resumen - instituto politécnico nacional · arn ciclasa, proteínas ribosomales y con estructuras...

Índice de Trabajos en Extenso IIIVVV CCCOOONNNGGGRRREEESSSOOO IIINNNTTTEEERRRNNNAAACCCIIIOOONNNAAALLL XXXVVV CCCOOONNNGGGRRREEESSSOOO NNNAAACCCIIIOOONNNAAALLL IIIVVV IIINNNTTTEEERRRNNNAAATTTIIIOOONNNAAALLL CCCOOONNNGGGRRREEESSSSSS XXXVVV NNNAAATTTIIIOOONNNAAALLL CCCOOONNNGGGRRREEESSSSSS

DDDEEE IIINNNGGGEEENNNIIIEEERRRIIIAAA BBBIIIOOOQQQUUUÍÍÍMMMIIICCCAAA OOOFFF BBBIIIOOOCCCHHHEEEMMMIIICCCAAALLL EEENNNGGGIIINNNEEEEEERRRIIINNNGGG

Del 4 al 7 de abril del 2006 en la ciudad de Morelia Mich. México.

COLEGIO MEXICANO DE INGENIEROS BIOQUÍMICOS, A. C.

Mar del Norte No. 5, Col. San Álvaro Azcapotzalco C.P. 02090, México, D. F. Tel. y Fax: (01 55) 5623 3088 e-mail: [email protected] y [email protected]

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Creación de una genoteca de Trypanosoma cruzi, e identificación, por análisis bioinformático, de información relevante en 17 clonas secuenciadas

©Maldonado, RA., ®Maldonado RR., ™Jiménez, CE., ™Campos, VG., ®Espinosa, LJM., ©Espinoza GF. © Facultad de Medicina -Universidad de Colima (Av. Universidad 333 Col. Las Víboras, Colima, Col. CP 28040) [email protected]

® Laboratorio de Tecnología del ADN Departamento de Bioquímica Escuela Nacional de Ciencias Biológicas IPN

™ Laboratorio de Investigación en Parasitología - HIM Federico Gómez SSA.

Resumen ________________________________________________________________________________________ Trypanosoma cruzi causa la enfermedad de Chagas, la cual es un grave problema de Salud Pública en América donde afecta alrededor de 20 millones de individuos, el parásito tiene gran variabilidad genotípica y fenotípica (Devera, 2003). Hace casi 100 años la enfermedad fue descrita por Carlos Chagas. Sin embargo, no es atendida por las autoridades por las siguientes razones, solo se dispone de dos fármacos (benznidazol y nifurtimox) que son tóxicos, caros y no están disponibles en las farmacias, tampoco son efectivos para todos. No hay vacuna para prevenirla. la población pobre es la más afectada por la enfermedad, y estos a su vez son los donantes de sangre u órganos. Lo anterior, justifica buscar secuencias relevantes en el genoma de T. cruzi que sean útiles en la prevención y la terapia empleando recursos de bioinformática.

En este trabajo inicialmente se generó la genoteca de cADN’s a partir epimastigotes de un cultivo in vitro en fase exponencial de T. cruzi obtenido de Triatoma dimidiata de Campeche. Empleando el procedimiento descrito por Bonilla, con la genoteca se transfectó E. coli DH5α utilizando como vector el plásmido TOPO TA Cloning® [Invitrogen Catálogo No. K4500-01].con resistencia a Kanamicina y Ampicilina. Se cultivaron en placas LB-Kanamicina/IPTG/X-Gal-Agar. A 25 colonias transfectadas con el plásmido-cADN (colonias blancas) se les extrajo los ADN plasmídicos con el Kit de Roche catálogo No.1754777 recuperando las clonas de cADN’s digiriendo con la enzima EcoRI. Los fragmentos se secuenciaron con el equipo ABI Prism DNA Sequencer, utilizando el Kit de secuenciación ABI Prism Big Dye Terminator Cicle Sequencing Ready, reacción basada en el método de Sanger, con los iniciadores M13 Forward (-20) 5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’ y M13 Reverse 5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’]. Las secuencias de los cADN’s se analizaron con recursos de bioinformática con el siguiente esquema: A partir de las secuencias electrónicas de los cADN’s (extensión ab1) se analizaron con los programas: Pregap4 y Trev (Staden Package v1.6.0)

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/ VecScreen, ORF finder, blastp y blastn / megablast eukariotic genoma (significancia p<0001) el NCBI; SeqVerter V 2.02, ReadSeq V 2.1.3, ClustalW V 1.7, GenDoc V 2.6.0.1 y Phylip V 3.6_alpha3.

Los análisis encontraron similitud significativa con: secuencias de citocromo “C” subunidad II, de metaxina. ARN ciclasa, proteínas ribosomales y con estructuras 3D de dominios conservados para proteínas ribosomales y citocromo “C” subunidad II. Con bases de datos de T. cruzi se obtuvo homología significativa con: proteínas hipotéticas, transialidasa, glicoproteína similar a muscina de T. cruzi, con una proteína de función desconocida de Leishmania major. En la cepa CL T. cruzi Brener se detectó un fragmento conservado de 35 bases en 91 secuencias de la cepa en cuestión. La secuencia conservada de 35 bases con blastn (“nr” GenBank) detectó la misma secuencia conservada en 40 genes de T. cruzi y en 10 genes de otras especies de tripanosomas. Se buscó en el genoma humano la secuencia de 35 bases conservada en 40 genes de T. cruzi, utilizando tamaños de 16, 20, 24, 28 y 32 bases, únicamente se encontraron fragmentos de 18 bases o menor en todos los cromosomas de Homo sapiens. Aplicando la misma estrategia para todas las secuencias y organismos de las bases de datos de GenBank, EMBL, BDJ, y PDB (3 740 965 secuencias; 16 531 947 686 bases) no se encontraron secuencias mayores de 18 bases. Con el fin de realizar filogenia, se construyeron dos árboles filogenéticos, con 71 secuencias homólogas de aminoácidos de citocromo C subunidad II. En el primero la clona cADN_Tcruzi se situó en la rama de los hominidos; un segundo árbol filogenético donde se hicieron alineamientos por grupos de organismos afines (protozoarios, aves, helmintos, etc.), con y sin la secuencia de la clona de T. cruzi; ésta cambió a la rama de los protozoarios Plasmodium y Toxoplasma. Los resultados obtenidos pueden continuarse en diversas vertientes: a) Continuar con los estudios in silico y experimentales para la recuperación de las proteínas identificadas en T. cruzi y su caracterización. B) Modelar mediante bioinformática la estructura 3D las secuencias de aminoácidos que tuvieron similitud con proteínas ribosomales y citocromo C para buscar homología con estructuras 3D, ya que tiene mayor relevancia biológica (forma-función) que por la secuencia de los aminoácidos. c) El fragmento de 35 bases conservado en 40 genes de T. cruzi, no se encontró en las bases de datos de ningún otro organismo vivo (otros kinetoplastidos_especies de tripanosomas, leishmanias etc., la presentan con algunas bases cambiadas) potencialmente puede emplearse para identificación de especie, y de manera particular para la inhibición del desarrollo del parásito Palabras clave: Trypanosoma cruzi, cADN’s, Bioinformática.

IIIVVV CCCOOONNNGGGRRREEESSSOOO IIINNNTTTEEERRRNNNAAACCCIIIOOONNNAAALLL XXXVVV CCCOOONNNGGGRRREEESSSOOO NNNAAACCCIIIOOONNNAAALLL IIIVVV IIINNNTTTEEERRRNNNAAATTTIIIOOONNNAAALLL CCCOOONNNGGGRRREEESSSSSS XXXVVV NNNAAATTTIIIOOONNNAAALLL CCCOOONNNGGGRRREEESSSSSS





Introducción ______________________________________________________________________________________ Trypanosoma cruzi el agente etiológico de la enfermedad de Chagas. Fue descubierto en 1909 por el médico brasileño Carlos Chagas, en chinches hematófagas. Ésta enfermedad es endémica en América Central, América del Sur y México, donde se estima que hay más de 18 millones de personas infectadas con T. cruzi, de 2 a 3 millones presentan manifestaciones clínicas relacionadas con Chagas crónico y 3 millones más se encuentran en la fase de Chagas indeterminado. Se estima que un millón de personas se infectan anualmente y 45 000 mueren anualmente por causa de esta enfermedad y se presume que estas cifras se incrementaran en caso de no tomarse estrategias para el control de la enfermedad de Chagas. La OMS considera dos zonas eco-epidemiológicas definidas en 18 países de América; 1. El Cono Sur de Sud América donde el insecto vive dentro de las habitaciones humanas; 2. La Región norte del cono sur de América, América Central y México donde el vector vive fuera y dentro de las habitaciones humanas. Se ha documentado la transmisión del parásito al hombre de 4 maneras; a) A través de las deyecciones de triatominos, b) Por transfusión con sangre de donantes infectados, c) Congénita de madre infectada a feto y d) Por transplante de órganos de donantes infectados (4). Generalmente la transmisión del parásito ocurre cuando el vector (infectado) se alimenta defeca, en las material fecal lleva al parásito que puede entrar por la picadura o por rascado, si ocurre cerca del ojo, el párpado se inflama (signo de Romaña). Pocos días después, puede ocurrir inflamación de nódulos linfáticos y afección cardiaca que en algunos casos puede llegar a la muerte, especialmente en niños. Con mayor frecuencia los individuos entran en un estadio asintomático que puede durar meses o años (Chagas indeterminado), durante este tiempo el parásito invade muchos órganos del cuerpo, se estima que un tercio de individuos con Chagas indeterminado pasan al estado crónico de la enfermedad, donde el enfermo presenta daño cardiaco y/o digestivo severo e irreversible. Hasta ahora no hay vacuna para prevenirla ni fármacos efectivos para las fases indeterminada y crónica de la enfermedad.

La eliminación completa del parásito no parece factible, debido a la naturaleza zoonótica de la enfermedad ya que afecta a un número indeterminado de mamíferos silvestres y domésticos, se conocen más de un centenar de vectores. La OMS ha considerado una serie de estrategias para su control tales como: 1. Fumigación de casas infestadas con vectores con insecticidas residuales, 2. La detección de anticuerpos anti_T. cruzi en donantes sanguíneos y en donadores de órganos que provengan de áreas endémicas de la enfermedad, 3. Diagnosticar oportunamente los casos agudos de la enfermedad, darles tratamiento farmacológico y seguimiento hasta su curación. 4. Mejorar las habitaciones humanas, y 5. Educar para la salud, enfatizando la participación activa de la población afectada. Recientemente se han detectado enfermos de Chagas en otros continentes, la transmisión del parásito ocurrió por transfusiones






de sangre afectando a individuos de Australia y Europa. La sangre fue donada por inmigrantes asintomáticos de América Central y América del Sur infectados con T. cruzi , pero a nadie en esos países decidió realizar pruebas de detección del parásito en estos donantes.

Trypanosoma cruzi presenta una amplia variabilidad de características biológicas se ha documentado diferencias en las tasas de crecimiento, curvas de parasitemia, mortalidad, tropismo tisular y susceptibilidad a las fármacos. Mediante análisis de schizodemus y zimodemus, cariotipo, huella genética y RAPD se ha comprobado esta variabilidad. Mas recientemente, se ha demostrado que las cepas de T. cruzi pueden dividirse en al menos dos tipos de linaje principales, donde T. cruzi I corresponde al ciclo selvático, mientras que T. cruzi II corresponde al ciclo peridoméstico. Esta variabilidad del parásito de la enfermedad de Chagas en sus casi 100 años de haber sido descrita no ha permitido identificar un blanco terapéutico común y efectivo para curar al 100% de los enfermos en la fase indeterminada de la enfermedad para evitar que progrese al Chagas crónico y se produzca el daño irreversible en órganos vitales. La OMS a través del subprograma TDR (Tropical Diseases Research) ha establecido algunas prioridades y estrategias para la investigación de la enfermedad de Chagas entre las que destaca el empleo de herramientas de bioinformática y genómica aplicada para la identificación de blancos de fármacos y el esclarecimiento de los mecanismos de patogénesis. Entre los años 1975 a 1997 se generaron 233 fármacos nuevos para emplearse en enfermedades tropicales, de los cuales únicamente 13 fueron aprobados, de estos 13 fármacos, 6 se desarrollaron con el soporte de TDR, continuado con la misma tendencia en años posteriores. No obstante ningún fármaco nuevo se desarrollo para tratar la enfermedad de Chagas.

En las últimas decadas se han identificado más de 15 blancos moleculares que pueden ser blancos terapéuticos en el parásito del Chagas, Por ejemplo, en julio del 2005 M. Levin y colaboradores reportaron que los ribosomas de T. cruzi tienen una estructura en forma de cuerno de unicornio, que lo distingue de los ribosomas de otros organismos, en particular los ribosomas del hombre, lo que sugiere que el parásito cuenta con un mecanismo especial y diferente para convertir la información genética en proteínas, por lo que los científicos tienen un nuevo blanco molecular hacia donde podrían disparar algún fármaco sin afectar las células de los pacientes, estos investigadores estiman que T. cruzi al ser organismo cercano de los parásitos que provocan la enfermedad del sueño y la leishmaniasis, presumen que la estructura del ribosoma que encontraron pudiera ser común a los tres organismos. Desde 1997 varias instituciones entre los que se encuentran El Instituto para Investigación Genómica (TIGR), El Instituto de Investigación Genómica de Seattle (Karolinska Institute), El Laboratorio de Secuenciación Genómica de la Universidad de Uppsala, Suiza y el Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (IIB) de Argentina han participado en el proyecto del genoma de Trypanosoma cruzi a partir del genoma (GSSs)






y el transcriptoma (ESTs) evaluando los cADN’s obtenidos a partir de mARN, con el objeto de descubrir genes en los tripanosomatidos para la identificación de blancos prospectivos para fármacos y el desarrollo de vacunas. De la misma manera se planea crear recursos de bioinformática para el análisis de secuencias en línea, enfocada a la anotación y predicción de funciones y al estudio de la regulación de expresión de genes para caracterizar motivos y señales de regulación de los tripanosomatidos. Las redes de trabajo internacionales han sido altamente exitosas, y han dado cabida a un incremento exponencial. Los datos obtenidos se almacenan en bases de datos, accesibles en la web. Esta información provee las bases para análisis funcionales y estructurales, que pueden usar investigadores interesados en el tema.

No obstante, a pesar de los avances de la medicina moderna, las enfermedades parasitarias (entre ellas el Chagas) aún afectan al hombre, constituyéndose en seria amenaza para la mayor parte de la población mundial. En México se carece de información epidemiológica suficiente acerca de la magnitud de la morbilidad y mortalidad asociada a la infección con T. cruzi, no se diagnostican los enfermos en la fase aguda de la enfermedad ni menos en la indeterminada, la que aunada a la discriminación social y la marcada desatención de los enfermos, han conducido a dar una baja prioridad al apoyo para la investigación de la enfermedad de Chagas y su control nacional. El propósito de nuestro estudio es encontrar mediante herramientas de bioinformática secuencias relevantes comunes en los cADN’s de T. cruzi, ya que pensamos que es posible identificar secuencias relevantes y sus características particulares empleando las bases de datos y las herramientas de bioinformática del dominio público existentes, y los hallazgos puedan servir de base para el diseño de estudios subsiguientes orientadas a la prevención y/o tratamiento de la enfermedad de Chagas, ya que hasta ahora la enfermedad continua afectando a la población de América y su posible propagación a otros continentes debido al incremento en la migración mundial, en este contexto la eliminación de la enfermedad de Chagas como un problema de salud pública puede ser una meta razonablemente alcanzable.

MÉTODOS EXPERIMENTALES






______________________________________________________ Diseño del experimento En nuestra investigación utilizamos un cultivo puro en fase exponencial de T. cruzi obtenido de Triatoma dimidiata de Campeche, México (el cual fue proporcionado por la Dra. Jiménez Jefe del Laboratorio de Investigación en Parasitología del Hospital Infantil de México de la SS, y codirectora de este estudio, laboratorio donde se realizo la fase experimental), con el que se creo la genoteca de cADN’s utilizando el procedimiento descrito por Bonilla (Biochemical Pharmacology 2003: 65. 1701-1707), a este respecto aunque existen diversos métodos para la obtención de genotecas, el procedimiento empleado por Bonilla tiene la ventaja de que están integrados los pasos desde la lisis celular hasta la síntesis de los cADN’s; Digestión de los cADN’s con EcoR1 (Promega, Cat. No.13662602) y ligación DNA (Ligation: Stratagene, Cat No. 203003) al vector pCR®2.1-TOPO TA Cloning® (Invitrogen: catálogo No. K4500-01_con un sitio de policlonación entre las bases 234-357 para enzimas de restricción flanqueadas por el promotor T7. El Operón LacZα entre las bases 1 – 547, resistencia a Kanamicina y Ampicilina, y tamaño de 3.9 Kb). Transformación de E.coli DH5a-T1™-T1R (cepa para clonación, selección azul/blanco. Sensible a Kanamicina y Ampicilina). con el vector pCR®2.1-TOPO con insertos de cADN’s ligados. Crecimiento de E.coli DH5a-T1 transformadas en placas LB-Kanamicina/IPTG/X-Gal-Agar y selección de colonias blancas portadoras del vector con el inserto. Cultivo en 10 ml de medio LB-Kanamicina de 25 colonias blancas durante 20 h a 37°C con agitación 170 rpm. Recuperación y purificación del vector pCR®2.1-TOPO con el cADN (High Pure Plasmid Isolation Kit._Roche, Cat. No. 1754777 y High Pure PCR Product Purification Kit. Roche, Cat. No. 1732668). Recuperación de los cADN’s cortando EcoRI y observación en gel de agarosa al 1% con Bromuro de Etidio. Secuenciación automática de los cADN’s con el Kit de Secuenciación ABI Prism Big Dye Terminator Cicle Sequencing Ready Reaction basado en el método de Sanger, utilizando los Iniciadores M13 Forward (-20) 5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’ y M13 Reverse 5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3. Finalmente se hizo el análisis bioinformático empleando ultilizando las herramientas de dominio público: Pregap4 y Trev (Software Staden Package v1.6.0) para verificar calidad de la secuenciación y corregir las “N” de las secuencias, VecScreen de GenBank, para identificar si los cADN’s contienen fragmentos de la secuencia del vector pCR®2.1-TOPO y en su caso eliminarlas; ORF finder (GenBank) para conocer los 6 marcos de lectura abierta de los cADN’s; blastp y blast eukarioptic genoma(GenBank) (significancia p<0001) para la búsqueda de homología con genes o secuencias de Trypanosoma cruzi u otros organismos que existen las bases de datos. Para hacer alineamiento múltiple y construir el árbol filogenético se utilizo los programas SeqVerter V 2.02 (juntar las secuencias en un archivo), ReadSeq V 2.1.3, y ClustalW Versión 1.7 (para alineamiento múltiple de las secuencias y generación de archivos para construir el árbol filogenético, el programa Phylip Versión 3.6 alpha3, utilizando el método de distancias de kimura.






