revista mexicana de ngeniería - scielo · aspergillus oryzae para utilizarlas en la preparacion´...

Revista Mexicana de Ingeniería Química

CONTENIDO

Volumen 8, número 3, 2009 / Volume 8, number 3, 2009

213 Derivation and application of the Stefan-Maxwell equations

(Desarrollo y aplicación de las ecuaciones de Stefan-Maxwell)

Stephen Whitaker

Biotecnología / Biotechnology

245 Modelado de la biodegradación en biorreactores de lodos de hidrocarburos totales del petróleo

intemperizados en suelos y sedimentos

(Biodegradation modeling of sludge bioreactors of total petroleum hydrocarbons weathering in soil

and sediments)

S.A. Medina-Moreno, S. Huerta-Ochoa, C.A. Lucho-Constantino, L. Aguilera-Vázquez, A. Jiménez-

González y M. Gutiérrez-Rojas

259 Crecimiento, sobrevivencia y adaptación de Bifidobacterium infantis a condiciones ácidas

(Growth, survival and adaptation of Bifidobacterium infantis to acidic conditions)

L. Mayorga-Reyes, P. Bustamante-Camilo, A. Gutiérrez-Nava, E. Barranco-Florido y A. Azaola-

Espinosa

265 Statistical approach to optimization of ethanol fermentation by Saccharomyces cerevisiae in the

presence of Valfor® zeolite NaA

(Optimización estadística de la fermentación etanólica de Saccharomyces cerevisiae en presencia de

zeolita Valfor® zeolite NaA)

G. Inei-Shizukawa, H. A. Velasco-Bedrán, G. F. Gutiérrez-López and H. Hernández-Sánchez

Ingeniería de procesos / Process engineering

271 Localización de una planta industrial: Revisión crítica y adecuación de los criterios empleados en

esta decisión

(Plant site selection: Critical review and adequation criteria used in this decision)

J.R. Medina, R.L. Romero y G.A. Pérez

Vol. 12, No. 3 (2013) 513-525

XYLANOLYTIC SYSTEM PROTEINS DESORPTION FROM Aspergillus flavipesFP-500 CULTURES WITH AGROWASTES

DESORCION DE PROTEINAS DEL SISTEMA XILANOLITICO DE Aspergillus flavipesFP-500 PRODUCIDAS EN CULTIVOS CON RESIDUOS AGRO-INDUSTRIALES

L.R. Torres-Barajas y G. Aguilar-Osorio∗

Departamento de Alimentos y Biotecnologıa. Conjunto E, Facultad de Quımica. Universidad Nacional Autonomade Mexico (UNAM). Ciudad Universitaria. 04510 Coyoacan, Mexico D.F. Mexico.

Recibido 22 de Febrero de 2013; Aceptado 8 de Mayo de 2013

ResumenLas enzimas degradadoras de carbohidratos que los hongos del genero Aspergillus son capaces de producir, hancobrado gran interes debido, entre otras cosas, a su aplicacion en los procesos de obtencion de etanol a partirde materias primas de bajo costo, como los residuos agroindustriales. Buena parte de las proteınas del sistemaxilanolıtico secretadas durante el cultivo de Aspergillus flavipes FP-500 en olote de maız son adsorbidas en el solidoresidual, a diferencia de las que se producen en cultivos con salvado de trigo, donde practicamente no se adsorben.La recuperacion de proteınas con soluciones de lavado a partir de ambos residuos indica que el incremento del pHfavorece la desorcion de las proteınas. Ası mismo, la adsorcion de las proteınas del sistema xilanolıtico es masselectiva en salvado de trigo que en olote de maız y puede verse influenciada por mas de un mecanismo, ya queademas de la adsorcion debida a la interaccion aleatoria de las proteınas con la superficie de los residuos, estastambien podrıan establecer interacciones especıficas con ciertas regiones expuestas de los polisacaridos debidos a lapresencia de dominios de union a carbohidrato en la secuencia de algunas de las proteınas involucradas.

Palabras clave: xilanasas, olote de maız, proteına, desorcion, Aspergillus.

AbstractCarbohydrate degrading enzymes produced by fungus such as Aspergillus are interesting due to its application intoprocess of ethanol production using cheap materials such as agro-wastes. Proteins of xylanolytic system which aresecreted during Aspergillus flavipes FP-500 culture with corn cobs as a carbon source, are adsorbed in the solidmatrix of cobs unlike wheat bran in which virtually are non-absorbed. Recovery of proteins with washing solutionsfrom both agro-wastes and protein sequences of some of these proteins shows: that increase of pH improves proteindesorption, adsorption of xylanolytic system proteins is pretty much selective in wheat bran than in corn cobs and theadsorption of that proteins could be influenced by random interaction between protein and polysaccharide surface aswell as specific interactions of proteins with polysaccharides by carbohydrate binding domains of certain involvedproteins.

Keywords: xylanases, corn cobs, protein, desorption, Aspergillus.

1 Introduccion

Los hongos son un grupo de microorganismos conun impacto importante en la actividad humana.Particularmente, los hongos filamentosos secretan unagran variedad de proteınas de interes biologico con

aplicaciones muy diversas (Ng, 2004).Aspergillus es un genero que ha sido clave en el

desarrollo de la biotecnologıa moderna, debido a ladiversidad de enzimas que es capaz de secretar y eluso que se le ha dado a las mismas.

∗Autor para la correspondencia. E-mail: [email protected]

Publicado por la Academia Mexicana de Investigacion y Docencia en Ingenierıa Quımica A.C. 513

Torres-Barajas y Aguilar-Osorio/ Revista Mexicana de Ingenierıa Quımica Vol. 12, No. 3 (2013) 513-525

En 1894, Jokichi Takamine realizo estudios condiastasas (hoy conocidas como amilasas) deAspergillus oryzae para utilizarlas en la preparacionde alimentos de la cocina tradicional japonesa. Apartir de entonces, diversas cepas de Aspergillus hansido empleadas en una gran variedad de procesos,(Flores y col., 2011); como la produccion de acidocıtrico por parte de Aspergillus niger o la obtencionde farmacos como mevalonina y acido itaconico porparte de Aspergillus terreus (Benet, 1998).

