REUNION ACADEMICA ANUAL 2008 Instituto de Biotecnología

Universidad Nacional Autónoma de México 8 al 11 de diciembre de 2008.

Cuernavaca, Morelos Auditorio del IBt

REUNION ACADEMICA ANUAL 2008

8 al 11 de diciembre de 2008. Auditorio del IBt Lunes 8 9:15-9:30 Bienvenida 9:30-11:00 Conferencia Magistral – “Repercusiones sociales de la Evolución” Dr. José Sarukhán Kermez Investigador Emérito Departamento Ecología de la Biodiversidad Laboratorio Ecología de Poblaciones Instituto de Ecología, UNAM 11:00-11:15 Receso Coordina: Dra. Hilda Lomelí Buyoli Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiol. Molecular 11:15-12:00 Dr. Mario Soberón Chávez Departamento de Microbiología Molecular

“Interacción toxina-receptor: Fundamento de la especificidad de las toxinas Cry de Bacillus thuringiensis”

12:00-12:45 Dr. Edmundo Calva Mercado Departamento de Microbiología Molecular

“Salmonella enterica: en la interfase de la biología molecular y la epidemiología”

12:45-13:30 Dr. Francisco Bolívar Zapata Departamento de Ingeniería Celular y Biocatálisis

“Utilización diferencial de σ70 y σ38 en la transcripción de los genes glicolíticos y de dos genes involucrados en la transformación de piruvato en AcCoA, como una respuesta adaptativa a la limitación de carbono en Escherichia coli”

Martes 9 Coordina: Dr. Alejandra Bravo de la Parra Departamento de Microbiología Molecular 9:30-10:15 Dra. Gladys I. Cassab López Departamento de Biología Molecular de Plantas

"Mecanismos que utilizan las raíces para dirigirse de ambientes secos a húmedos"

10:15-11:00 Dra. Susana López Charretón Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiol. Molecular

“Lo que los rotavirus nos pueden enseñar sobre la biología de la célula”

11:00-11:15 Receso 11:15-12:00 Dr. Agustín López-Munguía Canales

Departamento de Ingeniería Celular y Biocatálisis

"Biocatálisis: de la Biología Molecular a la síntesis orgánica"

12:00-12:45 Dra. Yvonne J. Rosenstein Azoulay Departamento de Medicina Molecular y Bioprocesos “CD43, una molécula polifacética”

Miércoles 10 Coordina: Dr. Lorenzo Segovia Forcella Departamento de Ingeniería Celular y Biocatálisis 9:30-10:15 Dr. Mario Rocha Sosa Departamento de Biología Molecular de Plantas

“Análisis de la respuesta molecular a patógenos y herida en plantas”

10:15-11:00 Dra. Guadalupe Espín Ocampo Departamento de Microbiología Molecular “Producción de polímeros y diferenciación en

Azotobacter vinelandii” 11:00-11:15 Receso 11:15-12:00 Dra. Patricia Joseph Bravo Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiol. Molecular "Neurona controla hormona" 12:00-12:45 Dr. Luis F. Covarrubias Robles

Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiol. Molecular "Descubriendo cómo funciona: de las moléculas y las

células al organismo" Jueves 11 Coordina: Dr. Baltazar Becerril Luján Departamento de Medicina Molecular y Bioprocesos

9:30-10:15 Dr. Rafael Vázquez Duhalt Departamento de Ingeniería Celular y Biocatálisis ¡Alguien tiene que limpiar! 10:15-11:00 Dr. Octavio Tonatiuh Ramírez Reivich Departamento de Medicina Molecular y Bioprocesos

“Estudios de escalamiento descendente de la producción de proteína recombinante termoinducida por cultivos de E. coli”

11:00-11:15 Receso 11:15-12:00 Dr. Alejandro Alagón Cano Departamento de Medicina Molecular y Bioprocesos “Antivenenos: de la práctica a la teoría” 12:00-12:45 Dr. Juan Enrique Morett Sánchez

Departamento de Ingeniería Celular y Biocatálisis

“Genómica de la regulación genética en bacterias” 12:45-13:00 Clausura Dr. Carlos F. Arias Ortiz Director del Instituto de Biotecnología

Conferencia Magistral

“Repercusiones sociales de la Evolución”

Dr. José Sarukhán Kermez Investigador Emérito

Departamento Ecología de la Biodiversidad Laboratorio Ecología de Poblaciones

Instituto de Ecología, UNAM

Resumen curricular

Obtuvo la Licenciatura en Biología en la Universidad Nacional Autónoma de México en 1964. En 1968 obtuvo la Maestría en Botánica Agrícola en el Colegio de Posgraduados y en 1972 se Doctoró en Ecología en la Universidad de Gales.

De 1979 a 1985 fue Director del Instituto de Biología de la UNAM, cargo en el que fue reelecto. En 1987 fue designado Coordinador de la Investigación Científica de la propia UNAM y electo Rector en diciembre de 1988 para el período 1989-1992 y reelecto en este cargo para el período 1993-1996. Es investigador titular "C" en el Instituto de Ecología desde 1988.

Fue Presidente de la Sociedad Botánica de México de 1972 a 1975, de la Academia de la Investigación Científica en 1984, en el que desempeñó un papel importante en la creación e instauración del Sistema Nacional de Investigadores; y de la Association for Tropical Biology para el período 1986-1987. En 1992, es designado Coordinador Nacional de la Comisión Nacional para el Conocimiento y Uso de la Biodiversidad (CONABIO), responsabilidad que desempeña hasta la fecha. Ha sido Presidente de la Unión de Universidades de América Latina (UDUAL) y Vicepresidente de la Asociación Universitaria Iberoamericana de Postgrado así mismo, Coordinador de

la Red Latinoamericana de Botánica. En diciembre de 2000 fue nombrado Comisionado de Desarrollo Social y Humano de la Oficina Ejecutiva de la Presidencia de la República, cargo que concluyó en enero de 2002.

Ha publicado más de 110 trabajos de investigación y varios libros, entre ellos: Primera, segunda y tercera edición de Arboles Tropicales de México, Las Musas de Darwin y Manual de Malezas del Valle de México, Perspectivas on plant population Ecology, México ante los retos de la Biodiversidad, Conservating Biodiversity. Ha dirigido 28 tesis de licenciatura, maestría y doctorado en estos temas. Es Miembro de El Colegio Nacional desde 1987, de la Third World Academy of Sciences desde 1991; Miembro de la U.S. National Academy of Sciences desde 1993; de la Academia de Ciencias de América Latina (ACAL) desde 1993; Honorary Fellow de la Association for Tropical Biology desde 1996; Honorary Fellow de la California Academy of Sciences desde 1998; Miembro del Comité de la División on Herat and Life Studies (DELS) de la National Academies, 2002-2005. 2006-2008; Foreign Member de la Royal Society, 2003; Miembro de la European Academy of Sciences, 2004; Member de la Commision Scientifique de I’Institut Francais de la Biodiversité.Paris, France, 2007, de la American Academy of Arts & Sciences., 2008. Es miembro de la junta directiva de numerosas organizaciones internacionales.

Ha recibido los siguientes premios y distinciones: Premio Nacional Forestal 1966,; Premio de Ciencias Naturales 1984, de la Academia de la Investigación Científica; Medalla al Mérito Botánico de la Sociedad Botánica de México 1991; Medalla "Alfonso L. Herrera" en Ecología y Conservación 1991; Premio Nacional de Ciencias Físico-Matemáticas y Naturales 1990, otorgado por el Gobierno de México; Medalla Henry Shaw del Missouri Botanical Garden 1991; primer Profesor Emérito de la Universidad Tecnológica Metropolitana de Santiago, Chile 1993. Conservation Biology Award 1994 de la Society for Conservation Biology; Director Emérito de Conservación Internacional 1994; Presea Pericles 1995 de la Fundación Amparo de Puebla; Medalla al Mérito Universitario Lázaro Cárdenas del Río de la Universidad de Colima 1995; Distinguished Service Award de la Society for Conservation Biology 2001; Medalla de Oro al Mérito Universidad Veracruzana 2002; Medalla "José Vasconcelos" 2002, Premio Interamérica 2003, Organización Universitaria Interamericana (OUI), Investigador Emérito de la UNAM, 2005; Reconocimiento de The Nature Conservancy, 2006, Centennial Award of The Botanical Society of America, 2006 y el Award Certificate for the Nobel Peace Prize to Intergovernmental Panel on Climate Chage (IPCC) Oslo, Norway 2007, por su participación en el Climate Change 2001: Impacts, Adaptation, and Vulnerability, Medalla John C. Phillips de IUCN (2008)

Ha recibido doctorados honorarios de varias universidades, entre ellas la Universidad Nacional Mayor de San Marcos de Lima, Perú; la Universidad de Gales en Gran Bretaña; la Universidad de Nueva York; del Colegio de Postgraduados; de la Universidad de Colima, de la Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo y de la Universidad Autónoma del Estado de Morelos..

Interacción toxina-receptor: Fundamento de la especificidad de las toxinas Cry de Bacillus

thuringiensis.

Mario Soberón Chávez Departamento de Microbiología Molecular Integrantes de Grupo (2007-2008)-Juan Miranda, Inv. Tit. B. (Mecanismos moleculares de la expresión genética mediada por Riboswitches). -Isabel Gómez, Inv. Tit. A. (Interacción de toxinas Cry1A con proteínas ancladas por GPI en insectos susceptibles). Investigadores Posdoctorales -Luisa E. Fernández (Modo de acción de toxinas Cry en mosquitos). -Claudia Martínez (Modo de acción de toxinas Cry en mosquitos). Estudiantes de doctorado -Sabino Pacheco (Determinantes de la especificidad de toxinas Cry1A). -Maria Teresa Fernández (Tutor J. Miranda; Identificación de receptores de toxinas Cry en Anopheles albimanus). -Ivan Arenas (Tutor I. Gómez; Interacción de la toxina Cry1Ab con alcalino fosfatasa y aminopetidasa –N de Manduca sexta). -Biviana Flores (Tutor I. Gómez; Análisis del papel de proteínas ancladas por GPI en el modo de acción de Cry1Ab por silenciamiento de RNA). Estudiantes de maestría -Fernando Zúñiga (Despliegue de la toxina Cry3Aa en fagos filamentosos). -Esmeralda Za-nicthe Reyes (Identificación de epítopes de unión de la toxina Cry4Ba con fosfatasa alcalina de Aedes aegypti). -Erandi Lira (Identificación de regiones de la fosfatasa alcalina de Aedes aegypti en la unión con toxina Cry11Aa). -Nancy Ontiveros (Tutor J. Miranda; Estudio de la unión de TPP por el "riboswitch" de tiamina). -Maria Teresa Martínez (Tutor I. Gómez; Selección de péptidos que unen receptores anclados por GPI de la toxina Cry1Ab).

Estudiantes de Licenciatura -Pablo Emiliano Cantón (Despliegue de la toxina Cyt1Aa en fagos filamentosos). -Josué Ocelotl (Tutor I. Gómez; Regiones del dominio III de Cry1Ab en la interacción con aminopeptidasa N). Personal Administrativo Graciela Domínguez. Secretaria Sergio Blancas. Laboratorista Alejandro Uribe. Laboratorista

Resumen

Las toxinas insecticidas Cry producidas por Bacillus thuringiensis se caracterizan por tener un rango de acción especifico ya que son toxicas a un reducido numero de insectos susceptibles. La especificidad de las toxinas Cry esta determinada por la interacción especifica de las toxinas con proteínas del epitelio intestinal de larvas susceptibles. En el caso de insectos lepidópteros que son plagas agrícolas, hemos descrito un modelo del modo de acción donde las toxinas Cry1A interaccionan de manera secuencial con al menos dos proteínas. La primera interacción con caderina facilita el corte de una alpha hélice en el amino terminal lo que provoca la oligomerización de la toxina y la interacción con una aminopeptidasa N (APN) anclada a ala membrana por GPI, lo que resulta en la inserción del oligómero a la membrana y la formación de un poro lítico. En trabajos previos hemos caracterizado toxinas Cry1A modificadas (Cry1AMod) que no tienen la hélice a-1 y cuya toxicidad esta limitada solo por la interacción con la APN. Las toxinas Cry están compuestas de tres dominios estructurales, el dominio I que esta involucrado en la inserción a membrana y los dominios II y III que están involucrados en la interacción con las proteínas del epitelio intestinal de insectos susceptibles. En nuestro grupo de investigación estamos interesados en entender las bases moleculares de la especificidad de las toxinas Cry con el propósito de modular su especificidad a través del análisis y modificación de los sitios de interacción con los receptores de los insectos susceptibles.

Con este propósito estudiamos el modo de acción de toxinas Cry que tienen especificidades diferentes como las toxinas Cry1A que son toxicas a insectos lepidópteros y toxinas Cry11Aa y Cry4Ba que son toxicas a insectos dípteros.

En el caso de las toxinas Cry1A, hemos identificado regiones del dominio II y del dominio III que están involucradas con la unión de receptor caderina y con la APN. Utilizando anticuerpos monoclonales scFv hemos descrito que las asas 2 y 3 del dominio II sufren un cambio conformacional cuando la toxina oligomeriza lo que facilita su unión posterior con la APN. En la unión del oligomero con la APN también participa la b-16 del dominio III. Por otra parte hemos identificado a una fosfatasa alcalina (ALP) como una proteína de unión del oligomero de Cry1Ab.

En cuanto al modo de acción de las toxinas con actividad contra mosquitos, identificamos y clonamos el cDNA de una fosfatasa alcalina de Aedes aegyti que une a la toxina Cry11Aa. Mutagénesis sitio dirigida de regiones del dominio II y III de Cry11Aa nos permitió definir regiones de la toxina que unen a la fosfatasa alcalina y que son importantes para su toxicidad. Asimismo mediante el análisis de unión de fragmentos de la ALP definimos dos sitios de la ALP que unen al dominio II o el III de Cry11Aa. En el mosco Anopheles albimanus identificamos a una glucosidasa anclada por GPI como una proteína de unión de la toxina Cry4Ba. Nuestro propósito es definir si el modo de acción de las toxinas Cry con actividad contra mosquitos es similar a el descrito en lepidópteros.

Un esfuerzo importante de nuestro grupo es el desplegar a las toxinas Cry en fagos filamentosos con el propósito de tener herramientas que nos permitan aislar variantes de las toxinas con una especificidad alterada. En esta ocasión presentare datos sobre la caracterización de mutantes puntuales de Cry1Ab en los sitios de interacción del dominio II y III y su caracterización en cuanto a su unión a los receptores APN y caderina así como mutantes puntuales en caderina que afectan la unión de la toxina Cry1Ab. También mostraremos datos sobre el despliegue eficiente de la toxina Cry1A en fagos filamentosos y la construcción de bibliotecas de variantes para recuperar toxinas que

unan a mutantes puntuales del receptor caderina. Fuentes de financiamiento 1. NIH. National Institutes of Health. 1R01 AI066014-01 (Resp. Sarjeet S. Gill) sub-contrato 500,000.00 USD (grupos Alejandra Bravo y Mario Soberón). 5 años. Julio 2005. 2. CONACyT. Contrato 46176-Q. $ 1,782,000.00 pesos. 3 años Junio 2005. 3. USDA, United States Department of Agriculture. 2007-35607-17780 (Resp. Sarjeet S. Gill grupos Alejandra Bravo y Mario Soberón) 128,000.00 USD. 3 años, Enero 2007. 4. DGAPA, UNAM Contrato IN210208. $600,000.00. 3 años Enero 2007 5. CONACyT. Contrato J46829-Q Monto: $599,150 Periodo: Junio 2005-Junio 2008 (IG) 6. DGAPA, Contrato IN218608-3 $599,500 Período: 2008-2010. (IG) 7. DGAPA UNAM Contrato IN204707-3. $ 600,000.00. 3 años Enero 2007 (JM) Alumnos Graduados 1. Nancy Ontiveros. Maestría en Ciencias Bioquímicas. “Estudio de la unión de TPP por el "riboswitch" de tiamina mediante mutaciones puntuales de las bases conservadas en las asas del riboswitch”. Febrero del 2007. Tutor Juan Miranda. 2. Erandi Lira Navarrete. Maestría en Ciencias Bioquímicas, UNAM. “Identificación del sitio de interaccion de la fosfatasa alcalina de Aedes aegypti con la toxina Cry11Aa”. Marzo del 2008. Tutor Mario Soberón. 3. Maria Teresa de Jesús Martinez.Maestría en Ciencias Bioquímicas. “Selección de péptidos que unen receptores de las toxinas Cry1A de Bacillus thuringiensis empleando la tecnología de despliegue en fagos”. Junio 2008. Tutor: Isabel Gómez Gómez. Publicaciones

1. Gomez, I., Pardo-López, L., Muñoz-Garay, C., Fernandez, L. E., Pérez, C., Sánchez, J., Soberón, M., and Bravo, A. (2007) Role of receptor interaction in the mode of action of insecticidal Cry and Cyt

toxins produced by Bacillus thuringiensis. Peptides. 28: 169-173.

2. Soberón, M., Fernandez, L. E., Pérez, C., and Bravo, A. (2007) Mode of action of mosquitocidal Bacillus thuringiensis toxins. Toxicon. 49: 597-600.

3. Bravo, A., Gill, S. S., and Soberón, M. (2007) Mode of action of Bacillus thuringiensis Cry and Cyt toxins and their potential for insect control. Toxicon. 49: 423-435.

4. Ishikawa, H., Hoshino, Y., Motoki, Y., Kawahara, T., Kitajima, M., Kitami, M., Watanabe, A., Bravo, A., Soberón, M., Honda, A.,Yaoi, K., and Sato, R. (2007) A system for the directed evolution of the insecticidal protein from Bacillus thuringiensis. Molecular Biotechnology. 36: 90-101.

5. Jiménez-Juárez, A., Muñoz-Garay, C., Gómez, I., Saab-Rincon, G., Damian-Alamazo, J. Y., Gill, S. S., Soberón, M., and Bravo, A. (2007) Bacillus thuringiensis Cry1Ab mutants affecting oligomer formation are non-toxic to Manduca sexta larvae. Journal of Biological Chemistry. 282: 21222-21229.