Desarrollo experimental El parásito Para el desarrollo del presente trabajo se emplearon parásitos de Trypanosoma cruzi aislados de un vector capturado en la ciudad de Campeche. Los parásitos se han mantenido en cultivo desde enero de 1999 en medio LIT (Liver Infusión Tryptose). Cultivo del Parásito Los epimastigotes cultivados del aislado de Campeche de T. cruzi en medio LIT a 28°C son re-sembrados en medio nuevo cada 28 días en tubos de ensayo con tapón de baquelita conteniendo 20 ml del medio LIT y un inóculo total de 1X109 parásitos/ml. Se observaron alícuotas del cultivo al microscopio a 40X para comprobar la esterilidad del cultivo Para realizar el experimento, los parásitos se cosecharon por centrifugación en tubos Costar de 50 ml a 1500xg durante 10 minutos a 4°C. El paquete celular se lavó con PBS 1X, y se resuspendió en 100 ml de la misma solución con que se lavaron. Los parásitos se contaron en cámara de Neubauer, para ello se tomó una alícuota y se hizo una dilución 1:10 en PBS. Con esta dilución se lleno la cámara de Neubauer, se dejo reposar en cámara húmeda 5 minutos y se hizo el conteo de flagelados visiblemente móviles con ayuda de un microscopio óptico, con el objetivo 40X. Se contaron los epimastigotes móviles de las 4 esquinas de la cámara. La cantidad de epimastigotes contados se dividió entre 4 y se multiplicó por 10 (factor volumen, cantidad de organismos en 1 mm3), se multiplica por 103 (para contabilizar el numero total de organismos /ml). Finalmente, para obtener el número total de parásitos/ml, se multiplicó por el factor 10 de la dilución inicial de la muestra. [Cantidad total de parásitos/ml = (Cantidad de epimastigotes/4) x 10 x 103 x 10]

Clonación de la genoteca de T. cruzi La genoteca se construyó con 300 epimastigotes contados en cámara de Neubauer utilizando un procedimiento que permite trabajar con pocas células (Bonilla, 2003).

Síntesis de cADN’s La lisis celular se realizó con nitrógeno líquido, inmediatamente después se agregó solución de lisis-RT y se incubó a 65°C durante 1 minuto. La mezcla de lisis se reposó a temperatura ambiente durante 2






minutos para permitir el alineamiento del oligo(dT)17 a los RNAs mensajeros. Se llevó a 4°C y se agregó 0.8 μl de la enzima transcriptasa reversa (Superscript II_15 U/μl) y se incubó a 37°C durante 15 minutos, posteriormente la enzima se inactivó a 65°C por 10 minutos y se enfrió hasta 4°C. Se adicionó 4.5 μl de MIX tailing [Polinucleótido de desoxiadenina (dA)17] al extremo 3’ de la primera cadena de cDNA, utilizando 15 U de la enzima TdT (0.5 μl) a 37°C por 15 minutos en presencia de 1.5 mM de dATP. Transcurrido el tiempo, se inactivó la enzima TdT a 65°C por 10 minutos, manteniendo al final el tubo de reacción en hielo. La síntesis de la segunda cadena de cDNA se realizó por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando como iniciador 4 µl de 100 pmoles/μl del Oligo(dT)17-EcoRI ATACCGCTCTGGTGAATTCTTTTTTTTTTTTTTTTT (Promega,Cat. No.15199901) que tiene un sitio de restricción de la enzima EcoR1. La mezcla de reacción se llevó a un volumen final de 100 μl con 10 U de Taq ADN polimerasa, amortiguador 10X de la enzima, 2.5 mM de MgCl2 y 25 mM de dNTPs. Las condiciones para la amplificación fueron: Un ciclo inicial a 96°C durante 10 segundos, 25 ciclos: a 96°C por 1 minuto, 42°C por 2 minutos y 72°C durante 6 minutos. Se finalizó con un ciclo de extensión a 72°C durante 5 minutos. Inmediatamente se añadió 10 U más de Taq ADN polimerasa para realizar una segunda reacción de PCR bajo las mismas condiciones, con excepción del último ciclo de extensión a 72°C durante 30 minutos. Para probar la síntesis de cADN, se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1% en TBE 0.5X tomando 10 µl del producto de amplificación y 2 µl del amortiguador de carga de electroforésis. Purificación y cuantificación del cADN por espectrofotometría El producto de amplificación (cADN) se purificó con un Kit comercial siguiendo las indicaciones del proveedor, obteniendo el purificado en 50 µl del amortiguador de elusión (10 mM de Tris-HCl pH = 8.5). El cADN purificado se cuantificó por espectrofotometría, a 260/280 nm diluyendo en agua el cADN 1:50, se realizaron los cálculos para tener una concentración de trabajo de 100 ng/ml de cADN purificado. Digestión con EcoRI El cDNA (1.5 µg) fue digerido con 12 unidades de la enzima EcoRI, a 37°C durante 4 horas. La reacción se detuvo inactivando la enzima a 65°C por 10 minutos. El ADN de la mezcla fue purificado nuevamente, la concentración fue estimada en placas de agar con Bromuro de Etidio.

Cuantificación de los cADNˈs en placas de agar con Bromuro de Etidio. Se preparó un placa de agarosa al 0.8% en TAE con 10 μl de una solución de Bromuro de Etidio de 10 mg/ml. Además, se prepararon 5 diluciones de ADN de concentraciones conocidas para usarse como estándares (Low ADN mass ladder: 20, 40, 60, 80, y 100 ng/ml). Se colocó en la superficie de la placa 0.5






μl del cADN digerido a cuantificar y los estándares y se dejó 15 minutos a temperatura ambiente, se observó con una lámpara de luz UV y se comparó la intensidad con los estándares.

Clonación de la genoteca de T. cruzi mediante el sistema TOPO TA Cloning® Version R:

Ligación al vector pCR®2.1-TOPO Para ligar el cDNA purificado por la técnica de Marligen a los brazos del vector pCR®2.1-TOPO se resuspendieron 1 μl (100 ng/μl) de cDNA con 1μl de solución reguladora salt, 1μl del vector y 3 μl de agua estéril. La mezcla de ligación se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente e inmediatamente se paso a hielo. Transformación de E.coli DH5a-T1 El producto de ligación fue usado para transformar células de E.coli DH5α-T1 competentes por choque térmico: 15 minutos en hielo, 30 segundos a 42ºC en baño maría e inmediatamente se pasaron a hielo. Las bacterias se crecieron en 250 μl de medio SOC durante 1 hora a 37ºC con agitación, posteriormente se vaciaron sobre placas LB-Kanamicina/IPTG/X-Gal-Agar precalentadas a 37ºC, permitiendo el crecimiento durante toda la noche a 37ºC. Se calculó el porciento de recombinantes en base al número de colonias blancas (plásmido con inserto) y azules (plásmido sin inserto) presentes en la placa. Con ellos de determino la eficiencia de transformación de la genoteca. Análisis de la Genoteca clonada en pCR®2.1-TOPO El cDNA ligado a los brazos del vector pCR®2.1-TOPO generó una genoteca con 32% de recombinantes (colonias blancas). Se seleccionaron 25 colonias blancas para crecerlas 20 h a 37°C con agitación 170 rpm en 10 ml de medio LB-Kanamicina. Aislamiento del ADN plasmídico (vector con cADN) Se tomaron 5 ml para extraer el DNA plasmídico de cada clona. El DNA plasmídico fue aislado con el Kit de Purificación de Plásmidos (Merligene_Roche) siguiendo las especificaciones del proveedor. Para verificar la presencia del vector se observó en un gel de agarosa al 1% con Bromuro de Etidio. Para verificar la presencia del inserto de cADN en el plásmido se realizó digestión con la enzima EcoRI y el producto de la digestión se observó en un gel de agarosa al 1% con Bromuro de Etidio. Secuenciación de las clonas (cADNˈs) La secuenciación del DNA plasmídico con inserto se llevó a cabo con el Kit de Secuenciación ABI Prism Big Dye Terminator Cicle Sequencing Ready Reaction basado en el método de Sanger.






La mezcla de reacción para secuenciar las clonas obtenidas por el sistema TOPO contenían 100 ng de ADN plasmídico, 0.1 μg/μl del iniciador M13, ddNTP’s, dNTP’s, Amplitaq DNA polimerasa, MgCl2, Tris-HCl pH = 9 y H2O c.b.p. 20 μl. El programa de secuenciación fue: 1 ciclo 98ºC por 1 minuto; 25 ciclos de: [96ºC/30 segundos; 55°C/30 segundos; 68ºC/2 minutos] y un ciclo final de 68ºC/1 minuto. Los productos de amplificación se purificaron precipitando con isopropanol, como lo recomienda el proveedor y se corrió en un equipo ABI Prism DNA Sequencer del Instituto de Biología de la UNAM. Análisis Bioinformático de las secuencias de los cADN’s. 1.- Edición de las secuencias de los cADN’s con extensión abi o scf mediante los programas de Pregap4 versión 1.4b1 del paquete StadenPackage y Bioedit versión 5.0.9 2.- Análisis de los cDNA’s con el programa Vecscreen (GenBank) para determinar si la secuencias presentan contaminación del vector para su edición. 3.- Búsqueda de los ORF en los seis marcos de lectura de las secuencias mediante el programa ORF finder (GenBank). 4.- Búsqueda de similitud de las secuencias con secuencias de las bases de datos no redundantes de GenBank y para genomas eucarióticos kinetoplastida (T. cruzi). mediante blastp. 5.- Análisis de los resultados de la búsqueda de similitudes, y su aplicación:

5.1 Inferencias de dominios conservados, estructura-función en base a homologías con proteínas.

5.2 Detección y reporte de secuencias no reportadas previamente (no hallazgo de homología con secuencias en la base de datos)..

5.3 Detección y reporte de de diferencias con las secuencias previamente reportadas.

5.4 Construcción de árboles filogenéticos

MATERIALES

Soluciones






• Las soluciones se encuentran en el Anexo 1. • Los medios de cultivo en el Anexo 2.

Vector

• TOPO TA Cloning® Catálogo No. K4500-01 [Invitrogen: pCR®2.1-TOPO®]. Con un sitio de policlonación entre las bases 234-357 para enzimas de restricción flanqueadas por el promotor T7. Con resistencia a Kanamicina y Ampicilina. Esta compuesto por 3908 nucleótidos (3.9 Kb). (10 ng/μl plasmid DNA) (Anexo 3)

Genotipo de las cepa de E. coli DH5α™-T1R: Use this strain for general cloning and blue/white screening without IPTG. Cepa para clonación, selección azul/blanco sin IPTG. Resistente al fago T1. Sensible a Kanamicina y Ampicilina. F- φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17(rk -, mk +) phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1 tonA (confiere resistencia al Fago T1)

Enzimas • Transcriptasa reversa Superscript II (GIBCO BRL‚ Cat. No. 28025-013) • Deoxinucleotidil exotransferasa terminal (TdT) (Roche, Cat. No. 220582) • Taq ADN polimerasa. (Promega, Cat. No. M1665) • EcoRI (Promega, Cat. No.13662602) • T4 ADNA ligasa (Stratagene, Cat. No. 203003)

Oligonucleótidos

• Oligo(dT)17 (Promega, Cat. No.15199901) • Oligo(dT)17-EcoRI ATACCGCTCTGGTGAATTCTTTTTTTTTTTTTTTTT • Iniciadores M13 Forward (-20) 5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’

M13 Reverse 5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’

Nucleótidos

• Desoxiadenosina trifosfato (dATP). (Promega, Cat. No. 13467310) • Desoxicitidina trifosfato (dCTP). (Promega, Cat. No. 15139209) • Desoxitimidina trifosfato (dTTP). (Promega, Cat. No. 15203012)






• Desoxiguanosina trifosfato (dGTP). (Promega, Cat. No. 13199607) • Low DNA Mass Ladder. (Invitrogen, Cat. No. 10068-013)

Kits comerciales • • DNA Ligation. (Stratagene, Cat No. 203003) • High Pure Plasmid Isolation Kit. (Roche, Cat. No. 1754777) • High Pure PCR Product Purification Kit. (Roche, Cat. No. 1732668) • ABI Prism“ Big DyeTM Terminator cycle sequencing ready reaction kit. (PE Applied Biosystems a division of Perkin-Elmer. Cat. No. 4303573) • TOPO TA Cloning“ Invitrogen‘ life Technologies (Cat. No.K4500-01) • Marligen Bioscience Inc. (Cat. No. 11456-019)

Programas informáticos empleados

• Staden Package Copyright © Medical Research Council, Laboratory of Molecular Biology, 1995 – 2001. Written by James Bonfield, Kathryn Beal and Rodger Staden. http://www.bio.cam.ac.uk/local/gcg10.3/fromstaden.html

• VecScreen: Sistema para la identificación rápida de segmentos de nucleótidos que

pueden ser del vector original. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html

• El “ORF” (Open Reading Frame Finder) es una herramienta gráfica que encuentra todos los marcos de lectura abierta de las secuencias de nucleótidos introducidas por el usuario, o secuencias conocidas en la bases de datos. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html

• La búsqueda de secuencias (base de proteínas no redundante “nr” de GenBank) con similitud a los cADNs se hizo por BLASTP (Basic Local Alingment Search Tool): en el sitio web: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.

• Una segunda búsqueda se realizó con blast eukarioptic genoma(GenBank) (significancia p<0001) para Kinetoplastida_Trypanosoma cruzi.:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_tree.cgi?organism=euk






Para hacer alineamiento múltiple y construir el árbol filogenético se utilizo los programas

SeqVerter V 2.02, ReadSeq V 2.1.3, y ClustalW Versión 1.7 (para alineamiento múltiple de las secuencias y generación de archivos para construir el árbol filogenético, el programa Phylip Versión 3.6 alpha3, utilizando el método de distancias de kimura.

esultados ______________________________________________________________________________________






Creación de Genoteca 1.- Observación microscópica de la pureza del cultivo de T cruzi. 2.- Electroforésis: Observación de la calidad del cADN en gel de agarosa al 1%

Figura 1: Aspecto de Trypanosoma cruzi del cultivo en medio LIT (Vector Campeche), No se observan bacterias - A partir de este cultivo se creo la genoteca

Microscopía 40X.

Figura 2: Electroforésis de cADN de T. cruzi en gel de agarosa al 1%. Carril 3: Low ADN Mass Ladder; Carriles 1 y 1’: cADN1 T. cruzi ; Carriles 2 y 2’: cADN2 T. cruzi.

1 2 3 1’ 2’

400 b

800 b






3.- Cuantificación espectrofotométrica del cADN cDNA1 y cDNA2, dilución 1:50 [2µl + 98 µl de agua mq] Muestras λ 260 nm (X50) λ 280 nm 260/280 Absorbancia Resultados Absorbancia I. Pureza cADN1 1.846 92,27 µg/ml 1.1052 1.66 cADN2 2.360 118.02 µg/ml 1.3501 1.74

[cDNA1 ] = 92.27 X 50 (FD) = 4 613 µg/ml = 4.61 µg/µl [cDNA2 ] = 118.02 X 50 (FD) = 5 900 µg/ml = 5.9 µg/µl

4.- Determinación de la concentración del cADN en placa. La concentración de cADN se estimo en placas de agar con Bromuro de Etidio.

Figura 3: Placa de agar con Bromuro de Etidio para cuantificar la concentración del cDNA. Se observa que la [cDNA] >50 ng.

cADN

ADN Estándar






5.- Transformación de E.coli DH5a-T1 con el vector pCR®2.1-TOPO

Análisis de la Genoteca clonada en pCR®2.1-TOPO Recuperación de vectores TOPO TA Cloning con inserto cADN de E. coli DH5α transformadas

Aislamiento del ADN plasmídico

Figura 4: Células transformadas con el vector pCR®2.1-TOPO con cADN” no expresan el gen de la β- Galactosidasa Colonias blancas. Y las transformadas con el vector pCR®2.1-TOPO sin cADN” expresan el gen de la β-galactosidasa Colonias azules. Eficiencia de Clonación: cDNA1 22 blancas (31%) 48 azules cDNA2 15 blancas (33% ) 30 azules

Figura 6: Digestión de plásmidos con EcoR1, [Electroforésis agarosa al 1%].

Figura 5: Plásmidos con iinserto_ estraídos de las células E.coli DH5a-T1 transformadas con cADN de T. cruzi. [Electroforésis agarosa al 1%].

4000 1000

Plásmidos con

Plásmidos con

cADNs T. cruzi






Análisis bioinformático de los cADN’s Los productos de amplificación de los cADN’s de Trypanosoma cruzi se secuenciaron por el método de Sanger en el equipo ABI Prism DNA Sequencer del Instituto de Biología de la UNAM. Los archivos de las secuencias de cADN’s en archivo de computación con extensión “ab1”, fueron analizados para verificar la calidad y la posible contaminación con fragmentos del vector mediante programas VecScreen (GenBank) y Staden Package (Pregap4 y Trev 1,8b1). En la tabla 1 se observa el resultado de éste análisis, de 22 un total de 5 no generaron resultados adecuados para continuar el análisis bioinformático.

