ELECTROFORESIS EN GEL

Es una técnica para separar moléculas basándose en propiedades de las mismas tales como el tamaño, la forma o el punto isoeléctrico.

Gel,se refiere a la matriz usada para separar las moléculas. En muchos casos un gel es un

polímero entrelazado de porosidad controlable.

Cuando la separación es de proteínas, ADN o ácidos nucleicos pequeños

(ADN, ARN o ribonucleótidos), el gel está compuesto por diferentes concentraciones

de acrilamida /bis-acrilamida y un iniciador de la polimerización, para producir redes de

poliacrilamida de diferentes tamaños.

Para separar ácidos nucleicos grandes (más de unos centenares de bases), la matriz

empleada es agarosa   purificada .

En ambos casos, el gel forma una matriz sólida pero porosa. La acrilamida, en contraste con

la poliacrilamida, es una neurotoxina y debe ser manejada cuidadosamente para evitar

envenenamientos.

Electroforesis, se refiere a la fuerza electromotriz que es empleada para desplazar las

moléculas a través del gel.

Al situar las moléculas en el gel y aplicar una diferencia de potencial eléctrico, las moléculas

se mueven a diferentes velocidades, hacia el cátodo, si están cargadas positivamente, y hacia

elánodo, si están cargadas negativamente.

Aplicaciones[editar]

Ácidos nucleicos[editar]

En los ácidos nucleicos la dirección de migración es del electrodo negativo al positivo, y esto

es debido a la carga negativa presente en el esqueleto azúcar-fosfato.

En los fragmentos de ADN dobles (con estructura de doble hélice) la velocidad de migración

es inversamente proporcional a su tamaño.

En fragmentos simples de ADN y ARN (una sola cadena), dichas moléculas tienden a

plegarse de forma compleja y a migrar de forma más complicada, según la estructura terciaria

formada tras el plegamiento. Sin embargo, compuestos que puedan romper los enlaces

de puente de hidrógeno, como el hidróxido de sodio o la formamida, son empleados para

'desplegar' las moléculas plegadas y permitir que la velocidad de migración dependa

únicamente y exclusivamente del tamaño y no de la estructura formada tras el

plegamiento.

Proteínas[editar]

Las proteínas no tienen una estructura predecible como los ácidos nucleicos, y por tanto sus

velocidades de migración no son similares entre las proteínas. Incluso puede que no migren ni

al aplicar una fuerza electromotriz . En estos casos, las proteínas se desnaturalizan

mediante la adición de un   detergente   como el dodecilsulfato sódico / dodecilfosfato

sódico   (SDS/SDP) y un agente reductor como el   2-mercaptoetanol .

Los detergentes otorgan una carga neta negativa a la proteína que les permite migrar a

través del gel de poliacrilamida en relación directa a su masa, ya que la cantidad de cargas

negativas que se unen a la proteína depende del tamaño de ésta, existiendo una relación

carga/masa similar. Además, la desnaturalización hace que pierdan su estructura terciaria

y cuaternaria por tanto su velocidad de migración es proporcional al tamaño y no a su

estructura terciaria ni a su interacción con otras macromoleculas.

Así, los más grandes se desplazan más lentamente.

Revelado y visualización[editar]

Cuando se ha completado la electroforesis, las moléculas más pequeñas han llegado al

ánodo. Entonces se pueden 'revelar' mediante la adición de un colorante específico para

hacerlas visibles. Se emplean compuestos como el bromuro de etidio , para los ácidos

nucleicos, o tinción de plata, azul de coomassie o tinción fluorescente, para las

proteínas.

Asimismo se emplean otros métodos para visualizar la separación de la mezcla en el gel. Si el

reactivo es fluorescente bajo la luz UV, se puede simplemente hacer una fotografía de la placa

bajo dicha luz. También, si las moléculas contienen átomos radiactivos se puede efectuar una

autorradiografía.

Si se han inyectado varias mezclas una junto a otra en la placa, se producirán separaciones

paralelas (calles). Cada calle mostrará distintas bandas correspondientes a cada componente

de la mezcla. Si dos componentes poseen la misma masa las separaciones serán

incompletas, por lo cual ambas bandas se verán solapadas.

Tipos[editar]

La electroforesis en gel se utiliza en biología molecular, genética y bioquímica:

La electroforesis en gel de muestras grandes de ADN y ARN se efectúa en geles

de agarosa.