En 2009 el mercado de enzimas de interesindustrial alcanzo una demanda que esta cerca delos 5.1 billones de dolares (Arora y col., 2009). Lasenzimas con actividad sobre la pared celular vegetalson un grupo que ha captado fuertemente la atencion,debido a su aplicacion en una amplia gama de procesosindustriales. Particularmente las xilanasas se empleanen procesos de clarificacion de jugos, elaboracion dedetergentes, blanqueo de pulpa Kraft y recientementeen la conversion de materiales lignocelulosicos acombustibles (Arora y col. 2009).

La necesidad de producir a gran escala y bajo costoeste tipo de enzimas genero la busqueda de materialeseconomicos que funcionaran como medios de cultivopara los organismos productores de estas enzimas.Diversos residuos agro-industriales poco valoradoshasta ahora han sido utilizados para diversos fines(Bolio y col., 2011) y como una alternativa viablefrente al uso de cereales utilizados anteriormente comofuentes de carbono en cultivos de microorganismos(Goncalves y col. 2010; Kadam y Mc Millan, 2003).Se estima que en los Estados Unidos de Norteamericase generan anualmente cerca de 500 millones detoneladas de estos residuos, por lo que su abundancialos convierte en una opcion muy rentable paradisminuir los costos de produccion de enzimas.

Se sabe que la invasion de los hongos en este tipode residuos agroindustriales favorece el crecimientosuperficial del micelio y la facil recuperacionde los productos de cultivo utilizando solucionestamponadas (Nigam y Pandey, 2009). Sin embargo,estos materiales poseen la capacidad de adsorberdistintos tipos de moleculas, entre las que seencuentran las proteınas gracias a la exposicionde grupos carboxilos y grupos fenolicos presentesen los polisacaridos ası como en la lignina de lapared celular vegetal. Dada la composicion definida;es decir el porcentaje de celulosa, hemicelulosa,lignina y demas componentes polimericos de losresiduos, estos pueden poseer distinta capacidad deadsorcion, que a su vez es susceptible a modificacionpor medio de mecanismos de deslignificacion,

esterificacion o hidrolisis (Demirbas, 2008). Sin duda,esta caracterıstica representa un problema durantela recuperacion de enzimas producidas cuando seutilizan residuos agroindustriales en los cultivos dehongos productores de enzimas lignocelulosicas.

El presente trabajo tiene como objetivo demostrarque una parte importante de las proteınas producidasdurante los cultivos de Aspergillus flavipes FP-500 sonadsorbidas en los residuos agroindustriales utilizadoscomo fuentes de carbono y que esta capacidad varıade acuerdo con el tipo de residuo empleado. Ademas,senalar que la retencion de estas proteınas podrıa estarsujeta no solo a mecanismos de adsorcion debida ainteracciones aleatorias entre el solido y las proteınas,sino a uniones especıficas debidas a la presencia dedominios de union a carbohidratos.

2 Materiales y metodos

2.1 Cultivo de A. flavipes FP-500 yseleccion de condiciones de lavadode olote de maız y salvado de trigoresidual.

Se obtuvieron cultivos de A. flavipes FP-500 en mediolıquido utilizando 100 mL de medio basal (K2HPO40.2 %, K2HPO4 0.2%, (NH4)2SO4 0.5 %) con olote demaız y salvado de trigo 1% en matraces Erlenmeyerde 500 mL. Cada cultivo tuvo una duracion de 64 h yse mantuvo a 37◦C con agitacion orbital de 200 rpmcon un inoculo de 106 esp/mL. Al cabo del tiempode cultivo se separaron los solidos residuales (olote osalvado+ biomasa) y el lıquido por filtracion con papelfiltro Whatman No. 1. Los solidos fueron divididos entres partes, cada una lavada tres veces con una soluciondiferente: buffer PBS pH = 6.8 (NaCl 136 mM, KCl2.68 mM, Na2HPO4·7H2O 4.29 mM, KH2PO41.47mM), solucion 1M NaCl y buffer de extraccion(Buffer de fosfatos 50 mM, pH 7.5, MgCl 5 mM, β-mercaptoetanol 5mM, EDTA1.71 mM). Se utilizo lamisma muestra de solidos de olote de maız y salvadode trigo en cada desorcion ya fuera para la sucesion detres o cuando el numero de desorciones se extendioa diez. Durante cada desorcion, los solidos fueronagitados por inversion de los tubos de centrıfuga en losque fueron depositados y posteriormente el volumende solucion de lavado fue colectado para realizarlas determinaciones correspondientes de proteına yactividad xilanolıtica. Una alıcuota de la solucionrecuperada despues de cada desorcion fue empleadapara la obtencion del SDS-PAGE correspondiente. Al

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cultivo lıquido filtrado y libre de celulas antes citado sele denominara cultivo lıquido a lo largo de este texto,para diferenciarlo de la proteına desorbida por mediodel lavado de los solidos residuales.

2.2 Determinacion de proteına

La proteına desorbida, ası como la del cultivolıquido se cuantifico utilizando el reactivo deBradford (Sigma-Aldrich Co L.L.C St. Louis Mo);determinando el cambio de absorbancia de lasmuestras a 595 nm. Se uso una curva estandar de suerode albumina bovina (BSA) (Sigma-Aldrich Co L.L.CSt. Louis Mo) utilizando un espectrofotometro Variande doble haz UV-Vis Cary 50.

2.3 Determinacion de actividad xilanolıtica

La actividad xilanolıtica de la proteına desorbida, asıcomo en el cultivo lıquido se determino mediante elcambio de absorbancia de las muestras a 575 nmutilizando la tecnica de azucares reductores descrita(Miller, 1959). Se utilizo una curva estandar de xilosay se empleo el mismo espectrofotometro citado en elapartado anterior. Una unidad de actividad xilanolıticase define como la cantidad necesaria de enzima que serequiere para liberar 1 µmol de sustrato por mL en 20minutos de reaccion.