Tabla 1 Identificación de los cADNs secuenciados genoteca de T. cruzi

A (cADNs)

Archivo electrónico con extensión “ab1”

B

*Secuenciación sin calidad para continuar su análisis”

(Pregap4 - Staden Package)

C

Secuencias con calidad para el continuar el análisis

bioinformática

22 (en total) >4RPSample (01) >4PSample (02) >5RPSample (03) >6PSample (04) >6RPSample (05) >1TcnM13 (06) >7TcrM13F (07) >7TcrM13R (08) >3TcrM13R (09) >5TcrM13R (10) >6TcrM13F (11) >8TcrM13R (12) >8TcrM13F (13) >11TcnM13F (14) >12 TcnM13F (15) >13TcnM13F (16) >14TcnM13F (17) >2TcnM13F (18) >4TcnM13F (19) >7TcnM13 (20) >10TcnM13F (21) >2PSample (22)

5 (cADN’s) >4RPSample (01) >7TcrM13R (08) >3TcrM13R (09) >5TcrM13R (10) >8TcrM13R (12)

17 (cADN’s) >4PSample (02) >5RPSample (03) >6PSample (04) >6RPSample (05) >1TcnM13 (06) >7TcrM13F (07) >6TcrM13F (11) >8TcrM13F (13) >11TcnM13F (14) >12 TcnM13F (15) >13TcnM13F (16) >14TcnM13F (17) >2TcnM13F (18) >4TcnM13F (19) >7TcnM13 (20) >10TcnM13F (21) >2PSample (22)

*Los archivos con extensión “exp” generados por el programa StadenPackage (Pregap4) permitieron identificar las las secuencias que no tenían la calidad adecuada para continuar el análisis bioinformático.






Secuencias de 17 cADN’s de T. cruzi pos Pregap y VecScreen

>4PSample26 AGCAGAAGAGGGCAACGATCCCTCCCTTACCATCAAATCAATTGGCCACCGATGGGACTGAACCTACCAGTA

CACCGACTACGGGGGACTAATCTTCAACTCCTACATACTTCCCCCATTATTCCTAGAACCAGGGGACCTGGG

ACTCCTTGACGTTGACAATCGAGTAGTACTCCCGATTGGAGCCCCCATTCGTATAATAATTACATCACAAGA

CGTCTTGGACTCCTGAGCTGGCCCCACATTAGGGTTAAAAACAGATGCAATTCCCGGACGTCTAAACCAAAC

CACTTTCACCGCTACACGACCGGGGGTATACTACGGGCAATGGTCTGAAATCTGGGGAGCAAACCACAGTTT

CAAGGCCATCGTCCTAAAATTAATTCCCCTAAAAATCTTTGAAATAGGGCCCGGATTTACCCTATAGCACCC

CCTCTACCCCCTCTAGAGGC (452 nt)

>5RPSample31 AGGGGGAAACAGGTTTATTCTGAGGACAACCCCCCATTTTTGGCTGCTCCAACCATGGGGGAGACGACGGAC

ACCTGGAATGCACGAGTAGAAAACTCAGACCTGGGAACTGGAACACCATCCTGCCTCTTCATCCTCCTCAGC

CAGGCCCAAGGTCCGGGTGCCTGGGGCCCGAACAGGGCTTGTCCGCTGGATAGAAACCATGCCTCTGAGGAG

GGCATACCCCACCATGGATGGCAGCCCTGCCAGCACACACAGAATCTGGGTCCGGGGCCAGTATGGGTCCTC

CTCGGTCTCAAGGGCTGCTGGTGTCTGGCCTGGAAGTGGCACCTCATCTCCATCCCGGGGAAAGTACACGTT

GAGGATGTGGGTGCAATACGTGCAGAGGTTGTGCATCCCCCGAAGGTGGGCCTGCATCTTCCCAATGGGCAC

TTTGGCCTGCACCAGCAGGCCAAATGGGTAAAAACAAAAGCGTCCAAGAAAAGCACGGACATCCCCCAAGAA

CACTTCTGAAAGCCCACACCCTGAAAAAGAAGGGTTACGCCCTCCCCCCCTCTTGGGATACTCTTTTTCGAG

TCCTCCCCCTTACTGAATTGTGCTCCC (603 nt)

>6PSample GCTGGGACTGCCCCAAAGGGCAGACAGGTTTATTGGGCAGCAGCTGGGAAAATCAGCGGTTGGACTTGGCCA

CACGCTCCAGCTCGTCCTTCTTCTTAATGGCATAGGAGTTCGAGGAGCCCTTGGCAGCATTGATGAGCTCAT

CTGCCAGGCACTCAGCAATGGTCTTAATGTTCCGGAAGGCAGCCTCACGAGCGCCTGTGCACAACAGCCAGA

TGGCCTGGTTCACACGGCGCAGGGGGGACACATCCACAGCCTGTCGTCTCACAGTCCCGGCGCGCCCAATGC

GTGTGGAGTCCTCCCGGGGACCACTGTTGATGATGGCGTTCACCAGGACCTGCAGAGGGTTCTCGCCTGTGA

GCAGGTGTATGATCTCGAAGCATGCTTGACGATGCGCACAGTCATGAGCTTCCTGCCGTTGTTGCGGCCGTG

CATCATCATGGAGTTAGTGAGGCGCTCCACAATGGGACACTGACTTTGCGGAAGCGTTTGGCGGCATACCGC

CCTGCACTGTGAGGCAGGTACTTGGCATACTTCTCCTTCCTGCAATGT (552 nt)






>6RPSample ACATTGCAGTGAAGGAGAAGTATGCCAAGTACCTGCCTCACAGTGCAGGGCGGTATGCCGCCAAACGCTTCC

GCAAAGCTCAGTGTCCCATTGTGGAGCGCCTCACTAACTCCATGATGATGCACGGCCGCAACAACGGCAGGA

AGCTCATGACTGTGCGCATCGTCAAGCATGCCTTCGAGATCATACACCTGCTCACAGGCGAGAACCCTCTGC

AGGTCCTGGTGAACGCCATCATCAACAGTGGTCCCCGGGAGGACTCCACACGCATTGGGCGCGCCGGGACTG

TGAGACGACAGGCTGTGGATGTGTCCCCCCTGCGCCGTGTGAACCAGGCCATCTGGCTGTTGTGCACAGGCG

CTCGTGAGGCTGCCTTCCGGAACATTAAGACCATTGCTGAGTGCCTGGCAGATGAGCTCATCAATGCTGCCA

AGGGCTCCTCGAACTCCTATGCCATTAAGAAGAAGGACGAGCTGGACGTGTGGGCCAATCCAACCGCTGATT

TTCCCAGCTGCTGCCCAATAAAACCTGTCTGCCCTTTGGGGCAGTCCCAC (554 nt)

>1TcnM13 AAATCGGGTGTGGAATTTGTGGCGCCCTGCGGGTTTGGTGGCTGTATATTCAAGGAGCCTTGTCTGCAGCGG

GTCCACCAGCACCTGTAAAGGCGGAGGGGACGCTTCACATATCCATTTATTTATATTTTAGGGCAAGAGGGG

AACAACAAGGGAGGAACTGCGAGGGGAATTTAAAAAAATTTTTCTTCCCCTTTTCTCCCGTGTTTGTTTCTT

TTTTTTTTCTTGCGTTGCTAGAACGAAGGGTGAGTTGCCGGACGTGAGGAGAAAAAAAAAAAGAGGACCGAC

GGCATCGTGAGGGGAAACGAGGCGGCAATAAAAAACAAACAAACAAAACAAAACAAAACAAAACAAAACAAC

AACAAAAAAGAAAAACAGGCGGCTTGTGGGCCTTTGAAGGGTGGGGAAG (409 nt)

>7TcrM13F AAATCGGNTGNGGAATTTGTGGCGCCCTGCGGGTTTGGTGGCTGTATATTCAAGGAGCCTTGTCTGCAGCGG



TTTTTTTTTCTTGCGTTGCTAGAACGAAGGGTGAGTTGCCGGACGTGAGGAGAAAAAAAAAAAAGAGGACCG

ACGGCATCGTGAGGGGAAACGAGGCGGCAATAAAAAACAAACAAACAAACAAAACAAAACAAAACAAAACAA

CAACAAAAAAGAAAAACAGGCGGCTTGTGGGCCTTTGAAGGGTGGGGAAG (410 nt)

>8TcrM13F AAATCGGNTGTGGAATTTGTGGCGCCCTGCGGGTTTGGTGGCCGTATATTCAAGGAGCCTTGTCTGCAGCGG



TTTTTTTTCTTGCGTTGCTAGAACGAAGGGTGAGTTGCCGGACGTGAGGAGAAAAAAAAAAGAGGACCGACG

GCATCGTGAGGGGAAACGAGGCGGCAATAAAAAACAAACAAAACAAAACAAAACAAAACAAAAAAAAACAAC

AACAAAAAGAAAAACAGGCGGCTTGTGGGCCTTTGAAGGGTGGGGAAAG (409 nt)






>11TcnM13F AAATCGGTTGTGGAATTTGTGGCGCCCTGCGGGTTTGGTGGCTGTATATTCAAGGAGCCTTGTCTGCAGCGG



TTTTTTTTCTTGCGTTGCTAGAACGAAGGGTGAGTTGCCGGACGTGAGGAGAAAAAAAAAAAGAGGACCGAC

GGCATCGTGAGGGGAAACGAGGCGGCAAT(317 nt)

>12 TcnM13F AAATCGGTTGTGGAATTTGTGGCGCCCTGCGGGTTTGGTGGCCGTATATTCAAGGAGCCTTGTCTGCAGCGG



TTTTTTTTTCTTGCGTTGCTAGAACGAAGGGTGAGTTGCCGGACGTGAGGAGAAAAAAAAAAAAGAGGACCG

ACGGCATCGTGAGGGGAAACGAGGCGGCAAT

(319 nt)

>13TcnM13F AGATAGAATTTTTGTGAGAGACGCGTCCGTTGGCGTCTGTGACAGTTCATGACACACACAGAAATATATACA

GAAACATACTGCGTACAGAAGTACTCTTCCTTTCTTACAGCTCTTGTATGACATCACCCAAGGCAACACAGG

CCCCTTCGACTCAGTATGTTTTGCCAACGCTGCGCCCTACAAAACAGTGGGCTCAACAGATCGCCACTGGCG

CTTTCAGACCACCGAATCCGTTGGTTCACTTGGCACACCACGTTAGGAGTGACGTGGCAACAACGGAGGAAA

ACAATTTACGTTTCTCATCTTTTCCCAACGCACCTTGCGCAATGCTCTTAAATCAGTCTCAGTCCCAGACCC

AGTGTACTGAAGATATAAGCGACACCATCGAAAGAATCATGAGCATGATTGCGAGTGCAGTTGGACAAGAGC

GAGACAGATTTGCCGCGCAGAAGGAGAGTAATCGCGTTTTAGAGCAGGAGTTGGGAACAGGTTCAGAGGCGC

CGCAAAAAGCACAACGTACTTTGCGTGAGTTTGAAAAATATTTCCTATCTTTGGAAGCCTTTCACGAGGAAA

ATTGCAATCTCCAAGAATTACGATNCCATGAGTATGGTTC (616 nt)

>14TcnM13F AGATAGAATTTTTGTGAGAGACGCGTCCGTTGGCGTCTGTGACAGTTCATGACACACACAGAAATATATACA

GAAACATACTGCGTACAGAAGTACTCTTCCTTTCTTACAGCTCTTGTATGACATCACCCAAGGCAACACAGG

CCCCTTCGACTCAGTATGTTTTGCCAACGCTGCGCCCTACAAAACAGTGGGCTCAACAGATCGCCACTGGCG

CTTTCAGACCACCGAATCCGTTGGTTCACTTGGCACACCACGTTAGGAGTGACGTGGCAACAACGGAGGAAA

ACAATTTACGTTTCTCATCTTTTCCCAACGCACCTTGCGCAATGCTCTTAAATCAGTCTCAGTCCCAGACCC

AGTGTACTGAAGATATAAGCGACACCATCGAAAGAATCATGAGCATGATTGCGAGTGCAGTTGGACAAGAGC

GAGACAGATTTGCCGCGCAGAAGGAGAGTAATCGCGTTTTAGAGCAGGAGTTGGGAACAGGTTCAGAGGCGC

CGCAAAAAGCACAACGTACTTTGCGTGAGTTTGAAAAATATTTCCTATCTTTGGAAGCCTTTCACGAGGAAA

ATTGCAATCTCCAAGAATTACGATNCCATGAGTATGGTTC (616 nt)






>2TcnM13F GCGTAATTGGAGAATTGCCCGATATGAGGGAATCATTGTGGCTGGCGGTGTCGCAGTACTACTGCATTCTCC

ATTTTATTCTGTTGTGTTCTAAGGCCCATCACTAACAGAAGCATCTTAAAGGGATGGACGACGAATAGGTTC

TATTGAGGAAACGGTGCGCTCCGCGTGACCGCATGGAGTGAGGCGCCGCGTCATGGATGGATGAGGATCCGC

TTCTGCGTGTGGCTCTTTGGGTGATTGCTTGCTTGGTATGCGCCGTGTATTGGCTGTGGCCGTATTCCGTTG

TCCGTGGACTGAACTGGAGGCGATGATGGCGGTGGGTCACTTCTTGTTCTTGTCCATTGGTGGATGATTGCT

TGTTTCGTGTGCGATATTGTTGTGTGGAGGGCTGAATCCTCTCACCCGCGGACTGGAACTGGAAGCAATGGT

GTGTGTGTGAAGGCTGGTGTGGAATTGCCCGGCCAAGGCAAAGCCCTGGCGGTGCTTTTCTCGTCTGCCCGT

TTGGTTTTTGGCTTCTTGCCTTTTTCCCTTTTCTCCGGGTTTCCCGCGGGGAAGGGGTTGCCCCCTCCCCGG

CCCATGGGGGATTGGGAAGGGCCTC (601 nt)

>4TcnM13F GACATTGGGCAATTTGCGCGCCTGCTGCCCTCCGTAGAAGTGGTAGCTATTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAA

TCGAACCCTAATCCCCCGCTCCCGTCAACGCCATGGCAGTCCACTACACGGCCATCGCTGGCTGATAGGGCA

GTTGTTCGTCAAAAGACGCCGGATAAAAAACCCGGCTTTCGCACGAAATGAATTGAATCAACACTTCTGAGT

GTTACTGCCCGGTGAAGGCATTGGTTTTACTTTCATTCATTCGCTGGACGTCCCATGGCAGCAGGTTGCCCT

GCCGCCGGAAACAGAGAACATCCGGTTGGTTCATGTATTAGCTTGGCCGTTTCGCCAAGTTATCCAATTTTG

CGGAGACCGCAAGATTTTTGCGGCAGATTACGTCTGATGT (400 nt)

>7TcnM13 AAATCGGTTGTGGAATTTGTGGCGCCCTGCGGGTTTGGTGGCTGTATATTCAAGGAGCCTTGTCTGCAGCGG



TTTTTTTTTCTTGCGTTGCTAGAACGAAGGGTGAGTTGCCGGACGTGAGGAGAAAAAAAAAAAGAGGACCGA

CGGTATCGTGAGGGGAAACGAGGCGGGCAATAAAAAACAAACAAACAAAACAAAACAAAACAAAACAAAACA

CAACAAAAAAGAAAAACAGGCGGCTTGTGGGCCTTTTGAAAGGGTGGGGAAG (412 nt)

>10TcnM13F TCTTTGCTCTCTATGCANTAAGCTTACAGTCATTCACCATATTCAATTGAACATGCCTCAAAAGCAATGAGA

TGCCCAGAGACATAACCCCCGTCTCACCTTTCCTTTTCATTCCTCTCTCCTTTCACACACACACACACACAC

ACACACACACACACACAAACAGTGTACATAAAGGATTGTTTTAATGAGNCATTCCAAACGGCGGC (209

nt)






>2PSample ACCACTGAGCCATGTGGTTATCCCATCCAGCCTGCCACCACTGGACTGTATGTACCGCGGTTCTCCTATCCA

GCCCACCACCACTGGACTCTCTCTCCTGTATGTAAGCCCCAAATAAAACCTCATGTCTCATTTGCTGGGCTC

TAGGTCTCTTCTTTGGCCTCTTGAAACCTGATGCCTCCCCATTGGAGTCAGTAAGGGTTTGGCACACAAGGA

GGTAATGAGGTTTAAAATCATGAAGGGCACGGGGGCTCCTCCTGTGATCCCGCCTTTGGGAGCGGAAATGGA

GGAACCCCAAGTCAGGACTCCAACACCTCAAGACCCCGAAATCGAGGCCGCCCAGAGGACTATGGAGGGCAC

TCTCGAAACTAAAATTTTGTGCCGTTTCCACCTAGAAGAGCGATAAG (407 nt)

>6TcrM13F AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTGTAGTCACGGAGCATACAACAAAAGAAGGCGTAGGGAC

GTCAAATTTAAGGAATTTCCATCCAAATACACACTCACACGGATCATGTCGACGTGGGTGAAATATCAGTCA

AATATTTATCGATATGGCCTTGTCTTCTGTTGTCTTTCGGCAGCCTTGGGGATGTTGGTGAACGGTGATGGC

GCAAAGGCACAGTGGGATTGGATGACAGATCGCTATGAGCGAATAAATGCGGGAAAGAAAGTGAAATAACAT

ATGAGTGCGAGCGTGCGTGCGTGAAGATGATTCTCCCTGTCTGTATCTGCTTTCCCTCAAAAAAAAAAAAAA

AGAATTCACCAGAGCCGGTATTTTC

(385 nt)

El análisis para homología de los 17 cADN`s (columna C tabla 1) con Blastp con la base de datos “nr” y Blast genómico_Kinetoplastida en GenBank (Tabla 2) muestrna homología significativa [E-value <0.0001] con:

Blastp “nr” Genbank ”N” secuencias de diferentes organismos para Citocromo “C” subunidad II. “N” secuencias de diferentes organismos para Metaxina. ARN ciclasa Proteinas ribosomales.