6. Pérez, C., Muñoz-Garay, C., C. Portugal, L., Sánchez, J., Gill, S. S., Soberón, M., and Bravo, A. (2007) Bacillus thuringiensis subsp. israelensis Cyt1Aa enhances activity of Cry11Aa toxin by facilitating the formation of a pre-pore oligomeric structure. Cellular Microbiology. 9: 2931-2937.

7. Soberón, M., Pardo-López, L., López, I., Gómez, I., Tabashnik, B., and Bravo A. (2007) Engineering Modified Bt Toxins to Counter Insect Resistance. Science. 318: 1640-1642.

8. Miranda-Rios, J. 2007. The THI-box riboswitch, or how RNA binds thiamin pyrophosphate Structure 15 259-265.

9. Gama-Castro, S. Jimenez-Jacinto, V. Peralta-Gil, M. Santos-Zavaleta, A. Peñaloza-Spinola, M. I. Contreras-Moreira, B. Segura-Salazar, J. Muñiz-Rascado, L. Martínez-Flores, I. Salgado, H. Bonavides-Martínez, C. Abreu-Goodger, C. Rodríguez-Penagos, C. Miranda-Rios, J. Morett, E. Merino, E. Huerta, A. M. Treviño-Quintanilla, L. Collado-Vides, J. 2008. RegulonDB (version 6.0): gene regulation model of Escherichia coli K-12 beyond transcription, active (experimental) annotated promoters

and Textpresso navigation Nucleic Acids Res 36 (Database issue) D120-D124.

10. Fernández-Luna, M.T. and Miranda-Ríos, J. (2008). Riboswitch folding: one at a time and step by step RNA Biol 5 20-23.

11. Taboada, H. Encarnación, S., Vargas, M del C., Mora, Y., Miranda-Rios, J., Soberón, M. and Mora J. (2008) Thiamine limitation determines the transition from aerobic to fermentative-like metabolism in Rhizobium etli CE3. FEMS Microbiology letters. 279: 48-55.

12. Jiménez-Juárez, N., Muñoz-Garay, C., Gómez, I., Gill, S. S., Soberón, M., and Bravo, A. (2008) The pre-pore from Bacillus thuringiensis Cry1Ab toxin is necessary to induce insect death in Manduca sexta. Peptides. 29: 318-323.

13. Fernández, L. E., Gómez, I., Pacheco, S., Arenas, I., Gill, S. S., Bravo, A., and Soberón, M. (2008) Employing phage display to study the mode of action of Bacillus thuringiensis Cry toxins. Peptides. 29: 324-329.

14. Ontiveros-Palacios, N., Smith, A. M., Grundy, F. J., Soberón, M., Henkin, T. M., and Miranda-Ríos J. (2008) Molecular basis of gene regulation by the THI-box riboswitch. Molecular Microbiology. 67: 793-803.

15. Bravo, A., and Soberón, M. (2008) How to cope with resistance to Bt toxins? Trends in Bioetchnology. 26: 573-579.

16. Pardo-López, L., Muñoz-Garay, C., Porta, H., Rodríguez-Almazán, C., Soberón, M., and Bravo, A. (2008) Strategies to improve the insecticidal activity of Cry toxins from Bacillus thuringiensis. Peptides. Aceptado.

17. Pacheco, S., Gómez, I., Gill, S. S., Bravo, A., and Soberón, M. (2008) Enhancement of insecticidal activity of Bacillus thuringiensis Cry1A toxins by fragments of a toxin-binding cadherin correlates with oligomer formation. Peptides. Aceptado.

Capítulos de libro

1. Soberón, M., Gómez, I., Pardo, L., Muñoz-Garay, C., Fernández, L., Perez, C., Gill, S. S., and Bravo, A. 2007. Important interactions with membrane receptors in the mode of actino of Bacillus thuringiensis Cry toxins. Proceedings of the 6th Pacific Rim conference on the Biotechnology of Bacillus thuringiensis and its Environmental Impact, Erudit, Montreal. pp 1-6. Cote, J-C., Otvos, I. M., Schwartz, J-L., and Vincent, C. eds. ISBN 978-2-9810223-0-1.

2. Bravo, A., Pardo, L., Gómez, I.,

Muñoz-Garay, C., Jiménez-Juarez, N., Sánchez, J., and Soberón, M. 2007. Oligomer formation of different Cry toxins indicates that a pre-pore is an essential intermediate in the mode of actino of the three-domain Cry family. Proceedings of the 6th Pacific Rim conference on the Biotechnology of Bacillus thuringiensis and its Environmental Impact, Erudit, Montreal. pp 7-8. Cote, J-C., Otvos, I. M., Schwartz, J-L., and Vincent, C. eds. ISBN 978-2-9810223-0-1.

3. Perez, C., Fernández, L., Sun, J.,

Folch, J. L., Soberón, M., Bravo, A., and Gill, S. S. 2007. Cyt1Aa from Bacillus thuringiensis subs israelensis synergizes Cry11Aa toxin activity by functioning as a membrane-bound receptor. Proceedings of the 6th Pacific Rim conference on the Biotechnology of Bacillus thuringiensis and its Environmental Impact, Erudit, Montreal. pp 9-11. Cote, J-C., Otvos, I. M., Schwartz, J-L., and Vincent, C. eds. ISBN 978-2-9810223-0-1.

4. Gómez, I., Miranda-Rios, J., Arenas,

I., Grande, R., Becerril, B., Bravo, A., and Soberón, M. 2007. Identification of scFv molecules that recognize loop 3 of domain II and domain III of Cry1Ab toxin from Bacillus thuringiensis. Proceedings of the 6th Pacific Rim conference on the Biotechnology of Bacillus thuringiensis and its Environmental Impact, Erudit, Montreal. pp 12-14. Cote, J-C., Otvos, I. M., Schwartz, J-L., and Vincent, C. eds. ISBN 978-2-9810223-0-1.

Docencia

1. Curso Básico de Bioquímica de la Maestría en Ciencias Bioquímicas. Semestre 2007-II, 2008-I, 2009-I. (MS).

2. Tópico selecto. Respuesta intracelular a agentes de estrés (toxinas formadoras de poro y otros) Postgrado en Ciencias Bioquímicas. Semestre 2009-1. (JM).

3. Tópico selecto. Proteínas: Estructura y Función. Postgrado en Ciencias Bioquímicas. Semestre 2009-1. (IG).

4. "Bacillus thuringiensis: Receptores y su papel en el mecanismo de Toxicidad”. Facultad de Ciencias. Universidad Autónoma de Aguascalientes 5 horas. Divulgación 1. Soberón, M. Scirus Topic page (por invitación): http://topics.scirus.com/Bacillus_thuringiensis_Cry_toxins.html 2. Soberón, M. and Bravo A. Avoiding insect resistance to Cry toxins from Bacillus thuringiensis. ISB-News Reports, Agricultural and Environmental Biotechnology. Mayo 2008, 5-11. http://www.isb.vt.edu Desarrollo Tecnológico -Patente. Pardo-López L, Tabashnik BE, Soberón M. Bravo A. Overcoming Pest Resistance with Bt Toxins that Bypass the Cadherin Receptor. Solicitud Internacional No. PCT/MX2007/000068. Depositada Junio 2007. Comités Editoriales 1. Editorial Adviser, Biochemical Journal. 2006-2009. 2. Editorial Board, Insect Biochemistry and Molecular Biology. 2007-2012.

Salmonella enterica: en la interfase de la biología molecular

y la epidemiología

Edmundo Calva Mercado Departamento de Microbiología Molecular

Integrantes del grupo (2007-2008)

Investigadores -Ricardo Oropeza (Biopelículas, ompS1) -Ismael Hernández-Lucas (Regulón LeuO, ompW, ompL) Investigadores Postdoctorales -Ismael Secundino (Respuesta inmune) -Claudia Silva (Ecología molecular) Técnicos Académicos -Marcos Fernández-Mora (Regulón LeuO, evolución molecular, respuesta inmune) -Alejandra Vázquez (Mutagénesis) Estudiantes de doctorado -Miguel Ángel De la Cruz (LeuO, ompS1, regulación islas patogenicidad) -Ana Lucía Gallego-Hernández (Regulón LeuO, assT) -Magdalena Wiesner (C. Silva, co-tutora; ecología molecular) -Carmen Guadarrama (LeuO) -Fernando Gil (Univ. Andrés Bello; ompW) -José Miguel Villarreal (Univ. Andrés Bello; ompL) Estudiantes de maestría -Adrián Izquierdo -Rosalva Salgado (Tutor R. Oropeza; biopelículas) -Liliana Medina (Tutor I. Hernández-Lucas; regulón LeuO) Estudiante de Licenciatura -Esteban Rebollar (Tutor I. Hernández-Lucas; regulón LeuO) Otros colaboradores -Víctor H. Bustamante (LeuO, regulación islas patogenicidad) -Juan J. Calva (Epidemiología) -Mario Alberto Flores-Valdez (LeuO, ompS1) -Claudia Saavedra (ompW, ompL) -Mussaret Zaidi (Epidemiología)

Resumen

En estos últimos años, nuestro grupo ha dedicado un esfuerzo importante hacia una visión integral en el estudio de Salmonella enterica, al agregar a nuestros estudios de regulación genética la caracterización molecular de cepas de origen clínico y de alimentos.

Desde el punto de vista molecular, el estudio de los genes de las porinas –proteínas antigénicas de la superficie de la bacteria- ha resultado en el descubrimiento de OmpS1 y OmpS2, las cuales son las primeras porinas quiescentes cuya expresión se describe en detalle. Esto es, se expresan generalmente en un número muy bajo de copias con la posibilidad de ser expresadas en cantidades mayoritarias, siendo sujetas a complejos sistemas de regulación tanto negativa como positiva. Los sistemas de regulación negativa implican tanto a la proteína nucleoide H-NS como a otras proteínas, siendo una de ellas StpA, también una proteína nucleoide. Entre los reguladores positivos de ompS1 y ompS2, nuestro grupo descubrió a LeuO, cuya función es todavía poco conocida. De esta manera, hemos determinado que LeuO actúa como antagonista de las proteínas nucleoides H-NS y StpA, permitiendo así la acción del regulador transcripcional OmpR sobre ompS1.

Recientemente, en consecuencia, hemos descrito por primera vez el regulón de LeuO en Salmonella enterica, el cual consiste, además de ompS1 y ompS2, del operón assT (arilsulfato sulfotransferasa)-dsbA (parálogo)-dsbB (parálogo) y del posible operón STY3070 al 3074, a los cuales regula positivamente; además de tpx (tiol peroxidasa), ompX (una proteína de membrana externa) y STY1978, a los que regula negativamente. Además, estamos explorando la existencia de una posible chaperona para LeuO, la cual sería inédita para un regulador genético. Es interesante apuntar que casi todos los genes del regulón, además de H-NS, StpA, OmpR y LeuO, han sido implicados en respuesta a estrés y virulencia.

Por otro lado, hemos establecido una colaboración con el grupo de la Dra. Claudia Saavedra de la Universidad Andrés Bello de Santiago de Chile, quienes han estado estudiando algunas porinas como canales

de expulsión de compuestos tóxicos; esto es, ahondando en la función de las porinas. Nuestro grupo ha contribuido ha entender mejor, en consecuencia, la regulación de los genes ompW por SoxS y de ompL.

Finalmente, desde el punto de vista molecular, nuestros estudios nos han llevado al descubrimiento de una forma novedosa de interacción entre las islas de patogenicidad SPI-1 y SPI-2 involucrando uno de los reguladores centrales, y a encontrar un nueva vía metabólica para la formación de biopelículas a través de la proteína detectora RcsC.

En otro rubro, hemos establecido una colaboración con los Dres. Mussaret Zaidi y Juan J. Calva, del Hospital O’Horan de Mérida, Yucatán y del Instituto Nacional de Ciencias Médicas y de Nutrición Salvador Zubirán, respectivamente, con quienes hemos realizado el primer estudio de epidemiología molecular de cepas mexicanas de Salmonella enterica, en este caso serovar Typhimurium. Las cepas provienen de áreas geográficas diversas, aunque en su mayoría son de una región maya endémica, tanto de humanos como de carnes. Uno de los aspectos que ha llamado la atención recientemente, en diversas partes del mundo. es la aparición de cuadros clínicos invasivos asociados a Typhimurium, cuando ésta usualmente se presenta con gastroenteritis. Tal ha sido el caso con algunas cepas de Yucatán. De esta manera, hemos encontrado cuatro linajes genéticos de Typhimurium en México por MLST (multilocus sequence typing). Uno de ellos, el ST213, es netamente mexicano y prevalente en nuestro país. Interesantemente, la cepa predominante es mucho más resistente a anticuerpos bactericidas y más invasiva a monocitos humanos que la cepa de colección; y de manera selectiva puede contener un plásmido de resistencia a ceftriaxona y carecer del plásmido pSTV, el cual es determinante para la infección del ratón.

Es así que contamos con cepas novedosas que nos permitirán explorar la variabilidad intraespecie, así como diferentes aspectos de la regulación genética de los factores de virulencia conocidos, así como de otros por conocer, a través de ensayos de invasión a monocitos y la genómica.

Fuentes de financiamiento 1. CONACyT, 46115Q 2. DGAPA/UNAM, IN201407 Alumno graduado Carmen Guadarrama. Maestría en Ciencias Bioquímicas, UNAM. Purificación de la porina OmpS1 de Salmonella enterica serovar Typhimurium: Implicaciones en la regulación y en estudios de inmunidad protectiva. 10 de agosto de 2007. Tutor Edmundo Calva. Publicaciones 1. Rosas, I., Salinas, E., Martínez, L., Calva, E., Cravioto, A., Eslava, C. and Amabile, C. (2006). Urban dust fecal pollution in Mexico City: antibiotic resistance and virulence factors of Escherichia coli”. International Journal of Hygiene and Environmental Health 209: 461-470. 2. Ramírez-Trujillo, J.A., Encarnación, S., Salazar, E., García de los Santos, A., Dunn, M.F., Emerich, D.W., Calva, E. and Hernández-Lucas, I. (2007). Functional characterization of Sinorhizobium meliloti acetate metabolism genes aceA, SMc00767 and glcB.” Journal of Bacteriology 189: 5875-5884. 3. De la Cruz, M.A., Fernández-Mora, M., Guadarrama, C., Flores-Valdez, M.A., Bustamante, V.H., Vázquez, A. and Calva, E. (2007). LeuO antagonizes H-NS and StpA-dependent repression in Salmonella enterica ompS1”. Molecular Microbiology 66: 727-743. 4. Hernández-Lucas, I., Gallego-Hernández A.L., Encarnación. S., Fernández-Mora, M., Martínez-Batallar, A.G., Salgado, H., Oropeza, R. and Calva, E. (2008). The LysR-type transcriptional regulator LeuO controls the expression of several genes in Salmonella enterica Serovar Typhi”. Journal of Bacteriology 190: 1658-1670. Docencia 1. Profesor del curso “Advanced Workshop on Food Safety and Food Microbiology”. Universidad Ain Shams, Cairo, Egipto

(American Society for Microbiology), 4-8 Nov, 2007. 2. Profesor del curso “Métodos de Investigación”, Centro Universitario Anglo Mexicano (preparatoria), 2008. 3. Cátedra de Fisiología Microbiana, para alumnos de la Facultad de Ciencias, UNAM (R. Oropeza), 2003- 4. Cátedra de Inmunología, Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma del Estado de Morelos (I. Secundino), 2007- Distinciones 1. Elected Fellow, American Academy of Microbiology, Washington DC, 2006. 2. Presidente (Chair), International Membership Committee, American Society for Microbiology, 2005-2011 (Diseño y coordinación de actividades de investigación y educativas en microbiología a nivel mundial). 3. Presidente (Chair), Jurado del International Member of the Year Award, American Society for Microbiology, 2005-2011. 4. Miembro, Nominations Committee, American Academy of Microbiology, 2007-2010. 5. Miembro de la Comisión Dictaminadora Revisora (Biotecnología), Sistema Nacional de Investigadores, 2008.

Otras actividades 1. Miembro, Comisión de Evaluación del Fondo Mixto de Fomento a la Investigación Científica y Tecnológica CONACYT-Morelos, Consejo Estatal de Ciencia y Tecnología, 2008- 2. Miembro, Comité de Ciencia Básica (Biología y Química) Conacyt, 2006-2007. 3. Árbitro (Reviewer) de manuscritos para las revistas: Molecular Microbiology, Journal of Molecular Biology, Microbial Ecology, y Microbiology. 4. Árbitro de proyectos para la National Science Foundation, EUA.

Divulgación

“El valor cultural de la ciencia”. Calva, E. Editorial en “La Unión de Morelos”, 28 de enero de 2008, pág. 37.

Distinciones a miembros del grupo -Ismael Hernández-Lucas, Investigador Nacional Nivel II, 2008. -Alejandra Vázquez, Investigador Nacional Nivel I, 2008 -Ismael Secundino, Candidato a Investigador Nacional, 2008

Utilización diferencial de σ70 y σ38 en la transcripción de los genes

glicolíticos y de dos genes involucrados en la transformación de piruvato en AcCoA, como una

respuesta adaptativa a la limitación de carbono en

Escherichia coli.

Francisco Gonzalo Bolívar Zapata Departamento de Ingeniería Celular y

Biocatálisis Integrantes de Grupo (2007-2008) -Adelfo Escalante Lozada, Inv. Tit. A. Investigadores Postdoctorales -Juan Carlos Sigala Alanís Técnicos Académicos -Noemí Flores Mejía, Tec. Acad. Tit. C. -Ramón de Anda Herrera, Tec. Acad. Tit. C -Elena Arriaga Arellano, Tec. Acad. Tit. A. -Mercedes Enzaldo de la Cruz, Tec. Laboratorista. Estudiantes de doctorado -Karla Martínez Gómez. Estudiantes de maestría -César Augusto Aguilar Martínez. -José Alberto Rodríguez Ruiz.

Resumen

En Escherichia coli la glucosa se transporta a través del sistema de transferencia de fosfato del fosfoenolpiruvato al carbohidrato (PTS). Nuestro trabajo previo ha demostrado que las cepas carentes de este sistema PTS, como PB11, crecen muy lento en glucosa (µ= 0.1hr-), han reducido la expresión de los genes glicolíticos y sobreexpresan los genes poxB y acs.