2.4 Analisis de integridad del micelio

Se analizo la integridad del micelio por microscopıaconfocal. Se colectaron muestras de olote residual delcultivo de A. flavipes FP 500 sometidas a una serie de5 lavados con buffer PBS y muestras del mismo sinlavar. Se utilizo un microscopio confocal de escaneolaser Olympus Fluoview FV-1000.

2.5 Efecto del pH en la desorcion deproteınas en olote de maız residual

Se tomaron alıcuotas del cultivo de A. flavipes FP500 en olote de maız con una cantidad de solidoequivalente a 0.21 g/peso seco y se colocaron en tubosde centrıfuga. A cada alıcuota le fue ajustado el pHin situ para alcanzar valores de 2, 4, 6, 8 y 10, conexcepcion de un control al que se le mantuvo con el pHfinal del medio de cultivo. Los tubos se agitaron porinversion durante 5 minutos y posteriormente el solidofue retirado por centrifugacion y al sobrenadante lefue determinada la cantidad de proteına y actividadxilanolıtica.

2.6 Obtencion de SDS-PAGE

Las alıcuotas provenientes de la proteına desorbidafueron precipitadas dentro de un bano de hieloutilizando una solucion 10% de acido tricloroacetico(TCA) en acetona y 0.07% de β-mercaptoetanol(Sigma-Aldrich Co L.L.C St. Louis Mo). Elprecipitado se recupero centrifugando las muestrasa 14,000 rpm y posteriormente fue lavado tres vecesutilizando una solucion de acetona y 0.07% de β-mercaptoetanol. La acetona residual se dejo evaporarhasta sequedad. El precipitado se re suspendio en unasolucion 0.1 N de NaOH y se mezclo con buffer decarga para su separacion en geles de acrilamida 15%de acuerdo con el protocolo de Laemmli (1970). Lasmuestras de proteına del cultivo lıquido obtenidastanto a partir de los cultivos en olote como ensalvado tambien fueron precipitadas por el mismometodo. Ademas se obtuvo un zimograma de actividadxilanolıtica en SDS-PAGE 15% tenido con rojo Congoa partir de las muestras de proteına sin precipitarprovenientes del cultivo lıquido en olote de maız.

2.7 ESI-MS/MS y analisis de los peptidos

Las tres bandas seleccionadas a partir del SDS-PAGE15% con muestras de proteınas del cultivo lıquidode A. flavipes FP-500 fueron escindidas del gel yseparadas por cromatografıa lıquida de alta resolucionacoplada a espectrometrıa de masas (Electrospray LC-ESI-MS/MS) utilizando un equipo LTQ orbitrap deTermo (Thermo Electron Corporation, MA, USA). Laidentificacion de las secuencias obtenidas se realizopor alineamiento con otras secuencias de enzimasglucosido hidrolasas publicamente disponibles en lasbases de datos del NCBI y Uniprot utilizando elsoftware BLASTp y CLUSTALW. Ası mismo, serealizo la busqueda de dominios de proteına en lassecuencias que mayor similitud mostraron con lospeptidos hallados; utilizando la base de datos dedominios conservados CDD del NCBI.

3 Resultados y discusion

3.1 Retencion de proteına en olote de maızy salvado de trigo residual de loscultivos de A. flavipes FP-500

Durante la recuperacion de proteına secretada enlos cultivos lıquidos de A. flavipes en olote de maızse observo que la concentracion de esta presentaba

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Tabla 1. Concentracion de proteına y actividad xilanolıtica. Desorcion de proteına con tres soluciones delavado a partir olote y salvado residual de los cultivos de A. flavipes FP-500

Olote de maız Salvado de trigoSolucion de Proteına Actividad Actividad especıfica Proteına Actividad Actividad especıfica

lavado µg/g‡ U/g‡ (U/µg) µg/g‡ U/g‡ (U/µg)

Buffer PBS 1367 ± 1 1018 ± 7 0.74 79 ± 1 74 ± 1 0.93NaCl 1M 1234 ± 15 864 ± 6 0.7 < 5µgU 57 ± 3 —

Buffer de Extraccion 624 ± 39 767 ± 13 1.22 < 5µgU 75 ± 1 —-‡Proteına y unidades de actividad xilanolıtica determinadas por gramo en peso seco de olote de maız residualU Sensibilidad del metodo de determinacion de proteına (Bradford, 1976)

valores promedio de 159 ± 63 µg/mL, aun cuandose utilizaba la misma concentracion de inoculo,fuente de carbono y volumen de medio de cultivoy fueron sometidas a tratamientos identicos antesde la determinacion de proteına. No obstante, estavariacion tan grande no se observaba en los cultivoslıquidos de A. flavipes con salvado de trigo, enlos que se obtenıan concentraciones de proteına de81± 12 µg/mL. Gracias a experimentos adicionalesrealizados en xilano de abedul (datos no mostrados)se identifico que los solidos residuales de los cultivoseran capaces de retener buena parte de la proteınaque se secretaba durante el cultivo, dando lugar alas grandes variaciones detectadas. Con el fin deobtener un metodo que permitiera la recuperacionde la proteına adsorbida en el solido residual, seseleccionaron tres condiciones de lavado. En cadauna se determino la cantidad de proteına y actividadxilanolıtica recuperada y se obtuvo el perfil deproteınas resultante en cada condicion. La Tabla 1muestra los valores de proteına, actividad xilanolıticay actividad especıfica calculada a partir de los valoresde proteına y actividad referidos a los lavados de olotede maız y salvado de trigo residual de los cultivos de A.flavipes FP-500 con buffer PBS, solucion 1M de NaCly buffer de extraccion respectivamente.