La electroforesis de proteínas se lleva a cabo en geles de poliacrilamida-SDS (SDS-

PAGE), isoelectroenfoque, geles nativos o electroforesis bidimensional.

Electroforesis capilar.

Electroforesis de ADN.

Zimografía o zimogramas

Extracción en gel.

Electroforesis en gel de campo pulsado.

HIBRIDACION

La hibridación de ácidos nucleicos (ADN o ARN) es un proceso por el cual se combinan

dos cadenas de ácidos nucleicos antiparalelas y con secuencias de bases

complementarias en una única molécula de doble cadena, que toma la estructura de

doble hélice, donde las bases nitrogenadas quedan ocultas en el interior.

Los nucleótidos se unirán con sus complementarios bajo condiciones normales: A=T; A=U;

C≡G; G≡C; T=A o U=A

Así que dos cadenas perfectamente complementarias se unirán la una a la otra rápidamente.

Por el contrario, debido a las diferentes geometrías de los nucleótidos, una simple variación de

las parejas anteriores lleva a inconsistencias entre las cadenas y dificultará la unión.

El proceso de hibridación se puede revertir simplemente calentando la disolución que

contiene la molécula.

El porcentaje de GC dentro de la cadena condiciona la temperatura de alineamiento y de

desnaturalización ya que G se une a C mediante tres puentes de hidrógeno y A se une a U o

T mediante dos puentes de hidrógeno; por tanto, y dado que se requiere más energía para

romper tres enlaces que para romper dos, dicha energía se traduce en una mayor

temperatura.

El %GC no es igual para todas las especies, es más, el %GC es distinto incluso entre el ADN

nuclear y el ADN mitocondrial, lo que nos da bastante juego en los protocolos de extracción de

ADN, según qué tipo vamos a estudiar y esto es importante, entre otros motivos porque

existen enfermedades genéticas debidas a mutaciones en el ADN mitocondrial.

En biología molecular experimentalmente se llevan a cabo dos tipos diferentes de

hibridación: Tipo   Southern , para uniones ADN-ADN y tipo   Northern blot , para uniones

ADN-ARN.

Procedimiento experimental

1. La hélice de doble cadena (ADN) se separa mediante un proceso físico (calor) o

químico (con una base fuerte, como la sosa cáustica). Esto rompe los enlaces

por puente de hidrógeno que mantienen unidas las dos hebras del ADN.

2. Las dos hebras complementarias se separan, el ADN se desnaturaliza.

3. Una muestra de cadenas simples (o desnaturalizadas) se mezcla con otra muestra de

cadenas simples.

4. La muestra combinada se enfría lentamente, las moléculas sencillas se van

emparejando por las zonas complementarias (más estables termodinámicamente) y

se va formando una nueva molécula hibridada

La velocidad de hibridación es un indicativo de la similaridad   genética   entre las dos

muestras. El porcentaje de similaridad genómica y la velocidad de hibridación es

directamente proporcional.

Métodos de laboratorio[editar]

Existen dos tipos de hibridaciones de ácidos nucleicos que se usan frecuentemente en los

laboratorios que utilizan técnicas de biología molecular.

Ambos métodos utilizan una cadena sencilla de ADN marcada por un método físico-

químico, bien sea con   radiactividad   o bien con un   fluorocromo . Esta cadena tiene

una   secuencia   de nucleótidos conocida y se utiliza como   sonda   para detectar otras

moléculas de ARN o ADN de cadena sencilla de secuencia parecida.

Southern

El método tipo Southern o Southern blot fue desarrollado para la detección de genes

específicos en el   ADN   celular.

El ADN es digerido con una enzima de restricción y los fragmentos son separados por

tamaños mediante electroforesis en un gel. A continuación los fragmentos de ADN de doble

cadena son desnaturalizados mediante un proceso químico separando las dos hebras

componentes del ADN en sus cadenas sencillas.

Posteriormente, el ADN inserto en el gel es transferido a un filtro de nitrocelulosa, con lo que

en el filtro queda representada una réplica de la disposición de los fragmentos de ADN

presentes en el gel.

A continuación el filtro se incuba durante un tiempo con la sonda marcada (radiactivamente o

con un fluorocromo); durante la incubación la sonda se va hibridando con las moléculas de

ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida).