Los productos proteicos de estos dos

genes están involucrados en una ruta alternativa para la producción de AcCoA a

partir de piruvato. La inactivación de rpoS, el gene que codifica para la subunidad σ38 de la RNA polimerasa, que es utilizada en condiciones de crecimiento no óptimo reduce aún más (50%) la velocidad específica de crecimiento (µ), de esta cepa, indicando que el factor σ38 juega un papel central en la expresión de los genes del metabolismo central en células de crecimiento lento. En la presentación, se expondrán los estudios realizados en colaboración con el grupo del doctor Enrique Morett, en los que se estudia a nivel molecular el papel de los diferentes factores σ38 y σ70, en la expresión de estos genes del metabolismo central. Determinamos los sitios de iniciación de la transcripción (TSSs) y los promotores de todos los genes glicolíticos, y de poxB y acs en las cepas parental JM101, PB11PTS-, PB12 (un derivado de PB11 que ha recuperado parcialmente su capacidad de crecimiento en glucosa), y de los derivados rpoS- de estas cepas, utilizando una modificación de la metodología 5'RACE y pirosecuenciación. Interesantemente, todos estos genes fueron transcritos por ambos factores sigma, normalmente a partir de promotores sobrelapados que inician transcripción en el mismo sitio. En algunos casos, la ausencia de PTS genera TSSs alternativos correspondientes a promotores σ38. Identificamos varios nuevos promotores y confirmamos varios otros, que habían sido ya reportados o propuestos. Experimentos de transcripción in vitro de algunos de estos genes, corroboran la funcionalidad de estos promotores. La presencia de ambos promotores dependientes de σ38 y σ70 en todos los genes glicolíticos, provee plasticidad para la expresión estos genes centrales del metabolismo, como una respuesta adaptativa a la limitación de glucosa, permitiendo la expresión diferenciada de estos genes en condiciones de crecimiento óptimo y limitado por la fuente de carbono. El trabajo también permitió comprender que en condiciones de crecimiento limitado de carbono, la célula utiliza importantemente el sistema PoxB-Acs reduciendo el papel de la piruvato deshidrogenasa, para transformar el piruvato en AcCoA. Este es un mecanismo que aparentemente opera para preservar esqueletos de carbono cuando E. coli crece lento en glucosa.

Alumnos graduados Juan Carlos Sigala Alanís. Doctorado en Ciencias Bioquímicas. 25 de noviembre 2008. Publicaciones

1. Flores, N., Escalante, A., de Anda, R., Báez, J.L., Merino, E., Franco, B., Georgellis, D., Gosset, G. and Bolívar, F. (2008). New insights on the role of the sigma factor RpoS as revealed in Escherichia coli strains lacking the phosphoenolpyruvate:carbohydrate phosphotransferase system. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 14: 176-192, (2008).

2. Lara, A.R., Caspeta, L., Gosset, G. Bolívar, F. and Ramírez, O.T. (2008). Utility of an Escherichia coli strain engineered in the substrate uptake system for improved culture performance at high glucose and cell concentrations: an alternative to fed-batch cultures. Biotechnology and Bioengineering. 99(4): 893-901.

3. Martínez, K., de Anda, R., Hernández, G., Escalante, A., Gosset, G., Ramírez, O.T. and Bolívar, F. (2008). Coutilization of glucose and glycerol enhances the production of aromatic compounds in an Escherichia coli strain lacking the phosphoenolpyruvate: carbohydrate phosphotransferase system. Microbial Cell Factories. 7: 1.

4. Huerta-Beristain, G., Utrilla, J., Hernández-Chávez, G., Bolívar, F., Gosset, G. and Martínez, M. (2008). Specific ethanol production rate in ethanologenic Escherichia coli strain KO11 is limited by pyruvate decarboxylase. Journal of Molecular Biology and Biotechnology, 15: 55-64.

5. Escalante, A., Giles-Gómez, M., Hernández, G., Córdova-Aguilar, M.S., López-Munguía, A., Gosset, G., Bolívar, F. (2008). Analysis of bacterial community during the fermentation of pulque, a traditional Mexican alcoholic beverage, using a polyphasic approach. International Journal of Food Microbiology. 124: 126-134.

6. Orencio-Trejo, M., Flores, N., Escalante, A., Hernández-Chávez, G., Bolívar, F., Gosset, G. and Martínez, A. (2008). Metabolic regulation analysis of an

ethanologenic Escherichia coli strain based on RT-PCR and enzymatic activities. Biotechnology for Biofuels. 1 (8):1-13.

7. Caspeta, L., Flores, N., Pérez, N.O., Bolívar, F., Ramírez, O.T. (2008). The effect of heating rate on Escherichia coli metabolism, physiological stress, the transcriptional response, and production of temperature-induced recombinant protein: a scale-down study. Biotechnology and Bioengineering.

8. Sigala, J.C., Flores, S., Flores, N., Aguilar, C., de Anda, R., Gosset, G. and Bolívar, F. (2008). Acetate metabolism in Escherichia coli strains lacking phosphoenolpyruvate:carbohydrate phosphotransferase system; evidence of carbon recycling strategies and futile cycles. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. (En prensa).

9. Chávez-Béjar, M.I., Lara, A.R., López, H., Hernández-Chávez, G., Martinez, A., Ramírez, O.T., Bolívar, F. and Gosset, G. (2008). Metabolic engineering of Escherichia coli for L-tyrosine production by the expression of the genes coding for the chorismate mutase domain from native P-protein and a cyclohexadienyl dehydrogenase from Zymomonas mobilis. Applied and Environmental Microbiology. (En prensa). Capítulos de libro 1. Bolívar, F. (2008). Ciencia, (bio)tecnología y sociedad. En: Perspectivas de Bioética, J. González (Coordinadora), UNAM/FCE, México, D.F. 356-380. Divulgación -Se impartieron 15 conferencias de divulgación, la mayor parte de ellas en mi calidad de miembro de El Colegio Nacional. Participación en Cuerpos Colegiados

1. Como miembro de la Junta de Gobierno de la UNAM, participó en la elección de 15 directores.

2. Participó como miembro de la Junta de Gobierno de CONACYT en el análisis y evaluación de los informes de la Dirección General y de propuestas de modificación a diferentes Reglamentos.

Organización de eventos académicos -Coorganizador como representante de la Academia Mexicana de Ciencias, del "Seminario de Ciencia, Tecnología y Derecho". Este Seminario se realizó como una de las actividades del Convenio de Colaboración celebrado entre la Suprema Corte de Justicia y la AMC. Distinciones 1. Doctorado /Honoris Causa/ de la Universidad Autónoma Metropolitana, México, D.F. Otorgado en Noviembre 2007. Recibido en Octubre 2008. 2. Miembro vitalicio de El Colegio Nacional.

Citas bibliográficas -Los trabajos de Francisco Bolívar han recibido más de 12,500 citas, incluyendo 800 en libros. Colaboraciones con diferentes grupos Durante el año se colaboró con los grupos de investigación de los doctores, Guillermo Gosset, Octavio Tonatiuh Ramírez, Enrique Morett y Dimitris Georgellis.

Mecanismos que utilizan las raíces para dirigirse de ambientes

secos a húmedos

Gladys I. Cassab López Departamento de Biología Molecular de

Plantas Integrantes de Grupo (2007-2008)-Georgina Ponce Romero. (Efecto del campo magnético pulsante en el desarrollo de las plantas; Localización de proteínas novedosas y específicas de cofia durante la respuesta gravitrópica y desarrollo de raíces de maíz; y Análisis genético y fisiológico del hidrotropismo en Arabidopsis). -Francisco Roberto Quiroz Figueroa. (Aislamiento de plantas mutantes sin respuesta hidrotrópica y tolerantes al estrés hídrico en Arabidopsis; Identificación del gen NHR1 en la mutante no hidrotrópica mediante el método de tilling; Efecto de algunos estreses abióticos (osmótico, salino, calor) en el crecimiento y desarrollo de mutantes no hidrotrópicas en Arabidopsis; Análisis del papel del ABA en la respuesta hidrotrópica y tolerancia a la sequía en la mutante nhr1 de Arabidopsis. Investigadores Posdoctorales -Elizabeta Hernández Domínguez (Respuesta fotomorfogénica de las mutantes hidrotrópicas nhr1 y suh1). Técnicos Académicos -María Eugenia Campos Torres (Expresión génica específica en la cofia de la raíz de Zea mays; Respuesta fotomorfogénica de las mutantes hidrotrópicas nhr1 y suh1; Aislamiento y caracterización de mutantes sin respuesta hidrotrópica en Arabidopsis; Identificación del gene NHR1 en la mutante no hidrotrópica mediante el método de tilling; Mapeo fino de la mutante superhidrotrópica suh1). Estudiantes -Adrián Rodríguez Acosta -Albina Bahena González -Berenice Herrera Alvarez -Catalina Puente Cedillo

-Cinthia Gemalit Martínez -Luis Alberto Romero Carachuri -Magnolia Hermenegilda Rogel Martínez -María de los Angeles González Delgado -Nadia Berenice Porras González -Yulemi Escamilla Díaz Personal Administrativo -Biól. Manuel Saucedo Ramírez -Carmelita Gante Villa -Adriana Montserrat

Resumen

Las plantas, a diferencia de los animales, son sésiles. Por ello, deben completar su ciclo de vida en la locación donde germinaron. De ahí que, hayan evolucionado varios mecanismos que regulan la orientación del crecimiento de sus órganos (tallos, hojas, raíces) de acuerdo a las señales ambientales a las que se enfrentan día con día. Esto les permite tanto adquirir recursos esenciales (agua y nutrientes) como evitar estreses (patógenos, obstáculos, etc.). Uno de estos mecanismos es el hidrotropismo, o crecimiento de la raíz dirigido por gradientes de humedad. La cofia, localizada en la punta de la raíz, es el tejido responsable de percibir diferentes estímulos, tal y como gradientes de humedad, gravedad, obstáculos, nutrientes, temperatura, etc., etc. A pesar de que la falta de agua es uno de los problemas agrícolas mas recurrentes a nivel mundial, existen muy pocos estudios sobre hidrotropismo. Nosotros estudiamos al hidrotropismo mediante enfoques genético y fisiológico. Hasta la fecha, hemos identificado dos genes que participan en este mecanismo tan importante para la sobrevivencia de las plantas, uno de ellos, NHR1, aparentemente es indispensable para el desarrollo de la respuesta hidrotrópica y el otro, SUH1, permite que la raíz primaria crezca temporalmente en ambientes secos o desfavorables y alcance ambientes húmedos. La mutante suh1, o super-hidrotrópica, aparentemente es resistente al estrés hídrico ajustando el potencial osmótico de las células de la cofia de la raíz, lo cual le permite mantener a diferencia de la plántula silvestre no solo el crecimiento de la raíz primaria sino la formación y desarrollo de raíces laterales. Hemos determinado la capacidad super-

hidrotrópica de la mutante suh1 en diferentes sistemas in vitro que permiten visualizar el crecimiento dirigido de las raíces hacia el ambiente mas húmedo, independientemente de su locación con respecto al vector de la gravedad, o de que si las raíces tengan que cruzar un espacio sin sustrato para llegar al ambiente mas favorable. La expresión fenotípica de la arquitectura radicular es por lo general dependiente de cada especie. Sin embargo, la mutación suh1 cambia por completo la arquitectura radicular de Arabidopsis, así como la profundidad a la cual las raíces son capaces de descender y accesar agua. Este cambio en la arquitectura radicular se observa exclusivamente cuando se presentan gradientes de potencial de agua en el medio de prueba, ya que cuando las condiciones son favorables el sistema radicular de suh1 es similar al de la planta silvestre. De ahí, esta mutación simula el fenotipo de varias especies desérticas con sistemas radiculares muy profundos. Por otro lado, el sistema radicular muy ramificado de suh1 no se observa en otras condiciones ambientales, tal como la deficiencia de fosfatos, por lo que únicamente se induce bajo condiciones de déficit hídrico. Nuestros estudios han permitido establecer que la respuesta hidrotrópica de la raíz y el regulador del crecimiento, ácido abscísico (ABA), influyen considerablemente el desarrollo de la arquitectura del sistema radicular. Financiamiento -CONACyT Ciencia Básica: 46022Q. -DGAPA: 224103 y 220807. -University of California, Institute for Mexico and the United States (UC Mexus). Alumnos graduados -Marco Amed Salazar Blas. Biólogo. Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Autónoma del Estado de Morelos. “Efecto del estrés hídrico sobre el crecimiento y desarrollo en las mutantes nhr1 (no hydrotropic response) y suh1 (superhydrotropic) de Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia-0”. 7 de Junio 2008. Tutor Francisco Quiroz.

-Edith del Rocío García Hernández, Doctora en Ciencias (Biología), Facultad de Ciencias, UNAM “Proteínas estructurales de flores de tres especies vegetales”. 7 de agosto de 2008. Tutor Gladys Cassab. -Fátima Azucena Rasgado Bonilla, Bióloga, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Autónoma del Estado de Morelos con la tesis titulada: “Degradación de almidón en la raíz silvestre de Arabidopsis thaliana durante la respuesta hidrotrópica”. 21 de agosto de 2008. Tutor Georgina Ponce. Publicaciones

1. Avila-Fernandez, A., Olvera-Carranza, C., Rudiño-Piñera, E., Cassab, G.I., Nieto-Sotelo, J. and López-Munguía, A. (2007). Molecular characterization of sucrose: sucrose 1-fructosyltransferase (1-SST) from Agave tequilana Weber var. Azul. Plant Science 173: 478-486.

2. Ponce, G., Rasgado, F. and Cassab, G.I. (2008). Roles of amyloplasts and water deficit in root tropisms. Plant, Cell & Environment 31: 205-217.

3. Ponce, G., Rasgado, F. and Cassab, G.I. (2008). How amyloplasts, water deficit and root tropisms interact? Plant Signaling & Behavior 3: 460-462. Capítulos en Libros 1. Cassab, G.I., & Sánchez-Guevara, Y. (2007) Capacidad motriz de las plantas. In: Fisiología Vegetal, (Francisco Squeo & Liliana Cardemil, eds). Ediciones Universidad de La Serena, La Serena, Chile pp.

2. Cassab, G.I. (2008) Other tropisms and relationship to gravitropism. In: Plant tropisms (S. Gilroy & P. H. Masson, eds.). Blackwell Publishing, London, England, pp. 123-139.

3. Cassab, G. I. & Sánchez, Y. (2008) Y sin embargo, las plantas se mueven. In: Una ventana al quehacer científico. Instituto de Biotecnología, 25 años, UNAM. Impresora Apolo, S.A. de C.V., pp. 213-222. (ISBN: 978-970-32-4658-8).

Docencia -Participación en el Curso de Biología Celular, Posgrado, IBt-UNAM. -Coordinadora y participante en el Curso de Biología Vegetal, Posgrado, IBt-UNAM.

Otros -Organización y Miembro del Comité Académico del 19avo Congreso de la Sociedad Internacional de Reguladores de Crecimiento de Plantas (19th IPGSA Meeting) en el Hotel NH Krystal de Puerto Vallarta, Jalisco, que tuvo lugar del 21 al 25 de Julio de 2007. -Meeting report: 4th Plant Neurobiology Symposium, An Overview. G. I. Cassab. Plant Signaling & Behavior 3: 755-757.

Lo que los rotavirus nos pueden enseñar sobre la biología de la

célula

Susana López Carretón Departamento de Genética del Desarrollo y

Fisiol. Molecular Integrantes de Grupo (2007-2008) Pavel Isa Ernesto Mendez Victoria Pando Tomas Lopez Técnicos Rafaela Espinosa Pedro Romero Gabriela Aguirre Estudiantes de doctorado Hilda Montero Margarito Rojas Camilo Ayala Rosa Ma Rubio Michelle Gutierrez Vicenta Treviño Daniela Silva Liliana Maruri Estudiantes de maestría Miguel Angel Martinez Marco Aurelio Diaz Marco Antonio Espinoza Diana Escobar Maria de Lourdes Gandara Estudiantes de licenciatura Maria Dolores Soto Federico Sanchez Quinto Selene Tomas Personal Administrativo Miguel Angel Olvera Silvia Flores Lorena Salazar

Resumen Los rotavirus son la causa principal de las diarreas deshidratantes severas en niños menores de dos años, causando aproximadamente 600 mil muertes cada año, a nivel mundial. Estos virus están formados por tres capas concéntricas de proteína que rodean al genoma viral, el cual está compuesto por once segmentos de RNA de doble cadena. El ciclo replicativo de estos virus se puede dividir en tres fases principales: La unión y penetración a la célula huésped, la cual está restringida por el tropismo del virus; la transcripción y replicación el genoma viral; y la morfogénesis y salida de la progenie viral. A lo largo de estos procesos el virus toma el control de la maquinaria biosintética de la célula y la utiliza a su favor. Durante todos estos pasos existen interacciones continuas entre las proteínas virales y celulares, que son necesarias par dar lugar a una infección productiva. En nuestro laboratorio nos hemos propuesto caracterizar las interacciones de los rotavirus con su célula huésped, identificando las moléculas celulares y virales que participan en estas interacciones, así como la relevancia de las mismas en la replicación del virus, para comprender detalladamente los mecanismos por los cuales los rotavirus ingresan a su célula huésped y son capaces de establecer una infección productiva basada principalmente en controlar la maquinaria biosintética de la célula huésped. También proponemos determinar cuáles son las proteínas celulares indispensables para la replicación de los estos virus, utilizando una estrategia global, que abarque todo el genoma de la célula huésped, basada en el uso de una biblioteca de microRNAs capaces de silenciar la mayor parte de los genes del genoma humano. Además, planeamos caracterizar cuales mensajeros celulares son traducidos durante la infeccion por rotavirus, condicion en la que hay una seria restricción en la síntesis de proteínas. Estos estudios deberán mejorar nuestro entendimiento general de la biología y la patogénesis de los rotavirus particularmente y contribuir a abrir nuevas avenidas para alcanzar medidas de control racionales contra este agente viral.