Proteínas hipotéticas conservadas en T. cruzi. Transialidasa en T. cruzi. Glicoproteína similar a muscina en T. cruzi. Proteína de función desconocida en Leishmania major. Adicionalmente se encontró homología con dominios conservados de proteínas 3D con proteínas ribosomales y citocromo “C” subunidad II.

Blastn_megablast de genoma eucariontes_kinetoplastida_T. cruzi Proteínas hipotéticas con la cepa CL Brener de T.cruzi.

£6TcrM13F encontró 1 secuencia de 35 conservada en 91 secuencias de ADN genómico en T. cruzi (tabla 3).






Tabla 2. Resultados del análisis de Homología significativa y no significativa de las 17 secuencias de cADN con Blast_nr y Blast genómico_kinetoplastida / GenBank

SECUENCIAS cADN ( C-I )

Marco de Lectura Con homología

significativa (C-II)

Blastp y Blastx – “nr” / GenBank Expectación (E – value) (C-III) (marcos de lectura especificados

C-II)

Blast genómico – Kinetoplastida Expectación (E-value) (C-IV)

(+1,2,3; -1,2,3)

4PSample nr_GB

452 b

+2 (426 nt 141 aa)

(+1,2,3; -1,2,3)

4e-65 a 3e-55

Citocromo C Subunidad II_ “n” organismos

No se encontró Similitud significativa

5RPSample31 nr_GB

603 b

-1 (507 nt 169 aa)

(+1,2,3; -1,2,3)

2e-48 a 4e-04

Metaxina_”n” organismos


6PSample nr_GB

552 b (H_4)

+1 (354 nt 118 aa) +2 (551nt 183 aa) -1 (549 nt 183 aa) -2 (216 nt 71 aa)

-3 (373 nt 124 aa) (+1,2,3; -1,2,3)

+1 (6e-04) ARN ciclasa +2 (7e-31) ARN ciclasa

-1 (8e-11 a 72-04) Proteina Ribosomal S5 -1 (2e-16) Proteína Ribosomal S5

-3 (2e-52 a 1e-23) Proteína Ribosomal

S5


6RPSample nr_GB

554 b (H_4)

+1 (504 nt - 167 aa) +3 (552 nt - 184 aa) -1 (552 nt - 184 aa)

(+1,2,3; -1,2,3)

+1 (6e-04) Proteína hipotética +3 (6e-84 a 8e-40) Proteína Ribosomal S5

-1 (4e-42) ARN ciclasa


1TcnM13F Kineto

409 b (H_1)

(+1,2,3; -1,2,3)

*** No se encontró Similitud significativa

gb|AAHK01000314.1| strain CL Brener tcruzi_ 1e-91 gb|AAHK01000200.1| strain CL Brener tcruzi_ 1e-69 gb|AAHK01031875.1| strain CL Brener tcruzi_ 3e-52 gb|AAHK01018847.1| strain CL Brener tcruzi_ 4e-47

Continuación tabla 2_

7TcrM13F Kineto

410 b (H_1)

(+1,2,3; -1,2,3)


gb|AAHK01000314.1| strain CL Brener tcruzi 6e-90 gb|AAHK01000200.1| strain CL Brener tcruzi 6e-68 gb|AAHK01031875.1| strain CL Brener






tcruzi 1e-51 gb|AAHK01018847.1| strain CL Brener tcruzi 2e-46

8TcrM13F Kineto 409 b (H_1)

(+1,2,3; -1,2,3)


gb|AAHK01000314.1| strain CL Brener tcruzi_.5e-94 gb|AAHK01000200.1| strain CL Brener tcruzi_.5e-72 gb|AAHK01031875.1| strain CL Brener tcruzi_.1e-54

gb|AAHK01018847.1| strain CL Brener tcruzi_.2e-49

11TcnM13F Kineto

317 B (H_2)

(+1,2,3; -1,2,3)




12TcnM13F Kineto

319 b (H_2)

(+1,2,3; -1,2,3)




13TcnM13F Kineto

616 b (H_3)

+3 (614 nt – 204 aa)

(+1,2,3; -1,2,3)

+3 (1e-71) Proteína hipotética conservada

T. cruzi +3 (4e-11) Proteína hipotética conservada

T. brucei +3 (0.006) Proteína hipotética

conservada L. major

gb|AAHK01000328.1| strain CL Brener tcruzi..0.0

14TcnM13F Kineto 616 b (H_3)

+3 (614 nt – 204 aa)

(+1,2,3; -1,2,3)

+3 (1e-71) Proteína hipotética conservada T. cruzi

+3 (4e-11) Proteína hipotética conservada T. brucei

+3 (0.006) Proteína hipotética conservada L. major

gb|AAHK01000328.1| strain CL Brener tcruzi..0.0






Continuación tabla 2_

2TcnM13F 601 b

+1 (594 nt – 198 aa)

(+1,2,3; -1,2,3)

+1 (5e-10 a 9 e-04)

Proteína hipotética .T cruzi Transialidasa T. cruzi

Glicoproteína similar a muscina T. Cruzi



“n” secuencias

4TcnM13F 400 b

(+1,2,3; -1,2,3)


gb|AAHK01005354.1| strain CL Brener tcruzi 0.0 gb|AAHK01006603.1| strain CL Brener tcruzi 0.0 gb|AAHK01009500.1| i strain CL Brener tcruzi 0.0

gb|AAHK01009511.1| strain CL Brener tcruzi_ 0.0

7TcnM13

412 b

(+1,2,3; -1,2,3)




10TcnM13F

209 b

(+1,2,3; -1,2,3)


gb|AAHK01000243.1| CL Brener tcruzi_. 3e-57

gb|AAHK01000091.1| CL Brener tcruzi_. 2e-54

2PSample

407 b

(+1,2,3; -1,2,3)



£6TcrM13F

385 b

+1 (261 nt 55aa) (+1,2,3; -1,2,3)

gb|AAZ09965.1| Proteína hipotética

de función desconocida con Leishm. 3e-08

gb|AAHK01000182.1| strain CL Brener tcruzi_. 6e-156

gb|AAHK01029686.1| strain CL Brener tcruzi_. 3e-07

“n” secuencias (fragmento 35b conservado)

*Búsqueda en los 6 marcos de lectura con Blast genómic – Kinetplastida (+1,2,3; -1,2,3) **Expectación significativa (homología) < 0.0001 ***Expectación no significativa (homología) > 0.0001 En el cADN’s 2PSample que no encontró homología significativa con ninguna de las dos bases, cabría dos posibilidades, que es un cADN mal secuenciado ó se trate de una secuencia nueva no reportada.






Citocromo “C” subunidad II- Filogenia clona 4PSample. Se emplearon 71 secuencias de aminoácidos con homología significativa con las que realizó alineamiento múltiple (ReadSeq y ClustalW Versión 1.7) y con este se construyo un primer árbol filogenético empleando el programa Phylip Versión 3.6 alpha3 - Kimura's distance. Posteriormente, se hizo un alineamiento por “clusters” de acuerdo a características biológicas afines (equinos, peces, hominidos, etc. Tabla 3), con ellos se realizaron alineamientos con y sin la secuencia de la clona de cADN de T. cruzi y se determino con GenDoc V 2.6.0.1 el “score o puntuación” de los alineamientos múltiple en cada cluster con y sin la presencia de la clona de T. cruzi, para evaluar cual cluster tiene e mayor similitud (tabla 4) y construir un segundo árbol filogenético con características filogenéticos más afines. En el primer árbol filogenético la clona de T. cruzi aparece colocada en la rama de los hominidos (figura 7), en el segundo árbol filogenético lo sitúa en la rama de los protozoarios(figura 8) Plasmodium y Toxoplasma, que tiene mas sentido ya que los tres son protozoarios.

Secuencias de aminoácidos Citocromo C subunidad II para Alineamiento __________________________________________________________________________________________________________ Xenopus MAHPSQLGFQDAASPIMEELLHFHDHTLMAVFLISTLVLYIITIMMTTKLTNTNLMDAQE Tcruzi EEGNDPSLTIKSIGHRWDWTYQYTDYGGLIFNSYILPPLFLEPGDLGLLDVDNRVVLPIG Anopheles MATWANLGLQDSSSPLMEQLNFFHDHTLLILTMITILVGYIMGMLSFNKFTNRFLLHGQT Arabidopsis MIVLKWLFLTISPCDAAEPWQLGSQDAATPIMQGIIDLHHDIFFFLILILVFVLWILVRA Armillifer MSYQKMTFQNSTSPIMEHLISFHDYILIILCLITTMIFYVLSSMITNKYLNQLLINNQVL Ascaris MNNFFQDFNLLFSSSLFSSYMDWFYNFNCSLLFGVLSFVSTMFVYLLLSSFYFKSKKIEY Papio MAHPVQLGLQDATSPVMEELITFLDQALMAMFLISFLILYALSSTLTTKLTNTNITDAQE Bos MAYPMQLGFQDATSPIMEELLHFHDHTLMIVFLISSLVLYIISLMLTTKLTHTSTMDAQE Brugia MYLQNYVFPVPSNSYVFCCYFIHNYYSHVIFFGFFIMFLVSFGLYFYGNSFKFNLKRSDS Bufo MAHPLQLGFQDAASPIMEELLHFHDHTLMAVFLISTLVLYIISTLMSTKLSNTNTIDAQE Buergeria MAQPAQLGLQDAASPIMEELLHFHDHTLMAVLLISTLVMYVITSLMTTNLSNTNTIDAQE Asno MAYPFQLGFQDATSPIMEELLHFHDHTLMIVFLISSLVLYIISSMLTTKLTHTSTMDAQE Equus MAYPFQLGFQDATSPIMEELLHFHDHTLMIVFLISSLVLYIISSMLTTKLTHTSTMDAQE Caiman MANPMHLGFQDAMSPLMEELLYFHDHTMMILILISSLVFYTMSALLLTKLYYSNTSDVQE Candida MIRLDVPTPWGIRLQDSATPNAEGIHELYDHIMFYLCLILGLVSYILYVIIKDYKDNRFA Capra MAYPMQLGFQDATSPIMEELLHFHDHTLMIVFLISSLVLYIISLMLTTKLTHTSTMDAQE CERCOCEBUS MAHPVQLGLQDATSPVMEELITFHDHALMAMSLISLLVLYALFSTLTTKLTNTNITDAQE Pan MAHAAQVGLQDATSPIMEELIIFHDHALMIIFLICFLVLYALFLTLTTKLTNTSISDAQE Crinipellis MTQLFFNTIFNDAAQPWQLGFQDSAAPVFTGIVTLHNTVGFYLVLISFSVFWVLFSIIYY Cryptococcu MTFSLWSTFVQCDAAEPWQIGFQDGASPTFEGITELHNAIFFYLVLIFIGVMWVIGSVVI Periplaneta MTTWANMNLQDSASPIMEQLIYFHDHALMIIIMILMVVSYMMIAMIFNKYINRFLLEGQM Cynomys MAYPLELGFQDATSPIMEELLHFHDHTLMIVFLISSLVLYIISLMLTTKLTHTSTMDAQE Daphnia MATWAQIGFQNSASPLMEQLIFFHDHALLILILITTLVGYFMLSLVTNKFVNRYLLDGQM Dasypus MPYPLQLGFQDATSPIMEELLHFHDHTLMIVFLISSLVLYIITLMLTTKLTHTSTMDAQE Dictyosteli MKILEIYDKQIAEKEGNIFIFISKWIISVDHKNIGTMYTNFSILAGIVGTLLSLVIRMEL Didelphis MPYPMQLGFQDATSPIMEELMYFHDHTLMIVFLISSLVLYIIILMLTTKLTHTSTMDAQE Dros MSTWANLGLQDSASPLMEQLIFFHDHALLILVMITVLVGYLMFMLFFNNYVNRFLLHGQL Elephantulu MAYPFELGFQDASSPIMEELIHFHDHTLMIVFLISSLVLYVITAMLTTKLTHTSTMDAQE Eschrichtiu MAYPFQLGFQDATSPIMEELLHFHDHTLMIVFLISSLVLYIITLMLTTKLTHTSTMDAQE Plasmodium MKLNHLRMMMTTTNKLKYRNFSFSFFLCPLCNIWTNVFIKNSYLFFIYTF---------- Felis MAYPFQLGFQDATSPIMEELLHFHDHTLMIVFLISSLVLYIISLMLTTKLTHTSTMDAQE Phoca MAYPLQMGLQDATSPIMEELLHFHDHTLMIVFLISSLVLYIISLMLTTKLTHTSTMDAQE Gallus MANHSQLGFQDASSPIMEELVEFHDHALMVALAICSLVLYLLTLMLMEKLSSNTVDAQEV Ixodes MVTWSNIMFSNSNSPIMEQMIFFHDHSMLIIMMITIITLYMIINIMMNSFSSRFLMEGQE Hylobates MAHATQVGLQDATSPIMEELISFHDHALMIIFLISFLVLYALFLTLTTKLTNTNITDAQE Gonostoma MAHPSQLGFQDAASPVMEELIHFHDHALMVVILISTLVLYIILAMVSTTLTNKFILDSQE






