replicación del dna e introducción a la técnica de reacción en
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Replicación del DNA e introducción a la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Curso de Biología Molecular y Genómica,Instituto de Ciencias Biomédicas (ICBM),
Fac. de Medicina
Universidad de Chile
Dr. Juan Venegas Hermosilla
Enero, 2014
Introducción: componentes del ADN, los desoxirribonucleótidos (dNMPs).
Fig.1. Se distinguen dos tipos: a) de un anillo = pirimídicas (C y T),
b) de dos anillos = púricas (A y G).
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Estructura de la doble héliceLa molécula de ADN (ácidodesoxirribonucleico) es el modelogenético de cada célula y, en últimainstancia, lo que determina todos losaspectos de un ser vivo. La moléculade ADN fue descubierta en 1951 porJames Watson, Francis Crick yMaurice Wilkins empleando latécnica de difracción de los rayos X.En 1953, Watson (izquierda) yFrancis Crick (derecha) describieronla estructura en doble hélice de lamolécula de ADN como una especiede escalera de caracol con muchosescalones. En 1962 ambos recibieronel Premio Nobel de Medicina por sutrabajo.
Fig. 2.
La estructura de la doble hélice descrita por Watson y Crick en 1953, tiene las siguientes características:
• La unión de dos desoxirribonucleótidos se realiza vía un ENLACE FOSFODIESTER en el cual esta involucrado el oxígeno del carbono 3´ de la desoxirribosa de un dNMP, con el oxígeno del carbono 5´ del siguiente dNMP, unidos vía un grupo fosfato. Tal como se ve en la fig. 3.
• Este hecho da origen a una molécula POLAR. Es decir, que tiene un determinado SENTIDO, caracterizado por un extremo 5´ y un extremo 3´.
Fig. 3.
Hebra de DNA 5´-ATG-3´o simplemente ATG
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La molécula de ADN estaba formada por dos hebras ANTIPARALELAS.
Eso quiere decir que una de las hebras estaba en el sentido 5´- 3´ y la otra en el sentido inverso, tal como se muestra en la Figura.
Fig. 4
F1
Entre las hebras antiparalelas del ADN doble hebra, hay COMPLEMENTARIDAD
DE BASES NITROGENADAS, (Fig.5).
Eso implica que: siempre cuando en una hebra había una timina (T) en la otra hebra había una adenina (A), y vise-versa.En cambio, cuando en una hebra había una citosina (C), en la otra había una guanina (G).-Además, la unión de una T con un A era a través de DOS puentes hidrógenos, en cambio, la unión de una C con una A, era a través de TRES puente hidrógenos. ¿en que afecta esto la estabilidad de la doble hélice?.
Diapositiva 5
F1 Fcoinhell, 04-11-2012
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En la doble hélice los enlaces fosfodiester forman un esqueleto de azúcar-fosfato
helicoidal, que queda hacia el exterior de la molécula.
Fig. 6
En cambio, las bases nitrogenadas quedan hacia adentro formando especie de escalones
De la información anterior:¿Qué se podría inferir con respecto a como podría ser la
duplicación o replicación de esta molécula?
-La COMPLEMENTARIDAD de bases nitrogenadas sugería que una hebra podía ser el MOLDE O MATRIZ de la otra (Fig. 6).
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Hebra molde (matriz o parental) y hebra hija
Fig. 7. La doble hélice de Watson y Crick, sugería que la molécula de DNA que surgía de la duplicación (la nueva doble hélice) estaba constituida por una hebra parental (antigua) y una hebra hija complementaria (nueva) Esto sugería que la duplicación del DNA era SEMICONSERVATIVA.
Los científicos que demostraron que efectivamente era así, fueron Meselson y Stahl.
Experimento de Meselson y Stahl (1957).a) Cultivó bacterias por varias generaciones en presencia del isótopo pesado 15N. Aisló el DNA y lo centrifugo. Todo el DNA aparece cerca del fondo del tubo.
b) Posteriormente, trasladó las bacterias a un medio de cultivo con 14N, dejó que se originara una primera generación de ellas. Aisló y centrifugó el DNA, encontró que el DNA se encontraba en una zona intermedia del tubo.
c) En una segunda generación de estas bacterias, al aislar y centrifugar el DNA, encontró dos zonas donde sedimento el DNA.
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Con el experimento de Meselson y Stahl, se demostró que la replicación era semi-conservativa , pero surgía una nueva pregunta:
• ¿En que dirección o sentido se realizaba la síntesis de las hebras hijas?.