Fuentes de financiamiento. HHMI, DGAPA, CONACyT Alumnos Graduados 1. Liliana Maruri. Doctorado en Ciencias Bioquímicas. 2008. Tutor C. Arias. 2. Michelle Gutierrez. Maestría en Ciencias Bioquímicas. Caracterización de la vía de entrada de la cepa humana de rotavirus Wa. 8 de Mazo 2007. 3. Rosa Rubio. Maestría en Ciencias Bioquímicas. Caracterización de papel de las proteínas eIF4E, eIF4GI y eIF4GII en la infección por rotavirus. 23 Octubre 2007. 4. Hilda Montero. Doctorado en Ciencias Bioquímicas. Regulación de la síntesis de proteína celular y viral durante una infección por rotavirus. 15 Junio 2007. Publicaciones 1. Broquet, A.H., Lenoir, C., Gardet, A., Sapin, C., Chwetzoff, S., Jouniaux, A.M., López, S., Trugnan, G., Bachelet, M. and Thomas, G. (2007). Hsp70 negatively controls rotavirus protein bioavailability in Caco-2 cells infected by the rotavirus RF strain. J Virol. 81:1297-1304. 2. Montero, H., Rojas, M., Arias, C.F., and López, S. (2008). Rotavirus infection induces the phosphorylation of eIF2{alpha}, but prevents the formation of stress granules. J. Virol. 82:1496-1504. 3. Isa, P., Gutiérrez, M., Arias C.F. and López, S. (2008). Rotavirus cell entry. Future Virology 3: 135-146. 4. Maruri-Avidal, L., López, S., and Arias, C.F. (2008). Endoplasmic Reticulum Chaperones Are Involved in the Morphogenesis of Rotavirus Infectious Particles. J. Virol. 82: 5368-5380.

Capítulos en Libros 1. Marta Argüello, Hilda Montero, Carlos Arias y Susana López. 2008. Cómo contienden los virus con el estrés” pp 167-177, en “Una ventana al quehacer científico”. A. Lopez, F. Rebolledo (Eds). Mexico D.F. ISBN 978-970-32-4658-8. 2. Tomás López, Daniela Silva, Susana López y Carlos Arias. 2008. RNA de interferencia: el silencio de los genes 2008. pp 109-119 en “Una ventana al quehacer científico”. A. Lopez, F. Rebolledo (Eds). Mexico D.F. ISBN 978-970-32-4658-8 3. Rojas, M., Ayala-Bretón C., López S 2008. “Biología Molecular de Rotavirus: Una mirada a través del RNA de interferencia” Mensaje Bioquímico, Vol XXXII. pp 149-162. Bustos I, Castañeda C, Oria J, Rendón E, Reyes H, and Romero I (eds) México D. F.(http://bq.unam.mx/mensajebioquimico). ISSN-1088-137X Divulgación -Gestión y coordinación del taller “Doctora por un día, por un día Doctor” En funcionamiento en el Museo Ambiental del parque ecológico de Chapultepec en Cuernavaca Morelos UNIVERSUM, del 30 de Abril del 2007 al 31 de Julio del 2007. Distinciones Premio TWAS en Biología 2008

Biocatálisis: de la Biología Molecular a la Síntesis Orgánica

Agustín López-Munguía Canales

Departamento de Ingeniería Celular y Biocatálisis

Integrantes de Grupo (2007-2008)Clarita Olvera Edmundo Castillo Técnicos María Elena Rodríguez Fernando González Investigadores Posdoctorales Ignacio Regla Jaime Priego Personal de apoyo Aurelia Ocampo Judith Uribe Estudiantes Moreno Alina, Torres Alejandro, Ávila Angela, Mena Arlette, Centeno Sara, Otero Anabel, Miranda Alfonso, Muñoz Ivan, Ponce Edith y Hernández Alberto Gabriel.

Resumen

Nuestro trabajo se ubica dentro de las diversas disciplinas que conforman la Biocatálisis: la biología molecular, la bioingeniería, la bioquímica y la microbiología, todas indispensables dentro de nuestro quehacer.

Las glicosiltransferasas (GTFs), son enzimas con las que hemos venido trabajando desde los inicios del grupo, y en las que hemos logrado aportes tanto a nivel básico como aplicado. Después de haber aislado el gen de la inulosacarasa (islA) de Leuconostoc citreum y proponer que esta enzima (IslA) es una quimera natural con características combinadas entre glucosil (GT)- y fructosiltransferasas (FT), hemos identificado 3 FTs más con esta misma arquitectura: LevS de L.mesenteroides B512F la cepa que se utiliza en la industria para la producción de dextrana; Lev C y Lev

L de L.mesenteroides ATCC 8293 cuyo genoma ha sido secuenciado y liberado. A partir de esta información hemos propuesto la existencia de una subfamilia de FTs dentro de la familia 68 de las Glicosyl hidrolasas que contiene a las FTs con dos dominios adicionales, de los cuales destaca en C terminal proveniente de las glucosil-transferasas,

En este período avanzamos sustantivamente en dos estrategias, tendientes a contestar la pregunta sobre ¿Cuál es la función del dominio C-terminal adquirido por las FT?. Una dirección es a través de la construcción de enzimas truncadas total o parcialmente de este dominio y otra, a través de la construcción de quimeras de enzimas de las enzimas unidominio, a las cuales hemos fusionado el C terminal de GTs total o parcialmente. Las conclusiones de estas líneas se encuentran en las publicaciones que se anexan y serán tema del informe 2008.

En lo que a la relación estructura-función del dominio catalítico de la FT, logramos importantes avances en la obtención de mutantes sitio-dirigidas de la levansacarasa de B.subtilis que dieron lugar a variantes con propiedades de sumo interés, como son la eliminación de la síntesis de polímero (levana) y la orientación de la actividad hacia la síntesis de oligosacáridos, en lo que a especificidad se refiere, así como un considerable efecto en la estabilidad y en la activación en presencia del polímero. Con la enzima silvestre y algunas de las mutantes se elaboraron biocatalizadores que van desde cristales catalíticos hasta agregados de las enzimas purificadas, mismos que fueron caracterizados y comparados con bio-catalizadores elaborados por inmovilización covalente en soportes tradicionales.

Siendo la síntesis de oligosacáridos y la fructosilación una línea de sumo interés para el grupo, logramos aislar el gen del agave que inicia la síntesis de inulina a través de la enzima 1-SST y estudiamos las propiedades de la enzima expresada en P.pastoris e iniciamos un proyecto de desarrollo tecnológico, vinculado con los productores de Agave del estado de Morelos, con el fín de hacer más eficiente el proceso de extracción de inulina de agave y encontrar vías de diversificación en la transformación de estos azúcares. En esta

dirección, estudiamos ampliamente la cinética de hidrólisis de fructanas de muy diversos orígenes cuando se someten a la acción de enzimas comerciales (mezcla de exo y endo inulinasas) así como de exo inulinasas termoresistentes, provenientes de T.maritima producida en el laboratorio. Iniciamos también u proyecto en el que buscamos encontrar la enzima y el proceso idóneos para obtener fructooligosacáridos a partir de inulina de agave.

Nuestro interés por la glicosilación surge de la complejidad de este proceso en el área de la Química Orgánica. De esta manera, se ha estudiado la fructosilación de compuestos polifenólicos con actividad antioxidante y de interés en la industria farmacéutica, con el el fin de conferirles mayor estabilidad, mejor comportamiento farmacocinético y aumentar su hidrofilicidad. Además, se ha propuesto un método eficiente de galactosilación de diferentes polioles utilizados como precursores de agentes anti-inflamatorios.

Uno de los proyectos que nos han permitido integrar las dos principales vertientes sintéticas abordadas en nuestro grupo (glicosilación-acilación), es la síntesis de agentes antioxidantes bifuncionales del tipo glicósidos de fenilpropanoides. En este sentido, el proceso de glicosilación de alcoholes aromáticos y su posterior acilación, ambas reacciones catalizadas enzimáticamente, permitió la síntesis de una batería de compuestos con propiedades antioxidantes mejoradas, en un proyecto de postdoctorado concluido a inicios de este año.

El otro reto de nuestro grupo es la búsqueda de enzimas, condiciones de reacción, y de alguna manera también sustratos, que nos permitan poner en evidencia la manipulación de la quimio- regio- o enantioselectividad en la biocatálisis, particularmente de las reacciones catalizadas por las lipasas. En esa dirección ya hemos establecimos los parámetros que hacen posible efectuar reacciones de hidrólisis de amidas utilizando lipasas como biocatalizador y en este período lo aplicamos a un caso concreto de interés industrial: la síntesis de un derivado de la capsaicina que por su efecto denominamos ultra-potente. Se publicó también una nueva ruta para la síntesis de análogos de Metoprolol basada en una

resolución enzimática quiral. Basados en estos resultados y en los resultados obtenidos en el control termodinámico de los procesos de síntesis de amidas, habíamos ya descrito el método enzimático “easy-on easy-off” –cuya publicación ahora reportamos- para la resolución efectiva de mezclas racémicas de amidas aromáticas mediante el uso de un solo catalizador. Ahora reportamos, como la lipasa puede catalizar la llamada “síntesis de Michael” de manera preferente sobre la amidación, aprovechando la promiscuidad catalítica de las lipasas. Finalmente nos encaminamos hacia la descripción y predicción termodinámica del comportamiento de las lipasas en lo que a quimio-selectividad se refiere. Esto primeramente en mezclas de alcoholes y aminas, y posteriormente de manera directa en moléculas bifuncionales. Para este fin, y después de una estancia sabática del Dr E. Castillo en el INSA de Toulouse, contamos con un paquete computacional que nos permite a partir de mediciones de química cuántica, predecir las actividades termodinámicas de nuestros compuestos en cualquier solvente, para a partir de ahí, definir condiciones de equilibrio y finalmente de viabilidad de reacción. Alumnos graduados Doctorado: Morales Sandra , Del Moral Sandra y Ortiz Soto Maria Elena. Maestría: Mena Arlette y Muñoz Gutiérrez Iván Licenciatura: Enciso Rodríguez Andrés. Publicaciones

1. Chemoenzymatic synthesis of the potential antihypertensive agent (2R,2'S)-b-hydroxyhomometoprolol. Tetrahedron: Asymmetry (aceptado)

2. An aceptor-substrate binding site determining glycosyl transfer emerges from mutant análisis of a plant vacuolar invertase and a fructosyltransferase. Altenbach D. Rudiño-Pinera E., Olvera C., Boller T, Wiemken A & Ritsema T. . Plant. Mol. Bio. Doi 10.1007/s11103-008-9404-7 (aceptado) (Artículo de portada)

3. Castillo,E. Regla,I. Demare,P. Luviano-Jardon,A. Lopez-Munguia,A. 2008. Efficient Chemoenzymatic Synthesis of

Phenylacetylrinvanil: An Ultrapotent Capsaicinoid. Synlett (aceptado) doi: 10.1055/s-0028-1083521

4. Jaime Priego, Claudia Ortiz-Nava, Manuel Carrillo-Morales, Agustín López Munguía, Jaime Escalante & Edmundo Castillo. Sovent engineering: an effective tool to direct chemoselectivity in a lipase calatyzed Michael Addition.2008. Tetrahedron. : Asymmetry doi:10.1016/j.tet.2008.10.103

5. Ortiz-Soto,M.E. Rivera,M. Rudino-Pinera,E. Olvera,C. Lopez-Munguia,A. 2008. Selected mutations in Bacillus subtilis levansucrase semi-conserved regions affecting its biochemical properties Protein Engineering Design & Selection 21 589-595.

6. Damian-Almazo,J.Y. Moreno,A. Lopez-Munguia,A. Soberon,X. Gonzalez-Munoz,F. Saab-Rincon,G. 2008. Enhancement of the alcoholytic activity of {alpha}-amylase AmyA from Thermotoga maritima MSB8 (DSM 3109) by site directed mutagenesis Appl.Environ.Microbiol 74 5168-5177.

7. Escalante,A. Giles-Gomez,M. Hernandez,G. Cordova-Aguilar,M.S. Lopez-Munguia,A. Gosset,G. Bolivar,F. 2008. Analysis of bacterial community during the fermentation of pulque, a traditional Mexican alcoholic beverage, using a polyphasic approach Int J Food Microbiol 124 126-134.

8. Del Moral S. Olvera,C. Rodriguez,M.E. Lopez-Munguia A. 2008. Functional role of the additional domains in inulosucrase (IslA) from Leuconostoc citreum CW28 BMC Biochemestry vol. 9, pp 1-10.

9. Olvera,C. Fernandez-Vazquez,J.L. Ledezma-Candanoza,L. Lopez-Munguia,A. 2007. Role of the C-terminal region of dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides IBT-PQ in cell anchoring Microbiology 153 3994-4002.

9. Torres-Gavilan,A. Escalante,J. Regla,I. Lopez-Munguia,A. Castillo, E. 2007. Easy-on Easy-off resolution of chiral 1-phenylethylamine catalyzed by Candida antarctica Lipase B Tetrahedron: Asymmetry 18, 2621-2624.

10. Vazquez-Limon,C. Vega-Badillo,J. Martinez,A. Espinosa-Molina,G. Gosset,G. Soberon,X. Lopez-Munguia,A. Osuna,J. 2007. Growth rate of a non-fermentative

Escherichia coli strain is influenced by NAD(+) regeneration Biotechnology Letters. 29 1857-1863.

11. Avila-Fernandez,A. Olvera-Carranza,C. Rudino-Pinera,E. Cassab,G.I. Nieto-Sotelo,J. Lopez-Munguia,A. 2007. Molecular characterization of sucrose: sucrose 1-fructosyltransferase (1-SST) from Agave tequilana Weber var. azul Plant Science 173, 478-486.

12. Castillo,E. Lopez-Gonzalez,I. De Regil-Hernandez,R. Reyes-Duarte,D. Sanchez-Herrera,D. Lopez-Munguia,A. Darszon,A. 2007. Enzymatic synthesis of capsaicin analogs and their effect on the T-type Ca(2+) channels Biochem Biophys.Res.Commun. vol. 356 pps. 424-430.

13. Olvera,C. Centeno-Leija,S. Lopez-Munguia,A. 2007. Structural and functional features of fructansucrases present in Leuconostoc mesenteroides ATCC 8293 International Journal of General & Molecular Microbiology. Antoine de Leeuvenhoek. 92, 11-20.

14. Castillo, E. Torres-Gavilan, A. Severiano, P. Ocaña A., Lopez-Munguia, A. 2007. Lipase-catalyzed synthesis of pungent capsaicin analogues Food Chemistry vol.100, No 3, 1202-1208. http://www.ibt.unam.mx/server/PRG.base?tipo:doc,dir:PRG.curriculum,par:altoga Divulgación -El Instituto de Biotecnología de la UNAM cumple 25 años. A. López Munguía. La Crónica, Abril 2007. -La vida Interior, A.López Munguía ¿Comoves? Año 9, 10-14 , 2007. -Azúcar: Mitos y Realidades. A. López Munguía. ¿Comoves? Abril, 2008. -La Química y la Alimentación. A. López Munguía. Dossier del final de la Tercera Unidad. Química de Secundaria. Editorial Castillo. 2007. -Una ventana al quehacer científico. Instituto de Biotecnología. Compilador y Coautor del capítulo: Fructosa, Fructanas y Frucotsiltransferasas. Olvera C., Castillo E. & López Munguía A. Editado por la DGDC, UNAM, Febrero 2008.

CD43, una molécula polifacética

Yvonne J. Rosenstein Azoulay Departamento de Medicina Molecular y

Bioprocesos Integrantes de Grupo (2007-2008) -Gustavo Pedraza-Alva Técnicos Erika Melchy Oswaldo López Estudiantes de doctorado Ma. Elena Bravo Monserrat Alba Sandoval Estudiantes de maestría Cecilia Martinez Campos (Tutor G. Pedraza) Amiel Olivos (Tutor G. Pedraza) Estudiantes de licenciatura Laura Montero (Tutor G. Pedraza) Nohemí Camacho (Tutor G. Pedraza) Natasha Quevedo Alavaro Torres Mireille (Servicio social; Tutor G. Pedraza) Personal Administrativo Margarita Marquina (secretaria) Patricia Jarillo Alejandro

Resumen

El trabajo de nuestro grupo se enfoca esencialmente, aunque no exclusivamente, a entender el papel que juega la molécula CD43 en diferentes escenarios inmunológicos. CD43 es una glicoproteína transmembranal tipo I, considerada como una mucina, expresada por todas las células del sistema inmune. Es una de las moléculas mas abundantes de la superficie de las células linfoides (ocupa cerca del 20% de la superficie), y a través de vías de señalización especificas, ha sido implicada en procesos de proliferación, diferenciación, migración y muerte celular. Conocer las

señales intracelulares generadas a partir de la interacción de CD43 con sus contra-receptores ha sido parte de nuestra tarea durante el periodo 2007-2008. En particular, nos avocamos a la interacción CD43/Galectina-1 (Gal-1) y CD43/Albúmina Sérica Humana (HSA).

En este contexto, los resultados preliminares del estudio de la interacción de CD43 con HSA indican que esta interacción promueve sobreviviencia a través de activar la vía de PI3K/AKT en linfocitos T (LT). En base a estos resultados, predecimos que CD43 mediante su interacción con HSA promueve la sobreviviencia de LT en el torrente sanguíneo y que probablemente también este involucrada en la proliferación homeostática de los LT. Contrario al efecto biológico que desencadena CD43 al interactuar con HSA, su interacción con Gal-1 induce la muerte celular de LT activados. Una vez que los LT se activan y proliferan se enciende un programa de muerte conocido como AICD (Activation Induced Cell Death), el cual involucra la expresión de novo de moléculas que promueven la muerte celular como Fas y su ligando (Fas-L), un aumento en los niveles de secreción de Gal-1, entre otros. Otro de los cambios que ocurre durante la activación de linfocitos T es el cambio en las proporciones de dos isoformas de CD43: Un linfocito CD4 en reposo expresa mayoritariamente la isoforma de 115 KDa, la cual es sustituida durante el proceso de activación por la isoforma de 130 KDa, un proceso que depende de la enzima C2NT, el proceso de cambio de isoforma se hace patente aproximadamente 48 hr después de la activación inicial del LT. Encontramos que al interactuar con Gal-1, la isoforma de CD43 de 130 KDa promueve la muerte de LT CD4 activados y de monocitos. Interesantemente, encontramos también que los LT CD8 no activados, en los cuales aproximadamente el 50% de las moléculas de CD43 expresadas son de la isoforma de 130 KDa, también son susceptibles a la muerte inducida por Gal-1. En conjunto estos resultados sugieren que la isoforma de 130 KDa de CD43 regula la muerte inducida por Gal-1 en distintas células del sistema inmune. Este resultado podría tener implicaciones en el diseño de estrategias para controlar tumores que expresan Gal-1, ya que es bien sabido que muchos LT

mueren al tratar de infiltrar el tumor. Por otra parte, aunque hasta hace poco

la expresión de CD43 se consideraba exclusiva de células del sistema inmune, varios estudios documentan su expresión en riñón, cerebro e intestino. También se ha encontrado la expresión del RNA mensajero de CD43 así como de la proteína en ciertos tipos de tumores, en los que expresión de CD43 correlaciona con malignidad. Sin embargo, se desconocen el papel de CD43 y los mecanismos moleculares que regulan su expresión en células normales o tumorales de tejidos no linfoides. Nos hemos enfocado en tratar de elucidar si CD43 participa en el proceso de transformación celular o si su expresión es simplemente una consecuencia de dicho proceso, sin ninguna relevancia biológica. Los resultados de experimentos de ganancia y perdida de función de CD43 indican que las señales generadas por CD43 cooperan con aquellas de distintos protooncogenes y oncogenes como el receptor para el factor epidermal (EGFR) , Ras y la proteína E6 del virus del papiloma para promover transformación celular. Así, las señales de CD43 favorecen el crecimiento en agar blando, la formación de focos en monocapa y el proceso de cicatrización. Por otra parte, encontramos que la expresión de CD43 favorece la producción de citocinas proinflamatorias, quimiocinas y de factores de crecimiento como VEGF. En conjunto estos resultados sugieren que la expresión de CD43 en tumores de origen no linfoide (mama, colon y pulmón )favorece proliferación, migración y sobrevivencia celular.

