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Recomendaciones ISFG en la

interpretacin de mezclas Lourdes Prieto Grupo de Medicina Xenmica. Instituto de Ciencias Forenses. Universidade de Santiago de Compostela

Interpretacin de perfiles mezcla

Introduccin

Etapas en la interpretacin de una mezcla:

Identificacin de la presencia de una mezcla

Asignacin de alelos

Determinacin del nmero de contribuyentes

Posibles combinaciones de genotipos

Comparacin con muestras de referencia

Clculo del LR

Perfiles LL-DNA

Introduccin

Elementos en la interpretacin de mezclas

PRINCIPIOS

(teora)

PROTOCOLOS

(Validacin)

PCTICA (entrenamiento

y experiencia)

Recomendaciones ISFG y

publicaciones

Vuestros protocolos

En vuestro laboratorio:

Consistencia entre

analistas

Introduccin

Qu es la ISFG? Organizacin internacional responsable de la promocin del

conocimiento cientfico en al campo forense

Fundada en 1968, miembros de 60 pases

Regularmente se forman comisiones de ADN compuestas por expertos que se renen para emitir recomendaciones

http://www.isfg.org/

Introduccin

ISFG DNA commissions: DNA polymorphisms (1989)

PCR based polymorphisms (1992)

Naming variant alleles (1994)

Repeat nomenclature (1997)

Mitochondrial DNA (2000)

Y-STR use in forensic analysis (2001)

Additional Y-STRs - nomenclature (2006)

Mixture Interpretation (2006)

Disaster Victim Identification (2007)

Biostatistics for Parentage Analysis (2007)

Non-human DNA (2011)

Low level DNA (2012)

Mitochondrial DNA (2014)

Introduccin


Introduccin



Asignacin de alelos




Clculo del LR

Perfiles LLDNA

Etapas en la interpretacin de una mezcla

1 Identificacin de la presencia de una mezcla

2 Asignacin de alelos

3 Identificacin del nmero potencial de contribuyentes

4 Consideracin de todas las combinaciones de genotipos posibles

5 Comparacin con las muestras de referencia

Clayton et al., For.Sci. Int. 1998, 91: 55-70


Presencia de ms de dos alelos en, al menos, dos loci. Excepciones: duplicaciones, trisomas y mosaicismos

Tener en cuenta si las diferencias de altura entre picos son mayores al 60%: Normalmente, en perfiles individuales, los heterocigotos presentan reas o

alturas relativas de mas del 60% (un alelo respecto al otro)

Si existe desequilibrio de heterocigotos puede ser una mezcla

Excepciones: mutaciones en zona de anillamiento de uno de los primers

Aparecen los stutters demasiado altos? Si los stutters estn por encima del 15-20% puede ser una mezcla

Excepciones: efectos estocsticos por low level DNA, mutaciones somticas


Clayton et al. (2004), A genetic basis for anomalous band patterns encountered during DNA STR profiling. J. For. Sci. 49 (6): 1207-1214

Patrones triallicos

Tipo 1: La suma de las alturas de

dos de los picos es igual al tercero

(comn en D18S51)

Tipo 2: Alturas de pico

equilibradas (comn en TPOX y

D21S11)

Patrones triallicos

Tipo 1: Suelen ser el resultado de una mutacin somtica en un locus heterocigoto durante el desarrollo del individuo.

Se produce una quimera con algunas clulas con el alelo

original y otras con el mutado.

Tipo 2: Suelen ser el resultado de un evento de duplicacin localizado, de una aneuploida cromosmica o de

reordenamientos cromosmicos



Estudios tericos sobre la posibilidad de mezclas con un mximo de dos alelos por

marcador (Gill et al., 1998, Ninth International Symposium on Human

Identification. N = 212.000, slo 4 mezclas mostraron 1 o 2 alelos para los 6 loci,

pero la mezcla puede sospecharse por el desequilibrio de heterocigotos)

Nmero de alelos para 6 loci en mezclas de dos contribuyentes


La cantidad de ADN influye en la deteccin de mezclas

Una mezcla slo puede detectarse si el componente minoritario est

por encima del ruido de fondo

Normalmente el umbral es 1:10

Problemtica de las cuantificaciones: no selectiva, cuantificacin en

conjunto de la mezcla y por tanto la cuantificacin del ADN del

contribuyente minoritario en mezclas desequilibradas est sobre-

estimada


Drop-out a bajas

concentraciones debido a

efectos estocsticos

Mezcla 1:1 a diferentes

cantidades de ADN

1ng

0,3ng

0,1ng


Mezcla anterior pero 1:3, a

diferentes cantidades de

ADN

1ng

0,3ng

0,1ng

Drop-out a bajas

concentraciones debido a

efectos estocsticos

El efecto es ms acusado en

el perfil minoritario

Criterios de evaluacin en general:

Tipo de muestra (ej. Resto seo)

es lgico encontrarnos una mezcla en la muestra que se est

analizando?:

Tener en cuenta dnde estaba asentada la muestra (ej.: picaporte)

Tener en cuenta el tipo de delito (Ej.: agresin sexual, reyerta)

Tener en cuenta otra informacin adicional (persona transfundida)

Valorar los resultados de Quantifiler Duo/Trio y amelogenina (slo en

mezclas hombre-mujer)



Perfil individual

Posible mezcla

ISFG recomienda >60%

cuando DNA > 500pg

En muestras LL-DNA los

heterocigotos pueden aparecer


Introduccin



Asignacin de alelos




Clculo del LR

Perfiles LLDNA

Asignacin allica

Los lmites de deteccin nos orientan: qu es un alelo real?

qu es un heterocigoto real?

qu es un stutter?

