reporte tinción de gram

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[ ]Introducción a la Biotecnología

RRESUMENESUMEN

El presente trabajo está hecho en miras de mostrar la identificación de bacterias por medio de la Tinción de Gram realizada en el laboratorio para dos tipos de bacterias (Pseudomona sp. y Saccharomyces cerevisiae), viendo el cómo la reacción de éstas al ser sometidas a ésta técnica nos da un color característico para cada una. Los reactivos de los cuales se hicieron uso para la realización de la tinción de Gram han sido la violeta de genciana como colorante inicial, la solución de yodo para acomplejar a éste, el alcohol para la decoloración y la safranina como contracolorante para la identificación de microorganismos Gram negativos, es de recalcar que se tuvo que haber tomado en cuenta el estado de los reactivos antes de la realización de la práctica, a manera de evitar discrepancias en los resultados. A continuación se muestra de manera objetiva los métodos utilizados y los resultados que se obtuvieron en cada etapa de la tinción (preparación y toma de muestra, tinción, enjuague, mordiente, decoloración, lavado y secado, tinción de contraste y el nuevo enjuague), y lo que se pudo observar en el microscopio para poder describir cuál de los dos tipos de organismo fue el que se obtuvo en cada lámina, Gram positivos ó Gram negativos, con la respectiva explicación y conclusión acerca de ello.

IINTRODUCCIÓNNTRODUCCIÓN

La tinción de Gram es usada para catalogar bacterias sobre la base de sus formas, morfologías celulares y reacción Gram (color). A nivel del laboratorio es útil como test para un rápido análisis presuntivo de agentes infecciosos, tanto en muestras como en cultivos en crecimiento. Las bacterias se tiñen Gram positivas, Gram negativas o no se tiñen debido a sus diferencias en la constitución de su pared y diseño celular.1

Las bacterias Gram positivas tienen una gruesa capa de péptidoglucano y gran cantidad de ácidos teicóicos que no son afectados por la decoloración con alcohol, manteniendo el colorante inicial

de su pared celular está intacta o dañada (por tratamientos antibióticos).

Las bacterias Gram negativas tienen en su pared celular una delgada capa de péptidoglucano ligada a una membrana externa por moléculas de lipopolisacáridos. Esta membrana externa es afectada por el alcohol de la decoloración, permitiendo que el primer colorante acomplejado con I2

escape y sea sustituido por el contracolorante que en la mayoría de casos es la safranina (Ver figura 1).2

2 Søgaard M., Nørgaard M., Schønheyder H.; 2007. "FIRST NOTIFICATION OF POSITIVE BLOOD CULTURES: HIGH ACCURACY OF THE GRAM STAIN REPORT”; Journal of clinical microbiology; European Society of Clinical Microbiology; Dinamarca; pags. 914-918.

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Figura 1: Diagrama de diferencias entre las Grampositivas y las Gramnegativas3

Esta importante coloración diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884, en miras a la identificación de microorganismos. En este método de tinción, la extensión bacteriana se cubre con solución de uno de los colorantes de violeta de genciana, que se deja actuar durante un lapso determinado. Se escurre luego el exceso de violeta de genciana y se añade luego una solución de yodo, que se deja durante el mismo tiempo que la anterior; después se lava la lámina con alcohol hasta que éste no arrastre más colorante. Sigue a tal tratamiento una coloración de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo Bismarck o verde de malaquita.4

Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, aún después de tratarlos con un decolorante, y el color no se modifica al añadir éste; otros pierden con facilidad el primer tinte, y toman el segundo. Los que fijan el violeta, se califican de Gram positivos, y los que pierden la primera coloración y retienen la segunda, de Gram negativos. Basándonos pues, en la reacción Gram, podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos. Los agentes más usados de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o de genciana, teniendo en cuenta que los colorantes de p-rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloración Gram.5

El colorante de violeta de genciana (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas). El I2 (mordiente) utilizado entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el colorante de violeta.6

El alcohol que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo I2-violeta de genciana. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen.

3 Tomado de la referencia (en línea) : http://www.biologycorner.com/resources/gram_bacteria.jpg. Consultado el Viernes 30 de abril del 2010.