La información generada de estos estudios es crucial para entender los eventos moleculares que regulan la inmunidad y el proceso de transformación celular, e indispensable para el desarrollo de terapias nuevas, diseñadas para modular facetas especificas de la respuesta inmune y detener el desarrollo de tumores.

Fuentes de financiamiento DGAPA IN219307 CONACYT U46505-M DGAPA IN-226206-3 (GPA) CONACYT 51198-M (GPA)

Alumnos graduados 1. José Luis Rivera Corona. Maestría en Ciencias Bioquímicas. Las señales de CD43 en linfocitos T CD4 y CD8 humanos. Marzo 2007 2. Maria Elena Bravo. Maestría en Ciencias Bioquímicas. Señales intracelulares generadas por la interacción CD43/ Sero Albumina Humana. Diciembre 2007 3. Constance Auvynet. Doctorado Faculté des Sciences Paris VI, Paris, Francia. Des peptides immunomodulateurs aux peptides opioides de la peau de rainettes latinoamericaines ou, l’originalité d’un modèle. (co-tutoria con el Dr. Pierre Nicolas). Junio 2007 4. María López Valenzuela. Licenciatura Facultad de Ciencias, UAEM, Morelos. CD43 regula la activación de la proteína cinasa C en macrófagos. Marzo 2007 5. Amiel Olivos Ortiz. Maestría en Ciencias Bioquímicas. EL papel de CD43 en células tumorales. Mayo 2008 Publicaciones

1. Aguilar-Delfin Irma, Fierro NA, Rosenstein Y: The molecule page for CD43, Signaling Gateway, Nature Publishing Group, 2007 doi:10.1038/mp.a000565.01

2. Prieto Moreno GA, Gonzalez Amaro R, Rosenstein Y: El enemigo más intimo. ¿Como ves?, Febrero 2007, pags.22-29 (la portada de la revista se refiere a este artículo).

3. Ramirez-Pliego, Escobar-Zárate D, Rivera-Martinez G, Cervantes-Vadillo M, Esquivel-Guadarrama FR, Rosas-Salgado G, Rosenstein Y & Santana MA: CD43 signals have a role in the type one lineage-commitment of human cells. BMC Immunology 2007, 8:30 doi:10.1186/1471-2172-8-30

4. Auvynet C, ElAmri C, Lacombe C, Bruston F, Bourdais J, Nicolas P & Rosenstein Y: Structural Requirements for Antimicrobial versus Chemoattractant Activities for Dermaseptin S9, FEBS J., 2008 275: 4134–4151; doi:10.1111/j.1742-4658.2008.06554.x

5. Pedraza-Alva g, Rosenstein Y: CD43: One molecule, many tales to reccount (review), Signal Transduction 2007, 7, 372 – 385

6. Thornton TM, Pedraza-Alva G, Deng B, Wood CD, Aronshtam A, Clements JL, Sabio G, Davis RJ, Matthews DE, Doble B, Rincon M.: Phosphorylation by p38 MAPK as an alternative pathway for GSK3beta inactivation. Science. 2008 320(5876):667-70.

7. Rosenstein Y & Pedraza-Alva G: La vida cotidiana de los linfocitos, o de los quehaceres de los inmunólogos, en “Una ventana al quehacer científico, libro conmemorativo del los 25 años del IBT, UNAM, A. López-Mungia & F. Rebolledo , compiladores, UNAM, 2008.

8. Kared H, Leforban B, Montandon R, Renand A, Layseca Espinosa E, Chatenoud L, Rosenstein Y, Schneider E, Dy M, Zavala F. Role of GM-CSF in tolerance induction by mobilized hematopoietic progenitors. Blood. 2008 112(6):2575-8.

9. Pedraza-Alva G, Fierro NA, Mérida LB., del Rio R, Cruz-Muñoz ME and Rosenstein Y. CD43 regulates the threshold for T cell activation by targeting Cbl functions (sometido)

10. Sacristán C,. Schattgen SA,. Berg LJ, Bunnell SC , Roy AL and Rosenstein Y: Novel characterization of the protein interaction between transcription factor TFII-I and the tyrosine kinase ITK in T lymphocytes (sometido)

11. Montiel JL, Monsiváis-Urenda A,

Figueroa-Vega N, Moctezuma JF, Burgos-Vargas R, González-Amaro R, and Rosenstein Y.: Anti-CD43 and anti-Galectin-1 autoantibodies in patients with systemic lupus erythematosus. Docencia -Biología Celular, Posgrado en ciencias Bioquímicas, IBT/UNAM -Inmunologia en la Licenciatura en Ciencias Genómicas (YR) Organización de eventos -Frontiers in Genomics (YR) Participación en cuerpos colegiados PAPIIT Comité de Bioética Distinciones SNI III (YR) SNI II (GPA)

Análisis de la respuesta molecular a patógenos y herida en plantas

Mario Rocha Sosa

Departamento de Biología Molecular de Plantas

Integrantes del Grupo (2007-2008) Investigadores -Helena Porta Ducoing (La muerte celular programada en los procesos de defensa y desarrollo de las plantas). Técnicos Elda Patricia Rueda Benítez Estudiantes de doctorado -María Teresa Maldonado Calderón (Participación del sistema ubicuitina-proteasoma en la regulación de la respuesta a estrés en plantas).

-Edgar Baldemar Sepúlveda García (Participación del sistema ubicuitina-proteasoma en la regulación de la respuesta a estrés en plantas).

-Alexis Acosta Maspons (Evaluación de la expresión diferencial de genes en plantas tratadas con oligosacarinas sintéticas).

Gustavo Pavón Meléndez (Análisis de la inducción de la síntesis de betacianinas en Beta vulgaris L. bajo condiciones de estrés oxidativo). Estudiantes de maestría -Luís Gastón Castillo Olamendi (La muerte celular programada en los procesos de defensa y desarrollo de las plantas). -Antonio Zavariz Vergara (La muerte celular programada en los procesos de defensa y desarrollo de las plantas). Personal Administrativo -Adriana M. Carreño Uribe (Secretaria) -Lilia Román Miranda (Secretaria) -Marta Trujillo Jiménez (Laboratorista) -Patricia Jarillo López (Laboratorista) -Lourdes Cazadero Rocha (Auxiliar)

Resumen

Las plantas están normalmente sujetas a una variedad de situaciones adversas, por lo mismo, estos organismos han desarrollado mecanismos de defensa que les permiten contender con un medio ambiente hostil. Gran parte de estos mecanismos involucran la inducción de genes específicos que codifican proteínas encargadas de la respuesta de defensa. En nuestro grupo nos dedicamos a tratar de comprender los mecanismos moleculares que le permiten a las plantas responder ante ciertos tipos de estrés como la herida, el ataque por patógenos o el estrés salino.

Durante el periodo 2007-2008 han sido dos las líneas de investigación en las cuales concentramos mayormente nuestros esfuerzos:

1) Participación del sistema ubicuitina-proteasoma en la regulación de la respuesta a estrés en plantas. El sistema ubicuitina-proteasoma es responsable de la degradación regulada de proteínas. En respuesta a una condición normal de desarrollo o en respuesta a factores ambientales, ciertas proteínas son marcadas mediante la unión de una cadena de poliubicuitina y de esta forma son reconocidas por el proteasoma y degradadas por este complejo de proteasas.

En la búsqueda de nuevos participantes en la respuesta de defensa de las plantas ante el ataque por patógenos, identificamos un gene, PvFBS1, cuyo mensajero se inducía en un cultivo de células en suspensión de frijol (Phaseolus vulgaris L.) por el tratamiento con un “elicitor” derivado de levadura. La acumulación del mensajero de PvFBS1 se induce en condiciones de estrés como son el ataque por patógenos, la herida o el estrés osmótico o salino. También reguladores del crecimiento como ácido jasmónico o ácido abscísico inducen la acumulación de este transcrito. La proteína PvFBS1 contiene una caja F, la cual es característica de una de las proteínas que forman parte del complejo SCF de ligasas de ubicuitina y que son las responsables de reclutar a la proteína que será ubicuitinada. Por lo tanto, muy probablemente PvFBS1 debe de participar en el reconocimiento y ubicuitinación de otra(s) proteína(s). En el genoma de Arabidopsis thaliana identificamos tres

genes que codifican para proteínas que presentan homología con PvFBS1. Actualmente estudiamos una de estas proteínas, la cual denominamos AtFBS1, ya que el gene de esta presenta un patrón de expresión muy semejante al de PvFBS1. En la búsqueda de posibles sustratos de AtFBS1 encontramos que ésta interactúa con proteínas 14-3-3, sin embargo, en el momento actual no conocemos el significado biológico de dicha interacción. Evidencia preliminar nos sugiere que la interacción con las proteínas 14-3-3 regula negativamente la acumulación de AtFBS1. Tenemos además evidencia de que existen otros mecanismos de regulación postranscripcional para AtFBS1 uno que involucra al proteasoma, ya que un inhibidor de éste provoca una acumulación mayor de esta proteína, además de que la remoción de la caja F causa también un incremento en los niveles de la misma. El otro mecanismo podría funcionar a nivel de la estabilidad de su transcrito y/o a través de regular su traducción, lo que sugiere que RNAs pequeños no codificantes podrían estar mediando la acumulación de AtFBS1.

2) La muerte celular programada (MCP) en los procesos de defensa y desarrollo de las plantas. Una de los mecanismos que emplean las plantas para defenderse del ataque por patógenos es la respuesta de hipersensibilidad (HR), ésta es un tipo de MCP que ocurre en las células en contacto con el patógeno y su función es la de aislar a éste. En la búsqueda de moléculas que pudieran participar en la HR iniciamos el estudio de una metacaspasa denominada AtMCP1b. Las metacaspasas son proteasas que al tener cierta semejanza con las caspasas en animales, se piensa podrían estar involucrada en procesos de MCP. El mensajero de AtMCP1b se acumula en respuesta a patógenos y en otras situaciones en donde ocurre muerte celular. En experimentos con fusiones del promotor de AtMCP1b a un gene reportero, encontramos que este promotor, además de activarse en respuesta a patógenos o herida, es muy activo en el sistema vascular de la planta y en la zona de abscisión de los pétalos y sépalos, por lo tanto consideramos que la actividad de esta metacaspasa no sólo es requerida en la defensa de la planta, sino que también es necesaria en situaciones normales de

desarrollo. AtMCP1b se localiza en el cloroplasto y por tanto nuestros esfuerzos en el momento actual se encaminan a tratar de averiguar como la metacaspasa AtMCP1b participa en procesos de MCP en este organelo. Para ello, hemos construido plantas transgénicas con el gene AtMCP1b bajo un promotor inducible y el análisis de las mismas se está iniciando. También estamos analizando el papel del ácido salicílico, hormona involucrada en la respuesta a patógenos y la muerte celular asociada a ésta, en la inducción del gene AtMCP1b y en el procesamiento de esta metacaspasa. Fuentes de financiamiento: -DGAPA, UNAM IN206907. Análisis de la función de la metacaspasa AtMCP1b de Arabidopsis thaliana durante la formación de nuevos haces vasculares y en la respuesta a estrés como la herida y la infección por patógenos. Periodo 07-09 -CONACYT 58761. El papel de la metacaspasa AtMCP1b las respuestas a estrés en Arabidopsis thaliana. Periodo 07-09. Alumnos Graduados -María Rosa Elia Figueroa Balderas. Doctorado en Ciencias Bioquímicas. “Análisis de la expresión de la región promotora del gen de la ACCasa de frijol en Arabidopsis thaliana”. 26 enero 2007. Publicaciones

1. Godinez-Vidal,D. Rocha-Sosa,M. Sepulveda-Garcia,E.B. Lara-Reyna,J. Rojas-Martinez,R. Zavaleta-Mejia,E. (2008). Phenylalanine ammonia lyase activity in chilli CM-334 infected by Phytophthora capsici and Nacobbus aberrans European Journal Of Plant Pathology 120 299-303.

2. Porta,H. Figueroa-Balderas,R.E. Rocha-Sosa,M. (2008). Wounding and pathogen infection induce a chloroplast-targeted lipoxygenase in the common bean (Phaseolus vulgaris L.) Planta 227 363-373.

3. Castillo-Olamendi,L. Bravo-Garcia,A. Moran,J. Rocha-Sosa,M. Porta,H. (2007). AtMCP1b, a chloroplast-localised metacaspase, is induced in vascular tissue after wounding or pathogen infection.Functional Plant Biology 34 1061-1071.

Producción de polímeros y diferenciación en Azotobacter

vinelandii.

Elda Guadalupe Espín Ocampo Departamento de Microbiología Molecular

Integrantes del Grupo (2007-2008) Daniel Segura Cinthia Núñez Técnicos Soledad Moreno Josefina Guzmán Estudiantes Raúl Noguez* Renato León* Alberto Hernández Yanet Romero Miguel Cocotl Claudia Velazquez Deborah Yanajara Jade Fernando Bonilla.

Resumen

Azotobacter vinelandii es una bacteria del suelo filogenéticamente muy cercana a especies de Pseudomonas que sufre un proceso de diferenciación para formar quistes resistentes a la desecación. Cuando se induce el enquistamiento, forma una capsula formada por dos capas conocidas como intina y exina. Esta bacteria también produce varios compuestos de importancia industrial entre los que se encuentran: alginato, un polisacárido extracelular; polihidroxibutirato (PHB), un poliéster intracelular y una familia de 5-n-alquilresorcinoles que son lípidos fenólicos sintetizados comúnmente por plantas. Estos tres polímeros están presentes en los quistes maduros. Alginato es un componente de la capsula del quiste. El PHB esta presente en forma de gránulos en los quistes maduros. A diferencia de el alginato y el PHB que están presentes en células vegetativas y en quistes, los alquilresorcinoles solo están presentes en los quistes donde reemplazan a los

fosfolípidos de la membrana celular y son un componente mayoritario de la exina.

En mi grupo estudiamos la genética y fisiología de la diferenciación, de la biosíntesis de alginatos, de PHB y de alquilresorcinoles así como su función biológica.

En los últimos años hemos estudiado algunos sistemas que controlan la expresión génica a nivel global como el sistema de dos componentes GacS-GacA, el sistema de regulación post-transcripcional RsmA/RsmB, los factores sigma AlgU y RpoS y el sistema PTSNtr y su efecto sobre el proceso de diferenciación y la síntesis de alginatos, de PHB y alquilresorcinoles. Durante este período estudiamos el papel del sistema Gac sobre el control del sistema RsmA/RsmB y el efecto de Rsm sobre la regulación post-traduccional de los RNAm correspondientes a los genes estructurales de la síntesis de alginatos y de PHB y alquilrsorcinoles.