Los resultados muestran que tanto en olote de maızcomo en salvado de trigo residual se obtiene mayorrecuperacion de proteına y actividad xilanolıticacuando se utiliza buffer PBS. El uso de solucionsalina disminuye ligeramente la cantidad de proteınarecuperada en olote de maız y reduce aun mas losvalores de actividad xilanolıtica. En salvado de trigose reduce tanto la cantidad de proteına como deactividad. Por otra parte, el uso de buffer de extraccionen olote de maız residual no solo reduce de maneraimportante la recuperacion de proteına, sino tambienla actividad xilanolıtica, mientras que en salvado detrigo a pesar de que la concentracion de proteına

Figura 1.

kDa

M 1 2 3

31.0

97.4

45.0

14.4

6. 5

Fig. 1. SDS-PAGE de la proteına desorbida a partirdel olote residual del cultivo de A. flavipes FP-500,lavando con 1) Buffer PBS, 2) Solucion 1M NaCl, 3)Buffer de Extraccion.

recuperada es sumamente baja, los niveles de actividadno poseen diferencia con respecto a los observadosen buffer PBS. Sin embargo, en general se apreciaque la cantidad de proteına desorbida a partir de olotede maız residual es considerablemente mayor a laque se recupera a partir de salvado de trigo, puesla concentracion de proteına recuperada por gramode solido es mınima. La Fig. 1, muestra el perfil deproteınas en SDS-PAGE obtenido a partir del lavadode olote residual del cultivo de A. flavipes FP- 500 encada una de las soluciones de lavado. Los perfiles deproteına muestran que utilizando buffer PBS se obtuvoun mayor numero de bandas que se distribuyen a lolargo de todos los pesos moleculares a comparacionde la solucion de NaCl en la que se observaron menosbandas y estas se encuentran mayoritariamente en

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pesos moleculares entre 45 y 97 KDa. El buffer deextraccion mostro un patron de proteınas semejanteal observado en PBS, aunque es menos efectivo en larecuperacion cuantitativa de proteına.

Las soluciones de lavado se seleccionaron con elfin de aumentar la fuerza ionica mediante la adicionde una sal y un agente desnaturalizante (NaCl yβ-mercaptoetanol respectivamente) para modificar laconformacion de las proteınas y favorecer ası ladesorcion de las mismas. Estos criterios han sidoampliamente utilizados en el diseno de estrategiasde purificacion de proteınas (Feramisco y Burridge1980). Cuando se obtuvo la actividad especıfica delas proteınas desorbidas a partir de ambos solidosresiduales con cada solucion de desorcion (Tabla 1),se observa que la actividad especıfica de la proteınadesorbida a partir de olote de maız con buffer PBS yNaCl es muy semejante (0.74 y 0.70 respectivamente),mientras que la observada en buffer de extraccion es de1.22. Esto indica que con menos proteına se recuperamayor actividad xilanolıtica, es decir, que la desorcionde proteınas en buffer de extraccion es selectivaa las proteınas con actividad xilanolıtica, mientrasque tanto PBS como NaCl, desorben todo tipo deproteına secretada durante el cultivo. Sin embargo, elβ-mercaptoetanol presente en el buffer de extraccion,es un agente desnaturalizante, por lo que reduceconsiderablemente la actividad xilanolıtica despues dela exposicion prolongada incluso si este compuesto eseliminado por dialisis. Por otra parte, en salvado detrigo la concentracion de proteına determinada en lasoluciones de NaCl y buffer de extraccion esta pordebajo de la sensibilidad del metodo, por lo que laactividad especıfica no fue calculada salvo para elbuffer buffer PBS con el que se obtuvo un valor de0.93. Por tales razones, para continuar los estudios dedesorcion se utilizo buffer PBS.

Para asegurar que la proteına determinada se debıaexclusivamente a la desorcion de la misma a partirdel solido y no a la liberacion de proteına intracelulardebida al rompimiento del micelio; se realizaronlavados sucesivos al olote de maız residual del cultivode A. flavipes FP-500 y se analizo la integridad delmicelio. La Fig. 2 muestra la sucesion de imagenesobtenidas de A. flavipes FP-500 cultivado en olotede maız obtenidas por microscopıa confocal. Lasmuestras fueron: a) Control no lavado, b) y c) lavadocon buffer PBS. Las imagenes muestran integridad delmicelio semejante en ambas condiciones. A pesar deque la longitud de las hifas puede variar en funciondel estadio de crecimiento, no se observo falta deproporcion entre la longitud de las mismas o detalles

a)

b)

c)

Figura 2 Fig. 2. Fotografıas de microscopıa confocal quemuestran la integridad del micelio de A. flavipes FP-500 a) micelio sin lavar, b) y c) micelio lavado conPBS.

que revelen un dano importante ni liberacion deproteına intracelular, que es un criterio importante paraasegurar que toda la proteına determinada despues decada desorcion se debiera unicamente a la proteınasecretada.

3.2 Retencion de proteına y actividadxilanolıtica en olote de maız y salvadode trigo residual de los cultivos de A.flavipes FP-500

Con el fin de analizar el numero de desorcionesnecesarias para recuperar la mayor parte de la proteınaadsorbida en ambos residuos, se extendio la sucesionde lavados realizados con buffer PBS hasta un numerode diez. La Fig. 3a muestra los valores de proteına yactividad xilanolıtica determinados a las muestras deproteına extraıda a partir de olote de maız residualdespues de cada desorcion. La proteına recuperadaposee un patron irregular hasta el lavado numerosiete, valor despues del cual comienza a decrecer. Laactividad por otra parte posee la tendencia a disminuir.La Fig. 3b muestra los valores de proteına y actividadacumulada, ası como el ajuste de ambas curvas, enlas que se observa que la recuperacion de proteına seajusta a un modelo polinomial de segundo grado.