Gorilla MAHAAQVGLQDATSPIMEELIIFHDHALMIIFLICFLVLYALFLTLTTKLTNNNISDAQE Heterodontu MAHPSQLGFQDAASPVMEELIHFHDHTLMIVFLISALVLYIITAMVSTKLTNKYILDSQE Hippopotamu MAYPLQLGFQDAVSPIMEELLYFHDHTLMIVFLISSLVLYIITLMLTTKLTHTNTMNAQE Homo MAHAAQVGLQDATSPIMEELITFHDHALMIIFLICFLVLYALFLTLTTKLTNTNISDAQE Huso MAHPSQLGFQDAASPVMEELLHFHDHTLMIVFLISTLVLYIIVAMVSTKLTNKYVLDSQE Iguana MAHPSQLGFQDAASPIMEELLHFHDHALMIVFLISALVLYTITLMITTTLTHTNTMDAQE Katharina MAFWSQWGFQDGASPIMEQLIFFHDHAMLILIMIISLLSYGAVSLMNNSFLSRSTLESQE Lumbricus MPNWGQVMFQDAASSVMLQLVSFHDHALLVLTLVLTVVGYALLALMLNKQVNRYIMEAQT Macaca MAHPVQLSLQDATSPVMEELITFHDHAFMAMSLISFLVLYALLSTLTTKLTNTNITNAQE Mus MAYPFQLGLQDATSPIMEELMNFHDHTLMIVFLISSLVLYIISLMLTTKLTHTSTMDAQE Mustelus MAHPSQLGFQDAASPVMEELIHFHDHTLMIVFLISTLVLYIITAMVTTKLTNKYILDSQE Pongo MAHAAQVGLQDATSPIMEELVIFHDHALMIIFLICFLVLYALFLTLTTKLTNTNISDAQE Ornithodoro MMTWTSISFPNSNSPIMEQLIFFHDHSMTVIILITVITMYMIFNIMNNFYSSHNLMEGQE Ornithorhyn MAYPLQLGFQDATSPIMEELLHFHDHTLMIVFLISSLVLYIISTMLTTKLTHTNTMDAQE Oryctolagus MAYPFQLGFQDASSPIMEELLHFHDHTLMIVFLISSLVLYIISLMLTTKLTHTSTMDAQE Canis MAYPFQLGLQDATSPIMEELLHFHDHTLMIVFLISSLVLYIISLMLTTKLTHTSTMDAQE Pupa MSYWGQLNLMDSASPLQGELFLFHDHAMVLLIAIFSFVATLGVKLMFNYFTCRNLLEAQQ Rana MAHPTQLGFQDAASPIMEELLHFHDHALMAVLLISMLVLYIISVLMTTKLSSTNTIDAQE Rattus MAYPFQLGLQDATSPIMEELTNFHDHTLMIVFLISSLVLYIISLMLTTKLTHTSTMDAQE Rhinolophus MAYPFQLGFQDATSPIMEELLHFHDHTLMIVFLISSLVLYIISLMLTTSLTHTSTMDAQE Rhipicephal MMTWSQMSFSDMNSPIMEQMVFFHDHSMMIILMITILTIYMITNIMMNNLLSRSMMEGQE Rickettsia MNIIRYWSKQSYKKLKVDQEHNTTEYTNVCNSTSLGSTYTLPLKMELWKIYITLIYFLIT Rhinoceros MAYPLQLGFQDATSPIMEELLHFHDHTLMIVFLISSLVLYIISLMLTTKLTHTSTMDAQE Saccharomyc MLTMMKIMTTMLYNDVPTPYGYYFQDSATPNQEGILELHDNIMFYLLVVLGLVSWMLFNI Salmo MAHPSQLGFQDAASPVMEELLHFHDHALMIVLLISTLVLYIIVAMVSTKLTNKYILDSQE Schizosacch MKLHFHFILNDAPQSWGLYFQDGATASYLGIVNLNDYIMFYLTLILIGVTYSLLVIVYRY Sciurus MAYPFELGFQDATSPIMEELLHFHDHTLMIVFLISSLVLYIISLMLTTKLTHTSTMDAQE Ceratotheri MAYPFQLGFQDATSPIMEELLHFHDHTLMIVFLISSLVLYIISLMLTTKLTHTSTMDAQE Sorex MAYPFQMGLQDATSPIMEELMNFHDHALMIVFLISTLVLYIISSMLTTKLTHTNTMDAQA Squalus MAHPSQLGFQDAASPVMEELLHFHDHTLMIVFLISTLVLYIIMAMVSTKLTNKYILDSQE Tarsius MTHPLQLGFQDATSPIMEELLHFHDHTLMIVFLISSLVLYIITLMLTTKLTHTSTMDAQE Triatoma MATWSNLGIQDANSPLMEQLIFFHDHTLMILTMITVLVGYMMGTVLYNKLINRYLLEGQT Thermobia MAIWNQLGLQDAASPVMEQMTFFHDHTMLIVTMITVLVGYLLASLLPNTYINRNLLEGQT Toxoplasma MSRNRRRRRMPPQNMMSTTLTTAQTISTTCLPTTLRPVTIWILMEQCATSRRQRLSTGST Trichinella MMKWTAMYTQDSYNHSSLLLINFMDWVMIMMLSILILVLWIYMGTLFTSSNSLMLDHKWL Xenopus IEMVWTIMPAISLIMIALPSLRILYLMDEVNDPHLTIKAIGHQWYWSYEYTNYEDLSFDS Tcruzi APIRIIITSQDVLDSWAGPTLGLKTDAIPGRLNQTTFTATRPGVYYGQWSEIWGANHSFK Anopheles IEIIWTVLPAIILMFIAFPSLRLLYLMDEINTPSITLKSIGHQWYWSYEYSDFLNLEFDS Arabidopsis LWHFHYKKNAIPQRIVHGTTIEILRTIFPSIISMFIAIPSFALLYSMDEVVVDPAITIKA Armillifer EFIWTSIPALILTFIMVPSLHILYLLDETMNPLLTVKIMGHQWYWSYEYSDFKNIQFDSY Ascaris QFGELLCSVFPTLILVMQMVPSLSLLYYYGLMNLDSSLTVKVTGHQWYWSYEFSDIPGLE Papio METIWTILPAVILILIALPSLRILYMTDEINNPSFTIKSIGHQWYWTYEYTDYGGLIFNS Bos VETIWTILPAIILILIALPSLRILYMMDEINNPSLTVKTMGHQWYWSYEYTDYEDLSFDS Brugia RMIELILQVLVVNFLVIMAGPGFWLIQYQGRMFRQSELTLKVIGHQWYWSYEYGDDSSLV Bufo IEMVWTIMPAIILIVIALPSLRILYLMDEVSNPDVTVKAIGHQWYWSYEYSDFNDLSFDS Buergeria IEMVWTIMPAVILIVIALPSLRILYLMDEVGNPNITVKAIGHQWYWSYEYSDFSNMSFDS Asno VETIWTILPAIILILIALPSLRILYMMDEINNPSLTVKTMGHQWYWSYEYTDYEDLTFDS Equus VETIWTILPAIILILIALPSLRILYMMDEINNPSLTVKTMGHQWYWSYEYTDYEDLTFDS Caiman IEVIWTILPAIILISIALPSLRTLYLMDETNNPCLTIKTTGHQWYWSYEYTDFSTLEFDS Candida YKYVRHGQVIEIIWTIFPAVILLLIAFPSFILLYLCDEVLTPAMTIKVIGLQWYWKYEYS Capra VETVWTILPAIILIMIALPSLRILYMMDEINNPSLTVKTMGHQWYWSYEYTDYEDLSFDS CERCOCEBUS MEIIWTILPAIILVLIALPSLRILYLTDEVNNPSFTIKSIGHQWYWTYEYTDYGGLIFNS Pan METVWTILPAIILVLIALPSLRILYMTDEVNDPSFTIKSIGHQWYWTYEYTDYGGLIFNS Crinipellis YNDKKNPIAHKYLTHGSVIELIWTITPALILIAIAFPSFKLLYLMDEVLSPTLTIKVVGH Cryptococcu NYSSTSNPISHKYSNHGTLIELVWTITPALILIAIAFPSFKLLYLMDDVISPAMTIKAVG Periplaneta IELAWTIAPAVILVFIAVPSLRLLYLMDEINTPTVTLKTIGHQWYWSYEYSDFAKVEFDS Cynomys VETIWTILPAIILMLIALPSLRILYMMDEINNPSLTVKTMGHQWYWSYEYTDYEDLNFDS Daphnia IEIIWTVLPAVILIILALPSLRLLYLIDETTEPSITLKTVGHQWYWSYEYSDFKDIEFDS Dasypus VETVWTILPAVILILIALPSLRILYMMDEINNPLLTIKAMGHQWYWSYEYTDYEDLNFDS Dictyosteli STGNMLDGDGQQYNVIVTAHGLIMIFFVVMPAMLGGFANWFIPIMVGSPDVAFPRLNNIS Didelphis VETIWTILPAVILILIALPSLRILYMMDEIYNPYLTVKAMGHQWYWSYEFTDYENLMFDS Dros IEMIWTILPAIILLFIALPSLRLLYLLDEINEPSVTLKSIGHQWYWSYEYSDFNNIEFDS Elephantulu IETIWTILPAAILILIALPSLRILYMMDEISNPAMTVKTMGHQWYWSYEYTDYTDLTFDS Eschrichtiu VETIWTILPAIILILIALPSLRILYMMDEVNNPSLTVKTMGHQWYWSYEYTDYEDLSFDS Plasmodium ------------------------------------------------------------






Felis VETIWTILPAIILILIALPSLRILYMMDEINNPSLTVKTMGHQWYWSYEYTDYEDLNFDS Phoca VETVWTILPAIILILIALPSLRILYMMDEINNPSLTVKTMGHQWYWSYEYTDYEDLNFDS Gallus ELIWTILPAIVLVLLALPSLQILYMMDEIDEPDLTLKAIGHQWYWTYEYTDFKDLSFDSY Ixodes IETIWTIIPAITLIFIAFPSLRLLYMLDESFTPSITIKIIGHQWYWSYELSDFNIEFDSF Hylobates METVWTILPAIILVLIALPSLRILYLTDEINDPSFTIKAIGHQWYWAYEYTDYGGLIFNS Gonostoma VEIIWTILPALILILIALPSLRILYLMDESNNPHLTIKAVGHQWFWSYEFTDYKDLTFDS Gorilla METIWTILPAIILVLIALPSLRILYMTDEINDPSFTIKSIGHQWYWTYEYTDYGGLIFNS Heterodontu IEIVWTILPAIILIMIALPSLRILYLMDEINDPHLTIKAMGHQWYWSYEYTDYEDLGFDS Hippopotamu VETVWTILPAIILILIALPSLRILYMMDEINNPSLTVKTMGHQWYWSYEYTDYEDLNFDS Homo METVWTILPAIILVLIALPSLRILYMADEVNDPSLTIKSIGHQWYWTYEYTDYGGLIFNS Huso IEIVWTVLPAVILILIALPSLRILYLMDEINDPHLTIKAMGHQWYWSYEYTDYEDLGFDS Iguana VEMIWTILPAIILILIALPSLRILYLMDEINNPHLTIKTLGHQWYWSYEYTDYEDLTFDS Katharina IEIVWTILPAVVLIFLAFPSLQLLYLLDELEEPALTIKVVGHQWYWSYEYSDFLNLEFDS Lumbricus VETIWTILPALILLVLALPSLRILYITDEVSQPSITVKTIGHQWYWSYEYTDFLNVEMDS Macaca METIWTILPAIILILIALPSLRILYLTDEINDPSFTIKSIGHQWYWTYEYTDYGGLIFNS Mus VETIWTILPAVILIMIALPSLRILYMMDEINNPVLTVKTMGHQWYWSYEYTDYEDLCFDS Mustelus IEIVWTILPAIILIMIALPSLRILYLMDEINDPHLTIKAMGHQWYWSYEYTDYEDLGFDS Pongo METIWTILPAIILILIALPSLRILYLTDEINDPSFTIKSIGHQWYWTYEYTDYGGLIFNS Ornithodoro IEILWTIIPAMILIYIALPSLRLLYLMEEAFFPSITTKIIGHQWYWSYEYPDFNFEFNSF Ornithorhyn VETIWTILPAIILILIALPSLRILYMMDEINNPNLTIKTLGHQWYWSYEYSDYEDLSFDS Oryctolagus VETIWTILPAIILILIALPSLRILYMMDEINNPSLTVKTMGHQWYWSYEYTDYEDLNFDS Canis VETVWTILPAIILILIALPSLRILYMMDEINNPSLTVKTMGHQWYWSYEYTDYEDLNFDS Pupa LETIWTIIPALLLVWLALPSLRLLYLLDEQANSGILLKATGHQWYWSYEVPSVSAESTDS Rana IEMVWTIMPAIILIVIALPSLRILYLMDEISNPDMTVKTIGHQWYWSYEYSDFTDLSFDS Rattus VETIWTILPAVILILIALPSLRILYMMDEINNPVLTVKTMGHQWYWSYEYTDYEDLCFDS Rhinolophus VETIWTILPAIILIMIALPSLRILYMMDEINNPSLTVKTMGHQWYWSYEYTDYEDLSFDS Rhipicephal IEIIWTIIPAITLIFIAIPSLHLLYLTDETFNSQISIKVLGHQWYWSYEYSDFNKEFDSF Rickettsia NSNCFASEPLAWQITFQPPASPIMEELYHFHNFLLYIGTAIVLFVAGLLGFVCIRFNAKN Rhinoceros VETIWTILPAIILILIALPSLRILYMMDEINNPSLTIKTMGHQWYWSYEYTDYEDLTFDS Saccharomyc VKTYSKNPIAYKYIKHGQTIEIIWTILPAVILLTIAFPSFILLYLCDEVISPSMTIKAIG Salmo IEIVWTVLPAVILILIALPSLRILYLMDEINDPHLTIKAMGHQWYWSYEYTDYEDLGFDS Schizosacch KYNTNPISRQFHQHGSIIEFIWTLVPALILISIAIPSFKLLYLVDEVKNPSLTVKIIGRQ Sciurus VETIWTILPAIILILIALPSLRVLYMMDEINDPSLTVKTMGHQWYWSYEYTDYEDLNFDS Ceratotheri VETIWTILPAIILILIALPSLRILYMMDEINNPSLTVKTMGHQWYWSYEYTDYEDLTFDS Sorex VETIWTILPAIILILIALPSLRILYMMDEINNPTLTVKTVGHQWYWSYEYTDYDELNFDS Squalus IEIVWTILPAVILIMIALPSLRILYLMDEINDPHLTIKAMGHQWYWSYEYTDYEDLGFDS Tarsius VETVWTILPAIILILIALPSLRILYMMDEINNPLLTVKTMGHQWYWSYEYTDYEDLNFDS Triatoma IELIWTILPAFTLIFIALPSLHILYLMDEMNNPAVTIKSIGHQWYWSYEYSDFHNVEFDS Thermobia LETIWTILPAITLIFIALPSLRLLYLLDEIHQPAITLKTIGHQWYWSYEYSDFSLTEFDS Toxoplasma LKQKRLPSRLFPLTDARWSRALRPEISSSSSLFTKKTFLSGHECVWTSGATTTCSWRLSS Trichinella EFLWTISPLGVLLSMASMSMKALYTEEGLPTPPALSLKITGHQWYWTYNYPDFNLEFDSY Xenopus YMIPTNDLTPGQFRLLEVDNRMVVPMESPTRLLVTAEDVLHSWAVPSLGVKTDAIPGRLH Tcruzi AIVLKLIPLKIFEIGPGFTL---------------------------------------- Anopheles YMVPTNELETNGFRLLDVDNRVVLPMNNQIRILVTATDVLHSWTVPSLGVKVDATPGRLN Arabidopsis IGHQWYRTYEYSDYNSSDEQSLTFDSYMIPEEDLELGQSRLLEVDNRVVVPAKTHLRIIV Armillifer MIPNNPLLRLLDTNNRLILPFSTLTRLLISSHDVLHSWTMPSLGAKIDAVPGRLNQLTIF Ascaris FDSYMKSLDQLELGEPRLLEVDNRCVVPCDVNIRFCITSGDVIHSWALPSMSIKLDAMSG Papio YMLPPLFLNPGDLRLLEVDFRVVLPIEAPVRMMITSQDVLHSWTIPTLGLKTDAVPGRLN Bos YMIPTSELKPGELRLLEVDNRVVLPMEMTIRMLVSSEDVLHSWAVPSLGLKTDAIPGRLN Brugia FDSFMKPVDDLSLGDFRLFDVDNRCVLPIGVNIGLYCTSSDVIHSFAVPKCFVKMDALNG Bufo YMVPTKDLLPGQFRLLEVDNRMTTPVGMTTRTLITAEDVLHSWAVPSLGVKLDAIPGRLN Buergeria YMTPTKDLTPGQARLLEVDNRMVIPIGTTTRALVTAEDVLHSWAVPTLGVKTDAIPGRLN Asno YMIPTSDLKPGELRLLEVDNRVVLPMEMTIRMLISSEDVLHSWAVPSLGLKTDAIPGRLN Equus YMIPTSDLKPGELRLLEVDNRVVLPMEMTIRMLISSEDVLHSWAVPSLGLKTDAIPGRLN Caiman YMTPPQDLLPGHLRLLEVDHRMVTPMNSTIRVLVTAEDVLHSWAIPSIGTKMDAVPGRLN Candida DFVDSIGETIEFESYVIPDDMLEPGALRLLDTDTSIVVPVDTHIRFVVTANDVIHSFTIP Capra YMIPTSELKPGELRLLEVDNRVVLPMEMTIRMLISSEDVLHSWAVPSLGLKTDAIPGRLN CERCOCEBUS YMLPPLFLNPGDLRLLEVDNRVVLPIEAPVRMMITSQDVLHSWTIPTLGLKTDAVPGRLN Pan YMLPPLFLEPGDLRLLDVDNRVVLPVEAPVRMMITSQDVLHSWAVPTLGLKTDAIPGRLN Crinipellis QWYWSYEYSDFITESGDSIDFDSYMIPESDLELGQFRLLDVDNKLVVPVDCHIRLIVTGI Cryptococcu HQWYWSYEYSDFVNEDGESIEFDSYMIPDSDLEDGQLRLLDVDNRVVLPVDTHVRFVVTG Periplaneta YMIPQNEMENNMFRLLDVDNRAALPMNTFIRIIVTAADVLHSWTIPSLGIKADATPGRLN Cynomys YMVPTSELTPGDLRLLEVDNRVVLPMELPVRMLISSEDVLHSWTVPSLGLKTDAIPGRLN Daphnia YMMPSNDLEKGQFRLLEVDNRVILPYLTQVRLLVTAGDVIHSWTIPSLGIKADAVPGRLN Dasypus YMVPTSDLKPGELRLLEVDNRLVLPMELSIRMLISSEDVLHSWAVPSLGLKTDAIPGRLN