¿Cuál seria entonces el sentido (dirección) de la síntesis de la hebra
hija?.
• La respuesta a esta pregunta vino de los estudios de Reiji Okazaki (1960), analizando la incorporación de timidina tritiada (timidina marcada con el isótopo tritium, 13H) en la replicación del DNA cromosomal de la bacteria Escherichia coli .
• Con estos estudios él demostró que la síntesis de las hebras hijas era en el sentido 5´- 3´, que además, una de las hebras se sintetizaba en forma discontinua (a los que posteriormente se le llamaron “Fragmentos de Okazaki) y la otra en forma continua .
• Es decir, que la replicación del DNA es también SEMI-DISCONTINUA.
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Resultados de los estudios de Okazaki: replicación SEMIDISCONTINUA
• Esto implica que hay una hebra “líder” (continua) y una hebra retrazada (discontinua).
• De este modelo surge el concepto de “horquilla de replicación” = vértice donde se va abriendo la doble hélice.
• Nótese que la dirección del avance de la horquilla no es igual a la dirección de la síntesis de la hebra retrazada.
Sin embargo, todavía quedaban mas preguntas por contestar, entre ellas:
• ¿Dónde se iniciaba la replicación del DNA, en sitios al azar o en algún sitio especifico?
• Si se iniciaba en un sitio especifico u ORIGEN DE REPLICACION: ¿ esta seria en una sola dirección (unidireccional) o ambas direcciones (direccional) ?.
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Comienza en un origen y es usualmente bidireccional: Experimentos de John Cairns
Este experimento confirmó además que la síntesis de ambas hebras era simultánea y que se generaba una estructura que sería llamada “burbuja de replicación”.
Lehninger, pag. 951, IV Ed. 2005
La burbuja de replicación
• Los resultados de los experimentos anteriores indican que en la replicación del DNA se produce una estructura que se llama “burbuja de replicación” (ver fig.anexa).
• En esta estructura hay dos horquillas de replicación , que avanzan en sentidos opuestos.
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La burbuja de replicación: avance bidireccional de las orquillas.
Resumiendo hasta aquí: las características generales de la
replicación del DNA (doble hélice) son:
- Semiconservativa- Semidiscontinua- Comienza en un origen y es usualmente
bidireccional- La síntesis de las hebras hijas es en la
dirección (sentido) 5´-3´.
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Bases moleculares de la replicación del DNA
Estudios realizados en la bacteria Escherichia coli (Arthur Kornberg).
• DNA cromosomal de la E.coli: doble hebra circular cerrado.• Secuenciado completamente en 1997 (Science 277 (5331) :1453-1462), cepa K-12,
tiene una longitud de 4.639.221 pares de bases (pb) y codificaría para 4288 proteínas.
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Características del origen de replicación u oriC.
- HU y IHF = proteínas tipo histona que ayudan a la unión de la proteína DnaA a la doble hebra en el oriC.
Formación de complejo pre-elongación.
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Necesidad de unión de una TOPOISOMERASA para relajar la tensión producida por la abertura de la doble hélice.
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Síntesis de los RNA partidores (“primers” o cebadores) por la
Primasa.
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Elongación de los partidores por la DNA polimerasa III de E. coli, tanto en la hebra líder como en la hebra retrazada.
Características generales de las DNA polimerasas:
1.Requieren una hebra de DNA molde (templado o matriz).
2. Necesitan un partidor (primer).
3. Utilizan un desoxirribonucleótido trifosfato (d-ATP, d-GTP, d-CTP y d-TTP
4. Polimerizan en sentido 5’ a 3’, adicionando nucleótidos al extremo 3’libre.
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Reacción catalizada por todas las DNA polimerasa
Además, en E. coli todas las DNA polimerasas poseen una actividad
correctora llamada exo 3´-5´.
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Las tres DNA pol. de E. coli
Estructura general de las DNA polimerasas: forma de una mano derecha (modelo de la
pol I de E. coli)
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Subunidades de la DNA polimerasa III de E. coli (la pol replicadora)
Estructura de un dímero de la DNA polimerasa III de E. coli
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Volviendo a la horquilla de replicación:
Dímero de la pol III cuando esta sintetizando simultáneamente la hebra líder y la hebra retrazada.
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Remoción de los partidores y ligamiento de los fragmentos de
Okazaki.
Función de la topoisomerasa IV para separar los dos DNA duplex replicados
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Fin de esta primera parte.
Suplemento:
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Deoxyribonucleotides and ribonucleotides of nucleic acids
Watson-Crick model for the structure of DNA.
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Comparison of A, B and Z forms of DNA