De acuerdo con la prediccion de este ajuste, serequieren hasta 44 lavados para que el nivel de proteınatotal recuperada a partir del solido alcance su valormaximo. Mientras que la curva de actividad se ajustamas a un modelo logarıtmico; este predice que elnumero de lavados necesarios para desorber toda laproteına con actividad xilanolıtica se extiende hastaun numero infinito. La Fig. 4 muestra el SDS-PAGEde: a) proteına obtenida a partir de los lavados 1-9de olote residual, E corresponde al perfil de proteınas

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Figura 3

a)

b) c)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

0

5000

10000

15000

20000

Proteina

Actividad

Polynomial Fit of Proteina

Desorcion

0

4000

8000

12000

Pro

tein

a (g

/g)

Activid

ad

(U

/g)y=-27x

2+2382x-261.8

R2=0.9999

y=2409 lnx+ 802

R2=0.983

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

0

50

100

150

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Pro

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a (g

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Activid

ad

(U

/g)

P

rote

ina

(g

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R2=0.9999

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R2=0.983

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

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Activid

ad

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Desorcion

Proteina

Actividad

Fig. 3. Secuencia de desorcion de proteına a partirdel olote residual del cultivo de A. flavipes FP-500a) Proteına y Actividad xilanolıtica determinada encada desorcion, b) Proteına y actividad xilanolıticaaditiva en olote de maız. c) Secuencia de desorcion deproteına y actividad xilanolıtica aditiva en salvado detrigo.

200

116

45

31

21

1 2 3 4 5 6 7 8 9M

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200

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14.4

66.2

31

M 1 2 3 4 5 6 7 8

b)

EkDa

kDa

Figura 4.

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1 2 3 4 5 6 7 8 9M

a)

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14.4

66.2

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M 1 2 3 4 5 6 7 8

b)

EkDa

kDa

Figura 4.

Fig. 4. SDS-PAGE de la desorcion de proteına a partirde olote de maız residual del cultivo de A. flavipesFP-500; a) Lıneas de 1 a 9, proteına desorbida; lıneaM, marcadores de masa molecular y lınea E, proteınasecretada en el cultivo lıquido. b) Lıneas 1-8, proteınadesorbida a partir de salvado de trigo residual.

obtenido a partir del cultivo lıquido. Adicionalmentese determino la concentracion de proteına que sedesorbe a partir de los lavados de un medio decultivo con 1% de olote de maız sin inoculo y seobtuvo el SDS-PAGE del mismo que se muestra en laFig. 1A (material adicional). Los valores de proteınadeterminados (5.00 ± 0.45 µg/g de solido), ası como elSDS-PAGE correspondiente indican que la desorcionde proteına a partir de la matriz del solido sin inoculoes mınima debido a que no hay proteına y que aquellaque es desorbida a partir del olote de maız residualproviene exclusivamente de la que es secretada porA. flavipes. La intensidad de las bandas se asociacon una mayor concentracion de proteınas; en loscarriles correspondientes a los lavados 4 y 7 de la Fig.4a, se observan incrementos en la intensidad total delas bandas, que coinciden tambien con un maximode proteına en la curva de la Fig. 3a antes descrita.Los resultados muestran que el perfil obtenido conla proteına desorbida es muy semejante al que seobtiene a partir del cultivo lıquido; lo que indica quela proteına desorbida proviene unicamente de la que sesecreta durante el cultivo.

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Tabla 2. Comparacion de los valores de proteına y actividad obtenidos a partir dela proteına desorbida de olote de maız y salvado de trigo residual de los cultivos

de A. flavipes FP-500

Muestra Proteına Actividad Actividad Especıfica(µg/g)U (U/g)U (U/µg)

Olote de maız 12,410 ± 14 13,117± 5 1.056(cultivo lıquido)

Proteına desorbida a partir 20,714 ± 141 6,159 ± 6 0.29de Olote de maız ‡

Salvado de trigo 8927 ± 7 6513 ± 5 0.729(cultivo lıquido)

Proteına desorbida a partir 38 ± 5 112 ±1 2.94de Salvado de trigo‡

‡ Suma de los valores de proteına y actividad de los 10 lavadosU Proteına y unidades de actividad determinadas por gramo en peso seco de residuo

Cuando se realizo este mismo analisis a la proteınadesorbida a partir de salvado de trigo residual y secomparo con los datos obtenidos en olote de maız;el resultado fue muy distinto. La Fig. 3c) muestralos valores de proteına y actividad acumulada, ambosdeterminados a partir de salvado de trigo residual. Enesta se observa que durante las primeras desorcionesse recupera la totalidad de la proteına adsorbida enel material, ya que en las desorciones sucesivas nose observa ningun cambio. La Tabla 2 por otra parte,presenta los valores de proteına y actividad xilanolıticadeterminados tanto en el cultivo lıquido como a lasuma de las diez desorciones realizadas en olotede maız y salvado de trigo residual, ası como laactividad especıfica calculada a partir de estos valores.Al comparar la proteına determinada en el caldo decultivo y la recuperada a partir de las desorcionesde olote de maız residual, se observa una cantidadimportante de proteına y actividad xilanolıtica quees retenida en el solido. Se calculo que la proteınaestimada al final de las diez desorciones era 1.66 vecesmayor que la toda la proteına que se recupero en elcaldo de cultivo. Esto indico que casi dos terceraspartes de la proteına total secretada por el hongo esretenida en la matriz solida del olote y no puede serrecuperada a menos que se emplee un medio adecuadopara hacerlo. Cuando se realizo el mismo analisis ensalvado de trigo y se compararon los valores de laproteına recuperada a partir del cultivo lıquido contralos de proteına desorbida; se encontro que la proteınarecuperada en el cultivo lıquido es 234 veces mayorque la que se desorbio a partir del solido. La actividadxilanolıtica tambien es mucho mayor en el cultivolıquido que la desorbida a partir del solido residual,

lo que indica que la proteına y actividad retenidaen salvado de trigo no alcanzo valores importantes.En la Fig.4b se muestra el SDS-PAGE obtenido conproteına desorbida a partir de salvado de trigo residualdel cultivo de A. flavipes FP-500. A excepcion de unpequeno grupo de bandas que se observan, la cantidadde proteına que fue retenida en salvado de trigo esinsignificante. Sin embargo, cuando se compararonlas actividades especıficas de los caldos de cultivo yla proteına desorbida a partir de ambos residuos, sedetermino que en el caldo que proviene del cultivoen olote se obtiene mayor actividad especıfica conrespecto a la proteına desorbida a partir del solidoresidual, es decir; hay mas proteınas con actividadxilanolıtica en el caldo de cultivo que en la proteınaque se desorbe. Mientras que en salvado de trigo, laactividad especıfica de la proteına que se desorbe esmuy alta, lo que indica que a pesar de que es muy pocala proteına que puede adsorberse en salvado, la mayorparte de ella posee actividad xilanolıtica, lo que indicaque la selectividad de estas proteınas a unirse a algunode los solidos es mayor para salvado de trigo.