Dictyosteli LWLIIVSFFLLLTSSCVGIGVGTGWTVYPPLSTMEYHPGHAVDVGILSLHIAGASSLLGA Didelphis YMIPTKDLSPGQLRLLEVDNRIVLPMELPIRMLISSEDVLHAWTMPSLGLKADAIPGRLN Dros YMIPTNELMTDGFRLLDVDNRVVLPMNSQIRILVTAADVIHSWTVPALGVKVDGTPGRLN Elephantulu YMIPTNELSPGGLRLLEVDNRLVLPVDVPVRMLISSEDVLHSWAIPALGLKTDAIPGRLN Eschrichtiu YMIPTSDLKPGELRLLEVDNRVVLPMEMTIRMLVSSEDVLHSWAVPSLGLKTDAIPGRLN Plasmodium ------------------------------------------------------------ Felis YMIPTQELKPGELRLLEVDNRVVLPMEMTIRMLISSEDVLHSWAVPSLGLKTDAIPGRLN Phoca YMIPTQELKPGELRLLEVDNRVVLPMEMTIRMLISSEDVLHSWAVPSLGLKTDAIPGRLN Gallus MTPTTDLPLGHFRLLEVDHRIVIPMESPIRVIITADDVLHSWAVPALGVKTDAIPGRLNQ Ixodes MIPPTEMKPNSFRLLDVDNRMVIPFNSHIKFLISSADVIHSWTIPSLGIKMDAIPGRLNQ Hylobates YMLPPLFLEPGDLRLLEVDNRVVLPIEAPVRMMITSQDVLHSWTVPSLGLKTDAIPGRLN Gonostoma YMVPPQDLPLGQFRLLEADHRVVVPTESPIRVLITAEDVLHSWAVPALGVKMDAIPGRLN Gorilla YMLPPLFLEPGDLRLLDVDNRVVLPVEAPVRMMITSQDVLHSWAVPTLGLKTDAIPGRLN Heterodontu YMIQTQDLTPGQFRLLETDHRMVVPMESPIRVLVSAEDVLHSWTVPALGVKMDAVPGRLN Hippopotamu YMVPTSDLKPGDLRLLEVDNRVVLPMDVTVRMLISSEDVLHSWAVPSLGLKTDAIPGRLN Homo YMLPPLFLEPGDLRLLDVDNRVVLPIEAPIRMMITSQDVLHSWAVPTLGLKTDAIPGRLN Huso YMIPTQDLAPGQFRLLEADHRMVVPMESPIRVLVSAEDVLHSWAVPALGIKMDAVPGRLN Iguana YMTPTQDLTPGSFRLLEVDNRMVVPMESPIRMLISAEDVLHSWAVPTLGIKTDAIPGRLN Katharina YMISLEDLEEGDYRLLEVDHRSVVPMKTKVRVLVTAADVLHSWTVPSLGVKADAVPGRLN Lumbricus YMLPTSDLLPGDYRLLEVDNRMVVPMQLEIRMLITAADVIHSWTVPALGVKVDAVPGRLN Macaca YMLPPLFLNPGDLRLLEVDNRVVLPIEASVRMMITSQDVLHSWAIPTLGLKTDAVPGRLN Mus YMIPTNDLKPGELRLLEVDNRVVLPMELPIRMLISSEDVLHSWAVPSLGLKTDAIPGRLN Mustelus YMIQTQDLAPGQFRLLETDHRMVVPMESPIRVLVSAEDVLHSWAVPALGVKMDAVPGRLN Pongo YMLPPLFLEPGDLRLLDVDNRVVLPVEAPVRMMITSQDVLHSWTVPSLGLKTDAIPGRLN Ornithodoro LLPQTELNLSNFRLLDVDNRMILPFNTSLRFLVTSEDVIHSWTIPTLGIKMDAVPGRLNQ Ornithorhyn YMIPTQDLLPGQLRLLEVDNHLVLPIELPIRMLISSEDVLHSWALPSMGLKTDAIPGRLN Oryctolagus YMIPTSDLNPGDLRLLEVDNRVVLPMELPIRMLISSEDVLHSWAVPSLGLKTDAIPGRLN Canis YMIPTQELKPGELRLLEVDNRVVLPMEMTIRMLISSEDVLHSWAVPSLGLKTDAIPGRLN Pupa YMVPDSDLEAGDYRLLEADNRAVVPFGLDTTIISTSADVLHAFAMPSAGVKMDAVPGRLN Rana YMIPTKDLEPGHFRLLEVDNCMVTPIGTAARILITAEDVLHSWAVPALGVKSDAIPGRLN Rattus YMIPTNDLKPGELRLLEVDNRVVLPMELPIRMLISSEDVLHSWAIPSLGLKTDAIPGRLN Rhinolophus YMIPTSDLKPGELRLLEVDNRVVLPMEMTIRMLISSEDVLHSWAVPSLGLKTDAIPGRLN Rhipicephal MIPEPEMMKNSFRLLDTDNNLVIPINTNIKYLISSMDVIHSWTIPSLGIKMDAVPGRLNQ Rickettsia NPVPAKFAHNLLIEIIWTVIPIIILVIIAVPSFRILRHAEKIPEIDLTIKVVGYQWYWHY Rhinoceros YMIPTSDLKPGELRLLEVDNRVVLPMEMTIRMLISSEDVLHSWAVPSLGLKTDAIPGRLN Saccharomyc YQWYWKYEYSDFINDSGETIEFESYVIPDSLLEDGQLRLLDTDTSIVVPVDTHIRFLVTA Salmo YMVPTQDLTPGQFRLLETDHRMVVPVESPIRVLVSAEDVLHSWAVPSLGVKMDAVPGRLN Schizosacch WYWTYEYSDFLKEEGDEPIMFDSYMVPEEDLEEGQLRQLEVDNRLVLPVNTPIRLILTSS Sciurus YMIPTSELKPGELRLLEVDNRVVLPMELPIRMLISSEDVLHSWAVPSLGLKTDAIPGRLN Ceratotheri YMIPTSDLKPGELRLLEVDNRVVLPMEMTIRMLISSEDVLHSWAVPSLGLKTDAIPGRLN Sorex YMIPTADLKPGDLRLLEVDNRAVLPMEMTVRVLITSEDVLHSWAVPSLGLKTDAIPGRLN Squalus YMIQTQDLTPGQFRLLETDHRMVVPMESPIRVLVSAEDVLHSWTVPALGVKMDAVPGRLN Tarsius YMVPTTDLKPGELRLLEVDNRVVLPMEVPIRMLISSEDVLHSWAVPSLGLKTDAIPGRLN Triatoma YMKPTNELEMSDFRLLDVDNRAVLPMNTQIRLLVTAADVLHSWTIPSLGIKIDGTPGRLN Thermobia YMIPINEMNPNSFRLLDVDNRIVLPINIDIRILITAADVLHSWAMPAFGIKADATPGRLN Toxoplasma FSSGLPHSSPGRLQFRCSRSCTCSTKRCMRPWPSKLSADSGTGSTKSSRLLTTRSREHRR Trichinella MKEWESQDFRLLDCDNRVVLPTQVPIRMSVTSADVIHSWTIPSLGIKMDAMPGRINSTTT Xenopus QTSFIATRPGVFYGQCSEICGANHSFMPIVVEAVPLTDFENWSSSMLEA----------- Tcruzi ------------------------------------------------------------ Anopheles QLNFLINRPGLFFGQCSEICGANHSFMPIVIESIPMNYFIKWITSMTN------------ Arabidopsis TSADVPHSWAVPSSGVKCDAVPGRLNQISILVQREGVYYGQCSEICGTNHAFTSIVVEAV Armillifer IQRPGIFFGQCSEICGINHSFMPISLQSVNTPDFINWLYSM------------------- Ascaris ILSTLSYSFPVVGVFYGQCSEICGANHSFMPVALEVTLLDNFKSWCVGLLSD-------- Papio QTVFTATRPGVYYGQCSEICGANHSFMPIVAELIPLKIFEMGPVFTL------------- Bos QTTLMSSRPGLYYGQCSEICGSNHSFMPIVLELVPLKYFEKWSASML------------- Brugia LLTKITFNFSCCGLFYGQCSEICGANHSFMPIALELTSLECWKAWSLGYLLG-------- Bufo QTSFIISRPGVYYGQCSEICGANHSFMPIVVESLPIKEFLNWSSASVDA----------- Buergeria QTSFLITHTGIYYGQCSEICGANHSFMPIVVEALPISNFLTWLQEAQN------------ Asno QTTLVASRPGLYYGQCSEICGSNHSFMPIVLELVPLKYFEEWSASML------------- Equus QTTLVASRPGLYYGQCSEICGSNHSFMPIVLELVPLKHFEEWSASML------------- Caiman QTMITLTNPGVFYGQCSEICGANHSFMPIVMETTPLNHFQLWLENRSTS----------- Candida SLGMKIDATPGRLNQVSALIQRTGVYYGQCSELCGVNHGMMPIKLECVSIEDFIEWLGEN Capra QTTLMSTRPGLFYGQCSEICGSNHSFMPIVLELVPLKYFEKWSASML------------- CERCOCEBUS QTVFTATRPGVYYGQCSEICGANHSFMPIVAELIPLKIFEMGPVFTL------------- Pan QTTFTATRPGVYYGQCSEICGANHSFMPIVLELIPLKIFEMGPVFTL-------------






Crinipellis TADVIHSFAVPSLGLKLDCVPGRLNQASFLAERTGTFYGQCSEICGVWHGMPIAVEAVTS Cryptococcu ADVIHDFAVPSLGLKIDCTPGRLNQVSVITEREGVYYGQCSELCGVMHGFMPIAVEAVSL Periplaneta QISFLINRPGLLYGQCSEICGANHSFMPIVIESISTNSFINWILKMNE------------ Cynomys QATLTSTRPGLYYGQCSEICGSNHSFMPIVLEMVPLKHFENWSSSML------------- Daphnia QLNVFFNRPGVFYGQCSEICGANHSFMPITVEAVNPADFLSWVKSF-------------- Dasypus QATLMATRPGLYYGQCSEICGSNHSFMPIVLELVPLKHFEDWSTSML------------- Dictyosteli INFLTTVFNMKIAGLSWSKVSLFVWSILITAVLLVLSLPVLAGGLTMLITDRNFETTFFD Didelphis QITLTSSRPGVFYGQCSEICGSNHSFMPIVLEMASLKYFEKWSSMMQSFLSYLYI----- Dros QTNFFINRPGLFYGQCSEICGANHSFMPIVIESVPVNYFIKWISSNNS------------ Elephantulu QATLSSTRPGLFYGQCSEICGSNHSFMPIVLEIVPLKHFDNWSSTL-------------- Eschrichtiu QTTLMSTRPGLFYGQCSEICGSNHSFMPIVLELVPLEIFEKWSASML------------- Plasmodium ------------------------------------------------------------ Felis QTTLMATRPGLYYGQCSEICGSNHSFMPIVLELVPLTYFEKWSASML------------- Phoca QTTLMTMRPGLYYGQCSEICGSNHSFMPIVLELVPLSHFEKWSTSML------------- Gallus TSFITTRPGVFYGQCSEICGANHSYMPIVVESTPLKHFEAWSSLLSS------------- Ixodes SFAFPNRPGIFFGQCSEICGANHSFMPISVEITSPKNFIKWMKSF--------------- Hylobates QTTFTATRPGVYYGQCSEICGANHSFMPIVLELIPLKIFEMGPVFTL------------- Gonostoma QTTFITSRPGIFYGQCSEICGANHSFMPIVVEAVPLEHFENWSTLMTEDT---------- Gorilla QTTFTATRPGVYYGQCSEICGANHSFMPIVLELIPLKIFEMGPVFAL------------- Heterodontu QTAFIISRPGVYYGQCSEICGANHSFMPIVVEAVPLEHFETWSSLMLEEA---------- Hippopotamu QTTLMSTRPGLFYGQCSEICGSNHSFMPIVLELVPLQTFEKWTASLL------------- Homo QTTFTATRPGVYYGQCSEICGANHSFMPIVLELIPLKIFEMGPVFTL------------- Huso QTAFITSRPGVYYGQCSEICGANHSFMPIVVEAVPLEHFENWSSLMLEESSL-------- Iguana QTTFITSHPGLFYGQCSEICGSNHSFMPIVVEAVPLQHFESWSTTLLSS----------- Katharina QLSFFANYPGVFYGQCSEICGANHSFMPIVLEVVDSSSFIKWIMFNGEA----------- Lumbricus QIGFTTTQPGVFYGQCSEICGANHSFMPIAVEAINTKSFMSWVSNFKP------------ Macaca QTVFTATRPGVYYGQCSEICGANHSFMPIVAELIPLKIFEMGPVFTL------------- Mus QATVTSNRPGLFYGQCSEICGSNHSFMPIVLEMVPLKYFENWSASMI------------- Mustelus QTAFIISRPGVYYGQCSEICGANHSFMPIVVEAIPLEHFEAWSSSMLEEA---------- Pongo QTTFTATRPGVYYGQCSEICGANHSFMPIVLELIPLKIFEMGPVFAL------------- Ornithodoro ISSIANRPGLYFGQCSEICGANHSFMPISLEITSLKNFLFWIKQF--------------- Ornithorhyn QATITSTRPGLFYGQCSEICGSNHSFMPIVLEMVPLKYFENWTSSMMSTS---------- Oryctolagus QATLISTRPGLFYGQCSEICGSNHSFMPIVLEMVPLKHFENWSLSMI------------- Canis QTTLMAMRPGLYYGQCSEICGSNHSFMPIVLEMVPLSYFETWSALMV------------- Pupa SMSTLFNRPGVFYGQCSEICGANHSFMPIVIESINLHDFVSTMEVEEN------------ Rana QSSFLIAHPGIYYGQCSEICGANHSFMPIVVEALPVPNFLNWINTAQDA----------- Rattus QATVTSNRPGLFYGQCSEICGSNHSFMPIVLEMVPLKYFENWSASMI------------- Rhinolophus QTTLLSTRPGLYYGQCSEICGSNHSFMPIVLELVPLKHFEKWSSSMV-------------

Tabla 3 (Citocromo C) Ejemplos de organismos que presentan similitud significativa con cADN de T. cruzi (4PSample)

Organismos Género y especie Organismos Género y especie Hominidos

Homo sapiens Papio hamadryas Pongo pygmaeus Gorilla gorilla Cercocebus galeritas Hylobates lar Hylobates lar Pan troglodytes

Artrópodos

Thermobia domestica Triatoma dimidiata Periplaneta fuliginosa Drosophila melanogaster Anopheles gambiae Daphnia pulex Ornithodoros moubata Rhipicephalus sanguineus Ixodes hexagonus

Hongos

Candida albicans Schizosaccharomyces japonicus Cryptococcus neoformans var. Grubii Crinipellis perniciosa

Peces

Squalus acanthias Gonostoma gracile Huso huso Mustelus manazo Heterodontus francisci






Saccharomyces servazzi I

Helmintos

Trichinella spiralis Armillifer armillatus Ornithodoros moubata Ascaris suum Brugia Malawi

Anfibios

Rana nigromaculata Xenopus lavéis Bufo melanostictus Buergeria buergeri

Moluscos

Pupa strigosa Katharina tunicata

Rhinocerotidae

Rhinoceros unicornis Ceratotherium simum

Plantas

Arabidopsis thaliana Procariontes

Rickettsia prowazekii str. Madrid E

Protozoarios

Dictyostelium discoideum Toxoplasma gondii F+1 Plasmodium falciparum F +2

Equidae

Equus caballus Asno

Canidos Canis familiares Caprinos Capra hircus

Felinos

Felis catus (cat) Bovinos Bos taurus

Otros mamíferos Phoca vitulina Chiroptera

Rhinolophus conoceros






0.1

RhinolophusSorexOrnithorhyn

ElephantuluIguana

CaimanGallus

LumbricusRickettsia

PupaTrichinella

AscarisBrugia

PlasmodiumToxoplasma

ArabidopsisDictyosteliSchizosacchCandidaSaccharomyc

CrinipellisCryptococcu

ArmilliferThermobia

AnophelesDros

PeriplanetaTriatoma

OrnithodoroIxodesRhipicephal

DaphniaKatharina

XenopusBufo

BuergeriaRana

GonostomaSalmoHusoMustelusHeterodontuSqualus

TcruziHylobatesPongoHomoPanGorillaPapioCERCOCEBUSMacaca

DidelphisMusRattus

OryctolagusCynomys

SciurusHippopotamuDasypusTarsius

FelisPhocaCanis

EschrichtiuBosCapraRhinocerosCeratotheriAsnoEquus

Pre-Bootstrap Trypanosoma cruzi está colocado con el Cluster de Hominidos

Figura 7. Árbol Filogenético Pre – BootStrap_ generado con las proteínas de Citocromos “C” Subunidad II - {Alineamiento Múltiple con ClustalW Versión 1.7; Árbol generado con Phylip Versión 3.6 alpha - Kimura's distance)






Tabla 4

Alineamiento Múltiple de Secuencias de Citocromo “C” subunidad II con “clusters” con y sin la secuencia de T. cruzi (cADN) [Programas Clustlx V 1.63 / GenDoc V 2.6.0.1] Cluster de Organismos A_Clustalx_ Alin Score

ΣPares - Cluster D_Clustalx alin Score ΣP Cluster + 4PSample

Contribución en el Score_ΣPares_4PSample

Índice D/A

Trichinella Pupa, Katharina

9020

19947

10927

2.21

Triatoma Thermobia, Periplaneta Drosophila, Anopheles

23986

41745

17759

1.74

Daphnia Armillifer, Ornithodorus Rhipicephalus, Ixodes

25342

43196

17854

1.70

Candida Schyzosaccharomyces, Cryptococcus, Crinipella Saccharmoyces, Arabidopsis

48832

73933

25101

1.53

Rickettssia Dictioce

13601

33278

19677

2.45

Squalus Gonostoma, Huso, Mustelus Heterodnotus

30766

51571

20805

1.68

Toxoplasma Plasmodium

3717

9995

6278

2.69

Rana Xenopus, Bufo, Burgueria

13339

27219

13880

2.04

Humano Papio, Macaca, Gorila Cercocibus, Hylobates Pongo, Chimpance

42254

64065

21811

1.52

Perro Felis, Foca, Capra Bos, Rhinolog

29254

49263

20009

1.68

Brugia Ascaris

3083

10311

7228

3.34

Burro Rinoceronte, Equus Cerato

11519

24817

13298

2.15

Rata Mus, Oryctolag, Sciurus, Cynomys

19731

36390

16659

1.84






0.1

RhinolophusSorexOrnithorhyn

ElephantuluIguana

GallusCaiman

ArmilliferRickettsia

TrichinellaAscarisBrugia

ToxoplasmaTcruzi

PlasmodiumArabidopsis

DictyosteliSchizosacchCandidaSaccharomyc

CrinipellisCryptococcu

LumbricusPupa

ThermobiaAnophelesDros

PeriplanetaTriatoma

OrnithodoroIxodesRhipicephal

DaphniaKatharina

XenopusBufo

BuergeriaRana

GonostomaSalmoHusoMustelusHeterodontuSqualusHylobatesPongoHomoPanGorillaPapioCERCOCEBUSMacaca

DidelphisMusRattus

OryctolagusCynomys

SciurusHippopotamuDasypusTarsius

FelisPhocaCanis

EschrichtiuBosCapraRhinocerosCeratotheriAsnoEquus

Pos-BootStrap Trypanosoma cruzi está colocado con el Cluster de Toxoplasma y Plasmodium

Figura 8: Árbol Filogenético- Pos – BootStrap_ generado con las proteínas de Citocromos “C” Subunidad II - {Alineamiento Múltiple con ClustalW Versión 1.7; Árbol generado con Phylip Versión 3.6 alpha - Kimura's distance)






Metaxina “n” secuencias: T. cruzi - (cADN - 5RPSample31)

Bornstein y colaboradores et al 2003, sugieren que la metaxina probablemente participa en el desarrollo embrionario en los ratones, Con el fin de evaluar la homología significativa encontrada con Metaxina, se hizo búsqueda de homología para metaxina empleando la secuencia de aminoácidos NP_038632.1 de Mus musculus que mostró el mejor grado de significancia (E-value de 0.0) con la clona 5RPSample31. El resultado de blastp generó “n” secuencias con similitud significativa, dentro de ellas dos secuencias de proteínas hipotéticas de T. cruzi de la cepa CL Brener gi|70873638|gb|EAN87429.1| y

gi|71414350|ref|XP_809280.1|, con una longitud de 406 aminoácidos un grado de significancia = 0.93, e identidad de 23/96 (23%), similitud de 46/96 (47%), con Gaps = 2/96 (2%); estos datos no muestran homología significativa con metaxina ( Anexo 6: figura 22). Para comprobar este resultado se recuperaron las secuencias de de aminoácidos metaxina de Mus musculus NP_038632.1; de T. cruzi 70873638; y de la clona 5RPSample31 marco de lectura -1; con las secuencias de aminoácidos se hicieron alineamientos con blastp para dos secuencias de proteínas para Mus musculus 7305291 Vs T. cruzi 70873638; 5RPSample31 Vs T cruzi 70873638; Mus musculus 7305291 Vs 5RPSample31-1; encontrando los resultado siguientes:

a) Mus musculus 7305291 Vs T. cruzi 70873638 : Expect = 0.051 – Identidad 22%; Similitud 39% y Gaps 14%

b) Mus musculus 7305291 Vs 5RPSample ORF -1 : Expect = e-147 – Identidad (88%) y Gaps de 1%.

c) 5RPSample ORF -1 Vs T. cruzi 70873638 : No encontró alineamiento significativo.