También se caracterizaron y evaluaron mutantes sobreproductoras de alginatos. Alumnos Graduados Raúl Noguez. Doctorado Alberto Hernández Eligio. Maestría Yanet Romero. Maestría Nashbly Rosas Galván. Licenciatura Publicaciones 1. Galindo, E., Peña, C., Núñez, C., Segura, D., Espín, G. Molecular and bioengineering strategies to improve alginate and PHB production by Azotobacter vinelandii. Microbial Cell Factories (2007). 6:7-21 2. Noguez R., Segura D., Moreno S., Hernández A., Juárez K. and Espín, G. Enzyme INtr, Npr and IIANtr are involved in regulation of the poly-b-hydroxybutyrate biosynthetic genes in Azotobacter vinelandii. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology (2008). 15:244-254 3. Fadeeva MS, Berstova YV, Núñez C, Espín, G, Bogachev AV. Catalitic properties of Na+-translocating 2008from Vibrio harveyi, Klebsiella pneumoniae and Azotobacter vinelandii. FEMS Microbiol Lett (2008). 279: 116-123

4. Steigedal, M., Sletta, H. Moreno, S, Christensen B.E., Bjerkan, T. M., Ellingsen, T.E., Espín, G., Ertesvåg, H.,and Valla, S. The Azotobacter vinelandii AlgE mannuronan C’5 epimerase family is essential for the in vivo control of alginate monomer composition and for functional cysts. Env. Microbiol (2008). 10: 1760-1770 5. León R and Espín, G. FlhCD but not FleQ regulates flagella biogenesis in Azotobacter vinelandii and is under AlgU and CydR negative control. Microbiology (2008). 154: 1729-1738

6. Segura, D., Mahadevan, R., Juárez, K. Lovley, D.R. Computational and experimental analysis of redundancy in the central metabolism of Geobacter sulfurreducens PLoS Comput.Biol. (2008). 4 e36 7. Núñez C., Bogachev A.V., Cárdenas L., Guzmán G., Tello I., Guzmán J., León R., Espín G. The Na+-translocating NADH:ubiquinone oxidoreductase of Azotobacter vinelandii negatively regulates alginate synthesis. Microbiology. (2008). En prensa Sometidos -Mejía MA, Segura D. Espín G. Galindo E and Peña C. Two-Stage fermentation process for the alginate production by Azotobacter vinelandii mutant impaired in polyhydroxybutyrate )PHB) synthesis. Journal of Applied Microbiology 2008

-Manzo J., Sanchez E., Velazquez C., Cocotl M., Montes L. A., Goiz Y., Carreno R., Fuentes L/E., Nunez C., Segura D., Espín G., Castaneda M. The GacS/A-RsmA/B signal transduction pathway, involved in alginate production, controls the algD gene expression in Azotobacter vinelandii. J Bacteriology -Segura D., Vite O., Romero Y., Moreno S., Castañeda M., Espín G. Isolation and characterization of Azotobacter vinelandii mutants impaired in alkylresorcinol synthesis: Alquilresorcinols are not essential for cysts desiccation resistance. J. Bacteriology Nov. 08 Capitulos Libros -Segura D. Noguez R, Espín, G. Contaminación ambiental y las bacterias productoras de plásticos biodegradables. Una ventana al quehacer científico ( 2008). P 361-372. Compiladores: Francisco Rebolledo y Agustín López Munguía. Edición: Instituto de Biotecnología y Dirección General de Divulgación de la Ciencia, UNAM. ISBN978-970-32-4658-8 -J. Krushkal, M. Puljic, B. Yan, J. F. Barbe, R. Mahadevan, B. Postier, R. A.O'Neil, G. Reguera, C. Leang, L. N. DiDonato, C. Núñez, B. A. Meth?, R. M. Adkins, and D. R. Lovley (2008) Genome regions involved in multiple regulatory pathways identified using GSEL, a genome-wide database of regulatorysequence elements of Geobacter sulfurreducens. In: BMEI2008. Biomedical engineering and informatics: new developments and the future. Proceedings the First International Conference on Biomedical Engineering and Informatics. Y. Peng andY. Zhang (Eds). Vol. 1, pp. 424-431. IEEE Computer Society, Las Alamitos, CA

Neurona controla hormona

Patricia Joseph Bravo Departamento de Genética del Desarrollo y

Fisiología Molecular Integrantes del Grupo (2007-2008) -Maria Juana Antonieta Cote -Martha Díaz -Rosa Maria Uribe Técnicos -Arlene Iskra Garcia. -Fidelia Romero Estudiantes de doctorado -Mariana Gutiérrez Mariscal Estudiantes de licenciatura -Alan I. Jiménez -Cristina Acasuso -Adrian Pérez Maldonado -Anabel Martínez Baez (Tutor A. Cote)

Resumen El objetivo central de nuestro grupo es

el estudio del efecto del estrés en las neuronas TRHérgicas; del NPV, las hipofisiotrópicas que modulan al eje tiroideo y por tanto el metabolismo así como las que proyectan hacia el tallo cerebral así como las del sistema límbico que están involucradas en conductas de alerta y control de la ansiedad. Abordamos el problema desde el nivel molecular mediante el estudio del modo de acción de los glucocorticoides en la biosíntesis del TRH, hasta el conductual que nos permite la identificación de las estructuras en las que se modula la actividad de las neuronas TRHérgicas y relacionarlas a determinados comportamientos.

Inicialmente nuestro estudio se enfocó a caracterizar los eventos que regulan la síntesis y la inactivación del péptido en el contexto del sistema neuroendocrino del roedor por el conocimiento existente del papel fisiológico del TRH en la regulación del eje hipotálamo-pituitaria-glándula tiroidea (HPT) y su importancia en la homeostasis energética.

Hallazgos recientes muestran que hay un dimorfismo sexual en la respuesta ya que las hembras muestran una mayor inhibición del eje HPT en condiciones de ayuno, restricción alimentaria o anorexia producida por deshidratación (de Gortari et al., 2008). Estudiamos el efecto de estradiol comparando hembras ovariectomizadas (OVX) con OVX inyectadas con estradiol; a dosis suprafisiológicas, el estradiol tiene efectos inhibitorios en el eje. (Uribe et al., en prensa). La respuesta al estímulo del frío se ve afectada dependiendo del estado hormonal o nutricional del animal (Uribe et al., en prensa; Jaimes-Hoy et al., 2007). Recientemente identificamos una respuesta diferencial en la expresión del neuropéptido CART en respuesta al frío o la succión que pudiera explicar la diferencia en la respuesta hipofisiaria a estos eventos (Sánchez 2008).

Basados en el conocimiento adquirido en medir la respuesta de las neuronas TRHérgicas en el sistema neuroendócrino y en el SNC en respuesta a la estimulación transináptica, estudiamos la función del TRH como neuromodulador en regiones y conductas específicas. El TRH administrado presenta una variedad de efectos conductuales que en ocasiones parecen contradictorios; por ejemplo, el efecto axiolítico del TRH (estudiado en la prueba de comportamiento al castigo) fué puesto en duda por su efecto en la atención y la locomoción. Debido a que las vías TRHérgicas se encuentran en distintas estructuras límbicas, la especificidad de su acción muy posiblemente dependa de la región involucrada. Hemos evaluado la actividad de las neuronas TRHérgicas cuantificando la expresión génica de TRH, y de los elementos involucrados en su transmisión, en animales sometidos a paradigmas conductuales representativos de funciones específicas. La medición simultánea de la expresión de CRH y sus receptores, de GR y BDNF en distintas áreas (septum, n. accumbens, corteza frontal, hipocampo, tálamo), así como la respuesta hormonal (niveles séricos de corticosterona y de tirotropina y/o hormonas tiroideas) nos permitió, por un lado evaluar la cinética y magnitud de la respuesta al estrés en cada prueba. Hemos caracterizado una activación específica de las neuronas TRHérgicas en hipocampo en respuesta al aprendizaje; en amígdala en

cambio, la actividad TRHérgica fue estimulada tanto en el grupo entrenado, como en el control de nado; en las mismas muestras, la actividad de las neuronas CRHérgicas estuvo inhibida (aún cuando los niveles de corticosterona estaban incrementados) y las de BDNF aumentada (Aguilar-Valles et al., 2007). El efecto ansiolítico reportado para TRH y BDNF sugería pudieran ser responsables de la inhibición del péptido anxiogénico, CRH. La modulación inversa del TRH y el CRH en amígdala se reproduce en situaciones de estrés psicológico (García-Vázquez, manuscrito en preparación). En base a estos resultados estudiamos el metabolismo de TRH en la amígdala de animales sometidos a paradigmas de ansiedad y demostramos que la administración central de TRH tiene efectos ansiolíticos; las neuronas TRHérgicas de la amígdala muestran una activación que es inversamente proporcional al estado de ansiedad (Gutiérrez-Mariscal 2008). Resultados recientes apoyan la teoría propuesta por Gary sobre el papel homeostático del TRH en sistema nervioso central ya que la activación de neuronas TRHérgicas en regiones como séptum y tálamo depende del estado de alerta del animal (Gutiérrez-Mariscal M, Jiménez A., Acasuso C, en progreso).

A nivel molecular hemos terminado la caracterización de los elementos de respuesta TRE, CRE y GRE del promotor de TRH utilizando estrategias complementarias (cuantificación de niveles de RNAm de TRH en cultivos primarios de hipotálamo, ensayos de protección a DNase I y, de immunoprecipitation de cromatina). Se corroboró el efecto inhibidor de T3 en la síntesis de TRH y que el sitio de reconocimiento de receptor de hormonas tiroideas (TR) es el conocido como sitio 4. Sin embargo, en contra de lo reportado utilizando sistemas heterólogos transfectados con TRs y el promotor de TRH unido a un reportero, en células hipotalámicas: a) la unión de TR se observó solo en células estimuladas con T3 y no en forma independiente al ligando; b? no se detecto unión de factores transcripcionales estimulados por AMPc, c? ni interferencia sobre la unión de TR. Estos resultados demuestran que las altas concentraciones de factores de transcripción alcanzados en

sistemas de transfixión transitoria pueden arrojar resultados que no reflejan la situación in vivo. Proponemos que la competencia entre TR y pCREB de da al nivel de asociación con coreguladores que modifican el estado de acetilación de las histonas.

El sitio CRE se encuentra es el CRE=2 previamente identificado por EMSA ¿Cote et al., 2005?. CRE2 es un sitio extendido flanqueado por sitios de reconocimiento de SP1 o factores tipo Krupel (Diaz et al.,sometido). En respuesta a la estimulación con el análogo de AMPc (8Br-AMPc) se incrementa la fosforilación de CREB; pCREB se une a CRE-2 y al sitio compuesto GRE (GREc) que contiene los sitios de reconocimiento de AP1. Tanto a CRE-2 como a GREc se une pCREB. La coincubación con glucorticoides y el análogo de AMPc interfiere con la unión de pCREB así como de GR tanto a CRE como a GRE. Estamos en proceso de caracterizar el mecanismo de este antagonismo mutuo y hemos descartado ya la posible interacción proteína=proteína entre pCREB y GR. Una posible opción es la interferencia con el trafico intracelular del GR activado ¿Cote et al., 2008? Y la posible asociación de este con PKAc.

Publicaciones 1. Aguilar-Valles A., Sánchez, E., de

Gortari P., García-Vázquez I, Ramírez-Amaya V., Bermúdez-Ratoni F, and Joseph-Bravo P. The expression of TRH, its receptors and degrading enzyme is differentially modulated in the rat limbic system during training in the Morris Water Maze. Neurochem. Int. 50, 404-417, 2007.

2. Sánchez E., Fekete C., Lechan RM and Joseph-Bravo P. Differential regulation of cocaine- and amphetamine-regulated transcript (CART) mRNA in the hypothalamic paraventricular nucleus of lactating rats exposed to suckling or cold stimulation. Brain Res. 1132, 120-128, 2007

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5. Jaimes-Hoy L., Joseph-Bravo P., de Gortari P., Differential response of TRHergic neurons of the PVN in animals submitted to food restriction or dehydration induced anorexia and cold exposure. Horm. Behav. 53, 366-377,2008.

6. Antonieta Cote-Vélez, Leonor Pérez-Martínez, Jean-Louis Charli and Patricia Joseph-Bravo. The PKC and ERK/MAPK pathway regulate glucocorticoid action on TRH transcription. Neurochem. Res. (S.I. Honouring Dr. R. Tapia), 33:1582-1591, 2008.

7. R. Cruz, M. A. Vargas, R.M. Uribe, I. Pascual, I. Lazcano, A. Yiotakis, M. Matziari, P. Joseph-Bravo and J.-L. Charli. Anterior pituitary pyroglutamyl peptidase II activity controls TRH-induced prolactin release. Peptides, 29, 1953-1964, 2008.

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9. Uribe RM, Zacarías M, Corkidi G, Cote-Vélez A, Charli JL, Joseph-Bravo P.

Response of the TRH neurons in the paraventricular nucleus of the hypothalamus in female rats submitted to metabolic and cold challenges. J. Neuroendocrinology. Aceptado.

10. Díaz-Gallardo MY, Cote Vélez A. Charlí JL, Joseph-Bravo P. In hypothalamic cells, thyroid hormones do not interfere with binding of pCREB to CRE in the TRH promoter. Sometido a Neuroendocrinology

Capítulos de libro

1. P. Joseph Bravo y P. de Gortari. El estrés y sus efectos en el metabolismo y el aprendizaje. Cap. Libro: Una ventana al quehacer científico. 25 años del IBT (2008)

2. J.L. Charli y P. Joseph-Bravo. El cerebro, la comunicación intercelular y los péptidos. Cap. Libro: Una ventana al quehacer científico. 25 años del IBT (2008). Alumnos Graduados -Emilia Horjales. Lic. en Biología, UNAM, Efecto de una dieta a base de tortillas en el comportamiento alimenticio y el metabolismo en ratas. Marzo 2007 -Candy Ramírez, 2007. (Tutor R.M. Uribe) -Ana Sanchez Tusie (Tutor M. Díaz) Otros datos relevantes

1. Se publicaron resultados de la respuesta al frçio en el libro de texto de Endocrinology de Williams (edición 2008) que es el más importante del área.

2. Se fundó el Grupo de investigación en

Psiconeuroendocrinología, con sede en el Dept. de Neurociencias del INPRFM, destinado al estudio de los efectos del estrés y la interacción entre el sistema neuroendócrino y límbico. El grupo surge de la estrecha colaboración entre el laboratorio de neuroendocrinología molecular del Instituto de Biotecnología (UNAM) dirigido por la Dra. Patricia Joseph y, el grupo de Neurofisiología Molecular del dept. de Neurociencias del Instituto de Psiquiatría RFM, (iniciado por P.Joseph en 1998), dirigido por la Dra. Patricia de Gortari. Al grupo se incorpora la Dra. Edith Sánchez Jaramillo como Investigadora en Ciencias Médicas “D” a partir de julio 2008.

3. Se obtuvo un donativo de CONACYT

para apoyar las líneas del grupo de Psiconeuroendocrinología (Inv. Resp. P. Joseph) por 2 400 000.00.

Descubriendo cómo funciona: de las moléculas y las células al

organismo

Luis F. Covarrubias Robles Laboratorio sobre Degeneración y

Regeneración Tisular Departamento de Genética del Desarrollo y

Fisiología Molecular Integrantes del Grupo (2007-2008) -Susana Castro Obregón -Christopher Wood Técnicos -Concepción Valencia García (diferenciación neural, señalización). -Rocío Rodríguez Valentín (muerte celular, autofagia). Investigadores Posdoctorales -Irma González Herrera (diferenciación neural, regulación traduccional). Estudiantes de doctorado -José Manuel Baizabal Carballo (células troncales, diferenciación neural) -Rocío Hernández Martínez (muerte celular, morfogénesis) -Niurka Trujillo Paredes (diferenciación neural, señalización) Estudiantes de maestría -Gilda Guerrero Flores (células troncales, diferenciación neural) -José Raúl Pérez Estrada (estrés oxidativo, regulación metabólica) -Gabriela Zárraga Granados (Tutor S. Castro; muerte celular, autofagia) -Damaris Anell Rendón (Tutor S. Castro; muerte celular, regulación metabólica) Estudiantes de licenciatura -Georgina Peñalosa Ruíz (células troncales, reprogramación) -Paula Rubio Alvarado (Tutor C. Word; diferenciación neural, visualización en tiempo real) -Héctor Ramírez Gómez (Tutor S. Castro; muerte celular, autofagia)

-Elizabeth Ortíz Gutiérrez (células troncales; biología de sistemas) Personal Administrativo -Minerva Carcaño Velásquez (Secretaria) -Carmen Muñoz García (Laboratorista) -Graciela Blancas Naranjo (Auxiliar) -Martina Romero Herrera (Auxiliar)

Resumen

Una célula en desarrollo no tiene marcado su destino intrínsecamente; mas bien, la célula va construyendo su destino conforme ésta va encontrando diferentes ambientes en el embrión en formación. En esta constante interacción entre la célula y su entorno el desarrollo avanza en una dirección y culmina en un tiempo mas o menos definido. Sin embargo, los cambios que le ocurren a la célula en el curso de su diferenciación no son totalmente irreversibles, sino que naturalmente mantienen un grado de plasticidad que van perdiendo conforme adquieren su estado terminal. Determinar la plasticidad de las células del embrión es una de las metas fundamentales de la Biología del Desarrollo y base fundamental para la aplicación de las células troncales en la Medicina Regenerativa. Nosotros hemos diseñado un sistema de cultivo de tejidos que permite determinar la plasticidad de las células troncales neurales aún sin conocer todos los componentes del entorno requerido para su diferenciación específica. De nuestros datos surgen preguntas fundamentales como ¿cuál es la interdependencia entre la neuralización y la especificación? ¿Qué controla la extensión y duración de la acción de un morfógeno? ¿Es posible reprogramar células neurales que han perdido su plasticidad? Nuestro sistema de cultivo será útil no solo para estudiar el potencial de diferenciación de células troncales, sino también para estudiar procesos celulares y moleculares en tiempo real.

Desde otro punto de vista, es común que durante el desarrollo embrionario una molécula particular genere una respuesta distinta dependiendo del tipo celular sobre el cual actúe. La célula responde acorde a las propiedades intrínsecas que gana a lo largo de su historia durante el desarrollo

embrionario y/o a la interpretación de la combinación de señales que recibe en un momento dado. Definir la red de interacciones moleculares que ocurren a lo largo del desarrollo es esencial para entender cómo las células guían su destino dentro del embrión, y es conocimiento esencial en la genómica funcional y relevante para prevenir la respuesta patológica causante de muchas enfermedades como las neurodegenerativas y el cáncer. Nosotros hemos estudiado las señales que interactúan para separar los dígitos en la extremidad en desarrollo donde el balance entre la proliferación, la diferenciación y la muerte celular es fundamental. En este modelo experimental hemos estudiado las vías intracelulares de transducción, sin embargo desconocemos aún a qué niveles se lleva acabo la integración que resulta en una respuesta proliferativa o de muerte celular. Un posible nivel de integración de las señales puede resultar en el cambio de actividad de una proteína debido a modificaciones postraduccionales específicas que recibe en una condición dada. Nur77, factor transcripcional que estamos estudiando, es un ejemplo de una proteína que está involucrada en diferentes procesos celulares, en donde las distintas modificaciones que sufre puede ser la causa de la respuesta celular específica, entre ellas la autofagia, a la cual se asocia su función.

En el embrión como en el adulto cambios metabólicos pueden influir de forma determinante en el destino de las células. Se puede predecir que el efecto de muchas moléculas que participan en desarrollo conducen directa o indirectamente a cambios metabólicos. Las especies reactivas de oxígeno producen respuestas celulares específicas, entre ellas la muerte celular. La concentración de especies reactivas de oxígeno en una célula está fuertemente influenciada por la actividad mitocondrial, la cual directamente se asocia a la actividad metabólica. En contraste, recientemente hemos encontrado indicios que sugieren que la ausencia de la catalasa, que causaría incrementos en peróxido, produce cambios metabólicos en animales completos. ¿Cómo las especies reactivas pueden afectar el metabolismo?

Es una pregunta a la que nos enfocaremos en responder en el futuro.