La hemicelulosa tiene una presencia importante enla composicion de ambos residuos, ya que representacerca del 42% del peso total del olote de maız yapenas el 25% en salvado de trigo. La presencia dealmidon es menor en olote de maız que en salvadode trigo, no ası celulosa, que tiene una presenciamayor en olote de maız como se muestra en latabla A1 (material adicional). La composicion delsalvado es mas heterogenea que la de olote, constituidamayoritariamente por celulosa y hemicelulosa.

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Tabla 3. Comparacion de la proteına yactividad desorbidas a diferentes valores de

pH de las muestras de olote de maız y salvadode trigo residual de los cultivos de A. flavipes

FP-500

pH Proteına Actividad(µg/g)U (U/g)U

Control ‡ < 5µg£ 1849 ± 72 < 5µg£ 1942 ± 24 < 5µg£ 1890 ± 16 420 ± 5 1945 ± 38 497 ±3 1854 ± 1

10 2463 ±3 1871± 1‡ Control= Posee el pH del medio de cultivo= 2.8U Proteına y unidades de actividad determinadas porgramo en peso seco de residuo£ Sensibilidad del metodo de determinacion deproteına (Bradford, 1976)

Tambien la relacion arabinosa/xilosa difiereampliamente en olote y salvado (0.12 y 0.7respectivamente). Esto tiene un efecto directo en lacapacidad que cada residuo posee para exponer susgrupos funcionales. La presencia de sustituyentes enla cadena principal de polisacaridos y la concentracionde los polisacaridos son factores determinantespara establecer sus mecanismos de union, ya quela adsorcion del xilano y celulosa requiere de unmenor grado de sustitucion de xilano con cadenasde arabinosa o de grupos acetilo y concentracionesmucho menores del mismo pueden interactuar mejorcon celulosa (Kabel y col. 2007). Considerandoque la presencia de cada polisacarido es diferenteen ambos residuos al igual que su concentracion,es posible que tambien su grado exposicion seadiferente, lo que traerıa como consecuencia que lacapacidad de interaccion entre unos polisacaridos yotros o de polisacaridos con otras moleculas (comolas proteınas) difiera en funcion del tipo de residuoy su composicion, explicando ası las diferenciasobservadas con respecto a la adsorcion selectiva deproteınas en ambos residuos.

3.3 Efecto del pH en la desorcion deproteına y actividad xilanolıtica delolote de maız residual

Dado que olote de maız demostro retener unacantidad importante de proteınas, a diferencia delo observado con salvado de trigo, se planteo un

experimento adicional con el fin de determinar elefecto que la modificacion del pH tiene en ladesorcion de proteınas retenidas en el solido residual.En este se determino la cantidad de proteına yactividad xilanolıtica recuperada a partir de olotede maız residual a diferentes valores de pH. LaTabla 3 presenta los valores de proteına y actividadxilanolıtica determinados en alıcuotas de olote de maızrecuperadas de los cultivos de A. flavipes FP-500.Los niveles de proteına observados a pH acido semantienen cerca del lımite de deteccion del metodo,por lo que no pueden ser cuantificados. A pesar deesto, se observa que a medida que el pH aumentatambien lo hace la concentracion de proteına. Porotra parte, se observo que los valores de actividadxilanolıtica determinados en cada uno de los pH’sprobados fueron muy semejantes (Tabla 3), mientrasque la actividad especıfica calculada a partir de estosdatos para pH 6, 8 y 10 disminuye conforme elpH aumenta (4.70, 3.73 y 0.76, U/µg de proteına,respectivamente). Esto indica que si bien se desorbemas proteına a pH’s alcalinos, esta no presentaabundancia de proteınas con actividad xilanolıtica,por lo que la desorcion a valores altos de pH sevuelve menos selectiva para las proteınas del sistemaxilanolıtico. Las proteınas presentan mayor adsorciona una superficie cuando el pH del medio en el queestan inmersas es cercano a su punto isoelectrico; porlo tanto, la desorcion de la misma tambien aumentacuando el pH es mayor, porque aumentan las fuerzasde repulsion de la proteına, incrementando la libertadrotacional, disminuyendo la estabilidad de la misma(Quiquampoix, 2002). Esto puede explicar el hechode que las proteınas adsorbidas en olote de maız sedesorben cuando el pH se hace mas alcalino, puestoque a pesar de que se tiene una muestra compleja deproteınas que poseen puntos isoelectricos diferentes,en general el punto isoelectrico de proteınas de hongoscomo Aspergillus poseen valores ligeramente acidos.

Como se senalo anteriormente, las diferencias deretencion de proteına mostradas por olote de maız ysalvado de trigo pueden entonces estar relacionadascon su composicion quımica, (material adicional). Lasdiferencias mas importantes halladas en estos residuosson principalmente la presencia de proteına cruday almidon que son mas abundantes en salvado detrigo, mientras que en olote de maız, el contenidode fibra total es mas elevado. Sin embargo, la fibratotal en olote de maız y que es evaluada comocelulosa y hemicelulosa alcanza los 319 y 342 g/kgrespectivamente (Okeke y Obi, 1994); mientras queposee un valor de 256 y 250 g/kg en salvado de trigo

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(Graham y col., 1986) senalando que la composicionde biopolımeros es mas heterogenea en salvado detrigo.