Homología con dominios conservados CDD 3D La tabla 5 muestra la homología significativa encontrada con dominios conservados “CDD” 3D con Citocromo “C” subunidad II y Proteínas Ribosomales; lo cual es importante, ya que se considera que es más importante la homología por estructura 3D, que la encontrada por por la secuencia de aminoácidos (Estructura 3D – Función).

Tabla 5

Homología significativa con dominios conservados “CDD” 3D (Blastp con tx base de datos “nr” GenBamk)

cADNs CDD 3D – GenBank

*4PSample nr_GB: 141 aa

gnl_CDD_5887: pfam0016. COX2_Citocromo oxidasa subunidad II periplásmico Expec 3e-49 95.5% alineado - Longitud CD = 132 aa

*4PSample nr_GB:

141 aa

gnl_CDD_11334 COG1622 CyoA, Heme/tipo cobre_ citocromo quinol oxidasa Exp. 8e-18

45.3% alineado – Longitud CD = 247 aa

*6PSample nr_GB 183 aa

gnl_CDD_ 25428 pfam00177, proteína Ribosomal S7p/S5e 2e-05 - 22.8% Alineado - Longitud CD = 149 aa

*6PSample nr_GB

183 aa

gnl_CDD_9924: COG 0049, RpsG, Proteína Ribosomal (Translación, ribosomal st..) 6e-04 20.9% alineado - Longitud CD = 149 aa

*6RPSample nr_GB

184 aa

gnl_CDD_ 25428 pfam00177, proteína Ribosomal S7p/S5e 3e-40 - 95.322.8% Alineado - Longitud CD = 149 aa

*6RPSample nr_GB

184 aa

gnl_CDD_9924: COG 0049, RpsG, Proteína Ribosomal (Translación, ribosomal st..) 2e-37 94.6% alineado - Longitud CD = 148 aa

*Falta modelar estructura 3D de los cADNs para buscar homología con los CDD.

La clona 6TcrM13 de 385 bases y el fragmento de 35 bases La clona 6TcrM13 encontró en la base de datos Kinetoplastide T. cruzi un fragmento de 35 bases [Query:

1 AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG 35], conservado en 91 secuencias de la cepa CL Brener de T.






cruzi (ejemplo tabla 6). El fragmento de 35 bases está localizado en posiciones diferentes de las secuencias. En tres secuencias está repetido el fragmento de 35 bases, una de ellas tiene además otro fragmento con secuencias conservada de 29 bases . BLASTN 2.2.13 [Nov-27-2005] Secuencia = 6TcrM13F ongitud longitud = 385 bases Base de datos: Trypanosoma cruzi 32,746 sequences; 89,612,356 bases

£. Tabla 6 Fragmento de 35 bases en 91 secuencias de T. cruzi. (ejemplo)

Fragmento conservado de 35 bases en 91 secuencias de la cepa CL Brener T. cruzi Query 1 AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG 35 ||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 24 AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG 58 Query 1 AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG 35 ||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 204 AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG 170 Query 1 AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG 35 ||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 412 AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG 446 Query 1 AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG 35 ||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 604 AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG 570 Query 1 AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG 35 ||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2454 AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG 2420 Query 1 AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG 35 ||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 111 AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG 77 Query 1 AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG 35 ||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 353 AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG 387

Los 91 (100%) casos encontrados indican su posición en el genoma (datos completos anexo).






Secuencias con dos fragmentos de 35 bases repetido gb|AAHK01002908.1| Trypanosoma cruzi strain CL Brener tcruzi_... 68.0 1e-10 100% - 35b y 29b / Q_IT 1-35 / Sbjct 3610-3576---35b - Q_IT 7-35 / Sbjct 4209-4181---29b gb|AAHK01019936.1| Trypanosoma cruzi strain CL Brener tcruzi_... 68.0 1e-10 100% - 35b/2 veces / Q_IT 1-35 / Sbjct 172-206---35b - Q_IT 1-35 / Sbjct 788-822---35b gb|AAHK01026997.1| Trypanosoma cruzi strain CL Brener tcruzi_... 68.0 1e-10 100% - 35b/2 veces / Q_IT 1-35 / Sbjct 132-98---35b - Q_IT 1-35 / Sbjct 747-713---35b

Blastn en base de datos “nr” de GenBank [35 bases] Con el fragmento de 35 bases [Query: 1 AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG 35] se busco homología en la base de datos “nr” (Blastn), se encontró el fragmento de 35 bases en 40 secuencias de Tripanosoma cruzi y en 10 secuencias de otras especies de tripanosomas. En 50 secuencias de triapanomas de diferentes especies más se encontró homología pero no conservada totalmente como en las primeras 50. Estas secuencias tienen funciones diferentes . 40 genes de Trypanosoma cruzi con la secuenia de 35 bases conservada en 100% gi|20977244|gb|AF506368.1| Trypanosoma cruzi trans-spliced le... 69.9 2e-10 gi|10628|emb|X62674.1|TCMINEX T.cruzi DNA for mini-exon 69.9 2e-10 gi|71608918|emb|AJ878873.1| Trypanosoma cruzi mRNA for protei... 69.9 2e-10 gi|71608916|emb|AJ878872.1| Trypanosoma cruzi mRNA for calcin... 69.9 2e-10 gi|10675|emb|X07452.1|TCUBIFUS Trypanosoma mRNA for FUS gene (ub 69.9 2e-10 gi|41351856|gb|AY513728.1| Trypanosoma cruzi trypomastigote liga 69.9 2e-10 gi|34485901|gb|AY367129.1| Trypanosoma cruzi CUTIA spliced le... 69.9 2e-10 gi|34485900|gb|AY367128.1| Trypanosoma cruzi MN spliced leade... 69.9 2e-10 gi|34485899|gb|AY367127.1| Trypanosoma cruzi SC43 spliced lea... 69.9 2e-10 gi|34485898|gb|AY367126.1| Trypanosoma cruzi M5631 spliced le... 69.9 2e-10 gi|34485897|gb|AY367125.1| Trypanosoma cruzi Tu18 spliced lea... 69.9 2e-10 gi|34485896|gb|AY367124.1| Trypanosoma cruzi 92122102r splice... 69.9 2e-10 gi|10627|emb|X00632.1|TCMIEX1 Trypanosome cruzi mini-exon repeat 69.9 2e-10 gi|13989956|gb|AY032683.1| Trypanosoma cruzi putative mucin E... 69.9 2e-10 gi|21616731|gb|AF499017.1| Trypanosoma cruzi U2 splicing auxi... 69.9 2e-10 gi|13897545|gb|AF251807.1|AF251807 Trypanosoma cruzi clone 2 ... 69.9 2e-10 gi|162271|gb|M30787.1|TRBSLGB T.cruzi spliced leader (SL) 35.1 m 69.9 2e-10 gi|162269|gb|M30786.1|TRBSLGA T.cruzi spliced leader (SL) 35.2 m 69.9 2e-10 gi|7682561|gb|AF203086.1|AF203086 Trypanosoma cruzi MLe-1 muc... 69.9 2e-10 gi|7682559|gb|AF203085.1|AF203085 Trypanosoma cruzi MLe-1 muc... 69.9 2e-10 gi|7109724|gb|AF112258.1|AF112258 Trypanosoma cruzi aromatic ... 69.9 2e-10 gi|6760647|gb|AF036409.2|AF036409 Trypanosoma cruzi mucin-lik... 69.9 2e-10 gi|3064215|gb|AF036451.1|AF036451 Trypanosoma cruzi mucin-lik... 69.9 2e-10 gi|3064213|gb|AF036450.1|AF036450 Trypanosoma cruzi mucin-lik... 69.9 2e-10 gi|3064207|gb|AF036445.1|AF036445 Trypanosoma cruzi mucin-lik... 69.9 2e-10 gi|3064204|gb|AF036443.1|AF036443 Trypanosoma cruzi mucin-lik... 69.9 2e-10 gi|3064201|gb|AF036441.1|AF036441 Trypanosoma cruzi mucin-lik... 69.9 2e-10 gi|3064149|gb|AF036410.1|AF036410 Trypanosoma cruzi mucin-lik... 69.9 2e-10 gi|3064143|gb|AF036407.1|AF036407 Trypanosoma cruzi mucin-lik... 69.9 2e-10 gi|14250893|emb|AJ299433.1|TCR299433 Trypanosoma cruzi mRNA for 69.9 2e-10 gi|3695011|gb|AF051309.1|AF051309 Trypanosoma cruzi strain MT... 69.9 2e-10 gi|3695009|gb|AF050523.1|AF050523 Trypanosoma cruzi strain MT... 69.9 2e-10 gi|3695007|gb|AF050521.1|AF050521 Trypanosoma cruzi strain M5... 69.9 2e-10 gi|1658424|gb|U74765.1|TCU74765 Trypanosoma cruzi clone 3 cdc... 69.9 2e-10 gi|1658422|gb|U74764.1|TCU74764 Trypanosoma cruzi clone 2 cdc... 69.9 2e-10 gi|1658420|gb|U74763.1|TCU74763 Trypanosoma cruzi clone 1 cdc... 69.9 2e-10 gi|1648993|gb|U69960.1|TCU69960 Trypanosoma cruzi cdc2-relate... 69.9 2e-10






gi|1648992|gb|U69959.1|TCU69959 Trypanosoma cruzi cdc2-relate... 69.9 2e-10 gi|1389836|gb|U59297.1|TCU59297 Trypanosoma cruzi complement ... 69.9 2e-10 gi|10631|emb|X68310.1|TCP2AME T.cruzi TCP2a mRNA 69.9 2e-10 gi|7414670|emb|AJ272603.1|TSP272603 Trypanosoma sp. H26 spliced 69.9 2e-10

Homología con otras especies de tripanosomas La búsqueda de homología con otras especies de tripanosomas con la clona 6TcrM13 de 385 bases, en la base de datos de GenBank usando Blastn_Megablast / ADN genómico eucarionte kinetoplastida. No encontró homología significativa con ninguna de las especies probadas: BLASTN 2.2.13 [Nov-27-2005] Secuencia = 6TcrM13F ongitud longitud = 385 bases Base de datos: Trypanosoma brucei cepa TREU927 18,865,491 bases No se encontró similitud singnificativa. Base de datos: Trypanosoma brucei 12,656,881 bases No se encontró similitud singnificativa. Base de datos: Leishmania major strain Friedlin 5,915,784 bases No se encontró similitud singnificativa.






Sin embargo, cuando se buscó homología con el fragmento de 35 bases conservado [Query: 1

AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG 35], empleando blastn se encontró homología con secuencias de otras especies de tripanosomas y de otros géneros. >gi|30315292|gb|AF507072.1| Trypanosoma brucei P-type H+-ATPase mRNA, cds completo. AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG AACGCTATTATTAGAACAGTTTCTGTACTATATTG

>gi|32718097|gi|32718097 Trypanosoma brucei P-type H+-ATPase mRNA, cds completo AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG AACGCTATTATTAGAACAGTTTCTGTACTATATTG

Genes con secuenias de 35 bases conservada en 100% gi|4972012|emb|AJ012420.1|TLE012420 Trypanosoma leeuwenhoeki ... 69.9 2e-10 gi|4972040|emb|AJ012419.1|TRA012419 Trypanosoma rangeli 5S rR... 69.9 2e-10 gi|7414670|emb|AJ272603.1|TSP272603 Trypanosoma sp. H26 spliced 69.9 2e-10 gi|7414667|emb|AJ272600.1|TCO272600 Trypanosoma conorhini spl... 69.9 2e-10 gi|7414660|emb|AJ250747.1|TTH250747 Trypanosoma theileri mini-ex 69.9 2e-10 gi|7414659|emb|AJ250746.1|TPE250746 Trypanosoma pestanai mini-ex 69.9 2e-10 gi|7414658|emb|AJ250745.1|TMI250745 Trypanosoma microti mini-exo 69.9 2e-10 gi|7414657|emb|AJ250744.1|TDI250744 Trypanosoma dionisii mini-ex 69.9 2e-10 gi|7414654|emb|AJ250741.1|TME250741 Trypanosoma mega mini-exon, 69.9 2e-10 gi|7414653|emb|AJ250740.1|TLE250740 Trypanosoma lewisi mini-exon 69.9 2e-10

Genes con secuenia de 35 bases no conservada en 100% gi|7414651|emb|AJ250738.1|TGR250738 Trypanosoma grayi mini-exon, 69.9 2e-10 gi|7414650|emb|AJ250737.1|TRO250737 Trypanosoma rotatorium mini- 69.9 2e-10 gi|10641|emb|X65066.1|TCPO1MRNA T.cruzi mRNA for acidic ribosoma 69.9 2e-10 gi|10633|emb|X65065.1|TCP2BMRNA T.cruzi mRNA for acidic ribosoma 69.9 2e-10 gi|10629|emb|X65025.1|TCP1RIB T.cruzi mRNA for ribosomal P1 type 69.9 2e-10 gi|1389742|gb|U57984.1|TCU57984 Trypanosoma cruzi strain CL spli 69.9 2e-10 gi|162282|gb|M62864.1|TRBSPLICE Trypanosoma rangeli trans-spl... 69.9 2e-10 gi|162279|gb|K02631.1|TRBSLRC Trypanosoma cruzi small spliced... 69.9 2e-10 gi|14279701|gb|AF274060.1| Trypanosoma cruzi casein kinase 1.1 ( 65.9 4e-09 gi|14279699|gb|AF274059.1| Trypanosoma cruzi casein kinase 1.2 ( 65.9 4e-09 gi|6760649|gb|AF036417.2|AF036417 Trypanosoma cruzi mucin-lik... 65.9 4e-09 gi|13897555|gb|AF252544.1|AF252544 Trypanosoma cruzi clone 4 ... 63.9 2e-08 gi|1658426|gb|U74766.1|TCU74766 Trypanosoma cruzi clone 4 cdc... 63.9 2e-08 gi|34485895|gb|AY367123.1| Trypanosoma cruzi CANIII spliced l... 61.9 6e-08 gi|30313710|gb|AY186573.1| Trypanosoma cruzi clone 13A surfac... 61.9 6e-08 gi|7414661|emb|AJ250748.1|TTH250748 Trypanosoma theileri mini-ex 61.9 6e-08 gi|161941|gb|K03278.1|TRB1F8M T.cruzi 1F8 mRNA 61.9 6e-08 gi|45685732|gb|AY540630.1| Trypanosoma cruzi NTPDase-1 mRNA, com 60.0 2e-07 gi|37782788|gb|AY206009.1| Trypanosoma cruzi ferredoxin-NADP+... 60.0 2e-07 gi|13897553|gb|AF252543.1|AF252543 Trypanosoma cruzi clone 1 ... 60.0 2e-07 gi|7414669|emb|AJ272602.1|TDA272602 Trypanosoma danilewskyi spli 60.0 2e-07 gi|7414668|emb|AJ272601.1|TCO272601 Trypanosoma cobitis spliced 60.0 2e-07 gi|4102196|gb|AF012653.1|AF012653 Trypanosoma cruzi putative ... 56.0 4e-06 gi|4102194|gb|AF012652.1|AF012652 Trypanosoma cruzi putative ... 56.0 4e-06 gi|4102192|gb|AF009958.1|AF009958 Trypanosoma cruzi putative ... 56.0 4e-06 gi|3004645|gb|AF009669.1|AF009669 Trypanosoma cruzi putative ... 56.0 4e-06 gi|162247|gb|M62862.1|TRBRTE Trypanosoma cruzi retrotransposo... 56.0 4e-06 gi|45385840|gb|AY547489.1| Herpetomonas mariadeanei 5S riboso... 54.0 1e-05 gi|45385838|gb|AY547487.1| Trypanosomatidae sp. Alexandria_19... 54.0 1e-05 gi|46361290|gb|AY547470.1| Trypanosomatidae sp. Alexandria_19... 54.0 1e-05 gi|46361289|gb|AY547469.1| Leptomonas sp. Nfm spliced leader RNA 54.0 1e-05 gi|46361288|gb|AY547468.1| Herpetomonas mariadeanei spliced l... 54.0 1e-05






gi|9454|emb|X62331.1|HSP5SRRNA H.samuelpessoai gene for 5SrRNA 54.0 1e-05 gi|473685|gb|L07519.1|TRBTCAC2X Trypanosoma cruzi stress and ... 54.0 1e-05 gi|10799|emb|X62675.1|TRMINEX5S T.rangeli DNA for mini-exon and 52.0 6e-05 gi|4433652|gb|AF124146.1| Trypanosoma desterrensis 5S ribosom... 52.0 6e-05 gi|4454559|gb|AF116570.1| Trypanosoma cruzi marinkellei clone... 52.0 6e-05 gi|4454557|gb|AF116568.1| Trypanosoma cruzi marinkellei strai... 52.0 6e-05 gi|4454553|gb|AF116564.1| Trypanosoma vespertilionis trans-sp... 52.0 6e-05 gi|3514074|gb|AF083351.1|AF083351 Trypanosoma rangeli strain ... 52.0 6e-05 gi|3514073|gb|AF083350.1|AF083350 Trypanosoma rangeli strain ... 52.0 6e-05 gi|4106740|gb|AF063004.1|AF063004 Trypanosoma rotatorium tran... 52.0 6e-05 gi|13897549|gb|AF251809.1|AF251809 Trypanosoma cruzi clone 5 ... 48.1 9e-04 gi|3695010|gb|AF051308.1|AF051308 Trypanosoma cruzi strain MT... 48.1 9e-04 gi|7414656|emb|AJ250743.1|TCY250743 Trypanosoma cyclops mini-exo 48.1 9e-04 gi|32718097|gb|AY263211.1| Trypanosoma brucei P-type H+-ATPase m 46.1 0.004 gi|27461070|gb|AY065988.1| Trypanosoma brucei vacuolar-type C... 46.1 0.004 gi|21728258|gb|AF288757.1| Bodo saltans isolate 20 trans-spli... 46.1 0.004 gi|30315292|gb|AF507072.1| Trypanosoma brucei P-type H+-ATPase m 46.1 0.004 gi|33317308|gb|AF452421.1| Trypanosoma cruzi 80 kDa prolyl ol... 46.1 0.004

Búsqueda de homología del genoma del Homo sapiens con el fragmento de 35 bases de la la clona 6TcrM13 ____________________________________________________________






Con el fragmento 35 [Query: 1 AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG 35], se buscó homología con el genoma (cromosomas ) de Homo sapiens usando Blastn_Megablast – ADN genómico eucariontito_kinetoplastida, y tamaño de palabras de 16, 20, 24, 28 y 32 bases. Cuando la de 16 bases se encontró fragmentos conservados de 18 y 17 bases o menores en el genoma de Homo sapiens. Con tamaños de 20, 24, 28 y 32 bases no se encontro secuencias conservadas en el genoma de Homo sapiens.

