ejemplo, pilones de acero, pontones, flotadores metálicos, etc. Los elementos de aluminio, en
contacto con acero húmedo, quedan expuestos también a la corrosión galvánica. (FAO.ORG,2008)
CONCLUSIONES:
Se identificaron las diferentes reacciones que ocurrieron en las diferentes latas durante los 5 días
del experimento
Se pudo comparar las reacciones que ocurren al momento de que ocurre la corrosión en cada lata
Se establecieron las características de cada reacción de corrosión de las latas del experimento
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http://www.nervion.com.mx/web/conocimientos/corrosion.php, 05 de Julio de 2014
SABELOTODO.ORG (2013). Corrosión de metales. Disponible en:
http://www.sabelotodo.org/metalurgia/corrosion.html, 05 de Julio de 2014
NERVIÓN (2012). Tipos de corrosión. Disponible en:
http://www.nervion.com.mx/web/conocimientos/tipos_corrosion.php, 05 de Julio de 2014
FAO.ORG. (2008). Como evitar la corrosión. Disponible en:
http://www.fao.org/docrep/003/v5270s/v5270s08.htm, 05 de Julio de 2014
REVISTA CIENTÍFICA -
BIOQUÍMICA
Universidad Técnica de Ambato
Facultad de Ciencia e Ingeniería en Alimentos
Carrera de Ingeniería Bioquímica
Pablo Carrasco Velástegui