La interaccion de celulosa con otros polisacaridosse ve favorecida con la concentracion de ambos, asıcomo el area expuesta de celulosa. La union xilano-celulosa por ejemplo, se favorece cuando las cadenasde xilano estan menos sustituidas por arabinosa ogrupos acetilo y su concentracion es baja (Kabel y col.,2007). La compactacion de la celulosa tambien poseeun efecto en la interaccion, pues la celulosa amorfa esmas susceptible a generar interacciones y a adsorberotras moleculas, mientras que la celulosa cristalinaes menos accesible y reactiva (Mogollon y col.,2008). De acuerdo con la composicion quımica de losresiduos utilizados en este trabajo, es evidente que laproporcion en la que se presentan sus componentes esmuy diferente en cada uno, modificando la interaccionde los biopolimeros presentes, ası como la capacidadde adsorcion que estos materiales presentan. Esto hasido ampliamente descrito en la adsorcion de metalesen distintos residuos agroindustriales como bagazode uva, residuos de manzana o cascara de coco(Farinella y col., 2007), pero a nuestro conocimiento,no hay referencias previas a este trabajo que describanla adsorcion selectiva de proteınas del sistemaxilanolıtico en residuos agroindustriales. Los valoresde proteına y actividad xilanolıtica determinados,senalan que las interacciones que se presentan en lamatriz solida de olote de maız favorecen la adsorcionde las diversas proteınas que son secretadas durante elcultivo de A. flavipes, mientras que las interaccionesque se presentan en salvado de trigo permiten laadsorcion selectiva de proteınas, aunque en unacantidad mucho menor.

3.4 Analisis de peptidos y dominios deunion a carbohidratos (CBM)

Despues de observar las diferencias tan marcadas enel patron de desorcion de proteına total y proteınascon actividad xilanolıtica, se planteo la posibilidad deque algunas de estas poseyeran dominios de union acarbohidratos (CBM por sus siglas en ingles). Tresbandas con peso molecular de 23, 27 y 33 KDarespectivamente, fueron seleccionadas a partir de unSDS-PAGE con muestras de proteına del cultivo de A.flavipes FP-500 en olote de maız. Estas bandas habıan

demostrado poseer actividad xilanolıtica presentandozonas de hidrolisis en zimogramas (Fig. 2A, materialadicional) y fueron escindidas del gel para su analisispor espectrometrıa de masas acoplado a masas(MS/MS). La Tabla 4 presenta las proteınas que fueronidentificadas a partir de un SDS-PAGE con proteınadel cultivo de A. flavipes FP-500 en olote de maız.La identidad de las mismas indica que la proteınade 23 kDa es semejante a la xilanasa de A. terreusy la proteına de 27 kDa es semejante a la xilanasade A. usamii; mientras que la tercera es semejante auna acetilxilano esterasa tambien de A. terreus. Lassecuencias completas de las proteınas con las cualesfueron identificadas se alinearon con las secuenciasde: 1) un dominio de union a celulosa (CBM) deA. clavatus (No. de acceso Uniprot A1CC3 ASPCL),2) una proteına de fusion con la secuencia dexilanasa III y CBM de la familia 9 (No. de accesoNCBIACR54951.1). El peptido1 (23 KDa) tuvo unasemejanza del 57% y un e =0.25 frente a la secuenciade CBM de A. clavatus. El peptido 2 mostro unaidentidad del 93% y e= 5 × 10−110 al ser alineadacon la proteına de fusion, mientras que el peptido3 mostro una identidad del 67% y e = 10−9 al seralineada con el CBM de A. clavatus. Estos resultadosindican que al menos dos de las tres proteınas queposeen mayor semejanza con las que se hallaron en elcultivo de A. flavipes pueden poseer dominios de uniona carbohidratos.

La presencia de estos dominios en las proteınasdel sistema xilanolıtico de A. flavipes representa unfactor adicional que puede afectar la adsorcion de lasmismas. Los dominios de union a carbohidrato poseensecuencias ricas en aminoacidos como: prolina,glicina e hidroxi aminoacidos (Black y col., 1997;Kiyohara y col., 2009). No poseen actividad catalıtica;sin embargo, facilitan la hidrolisis de sus sustratosespecıficos por interaccion con algunos de loscarbohidratos adyacentes, proporcionandoles soportey facilitando el contacto con sus sustratos, han sidohallados no solo en secuencias de proteınas conactividad celulolıtica, sino xilanolıtica y de enzimasaccesorias (Gordillo y col., 2006). El numero desecuencias de CBM’s identificadas hasta el dıa de hoyse ha incrementado de manera importante, tanto queexisten 29, 727 modulos distribuidos en 67 familiasde dominios de union a carbohidrato de acuerdocon la clasificacion de la base de datos de CAZy(http://www.cazy.org/) (Cantarel y col., 2009).

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Tabla 4. Proteınas identificadas a partir del cultivo de A. flavipes FP-500 en olote de maız.

Peptido Identidad Numero de Acceso Identidad Valor-e

No.1 Endo-1,4-beta-xylanase A XP 001216082.1 94% 2 × 10−7

(23 KDa) precursor Aspergillus terreus NIH2624 (NCBI)No.2 Endo-1,4-beta-xylanase ABR 14629.1 70% 3 × 10−12

(27 KDa) Aspergillus usamii (NCBI)No.3 Acetilxylanesterase Aspergillus terreus Q0CNM5 ASPTN 94% 9 × 10−5

(33 Kda) NIH 2624/ FGSC A1156 (Uniprot)

La presencia de CBM’s en enzimas secretadaspor miembros del genero Aspergillus demostro queno solo la actividad enzimatica mejora de maneraimportante, sino que la sensibilidad a la accionde proteasas disminuye gracias a la proteccion queestos dominios y las secuencias de union (linkers)le proporcionan. Tambien, Paldi (2003) demostroque aunque la afinidad (Kd) de un CBM puede serla misma en polisacaridos de diversos orıgenes, laconcentracion maxima de union de estos (Bmax) puedevariar de manera considerable en funcion del origendel polisacarido; esto fue observado al compararlos parametros cineticos de union de CBM’s deglucoamilasas de A. niger en los cuales Bmax fue casisiete veces mayor en almidon de maız con respectoal de papa. Esto indica que la union de un mismotipo de CBM se puede unir cuantitativamente de formadistinta de acuerdo con el tipo de polisacarido, lo quepodrıa explicar la gran diferencia observada en losperfiles de desorcion de proteınas a partir del olote demaız y salvado de trigo residual.