La capacidad regenerativa de algunos tejidos es parte fundamental del funcionamiento de ciertos órganos. Sin embargo en algunos organismo la capacidad para regenerar extremidades, como en los urodelos y nuestras observaciones en peces basales, pareciera ser superflua puesto que ésta no se ha mantenido a lo largo de la evolución. En los vertebrados la regeneración de la piel es necesaria para su mantenimiento y para la reparación en caso de daños severos. No obstante la capacidad regenerativa en los mamíferos es muy limitada al punto que, por ejemplo, la misma piel ante daños severos es incapaz de reparar sin dejar huella. Nosotros hemos observado que esta limitación en la capacidad regenerativa de la piel puede ser incrementada a través de modificar el número y migración de células precursoras. Estas evidencias y otras reportadas en la literatura sugieren que los mecanismos que a lo largo de la evolución redujeron la capacidad regenerativa en los mamíferos no son irreversibles. No obstante se debe considerar que incrementar la capacidad regenerativa puede, en consecuencia, causar enfermedades como el cáncer.

Como nunca, ahora los conocimientos básicos provenientes de la biología del desarrollo trascienden de manera evidente a la biotecnología aplicada a la medicina (e.g., medicina regenerativa). Fuentes de financiamiento -CONACyT CB-2005-01-50956 (LC) -CONACyT SALUD-2005-01-14609 (LC) -CONACyT Q46174 (SC) -DGAPA IN218607 (LC) -DGAPA IN202005 (SC) -ICGEB MEX 03/03 (SC) -IMPULSA 02 (LC) Alumnos Graduados -Gabriela Paulina Panamá Hernández. Licenciatura en Ciencias Genómicas. “Participación de Nurr1 y Nur77 en la diferenciación de las células troncales embriónicas a neuronas dopaminergicas”. Octubre 2007

-Carlos Rodrigo Osorno. Facultad de Ciencias/UNAM. “Degeneración y regeneración de neuronas dopaminergicas in vitro”. Agosto 2007 -Gabriela Zárraga Granados. Facultad de Ciencias/UNAM. “Modificaciones post-traduccionales del receptor nuclear Nur77”. Abril 2008. Tutor S. Castro. -Xicotencatl Gracida Canales. Facultad de Ciencias/UNAM. “Estudio de los mecanismos moleculares del receptor nuclear Nur77 en la modulación del destino celular: proliferación o muerte”. Septiembre de 2007. Tutor S. Castro. -Osiris Cuevas. Maestría en Ciencias Bioquímicas. “Función de la catalasa en la senesencia replicativa y la longevidad”. Marzo 2007. -Brenda Sarquíz. Maestría en Ciencias Bioquímicas. “Papel de Nurr1 y Nur77 en la degeneración de neuronas dopaminérgicas derivadas de células troncales embrionarias”. Febrero 2007. -Andrea Mendoza Campos. Maestría en Ciencias Bioquímicas. ”Análisis de la expresión de la subfamilia NR4A en las extremidades del ratón en desarrollo”. Junio de 2007. Tutor S. Castro. Publicaciones

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2. Valencia, C., Bonilla-Delgado, J., Oktaba, K., Ocadiz-Delgado, R., Gariglio, P. and Covarrubias, L. (2008) Human papillomavirus E6/E7 oncogenes promote mouse ear regeneration by increasing the rate of wound re-epithelization and epidermal growth. Journal of Investigative Dermatology 128, 2894-903

3. Covarrubias, L., Hernández-García, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E. and Castro-Obregón, S. (2008) Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active? Developmental Biology 320, 1-11

4. Baizabal, J-M. and Covarrubias, L. (2008) The embryonic midbrain directs neuronal specification of embryonic stem cells at early stages of differentiation. Developmental Biology. Epub ahead of print.

5. Ocadiz-Delgado R., Marroquin-Chavira A., Hernandez-Mote R., Valencia C., Manjarrez-Zavala M.E., Covarrubias L. and Gariglio P. (2008) Induction of precancerous lesions in tongue of young bk6-E6/E7 HPV16 transgenic mice. Transgenic Research. Aceptado.

6. Hernández-Martínez, R., Castro-Obregón, S. and Covarrubias, L. (2008) Progressive interdigital cell death: regulation by the antagonistic interaction between fibroblast growth factor 8 and retinoic acid. Development. Sometido.

7. Bouzas, J. Rodríguez-Valentín, R., Bredesen, D., Covarrubias, L. and Castro-Obregon, S. (2007). Nur77 is a modulator of autophagic cell death. Manuscrito en preparación. Capítulos en Libros

1. Castro-Obregón, S. and Covarrubias L. (2007) Types of cell death: basic mechanisms (Chapter 1). In: Neurochemistry of neuronal death (Massieu, L., Arias, C, Morán, J., Eds.). Research Signpost. 1-27

2. Covarrubias, L. (2007) Estrategias para determinar la relevancia fisiológica de las especies reactivas de oxígeno en animales completos (Capítulo 36). En: Radicales libres y estrés oxidativo. Aplicaciones médicas (Dra. Mina Konigsberg Fainstein, Coompiladora). Editorial El Manual Moderno. Páginas 543-557

3. Covarrubias, L. y S. Castro-Obregón. (2008) “Degeneración y Regeneración Tisular: de la Embriogénesis a la Medicina Regenerativa” (Capítulo 13). En: “Una Ventana al Quehacer Científico” Instituto de Biotecnología de la UNAM, 25 Aniversario (Compiladores Francisco Rebolledo y Agustín López Munguía). Editado por el Instituto de Biotecnología y la Dirección General de Divulgación de la Ciencia, UNAM (ISBN 978-970-32-4658-8). Páginas 145-158

4. Dhanya Mullassery, Caroline Horton, Christopher Wood & Michael White (2008) Single live-cell imaging for systems biology. In: Essays in Biochemistry: Systems Biology. (OLAF WOLKENHAUER, PETER WELLSTEAD, KWANG-HYUN CHO eds) Editorial PORTLAND PRESS, vol 45.

Docencia -Curso Básico de Biología Celular, Posgrado en Ciencias Bioquímicas, UNAM. SC, Coordinadora y participante; LC, participante; CW, participante. -La Biología del Desarrollo en la Era Genómica, Facultad de Ciencias (Biología), UNAM. LC, ponente. -La Biología a partir de las biomoléculas: nuevos paradigmas y aplicaciones. Facultad de Ciencias (Biología). Taller impartido desde el 2000 hasta la fecha. LC y SC, participantes. -Respuesta Celular al daño por estrés oxidativo. Curso: “Biología Molecular de la Medicina”. Organizado por el Instituto Politécnico Nacional y el Consejo Superior de Investigaciones Científicas, España. Auditorio de la Secretaría Académica, IPN, México, D.F. Noviembre 6, 2007. LC, participante. -2007 Ricardo Miledi Course for Neuroscience Training: “(Module 3. Stem cell biology /Stem cell culture and differentiation). Juriquilla, Querétaro, Febrero 2008. LC, participante. -Taller de Biología Celular, Licenciatura en Ciencias, Facultad de Ciencias UAEM. SC, participante.

-FRAP, FLIP, y técnicas que rompen los límites de la resolución espacial dentro del tópico "Teoría y aplicaciones de la fluorescencia para el análisis dinámico de los procesos biológicos". Posgrado en Ciencias Bioquímicas. CW participante Divulgación -Covarrubias, L. “Animales transgénicos en la ciencia y la biotecnología”. Simposio: Mitos y realidades sobre los organismos modificados genéticamente. Organizado por Programa Interdisciplinarios de Ciencias y Humanidades, Universidad Autónoma de la Ciudad de México. México, D.F., Octubre 10, 2007. -Covarrubias, L. “Potencial de diferenciación de células troncales y reprogramación” Mesa Redonda: Células troncales: implicaciones biológicas, médicas y éticas. Organizado por la Academia de Investigación de la reproducción, A.C. Instituto de Investigaciones Biomédicas, Noviembre 7, 2007.

¡Alguien tiene que limpiar!

Rafael Vázquez Duhalt Departamento de Ingeniería Celular y

Biocatálisis Integrantes del Grupo (2007-2008) -Marcela Ayala Aceves Técnicos -Lucia Perezgasga -Rosa Roman Estudiantes Adriana Margarita Longoria Lorena Paulina Sánchez Abraham Marcelino Vidal Cristina Torres Julio Cesar Cruz Javier Martínez Berenice Trujillo Martha Moreno Cristina Uribe

Resumen

Sin duda, uno de los grandes retos de la

humanidad en este inicio del siglo XXI es el de convertir los procesos productivos en procesos limpios y eficientes energéticamente. Por otro lado, se requerirá tener la capacidad tecnológica para restaurar los sitios dañados ambientalmente. La biotecnología jugará un papel importante en esta transformación tecnológica.

Nuestro trabajo de investigación está principalmente enfocado en la utilización de nuevas herramientas biotecnológicas para la prevención, control y remediación de contaminaciones ambientales. El esfuerzo del laboratorio de Biotecnología Ambiental se centra en la modificación enzimática de sustancias contaminantes, principalmente hidrocarburos aromáticos policíclicos, plaguicidas, colorantes industriales, heterocíclicos y aromáticos policlorados. Para el diseño de sistemas biocatalíticos con fines ambientales, se usan diferentes herramientas químicas, genéticas y de ingeniería.

Además de investigaciones en enzimología ambiental, se desarrollan actividades de investigación en Biotecnología Petrolera. Proyectos como la

remoción enzimática del azufre en combustibles y la biotransformación de los asfaltenos se desarrollan actualmente.

En este período se desarrollaron actividades de investigación en las siguientes líneas de investigación:

Desarrollo del Citocromo c como biocatalizador activo y estable para fines ambientales, en donde el objetivo es diseñar por medios químicos y genéticos una biomolécula capaz de realizar oxidaciones de sustratos contaminantes y tóxicos.

Estudio sobre la capacidad de las hemoproteínas como biocatalizadores en la oxidación de hidrocarburos polinúcleo aromáticos. Peroxidasas como peroxidasas de hongos ligninolíticos y chloroperoxidasa de Caldariomyces fumago, así como proteínas no enzimáticas, incluyendo los citocromos y hemoglobina, son usadas como biocatalizadores en la oxidación de sustancias contaminantes.

Estudio sobre el proceso de inactivación por peróxido de hidrógeno de las peroxidasas y el diseño genético racional de variantes más estables.

Síntesis enzimática de polímeros intrínsecamente conductores.

Biotecnología petrolera en la biodesulfuración de fracciones del petróleo y en la transformación enzimática de los asfaltenos. Esta línea de investigación tiene como objetivo el uso de métodos biotecnológicos para la refinación y valorización del petróleo.

Estudio sobre la capacidad de las lacasas de hongos ligninolíticos para la oxidación de, pesticidas organofosforados y organohalogenados. Diseño de sistemas lacasa-mediador con el objetivo de incrementar el rango de sustratos y poder oxidativo.

Estudio de la degradación de hidrocarburos en sistemas hipersalinos.

En esta presentación se ha seleccionado el mostrar un panorama histórico de la investigación pasada, presente y futura del laboratorio en el tema de transformación enzimática de plaguicidas. Se presentan resultados del uso del sistema multienzimático citocromo P450, de la capacidad de peroxidasas y lacasas para la transformación de plaguicidas organohalogenados y organofosfoados, y del papel y características de los mediadores redox en

la transformación Además se hará la presentación del proyecto en el diseño de un partícula catalíticamente activa e inmunológicamente inerte para el tratamiento de intoxicaciones por plaguicidas órganofosforados. Fuentes de financiamiento. -Design of an enzymatic reactor for asphaltene transformation. BP Products North America Inc. Julio 2008- Julio 2010. $ 200,000 USD -Mecanismo de autoinactivación en las peroxidasas: identificación de rutas de transferencia intramolecular de electrones. SEP-CONACYT (56718). Junio 2007-Mayo 2010. $ 860,000.00 (Responsable Dra. Ayala). -Síntesis de una partícula de fosfotriesterasa catalíticamente activa e inmunológicamente inerte. SEP-CONACYT (59497). Junio 2007-Mayo 2010. $ 694,494.00 -Efectos y seguimiento del alterador endócrino nonilfenol en la cadena trófica. SEMARNAT CONACYT (2004-C01-42). Mayo 2005-Junio 2007. $ 511,000.00 Alumnos Graduados -Cruz de la Cruz J.C. Ingeniero Bioquímico. Instituto Tecnológico de Villahermosa. “Estudio del proceso de inactivación de una peroxidasa fúngica. Tutora M. Ayala. 2008. -Paniagua Meza D.S. Maestro en Ciencias Bioquímicas, UNAM. “Aislamiento y caracterización de bacterias halófilas degradadoras de hidrocarburos”. -Trujillo Robles L. Maestro en Ciencias Bioquímicas, UNAM. “Síntesis de derivados monofenólicos oxidados utilizando una lacasa de orígen fúngico”. Tutora M. Ayala. 2007. -Espinoza Torres M.A. Biólogo. Universidad Autónoma de Morelos. “Caracterización enzimática del citocromo c químicamente modificado”. 2007 -Rodríguez Solís A. J. Maestro en Ciencias Bioquímicas, UNAM. “Modulación del potencial Redox en citocromo c y su efecto en la oxidación de fenoles”. 2007.s

Publicaciones

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8. Gil-Rodriguez P., Ferreira-Batista C., Vazquez-Duhalt R. and Valderrama B. (2008) A novel peroxidase from Raphanus sativus intrinsically resistant to hydrogen peroxide. Eng. Life Sci. 8: 286-297.

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(2008) Stereoselective oxidation of R-(+)-limonene by chloroperoxidase from Caldariomyces fumago. Green Chemistry 10: 647–653.

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12. Ayala M., Roman R. and Vazquez-Duhalt R. (2007) A catalytic approach to estimate the redox

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13. Correa-Reyes G., Viana M.T., Marquez-Rocha F.J., Licea A.F., Ponce F. and Vazquez-Duhalt R. (2007) Nonylphenol algal bioaccumulation and its effect through the trophic chain. Chemosphere 68: 662-670.

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15. Cabra V., Arreguin R., Vazquez-Duhalt R. and Farres A. (2007) Effect of alkaline deamidation on the structure, surface hydrophobicity and emulsifying properties of 19 kDa alpha-zein. J. Agricult. Food Chem. 55: 439-445. Distinciones -2007 Premio Luis Elizondo en la categoría Científico y Tecnológico. Instituto Tecnológico de Estudios Superiores de Monterrey.

Estudios de escalamiento descendente de la producción de

proteína recombinante termoinducida por cultivos de

E. coli

Octavio Tonatiuh Ramírez Reivich Departamento de Medicina Molecular y

Bioprocesos Integrantes del Grupo (2007-2008) -Laura Alicia Palomares Aguilera -Norma Adriana Valdez Cruz -Álvaro Raúl Lara Rodríguez (Profesor Visitante)* Técnicos -Zoila Vanessa Hernández Rodríguez -Ana Ruth Pastor Flores (por honorarios) Estudiantes de doctorado -Álvaro Raúl Lara Rodríguez -Luís Caspeta Guadarrama -Antonino Báez Rogeli o -Germán Plascencia Villa -William Alfonso Rodríguez Limas -Lilí Esmeralda Gallo Ramírez -Odón Vite Vallejo -José Antonio Serrato Pérez -Yimy Alexander Mena Méndez Estudiantes de Maestría Mauricio Barrón Castillo Martha Rosa Hidalgo Morales Ricardo Martín Castro Acosta Ricardo Rojas Gómez Ramsés Ismael García Cabrera René Soto Martínez(*) Cuitlahuac Chávez Peña Itzcóatl Arturo Gomez Aquino William Alfonso Rodríguez Limas Lilí Esmeralda Gallo Ramírez Julio César Fabián Macedo Estudiantes de Licenciatura Juan Pablo Arias Echeverri Luis Medina(*) José Eduardo Agámez Fuentes David Fernando Zuluaga Rave (*) Estudiantes del Profesor visitante

Gerente de Proyecto Karin Christiane Levy Popp Secretaria Margarita Marquina Rivera Laboratoristas Javier Dorantes Juana Ferrer Fuentes Auxiliar Técnico Dulce Pacheco

Resumen Uno de los enfoques principales de

nuestro grupo de investigación durante los últimos 14 años ha sido el estudio de gradientes espaciales de parámetros de cultivo, tales como oxígeno disuelto, dióxido de carbono disuelto, pH y concentración de substratos. Los gradientes espaciales comúnmente se presentan en biorreactores de gran escala y representan un problema serio desde la perspectiva del bioproceso. La aparición de tales gradientes se debe a los altos tiempos característicos de mezclado comparados con los subprocesos cinéticos y de transferencia de masa, y se originan por las limitaciones inherentes a los métodos tradicionales de escalamiento así como restricciones en la operación y diseño de grandes biorreactores. El acercamiento seguido por nuestro grupo ha sido simular, mediante el escalamiento descendente, diversos gradientes ambientales relevantes para una variedad de células industrialmente importantes, incluidas bacterias, células de insecto y de mamíferos. En esta presentación, se discutirá un estudio de escalamiento descendente que simula las velocidades típicas de calentamiento que se pueden alcanzar en biorreactores de gran escala durante el proceso de producción de una proteína recombinante modelo producida por un sistema de expresión termoinducible en E. coli. En escala laboratorio es posible realizar cambios súbitos (tipo escalón) en la temperatura, como por ejemplo de 30 a 42 °C para alcanzar condiciones óptimas de inducción. Sin embargo, limitaciones en la transferencia de calor en cultivos de gran escala ocasionan que la velocidad a la que se puede aumentar la temperatura es

mucho menor que en cultivos de laboratorio, por lo que el tipo de perfil seguido es el de una rampa. Hemos mostrado, por primera vez, que la velocidad de calentamiento puede tener efectos metabólicos muy importantes, afectar las respuestas transcripcionales y determinar la calidad y rendimiento de cuerpos de inclusión de una cepa de E. coli recombinante durante la producción termo-inducida de pre-proinsulina en cultivos de alta densidad celular por lote alimentado. Este hallazgo es relevante, ya que indica que la escala del proceso puede determinar y/o afectar los procesos moleculares. El estudio comprendió la inducción utilizando tasas de calentamiento entre 6 y 0.4 °C/min con la finalidad de emular el proceso que ocurre en fermentadores de escala entre 0.1 y 100 m3. Al aumentar la velocidad de calentamiento, el rendimiento y producción máxima de proteína recombinante disminuyó, mientras que una mayor fracción de esqueletos carbonados se perdió como acetato, lactato y formato. Tales resultados, en conjunto con los perfiles transcripcionales (medidos por RT-PCR) de seis genes relevantes de la respuesta de choque térmico, tres genes de la maquinaria transcripcional/traduccional, cinco genes de control de estrés y el gene codificante de la proteína heteróloga mostraron que células sometidas a incrementos lentos de temperatura pueden adaptarse mejor al estrés que aquellas expuestas a cambios bruscos. De tal forma, los datos que se discutirán indican que tasas de calentamiento lento, similares a las esperadas en biorreactores convencionales de gran escala, favorecerán la síntesis de proteína heteróloga por el sistema de expresión termoinducible utilizado en este trabajo. Otra aportación relevante de este estudio fue que con base en la información generada sobre el efecto del calentamiento en la fisiología bacteriana y formación de producto, desarrollamos una novedosa estrategia de inducción de proteína recombinante que será discutida durante la presentación. En conjunto, el presente estudio es de importancia para la generación de políticas racionales de diseño de biorreactores y de estrategias de escalamiento ascendente de bioprocesos para la producción óptima de proteína recombinante.