BLASTN 2.2.13 [Nov-27-2005] Base de datos: NCBI Cromosomas 4782 secuencias; 22,442,197,197 bases Pregunta = 6TcrM13F longitud = 35 bases Resultados gi|51511726|ref|NC_000010.8|NC_000010 Homo sapiens chromosome 10 36.2 0.67 gi|51511752|ref|NC_000023.8|NC_000023 Homo sapiens chromosome X, 34.2 2.7 gi|51511750|ref|NC_000021.7|NC_000021 Homo sapiens chromosome 21 34.2 2.7 gi|51511735|ref|NC_000018.8|NC_000018 Homo sapiens chromosome 18 34.2 2.7 gi|51511723|ref|NC_000007.11|NC_000007 Homo sapiens chromosome 7 34.2 2.7 gi|51511722|ref|NC_000006.9|NC_000006 Homo sapiens chromosome 6, 34.2 2.7 gi|51511464|ref|NC_000004.9|NC_000004 Homo sapiens chromosome 4, 34.2 2.7 gi|51511732|ref|NC_000016.8|NC_000016 Homo sapiens chromosome 16 32.2 11 gi|51511734|ref|NC_000017.9|NC_000017 Homo sapiens chromosome 17 32.2 11 gi|51511731|ref|NC_000015.8|NC_000015 Homo sapiens chromosome 15 32.2 11 gi|51511730|ref|NC_000014.7|NC_000014 Homo sapiens chromosome 14 32.2 11 gi|51511729|ref|NC_000013.9|NC_000013 Homo sapiens chromosome 13 32.2 11 gi|51511728|ref|NC_000012.9|NC_000012 Homo sapiens chromosome 12 32.2 11 gi|51511725|ref|NC_000009.9|NC_000009 Homo sapiens chromosome 9, 32.2 11 gi|51511724|ref|NC_000008.9|NC_000008 Homo sapiens chromosome 8, 32.2 11 gi|51511721|ref|NC_000005.8|NC_000005 Homo sapiens chromosome 5, 32.2 11 gi|51511463|ref|NC_000003.9|NC_000003 Homo sapiens chromosome 3, 32.2 11 gi|51511462|ref|NC_000002.9|NC_000002 Homo sapiens chromosome 2, 32.2 11 gi|51511461|ref|NC_000001.8|NC_000001 Homo sapiens chromosome 1, 32.2 11 gi|42406306|ref|NC_000019.8|NC_000019 Homo sapiens chromosome 19 30.2 42 gi|51511753|ref|NC_000024.7|NC_000024 Homo sapiens chromosome Y, 30.2 42 gi|51511747|ref|NC_000020.9|NC_000020 Homo sapiens chromosome 20 30.2 42 gi|51511727|ref|NC_000011.8|NC_000011 Homo sapiens chromosome 11 30.2 42

Ejemplos por cromosoma gi|51511726|ref|NC_000010.8|NC_000010 Homo sapiens chromosome 10, complete sequence Length = 135 413 628 Query 4 GCTATTATTGATACAGTT 21 Strand=Plus/Plus |||||||||||||||||| Sbjct 67713165 GCTATTATTGATACAGTT 67713182 Query 7 ATTATTGATACAGTTTC 23 Strand=Plus/Minus ||||||||||||||||| Sbjct 93507104 ATTATTGATACAGTTTC 93507088 Query 17 CAGTTTCTGTACTATA 32 Strand=Plus/Plus |||||||||||||||| Sbjct 64687884 CAGTTTCTGTACTATA 64687899

gi|51511752|ref|NC_000023.8|NC_000023 Homo sapiens chromosome X, complete sequence .Length = 154 824 264






Query 6 TATTATTGATACAGTTT 22 Strand=Plus/Plus ||||||||||||||||| Sbjct 50817960 TATTATTGATACAGTTT 50817976 Query 6 TATTATTGATACAGTTT 22 Strand=Plus/Minus ||||||||||||||||| Sbjct 151392465 TATTATTGATACAGTTT 151392449 Query 12 TGATACAGTTTCTGT 26 Strand=Plus/Plus ||||||||||||||| Sbjct 37152237 TGATACAGTTTCTGT 37152251

gi|51511750|ref|NC_000021.7|NC_000021 Homo sapiens chromosome 21, complete sequence Length = 46 944 323 Query 6 TATTATTGATACAGTTT 22 Strand=Plus/Minus ||||||||||||||||| Sbjct 20984885 TATTATTGATACAGTTT 20984869 Query 20 TTTCTGTACTATATTG 35 Strand=Plus/Minus |||||||||||||||| Sbjct 37537096 TTTCTGTACTATATTG 37537081

gi|51511735|ref|NC_000018.8|NC_000018 Homo sapiens chromosome 18, complete sequence Length = 76 117 153 Query 10 ATTGATACAGTTTCTGT 26 Strand=Plus/Minus ||||||||||||||||| Sbjct 61941661 ATTGATACAGTTTCTGT 61941645 Query 10 ATTGATACAGTTTCTG 25 Strand=Plus/Plus |||||||||||||||| Sbjct 17867946 ATTGATACAGTTTCTG 17867961 Query 6 TATTATTGATACAGTT 21 Strand=Plus/Plus |||||||||||||||| Sbjct 26864347 TATTATTGATACAGTT 26864362

gi|51511723|ref|NC_000007.11|NC_000007 Homo sapiens chromosome 7, complete sequence Length = 158 628 139 Query 7 ATTATTGATACAGTTTC 23 Strand=Plus/Minus ||||||||||||||||| Sbjct 78037783 ATTATTGATACAGTTTC 78037767 Query 6 TATTATTGATACAGTTT 22 Strand=Plus/Minus ||||||||||||||||| Sbjct 88571883 TATTATTGATACAGTTT 88571867 Query 8 TTATTGATACAGTTTC 23 Strand=Plus/Minus |||||||||||||||| Sbjct 109839466 TTATTGATACAGTTTC 109839451






gi|51511722|ref|NC_000006.9|NC_000006 Homo sapiens chromosome 6, complete sequence Length = 170 975 699 Query 18 AGTTTCTGTACTATATT 34 Strand=Plus/Plus ||||||||||||||||| Sbjct 66690929 AGTTTCTGTACTATATT 66690945 Query 20 TTTCTGTACTATATTG 35 Strand=Plus/Plus |||||||||||||||| Sbjct 25060296 TTTCTGTACTATATTG 25060311 Query 11 TTGATACAGTTTCTGT 26 Strand=Plus/Minus |||||||||||||||| Sbjct 25414276 TTGATACAGTTTCTGT 25414261

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gi|51511732|ref|NC_000016.8|NC_000016 Homo sapiens chromosome 16, complete sequence Length = 88 827 254 Query 8 TTATTGATACAGTTTC 23 Strand=Plus/Minus |||||||||||||||| Sbjct 57441301 TTATTGATACAGTTTC 57441286 Query 6 TATTATTGATACAGTT 21 Strand=Plus/Minus |||||||||||||||| Sbjct 62592514 TATTATTGATACAGTT 62592499 Query 21 TTCTGTACTATATTG 35 Strand=Plus/Minus ||||||||||||||| Sbjct 12557761 TTCTGTACTATATTG 12557747

gi|51511734|ref|NC_000017.9|NC_000017 Homo sapiens chromosome 17, complete sequence Length = 78 774 742 Query 6 TATTATTGATACAGTT 21 Strand=Plus/Minus |||||||||||||||| Sbjct 77620501 TATTATTGATACAGTT 77620486






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gi|51511731|ref|NC_000015.8|NC_000015 Homo sapiens chromosome 15, complete sequence Length=100 338 915 Query 19 GTTTCTGTACTATATT 34 Strand=Plus/Plus |||||||||||||||| Sbjct 41435423 GTTTCTGTACTATATT 41435438 Query 7 ATTATTGATACAGTT 21 Strand=Plus/Plus ||||||||||||||| Sbjct 22379879 ATTATTGATACAGTT 22379893 Query 12 TGATACAGTTTCTGT 26 Strand=Plus/Minus ||||||||||||||| Sbjct 30137532 TGATACAGTTTCTGT 30137518

gi|51511730|ref|NC_000014.7|NC_000014 Homo sapiens chromosome 14, complete sequence Length = 106 368 585 Query 13 GATACAGTTTCTGTAC 28 Strand=Plus/Plus |||||||||||||||| Sbjct 42939970 GATACAGTTTCTGTAC 42939985 Query 12 TGATACAGTTTCTGT 26 Strand=Plus/Plus ||||||||||||||| Sbjct 27205916 TGATACAGTTTCTGT 27205930 Query 7 ATTATTGATACAGTT 21 Strand=Plus/Plus ||||||||||||||| Sbjct 35689502 ATTATTGATACAGTT 35689516

gi|51511729|ref|NC_000013.9|NC_000013 Homo sapiens chromosome 13, complete sequence Length = 114 142 980 Query 14 ATACAGTTTCTGTACT 29 Strand=Plus/Plus |||||||||||||||| Sbjct 73614924 ATACAGTTTCTGTACT 73614939 Query 16 ACAGTTTCTGTACTAT 31 Strand=Plus/Plus |||||||||||||||| Sbjct 75353710 ACAGTTTCTGTACTAT 75353725 Query 9 TATTGATACAGTTTCT 24 Strand=Plus/Plus |||||||||||||||| Sbjct 81268263 TATTGATACAGTTTCT 81268278






gi|51511728|ref|NC_000012.9|NC_000012 Homo sapiens chromosome 12, complete sequence Length = 132 449 811 Query 6 TATTATTGATACAGTT 21 Strand=Plus/Plus |||||||||||||||| Sbjct 39663386 TATTATTGATACAGTT 39663401 Query 6 TATTATTGATACAGTT 21 |||||||||||||||| Sbjct 82611755 TATTATTGATACAGTT 82611740 Query 18 AGTTTCTGTACTATA 32 Strand=Plus/Minus ||||||||||||||| Sbjct 29390714 AGTTTCTGTACTATA 29390700

gi|51511725|ref|NC_000009.9|NC_000009 Homo sapiens chromosome 9, complete sequence Length = 138 429 268 Query 16 ACAGTTTCTGTACTAT 31 Strand=Plus/Minus |||||||||||||||| Sbjct 15804476 ACAGTTTCTGTACTAT 15804461 Query 6 TATTATTGATACAGTT 21 Strand=Plus/Plus |||||||||||||||| Sbjct 39083207 TATTATTGATACAGTT 39083222 Query 6 TATTATTGATACAGTT 21 Strand=Plus/Plus |||||||||||||||| Sbjct 40120056 TATTATTGATACAGTT 40120071

gi|51511724|ref|NC_000008.9|NC_000008 Homo sapiens chromosome 8, complete sequence Length = 146 274 826 Query 6 TATTATTGATACAGTT 21 Strand=Plus/Minus |||||||||||||||| Sbjct 78815399 TATTATTGATACAGTT 78815384 Query 8 TTATTGATACAGTTT 22 Strand=Plus/Minus ||||||||||||||| Sbjct 24663530 TTATTGATACAGTTT 24663516 Query 7 ATTATTGATACAGTT 21 Strand=Plus/Plus ||||||||||||||| Sbjct 31577475 ATTATTGATACAGTT 31577489

gi|51511721|ref|NC_000005.8|NC_000005 Homo sapiens chromosome 5, complete sequence Length = 180 857 866 Query 20 TTTCTGTACTATATTG 35 Strand=Plus/Plus |||||||||||||||| Sbjct 29801590 TTTCTGTACTATATTG 29801605






Query 7 ATTATTGATACAGTTT 22 Strand=Plus/Plus |||||||||||||||| Sbjct 114116155 ATTATTGATACAGTTT 114116170 Query 6 TATTATTGATACAGTT 21 Strand=Plus/Plus |||||||||||||||| Sbjct 116487752 TATTATTGATACAGTT 116487767

gi|51511463|ref|NC_000003.9|NC_000003 Homo sapiens chromosome 3, complete sequence Length = 199 505 740 Query 7 ATTATTGATACAGTTT 22 Strand=Plus/Plus |||||||||||||||| Sbjct 154307212 ATTATTGATACAGTTT 154307227 Query 8 TTATTGATACAGTTT 22 Strand=Plus/Minus ||||||||||||||| Sbjct 17479273 TTATTGATACAGTTT 17479259 Query 6 TATTATTGATACAGT 20 Strand=Plus/Plus ||||||||||||||| Sbjct 31404396 TATTATTGATACAGT 31404410

gi|51511462|ref|NC_000002.9|NC_000002 Homo sapiens chromosome 2, complete sequence Length = 243 018 229 Query 6 TATTATTGATACAGTT 21 Strand=Plus/Plus |||||||||||||||| Sbjct 28266208 TATTATTGATACAGTT 28266223 Query 5 CTATTATTGATACAGT 20 Strand=Plus/Minus |||||||||||||||| Sbjct 218625954 CTATTATTGATACAGT 218625939 Query 12 TGATACAGTTTCTGTA 27 Strand=Plus/Plus |||||||||||||||| Sbjct 226510007 TGATACAGTTTCTGTA 226510022

gi|51511461|ref|NC_000001.8|NC_000001 Homo sapiens chromosome 1, complete sequence Length = 245 522 847 Query 7 ATTATTGATACAGTTT 22 Strand=Plus/Plus |||||||||||||||| Sbjct 213718670 ATTATTGATACAGTTT 213718685 Query 7 ATTATTGATACAGTTT 22 Strand=Plus/Minus |||||||||||||||| Sbjct 237495499 ATTATTGATACAGTTT 237495484 Query 20 TTTCTGTACTATATT 34 Strand=Plus/Minus ||||||||||||||| Sbjct 78795909 TTTCTGTACTATATT 78795895






gi|42406306|ref|NC_000019.8|NC_000019 Homo sapiens chromosome 19, complete sequence Length = 63 811 651 Query 7 ATTATTGATACAGTT 21 Strand=Plus/Minus ||||||||||||||| Sbjct 12503650 ATTATTGATACAGTT 12503636 Query 5 CTATTATTGATACAG 19 Strand=Plus/Minus ||||||||||||||| Sbjct 23311549 CTATTATTGATACAG 23311535

gi|51511753|ref|NC_000024.7|NC_000024 Homo sapiens chromosome Y, complete sequence Length = 57 701 691 Query 20 TTTCTGTACTATATT 34 Strand=Plus/Minus ||||||||||||||| Sbjct 3156900 TTTCTGTACTATATT 3156886 Query 7 ATTATTGATACAGTT 21 Strand=Plus/Plus ||||||||||||||| Sbjct 6080944 ATTATTGATACAGTT 6080958 Query 10 ATTGATACAGTTTCT 24 Strand=Plus/Plus ||||||||||||||| Sbjct 15870387 ATTGATACAGTTTCT 15870401

gi|51511747|ref|NC_000020.9|NC_000020 Homo sapiens chromosome 20, complete sequence Length = 62 435 964 Query 10 ATTGATACAGTTTCT 24 Strand=Plus/Minus ||||||||||||||| Sbjct 13523965 ATTGATACAGTTTCT 13523951 Query 13 GATACAGTTTCTGTA 27 Strand=Plus/Minus ||||||||||||||| Sbjct 19951129 GATACAGTTTCTGTA 19951115 Query 9 TATTGATACAGTTTC 23 Strand=Plus/Minus ||||||||||||||| Sbjct 22276698 TATTGATACAGTTTC 22276684

gi|51511727|ref|NC_000011.8|NC_000011 Homo sapiens chromosome 11, complete sequence Length = 134 452 384 Query 7 ATTATTGATACAGTT 21 Strand=Plus/Minus ||||||||||||||| Sbjct 6875270 ATTATTGATACAGTT 6875256 Query 17 CAGTTTCTGTACTAT 31 Strand=Plus/Plus ||||||||||||||| Sbjct 6942291 CAGTTTCTGTACTAT 6942305






Query 10 ATTGATACAGTTTCT 24 Strand=Plus/Plus ||||||||||||||| Sbjct 18431535 ATTGATACAGTTTCT 18431549

Búsqueda de homología en todas las bases de datos de todos los organismos GenBank_EMBL_BDJ_PDB con el fragmento de 35 bases de la la clona 6TcrM13 ____________________________________________________________ Con el fragmento 35 [Query: 1 AACGCTATTATTGATACAGTTTCTGTACTATATTG 35], se buscó en todas la secuencia en las bases de datos y organismos de GenBank, EMBL, BDJ, y PDB (3 740 965 secuencias; 16 531 947 686 bases), no se encontraron secuencias mayores de 18 bases.

BLASTN 2.2.13 [Nov-27-2005] Base de datos: Todas las secuencias de GenBank+EMBL+DDBJ+PDB (No buscado en EST, STS, GSS, muestras ambientales o fase 0, 1 o 2 secuencias HTGS) 3 740 965 secuencias; 16,531,947,686 bases

No se encontró similitude significativa.

Conclusiones _____________________________________________________________________________ Los hallazgos de secuencias relevantes en la genoteca de cADN’s de Tripanosoma cruzi, permitieron generar información que potencialmente pueden continuarse para encontrar posible cura para la enfermedad que causa el parásito y conocer aspectos particulares de la biología del paràsito y su filogenia.






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