La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el filtro de una

forma sencilla mediante una exposición a una película de rayos X para el caso de sondas

radiactivas o con una película sensible a la luz, para el caso de sondas con fluorocromo

Northern

El segundo método, tipo Northern blot o Northern, se utiliza para identificar las cadenas

de   ARN   de secuencia semejante al ADN que se usa como sonda ; a diferencia del tipo

Southern que se utiliza para identificar ADN, el método Northern sirve para identificar ARN.

El ARN se extrae y se fracciona en tamaños variables mediante una electroforesis en gel de

poliacrilamida en unas condiciones que mantengan las cadenas de ARN en estado

desnaturalizado. El proceso continúa de forma semejante a la hibridación de tipo Southern. El

método del Northern se utiliza muy frecuentemente para realizar estudios de   expresión

génica ; para conocer qué genes están activos formando ARN mensajero en qué

condiciones, en qué tejidos o tipos celulares.

Hibridación in situ

Un desarrollo de las técnicas de preparación y fijación de materiales biológicos para su

observación al microscopio, junto con el desarrollo de técnicas de hibridación tipo Northern ha

llevado a poder realizar la hibridación de las sondas directamente sobre tejidos de material

orgánico. Utilizando técnicas inmunohistoquímicas se puede conocer la localización precisa de

los tejidos y células que están expresando los genes de secuencia complementaria a las

sondas utilizadas. También en esta categoría destaca el FISH, técnica de hibridación in situ,

donde las sondas son secuencias de ADN marcadas que se unen a secuencias de ADN

conocidas dentro del cromosoma, con las que comparte un alto grado de similitud y que

podemos observar con un microscopio óptico de fluorescencia.

ELISA  es una técnica de inmunoensayo en cual un antígeno inmovilizado se detecta

mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable

como cambio de color o algún otro tipo en ocasiones, con el fin de reducir los costos del

ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y

que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima

anteriormente mencionada.

La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el

antígeno en la muestra.

Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la

muestra de sangre de un paciente..

La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un

paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune.

Pero como prueba diagnóstica, posee diversas limitaciones que conviene conocer:

En primer lugar, un resultado positivo que confirma la presencia de anticuerpos no

significa necesariamente que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha

estado enferma y que ya se ha recuperado puede seguir produciendo anticuerpos. Esto

originaría un falso positivo.

En segundo lugar, hay personas que producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo

que estos pueden pasar desapercibidos y no ser medidos, dando lugar a un falso

negativo. Sería el caso, por ejemplo, de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o

que se encuentren en el periodo ventana de la infección en el momento de realizar la

prueba, o que estén infectadas por una cepa extraña.

En tercer lugar, pueden aparecer falsos positivos cuando se da inespecificidad entre

antígeno-anticuerpo.

En estos casos de diagnóstico de enfermedad, es recomendable la eliminación (mediante

centrifugación) de células de la sangre que puedan interferir con el ensayo y puedan

ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aquel de especificidad.

También, debemos tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que

posee un valor predictivo positivo bajo en una determinada población —es decir, que esa

enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha población—, es necesario volver a confirmar el

resultado positivo mediante otro método de diagnóstico independiente. Normalmente, se lleva

a cabo un western blot donde se detecta la presencia de varios anticuerpos, simultáneamente,

frente a la misma infección en una muestra. El resultado del western se considera positivo

cuando aparecen al menos 5 bandas, que indica que 5 anticuerpos diferentes están presentes

en el sujeto frente a esa infección. Es entonces cuando se diagnostica como positivo a dicho

paciente.

Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto

y simple en su realización, mediante el uso de la fase sólida, una separación fácil entre la

fracción retenida y la fracción libre.

Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal

(luminiscentes, cascadas enzimáticas...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos

ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal.

Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se

precisaba la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección

viral, clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.

Dispositivos empleados en ELISA

Se han ensayado numerosas fases sólidas, desde los tubos de cristal de los orígenes hasta

las actuales microplacas de 96 pocillos de plástico tratado, para aumentar su capacidad de

adsorción (en su superficie) de moléculas, y con fondos de pocillo ópticamente claros que

permitan realizar las medidas de densidad óptica en instrumentos específicos,

espectrofotómetros de lectura de placas que han recibido el nombre de lectores ELISA.