Ası, la presencia de CBM’s en las enzimas delsistema xilanolıtico de A. flavipes FP 500, puede ser unfactor adicional en la adsorcion de proteınas en ambosresiduos. Es decir, que la adsorcion observada en losresiduos probados se debe a la interaccion aleatoriade las proteınas con los grupos funcionales expuestosen los polisacaridos, pero tambien a la interaccionespecıfica de los dominios de algunas proteınas conregiones particulares de los polisacaridos. La curvade desorcion con valores acumulados de proteına yactividad mostrada en la Fig. 3b en el que ambascurvas poseen modelos de ajuste diferentes indica quelas proteınas con actividad xilanolıtica presentan uncomportamiento distinto al del resto de las proteınassecretadas. Que se requiera un numero muy grande dedesorciones para recuperar las proteınas con actividadxilanolıtica, mientras que solo se requieran 44 paradesorber la de proteına total, sugiere que las proteınasasociadas con la actividad xilanolıtica presentan unainteraccion mas fuerte con el solido y que podrıaasociarse directamente con la presencia de dominios

de union a carbohidratos.Los dominios de union a carbohidrato que han sido

informados en Aspergillus poseen mayoritariamentesitios de union a celulosa, pero tambien a xilanoy xiloglucano (Fernandes y col., 1999; Luis y col.,2013); algunos de estos CBM’s presentan mayorafinidad por regiones de celulosa mas ordenadas,otras por la celulosa amorfa y otros no presentandiferencias importantes (Quentin y col., 2002). Ası,la composicion de los residuos agroindustrialesutilizados como fuentes de carbono en los cultivosde A. flavipes podrıa ser el factor clave que afectadirectamente los mecanismos de adsorcion de estasproteınas.

Conclusiones

De acuerdo con los resultados observados, laadsorcion de las proteınas secretadas durante loscultivos de A. flavipes FP-500 en olote de maızy salvado de trigo es diferente. Los valoresdeterminados de proteına, actividad xilanolıtica yactividad especıfica, indican que cuantitativamente laproteına total secretada por A. flavipes establece unainteraccion mucho mayor con olote de maız que consalvado de trigo. Sin embargo, la adsorcion selectivade proteınas del sistema xilanolıtico es mayor en lamatriz solida de salvado de trigo, a pesar de quecuantitativamente una menor cantidad de proteınasse adsorben en el. Mientras que en olote de maız,la mayor parte de las proteınas que pueden serdesorbidas no pertenecen al sistema xilanolıtico, porlo que la adsorcion es menos selectiva. El pH tieneun efecto importante en la desorcion de proteınasretenidas en olote de maız, no ası en la desorcionselectiva de proteınas con actividad xilanolıtica. Laposible presencia de dominios de union a sustratoen las enzimas del sistema xilanolıtico de A. flavipespuede tener un efecto adicional en la interaccion queestas proteınas establecen con los solidos residualesdel cultivo, ya que podrıan estarse estableciendo dos

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tipos de interaccion: una aleatoria entre los gruposfuncionales expuestos por parte de la proteına totaly los polisacaridos presentes en los residuos; asıcomo una especıfica establecida entre las proteınasque poseen dominios de union a carbohidratocon regiones especıficas de los polisacaridos. Esimportante considerar todo esto durante la seleccionde residuos agroindustriales que puedan ser empleadoscomo sustratos en algun cultivo, ya que de existirinteracciones entre las proteınas producidas y el solidocomo en el caso aquı descrito en olote de maız, secorre el riesgo de aumentar los costos del procesodebido a la adecuada recuperacion de proteınas yperder ası el valor agregado que originalmente se leda al aprovechamiento de estos residuos.

AgradecimientosEl primer autor agradece el apoyo al ConsejoNacional de Ciencia y Tecnologıa (CONACYT) porla beca otorgada para cursar el doctorado en CienciasBioquımicas dentro del programa de doctorado de laUniversidad Nacional Autonoma de Mexico, incluidoen el padron de Postgrados de Excelencia.

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Apendice

Tabla A1. Composicion quımica de olote de maız ysalvado de trigo

Componente Olote de maız Salvado de trigo(g/kg) (g/kg)

Cenizas 18 61Proteına cruda 32 151

Almidon 143 229Fibra total 662 527CelulosaU 319 256

HemicelulosaU 342 250Fibra soluble 26 92

Lignina (Klason) 67 109Salvador, V., Cherbut, Ch., Barry, J., Bertrand, D., Bonnet,Ch., Delort-Laval, J. (1993). Sugar composition of dietaryfibre and short chain fatty acid production during in vitrofermentation by human bacteria. British Journal of Nutrition70, 189-197.UDatos calculados a partir de Okeke, B.C., Obi, S.K. (1994).Lignocellulose and sugar composition of some agro-wastematerials. Bioresource Technology 47, 283-284

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Figura 1A Fig. A1. SDS-PAGE. Proteına desorbida a partir deolote de maız 1% en medio basal sin inoculo. Lıneas1-8, proteına desorbida; lınea M marcadores de masamolecular.

Figura 2A Fig. A2. Proteına obtenida a partir del cultivo lıquidode A. flavipes FP-500 con olote de maız; a) SDS-PAGE Lınea 1, proteına tenida con azul de Coomassie;lınea M, marcadores de masa molecular. b) Lıneas 1y 2, zimograma de actividad xilanolıtica en gel deacrilamida tenido con rojo congo.

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