Fuentes de Financiamiento: -Donativo: Vinculación Industria – Academia. Responsable: Dr. O. T. Ramírez. Financiado por Probiomed S.A. de C.V. (octubre 1997 a la fecha). -Donativo: Convenio de colaboración con la Industria. Responsable: Dra. Laura A. Palomares. Financiado por: Instituto Bioclón S.A. (agosto 2005- a la fecha). -Donativo: "Desarrollo de Estrategias de Producción de un Vacuna Recombinante contra Rotavirus con Aplicación Veterinaria". Responsable: Dr. O. T. Ramírez. Financiado por: Fondo Sectorial Sagarpa-Conacyt 2004-c01-103 (mayo 2005-abril 2007). -Donativo: “Respuesta Transcripcional de Escherichia coli ante Fluctuaciones Ambientales: Implicaciones Biotecnológicas en Procesos de Gran Escala". Responsable: Dr. O. T. Ramírez. Financiado por CONACYT 46408-Z (marzo 2005-junio 2008). -Donativo: “El Ensamblaje de Vectores de Virus Adeno-asociado para Terapia Génica Utilizando Células de Insecto”. Responsable: Dra. Laura A. Palomares. Financiado por CONACYT 46225-z (marzo 2005-junio 2008). -Donativo: “Uso de las Proteínas Estructurales de Rotavirus para la Construcción de Nanoestrucuras”. Responsable: Dra. Laura A. Palomares. Conacyt Fondo Mixto-Morelos 058 (julio 2005 a junio 2008). -Donativo: “Respuestas Bioquímicas y Moleculares al Estrés por Frío en Células de Mamífero: Estudio y Aplicación de Nuevas Estrategias para la Producción de Glicoproteínas Recombinantes”. Responsable: Dr. O. T. Ramírez. Financiado por DGAPA IN-217007 (enero 2007- diciembre 2008). -Donativo: “Genotipificación de Serotipos de Rotavirus Bovino Presentes en México y Desarrollo de una Vacuna Recombinante Basada en Pseudopartículas Virales”. Responsable: Dra. Laura A. Palomares. Financiado por DGAPA IN206407 (enero 2007- diciembre 2009). -Donativo: “Characterization of Influenza Virus Hemagglutinin” (febrero 2007 a la fecha). Responsable: Dra. Laura A. Palomares. Financiado por Protein Sciences Corp.

-Donativo: “Estudio Molecular y Fisiológico de una Cepa de E. coli capaz de Tolerar Ambientes Heterogéneos Típicos de Biorreactores Industriales”. Responsable: Dra. Norma A. Valdez. Financiado por DGAPA IN223308 (enero 2008- diciembre 2009). -Donativo: “Implementación de una Plataforma Tecnológica para la Producción de Vacunas por el Sistema Células de Insecto-baculovirus”. Responsable: Dr. O.T. Ramírez. Conacyt Fondo Salud-2007-c01-69911 enero 2008-diciembre 2010. Alumnos Graduados: -Yimy Alexander Mena Méndez, Doctorado en Ciencias Bioquímicas “Diseño de Estrategias Racionales de Producción de Pseudopartículas Virales de Rotavirus”. Obtención de grado: 2 julio 2007 (Mención Honorífica). Director de Tesis: Dra. L.A. Palomares. -Álvaro Raúl Lara Rodríguez; Doctorado en Ciencias Bioquímicas “Gradientes Espaciales en Biorreactores: Efectos Fisiológicos en Escherichia coli Recombinante y Estrategias Moleculares de Proceso para Contender con Heterogeneidades Ambientales”. Fecha de titulación 11 octubre 2007 (Mención Honorífica). Director de Tesis Dr. O.T. Ramírez. -Julio César Fabián Macedo, Maestría en Ciencias Bioquímicas. “ Estudio del Efecto de las Variables de Proceso durante la Purificación del Antígeno de Superficie de Hepatitis B (HBsAg)”. Obtención de grado 19 abril 2007. Director de Tesis: Dra.L.A. Palomares. -William Alfonso Rodríguez Limas, Maestría en Ciencias Bioquímicas. “Identificación de Genotipos de Rotavirus Bovino Prevalecientes en México como Herramienta para el Desarrollo de una Vacuna Recombinante”. Obtención de grado 31 agosto 2007. Director de Tesis: Dra. L. A. Palomares. -Lilí Esmeralda Gallo Ramírez, Maestría en Ciencias Bioquímicas. “Estudio del Ensamblaje de Vectores de Virus Adeno-asociado tipo 2 en el Sistema Células de Insecto-baculovirus”. Obtención de grado 28 septiembre 2007. Director de Tesis: Dra. L. A. Palomares. -Ricardo Martín Castro Acosta, Maestría en Ciencias Bioquímicas. “Estudio Cinético de

Producción de Partículas Pseudovirales de Triple Capa”. Obtención de grado 5 diciembre 2008. Director de Tesis: Dra. L. A. Palomares. Publicaciones 1. N. Flores, L. Leal, J.C. Sigala, R. de Anda, A. Escalante, Martínez A., O. T. Ramírez, G. Gosset, and F. Bolívar; (2007) “Growth Recovery on Glucose under Aerobic Conditions of an Escherichia coli Strain Carrying a Phosphoenolpyruvate:Carbohydrate Phosphotransferase System Deletion by Inactivating arcA and Overexpressing the Genes Coding for Glucokinase and Galactose Permease”; Journal Molecular Microbiology and Biotechnology 13, 105-116. 2. J.A. Serrato, V. Hernández, S. Estrada-Mondaca, L. A. Palomares, and O. T. Ramírez; (2007) “Differences in the Glycosylation Profile of a Monoclonal Antibody Produced by Hybridomas Cultured in Serum-supplemented, Serum-free or Chemically Defiened Media”; Biotechnology and Applied Biochemistry, 47, 113-124. 3. J. A. Mena, O. T. Ramírez, L. A. Palomares; (2007); “Population Kinetics During Simultaneous Infection of Insect Cells with two Different Recombinant Baculoviruses for the Production of Rotavirus-like Particles”; BMC Biotechnology 7: 39{1-11}. 4. D. Fuentes-Silva, G. Mendoza-Hernández, V. Stojanoff, L.A. Palomares, E. Zenteno, A. Torres-Larios, A. Rodríguez-Romero; (2007) “Crystallization and identification of the glycosylated moieties of two isoforms of the main allergen Hev b 2 and preliminary X-ray analysis of two polymorphs of isoforma II” Acta Crystallog. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 63 787-791. 5. A.R. Lara, L. Caspeta, G. Gosset, F. Bolívar, and O. T. Ramírez; (2008) “Utility of an Escherichai coli Strain Engineered in the Substrate Uptake System for Improved Culture Performance at High Glucose and Cell Concentrations: An Alternative to fed-batch Cultures”; Biotechnology and Bioengineering, 99: 4, 893-901. 6. K. Martínez, R. de Anda, G. Hernández, A. Escalante, G. Gosset, O. T. Ramírez, and F. Bolívar; (2008) “Coutilization of Glucose Enhances the Production of Aromatic Compounds in an Escherichia coli Strain

Lacking the Phosphoenolpyruvate: Carbohydrate Phosphotransferase System” Microbial Cell Factories, 7:1 {1-31}. 7. M. I. Chávez-Bejar, A. R. Lara, H. López, G. Hernández-Chávez, A. Martínez, O. T. Ramírez, F. Bolívar, G. Gosset; (2008) “Metabolic Engineering of Escherichia coli for L-tyrosine Production by Expression of the Genes Coding for the Chorismate Mutase Domain of Native Chorismate Mutase-Prephenate Dehydrogenase from Zymomonas mobilis”; Applied and Environmental Microbiology, 74 (10), 3284-3290. 8. L. Caspeta, N. Flores, N.O. Pérez, F. Bolívar, O.T. Ramírez; (2008) “The Effect of Heating Rate on Escherichia coli Metabolism, Physiological Stress, Transcriptional Response, and Production of Temperature-Induced Recombinant Protein: A Scale Down Study” Biotechnology and Bioengineering, published online 18 August. 9. E. Dantan-González, O. Vite-Vallejo, C. Martínez-Anaya, M. Méndez-Sánchez, M.,C. González, L.A. Palomares, J. Folch-Mallol; (2008) “Production of two novel laccase isoforms by a thermotolerant strain of Pycnoporus sanguineus isolated from an oil-polluted tropical habitat”, International Microbiology. 11, 163-169. 10. N. A. Chávez, E. Salinas, J. Jauregui, L. A. Palomares, and K. Macias; “Detection of bovine milk adulterated with cheese whey by a Western blot immunoassay”; Food and Agricultural Immunology, en prensa 2008. 11. W. A. Rodríguez-Limas, B. Flores-Samaniego, G. de la Mora, O. T. Ramírez, and L. A. Palomares; “Genotypification of bovine group A rotavirus in Mexico”; sometido septiembre 2008. 12. L.A. Palomares and O. T. Ramírez; “Challenges for the Production of Virus-like Particles in Insect Cells: The Case of Rotavirus-like Particles”; sometido noviembre 2008. 13. A. Baez, N. Flores, F. Bolívar, O. T. Ramírez; Metabolic and Transcriptional Response of Recombinant Escherichia coli to Elevated Dissolved Carbon Dioxide Concentrations. sometido diciembre 2008. 14. G. Plascencia-Villa, J. Saniger, L. A. Palomares, and O. T. Ramírez; “New Multifunctional Nanobiomaterials From Recombinant VP6 Rotavirus Protein: Explanding Applications of Viral Assemblies

in Nanobiotechnology”; sometido diciembre 2008. Capítulos en libros 15. L.A. Palomares, A.R. Lara, O.T. Ramírez, “Bioreactor Scale-Down” En: The Encyclopedia of Industrial Biotechnology; Spier, R.E. (ed), John Wiley and Sons. Versión ampliada y actualizada del capítulo con el mismo nombre impreso en The Encyclopedia of Cell Technology. En prensa. 16. L.A. Palomares, O.T. Ramírez, “Bioreactor Scale-Up” En: The Encyclopedia of Industrial Biotechnology; Spier, R.E. (ed), John Wiley and Sons. Versión ampliada y actualizada del capítulo con el mismo nombre impreso en The Encyclopedia of Cell Technology. En prensa. Editoriales en Libros Internacionales 17. O.T. Ramírez, autor del prefacio del libro: “Animal Cell Technology: From Biopharmaceuticals to Gene Therapy”; L.R. Castilho, A. Moraes y E.F Pires-Augusto (eds.). Taylor & Francis, N.Y., N.Y. 2008. -Autor del prefacio para la edición del mismo libro en Portugués” “Tecnología del Cultivo de Células Animales: de Biofármacos a Terapia Génica” de L.R. Castilho, A. Moraes y E.F Pires-Augusto (eds.). Roca Editora, Brasil. Publicaciones Internacionales en Memorias in Extenso 18. N. A. Valdez-Cruz, M. A. Trujillo-Roldán y O. T. Ramírez; “Del Gen al Biofármaco: Expresión de Proteínas Heterólogas”; Memorias del III Simposio sobre Biofábricas, Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín; del 15 al 17 de agosto 2007; 17 p. ISBN: 978-958-8256-58-0 19. N. A. Valdez-Cruz, J. Uribe W., O. T. Ramírez; “Caracterización Analítica de Proteínas Recombinantes Usadas como Biofármacos”; Memorias del III Simposio sobre Biofábricas, Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín; del 15 al 17 de agosto 2007; 6 p. ISBN: 978-958-8256-58-0. 20. W.A. Rodríguez-Limas, J.L. Folch-Mallol, O.T. Ramírez, L.A. Palomares. Construction of different strains of Saccharomyces cerevisiae for rotavirus protein expression. Proceedings of the First International Congress on Biotechnology and Bioengineering. CINVESTAV, Mexico. ISBN: 978-607-95065.1.3.

Publicaciones Nacionales: 21. W.A. Rodríguez-Limas WA, O.T. Ramírez, L.A. Palomares (2007) Identificación de genotipos de rotavirus bovino prevalecientes en México como herramienta para el desarrollo de una vacuna recombinante. BioTecnología. 10 (1) 34-41. 22. L.A. Palomares, O.T.Ramírez (2007) Glicosilación de proteínas recombinantes: Importancia y relación con las condiciones de bioproceso. En: Diseño y producción de fármacos. E Juaristi (ed.) El Colegio Nacional. México. Pp. 95-123. 23. L. A. Palomares, N. A. Valdez y O. T. Ramírez; “Superando los Retos del Cultivo de Células Animales a través de la Bioingeniería” en: Una Ventana al Quehacer Científico: Instituto de Biotecnología 25 aniversario, Editorial D, F. Redobello y A. López Munguía (Compiladores), Dirección General de Divulgación de la Ciencia UNAM/-IBT; Cuernavaca, Mor. México. 385-398 (2008). ISBN 978-970-32-4658-8 24. I. Martínez-Duncker, L.A. Palomares, D. Sánchez Francia, R. Mollicone, I. Ibarra González; (2008) “Trastornos Genéticos de la Glicosilación: Abordaje Clínico y de Laboratorio” Acta Pediátrica de México 29 (2) 78-88. Patentes 25. A. De León, E. Galindo y O. T. Ramírez; “Proceso en Dos Etapas para la Producción de CélulasConteniendo Proteína Madurada con Actividad Biológica”. Patente número 249141, IMPI, México, D.F. Otorgada: 19 de septiembre de 2007. 26. O.T. Ramírez, G. Plascencia Villa, L.A. Palomares, Y.A. Mena Méndez y J.M. Saniger Blesa; “Uso de Proteínas Multiméricas Virales como Templados para la Construcción de Nanobioimateriales” Solicitud internacional PCT/MX 2008/00080 presentada el 24 Jun. 2008. Docencia: O.T. Ramírez Curso impartido en su totalidad: Tópico Selecto en “Dinámica y Control de Biorreactores”. Maestría y Doctorado en Ciencia Bioquímicas. Instituto de Biotecnología-UNAM. Participación en cursos: VII Curso Latinoamericano de Biotecnología y XLII Curso Internacional de Ingeniería Bioquímica. Escuela de Ingeniería

Bioquímica, Pontificia Universidad Católica de Valparaiso, Chile. Curso Básico, Bioingeniería. Participación cada semestre. Posgrado en Ciencias Bioquímicas. UNAM. L.A. Palomares Cursos como responsable: Ingeniería Bioquímica 2007. Participación en el curso del 2008. Cursos a la industria: Capacitación en el sistema Células de Insecto-Baculovirus. Boehringer Ingelheim. IBt/ UNAM abril 2008 y noviembre 2007 2 cursos de 4 días cada uno). Con participación de las M.C. Ruth Pastor y Vanessa Hernández. Participación en cursos: Curso Básico Bioquímica. Participación anual. Cursos varios en el IBT y la UAEM. N.A. Valdez Cursos como responsable Curso “Desde la biología molecular hasta la purificación y estabilización de proteínas heterólogas expresadas en sistemas procariotes y eucariotes”. En la Maestría en Biotecnología y la Maestría en Ingeniería Química de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín, Agosto 2007 (12 h). Tópico Selecto en “Expresión de proteínas en sistemas heterólogos: desde la biología molecular hasta la purificación y estabilización de proteínas ”. Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas. Instituto de Biotecnología-UNAM, 2008. (El Dr. Gerardo Corzo también fue responsable en este curso). Curso “Producción de proteínas recombinantes desde el gen hasta el biorreactor”. 28-30 de abril 2008, en la Sede de Investigación Universitaria, SIU, de la Universidad de Antioquia. (Con la participación del Dr. Mauricio Trujillo) Desarrollo Tecnológico: Colaboración estrecha y/o convenios con las siguientes compañías: Probiomed S.A. de C.V.; Birmex S.A. de C.V.; Protein Sciences Corp., Instituto Bioclón; Biozoo S.A. de C.V.; Boehringer-Ingelheim. Distinciones: O.T. Ramírez: Editor Asociado de Biochemical Engineering Journal, febrero 2008 a la fecha. Miembro del Comité Editorial de “Biotechnology and Bioengineering”. Miembro del Comité

Asesor Editorial de “The Open Biotechnology Journal”, desde 2007. L.A. Palomares: Distinción Universidad Nacional para Jóvenes Académicos 2007. Área Innovación Tecnológica y Diseño Industrial. Asesoría al trabajo de W. A. Rodríguez-Limas, ganador del Premio “Sergio Sánchez Esquivel-SMBB 2008”, categoría Doctorado. Miembro del Comité Asesor Editorial de “The Open Biotechnology Journal”, desde 2007. Miembro del Comité Editorial de “Microbial Cell Factories”. Otros O.T. Ramírez y A. Lara, con contrapartes alemanas, organizaron el German-Mexican Workshop on the Integration of Microbial Physiology and Bioprocess Technology (2008).

O.T. Ramírez y L.A. Palomares participaron en la organización de varios congresos nacionales e internacionales, principalmente como miembros de comités científicos. O.T. Ramírez fue miembro del Jurado del Merck Cell Culture Engineering Award, E.U.A., 2008, de la Comisión Evaluadora del PRIDE del Instituto, miembro del Comité Técnico Calificador del “Premio Birmex 2007”, Birmex S.A. de C.V. y evaluador para la Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), Canadá (2008). L.A. Palomares es miembro del “Scientific Advisory Board” de la empresa Estadounidense Protein Sciences Coorporation.