4http://depa.pquim.unam.mx/amyd/archivero/2m.Tinciones_10880.pdf

5 Madigan, MT; Martinko J, Parker J; 2004; “BROCK BIOLOGY OF MICROORGANISMS; 10ª Edición; EE.UU.; Williams & Wilkins publications; pags. 87-90.

6 Ryan KJ and Ray CG. Sherris. Microbiología Médica. Una introducción a las enfermedades infecciosas. 4ta edición. Editorial Mc Graw Hill México, D.F. 2005.

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Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules.

Algunos detalles a considerar en la tinción son: * Se debe comprobar que no existen precipitados ni cristales en la solución de violeta de genciana. Si los hay, filtrar antes de su uso.

* La estabilidad de la solución de violeta de genciana, alcohol y la safranina básica es de 1 año y la de la solución de I2 de 6 meses, todas ellas conservadas en frascos cerrados a temperatura ambiente ya que la evaporación puede alterar su efectividad.

* Ciertas técnicas de laboratorio pueden alterar la interpretación microscópica de la tinción, como son la preparación de extensiones demasiado gruesas, uso de portas que no han sido prelavados o desengrasados, excesivo calentamiento en la etapa de fijación y lavados prolongados durante la tinción.

Todo lo anteriormente mencionado son causas comunes de pobres resultados en la tinción de Gram.

La safranina no es un elemento trascendental para la realización de la

práctica. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al término de la técnica, las Gram positivas se verán azul-violáceas y las Gram negativas, se verán rosas (si no se hizo la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina).7

La facultad de los microorganismos para tomar la coloración Gram no es propia de toda célula viviente, sino que se limita casi en su totalidad a los hongos y las bacterias (Ver figura 2). Los mohos se tiñen con cierta anormalidad; los gránulos de micelios tienden a mantener el colorante. La reacción de Gram no es irrefutable ni invariable; puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del entorno y otras causas varias.8

Figura 2: Cocos Grampositivos.

7 Brooks GF. Butel JS y Morse SA. Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. 17ª Edición. El Manual Moderno, México D.F. 2002.

8http://journals.cambridge.org/action/login;jsessionid=C04CB5C2473BA58D8D2AADFFF8AABFBB.tomcat1

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MMÉTODOSÉTODOS

Está práctica tiene dos partes bien definidas, una de preparación de los frotis bacterianos y la otra de tinción.

1. Preparación de la Muestra

La preparación de la muestra fue llevada a cabo por la instructora y consistía en un frotis de la bacteria Saccharomyces cerevisiae y otro de Pseudomona sp. Ambos colocados en un incubador en el área estéril del laboratorio.

Para entrar al área estéril necesitamos colocarnos un par de guantes, una mascarilla, una gabacha limpia y dos pares de zapatillas. Luego con dos portaobjetos debidamente desinfectados con una solución de alcohol al 95 % se ingresó al área estéril del laboratorio donde se encontraban los frotis de las bacterias. Luego de encender el mechero y desinfectar el área de trabajo con un mascón impregnado con la solución de alcohol, se procedió a tomar el asa, que fue flameada hasta observar un color rojo y luego se dejó enfriar cerca del área del mechero, para la extracción de la muestra de la caja petri cerca de la llama del mechero.

Figura 3: Preparación de la muestra.

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Primero se tomó la muestra del la Saccharomyces cerevisiae de la caja petri con el asa fría y con el cuidado de solo llevar muestra de la colonia de bacterias formada(ver figura 3). Y se colocó en una lámina portaobjetos con el asa, formando círculos sobre está y luego dejando que seque, siempre en el área de la llama del mechero. Cuando la muestra sobre la lámina portaobjetos se había secado con la ayuda del calor del mechero, se procedió a tomar la muestra de la Pseudomona sp. de la misma forma antes indicada.

2. Tinción Diferencial de Gram

Para determinar el tipo de bacteria, ya sea Grampositiva o Gramnegativa se procedió para cada bacteria dada de la siguiente forma:

Tinción: Los frotis fueron cubiertos con violeta de cristal o cristal de genciana durante un minuto. Luego de decantó el colorante sobre una cubeta plática.

Enjuague: Se enjuagó con agua destilada la lámina portaobjetos en una posición inclinada con el cuidado de que el chorro de agua no cayese directamente sobre los frotis, sino que se deslizara suavemente por entre ellos para quitar el resto de colorante.