Los lectores ELISA son espectrofotómetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno

de los pocillos de la placa ELISA.

A diferencia de un espectrofotómetro convencional, con capacidad de leer todas las

longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera continua, los lectores de ELISA

disponen de sistemas de filtros que solo permiten la lectura de una o pocas longitudes de

onda; son la que se corresponden con las necesarias para determinar la densidad óptica de

los cromógenos más comúnmente utilizados.

Las cuatro fases de un ensayo ELISA son las siguientes:

1. Conjugación del anticuerpo o del antígeno con una enzima (peroxidasa, fosfatasa

alcalina...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e

indirectos, sandwich, etc.El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición

de antígeno.

Dicha unión anticuerpo-enzima o antígeno-enzima ha de producirse durante un

determinado período de tiempo en aras de producir una solución coloreada y que

pueda ser valorada visualmente o cuantificada por medio de un espectrofotómetro .Si

no transcurre el tiempo adecuado para que se dé la reacción, no se evidenciará

ningún color, interpretándose este resultado como un falso negativo y disminuyendo la

sensibilidad de la técnica.

2. Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o

antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran

afinidad por proteínas. Así, el procedimiento de recubrimiento de los pocillos debe

realizarse cuidadosamente. Si se usa mucho antígeno, se pueden obtener falsos

positivos. Por el contrario, si se usa poco antígeno, el exceso dará lugar a una

reacción falsa negativa.

3. Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno

unido a la placa, se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno

marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un

secundario anti-primario marcado (ELISA indirecto).

Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más

anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario.

4. Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todas las

moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos, se añade el sustrato

enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica mediante

espectrofotometría.

Tipos de ensayos ELISASe han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten la cuantificación de

un antígeno en solución, la detección de un anticuerpo en una solución (por ejemplo en el

clonaje de anticuerpos monoclonales) o la determinación de la subclase (idiotipo) de un

anticuerpo. A continuación se describen los más comunes.

ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan

recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el

antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la

solución analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del

mismo tipo que las analizadas (sangre, orina...), pero en las que se tenga la certeza de la

ausencia del antígeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones

donde se encuentra el antígeno buscado).

ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la anterior. Los

controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos

anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra el

primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal

debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario.

Es el ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo

secundario marcado y un mismo sistema enzimático permiten cuantificar una gran

variedad de antígenos; por eso es un método más polivalente y barato, aunque se pierda

algo de precisión por tener un eslabón más con respecto al método directo.

El ELISA indirecto es el método de elección para detectar la presencia de anticuerpos

séricos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), agente causante del

síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Según esta técnica, proteínas

recombinantes de la envoltura y el núcleo del VIH se absorben como antígenos en

fase sólida a los pocillos. Las personas afectadas de VIH producen anticuerpos séricos

contra epítopos en estas proteínas víricas. En general, el ELISA indirecto permite

detectar anticuepos séricos contra VIH desde las primeras seis semanas de una

infección.

ELISA «sándwich» (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante

inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el

pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de

anticuerpo, se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que

será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un

segundo lavado que elimina el material no retenido, se aplica una solución con un

segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así, pues, cada molécula de antígeno

estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al

menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido

a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.

Quimioluminiscencia

Durante determinadas reacciones químicas, la luz generada por este fenómeno

constituye una alternativa conveniente y muy sensible para las mediciones de

absorbancia en ELISA. Los tipos de ELISA que recurren a la quimioluminiscencia utilizan

un sustrato que genera luz, en lugar del sustrato cromógeno de las reacciones ELISA

ordinarias. Tales son los casos de la oxidación del compuesto luminol por peróxido de

hidrógeno y la enzima peroxidasa de rábano (HRP), que producen luz. La medición

cuantitativa de la emisión de luz puede hacerse mediante el uso de un luminómetro.

Prueba ELISPOTUna variante de la prueba ELISA, llamada ELISPOT, es capaz de detectar

cuantitativamente el número de células en una población productora de anticuerpos

específicos contra un antígeno determinado o un antígeno contra el que se dispone de un

anticuerpo específico. Aquí, las placas se recubren con el antígeno reconocido por el

anticuerpo de interés o con el anticuerpo específico para el antígeno cuya producción se

valora.