Mordiente: Se cubrió con una solución de Lugol o mordiente de yodo durante un minuto, luego se decantó el reactivo en la cubeta.

Decoloración: Transcurrido el minuto se procedió a decolorar la muestra usando una pizeta con solución de alcohol 95%, de la misma manera como se hizo con el agua destilada y se detuvo la decoloración hasta

que no escurriera colorante por la parte baja del portaobjetos.

Lavado y secado: Luego se procedió a quitar el resto de decolorante con agua destilada (esto evita la excesiva decoloración o la remoción completa del complejo cristal violeta – Lugol de aquellas bacterias que son Grampositivas). Se esperó a que seque al aire libre para proceder con la tinción de safranina.

Tinción de contraste: Una vez seco el frotis procedimos a teñirlo con un colorante de contraste llamado safranina y se dejó actuar por 30 segundos.

Nuevo enjuague: Se enjuagó el frotis con agua destilada siguiendo las precauciones antes mencionadas en los enjuagues realizados y finalmente se dejó secar para su posterior observación en el microscopio.

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RRESULTADOSESULTADOS

Al observar por el microscopio se pudo notar una clara diferencia entre la coloración de las bacterias en cada lámina portaobjetos las de Saccharomyces cerevisiae presentaban una coloración fucsia, indicando que era una bacteria Grampositiva, es decir que su pared celular tiene una gruesa capa de peptidoglucano9, y al ser observadas en el microscopio se podía ver que eran de forma redonda y las aglomeraciones de bacterias en forma de cadenas (ver figura 4). Mientras que al observar las Pseudomona sp. la coloración era rosada-roja, indicando que era una bacteria Gramnegativa, que luego, al ser observada por el microscopio se notó la presencia de agar (medio de cultivo de la bacteria) y una que otra bacteria de forma bacilar, perteneciente a las Pseudomona sp. El que la prueba resultara negativa por la coloración de la safranina indica que la pared celular de la bacteria antes mencionada tiene una capa de lipopolisacarídica externa.

Figura 4: Grampositivas (izq.) y Gramnegativas (der.) después de la tinción.

Este tipo de tinción tiene importancia para poder determinar qué tipo de sustancias pueden ser antibióticos para estos microorganismos, ya que dichos antibióticos trabajan destruyendo la pared celular del agente patógeno y dejando el núcleo expuesto para la destrucción de la bacteria.

Así en el caso de las Pseudomona sp. se necesita un antibiótico que tenga una filiación a los tejidos liposos para poder destruir y penetrar la pared celular de la bacteria.

9 Ryan KJ and Ray CG. Sherris. Microbiología Médica. Una introducción a las enfermedades infecciosas. 4ta edición. Editorial Mc Graw Hill México, D.F. 2005.

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BIBLIOGRAFÍA

2; Søgaard M., Nørgaard M., Schønheyder H.; 2007. "FIRST NOTIFICATION OF POSITIVE BLOOD CULTURES: HIGH ACCURACY OF THE GRAM STAIN REPORT”; Journal of clinical microbiology; European Society of Clinical Microbiology; Dinamarca; pags. 914-918.

5; Madigan, MT; Martinko J, Parker J; 2004; “BROCK BIOLOGY OF MICROORGANISMS; 10ª Edición; EE.UU.; Williams & Wilkins publications; pags. 87-90.

6,9; Ryan KJ and Ray CG. Sherris. Microbiología Médica. Una introducción a las enfermedades infecciosas. 4ta edición. Editorial Mc Graw Hill México, D.F. 2005.

1,7; Brooks GF. Butel JS y Morse SA. Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y Adelberg. 17ª Edición. El Manual Moderno, México D.F. 2002.

Páginas de Internet consultadas:

4; http://depa.pquim.unam.mx/amyd/archivero/2m.Tinciones_10880.pdfConsultada el día Jueves 29 de Abril de 2010 a las 22:53 horas.

8;http://journals.cambridge.org/action/login;jsessionid=C04CB5C2473BA58D8D2AADFFF8AABFBB.tomcat1Consultada el día Viernes 30 de Abril de 2010 a las 19:35 horas.

3; http://www.biologycorner.com/resources/gram_bacteria.jpg.

Consultado el Viernes 30 de abril del 2010 a las 20:30 horas.

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