Seal 3 veces superior a la

desviacin std del ruido

Equilibrio de

heterocigotos

Tpicamente >60%

Stutters por debajo del

15%

Asignacin allica

Determinacin de un pico como un alelo real:

Muchos labs usan Picos reproducibles con alturas superiores a 50 rfu

Bajo ruido en la lnea base

Nmero de ciclos en la PCR recomendado por el kit

Tamao coincidente con ladder (0.5bp)

La mayora de artefactos se identifican fcilmente

Pull ups, dye blobs, etc

Pero los stutters son productos allicos, por lo que su

identificacin como artefactos es ms complicada:

Los stutters asociados al perfil mayoritario pueden ser equivalentes a la

altura del perfil minoritario y por tanto ser indistinguibles

Asignacin allica: stutters

Determinacin de stutters n-4:

Normalmente, el 5-15% del alelo real en loci STR tetranucleotdicos

n-4

stutter

product

Delecin causada por slippage en

la hebra copiada (abajo)

GATA GATA GATA

CTAT CTAT CTAT 3

5

1 2 3

CTAT CTAT

5 6

1 2 3

GATA

5

4

C T A

T

Alelo real (tetranucleotide repeat)


Determinacin de stutters n+4:

Ocurre menos frecuentemente (


Stutters n+4pb:

Su presencia est relacionada con el exceso de muestra en la PCR

Generalmente representan el 4% del alelo progenitor


El porcentaje de stutter puede variar en

los siguientes dos casos:

Muestras low level DNA

Exceso de ADN

Determinacin de stutters:

Un alelo real puede encontrarse en posicin

stutter

En caso de duda, considerarlo como un alelo real

e incluirlo en la valoracin estadstica


Stutter elevado o mezcla de dos componentes?

Mezcla 1:3

29-30 y 28-30

Mezcla 10:1

29-30 y 28-30

En muchas ocasiones no tenemos criterio para decidir si un pico en posicin

stutter es realmente un stutter, o un alelo, o una mezcla de ambos

Asignacin allica: Hb

Equilibrio de heterocigotos En perfiles individuales Hb>60% Identifiler, 1ngr ADN, 28 ciclos

Asignacin allica: Hb

Hb>60% no se cumple en muestras con escaso contenido en ADN

FGA-22 FGA-25 Hb Media

1692 1517 0,90

0,69

(0,23) 1915 864 0,45

1239 909 0,73


992 260 0,26

0,49

(0,36) 1422 419 0,29

895 805 0,90


- 66 0

0,37

(0,32) 54 107 0,50

130 219 0,59

John Butler


Introduccin



Asignacin de alelos




Clculo del LR

Perfiles LLDNA


En general:

Si no hay ms de 4 alelos por locus: al menos dos contribuyentes

Si no hay ms de 6 alelos por locus: al menos tres contribuyentes

Si hay ms de 6 alelos por locus: no se puede determinar el nmero de

contribuyentes

Atencin a mezclas formadas por individuos emparentados:

Dos contribuyentes y ningn locus con ms de 3 alelos

Pero puede que el fiscal o la defensa nos

propongan otro n de contribuyentes


El nmero de alelos observados por locus depende del nivel de heterocigosidad y polimorfismo del propio marcador

Nmero de alelos observados en mezclas formadas por dos contribuyentes

Buckelton et al. (2007), Towards understanding the effect of uncertainty in the number of contributors to

DNA stains. FSI:Genetics 1: 20-28


Introduccin



Asignacin de alelos




Clculo del LR

Perfiles LLDNA


Dos posibles abordajes:

Contemplar todas las posibilidades: unconstrained conditional method (ISFG,

2006) o unrestricted method (SWGDAM, 2010)

Contemplar slo las combinaciones ms probables: constrained conditional

method (ISFG 2006) o restrictedd method (SWGDAM 2010)

Si se contemplan slo las combinaciones ms probables es necesario separar los componentes de la mezcla: deconvolution

Podemos realizar esta tarea con distintas metodologas manuales o con la ayuda de software: M. Bill et al. Forensic Sci. Int. 148 (2005) 181189 (Pendulum)

P. Gill et al. Forensic Sci. Int. 91 (1998) 4153

T. Clayton et al. Forensic Sci. Int. 91 (1998) 5570

M.W. Perlin et al. Am. J.Hum.Genet. 57 (1995) 11991210.

M.W. Perlin et al. J. Forensic Sci. 46 (6) (2001) 13721377


Mezclas de dos contribuyentes sin restricciones

4 alelos

A-B C-D

A-C B-D

A-D B-C

C-D A-B

B-D A-C

B-C A-D

3 alelos

A-A B-C

B-B A-C

C-C A-B

A-B A-C

B-C A-C

A-B B-C

B-C A-A

A-C B-B

A-B C-C

A-C A-B

A-C B-C

B-C A-B

2 alelos

A-B A-B

A-A A-B

A-A B-B

A-B B-B

A-B A-A

B-B A-A

B-B A-B

(Clayton et al., For. Sci. Int. 1998; 91: 55-70)

En azul: combinacin recproca


Introduccin



Asignacin de alelos




Clculo del LR

Perfiles LLDNA


En este momento es cuando se debe comparar el perfil mezcla con

las muestras de referencia. No hacerlo con anterioridad (si no se

va a utilizar LR semicontnuo)

Muestras de referencia

hay sospechoso?:

Algunos laboratorios no analizan si no hay sospechoso

Es til analizar para comparar con la base de datos nacional

hay vctima?:

Puede ser til para eliminar su contribucin allica

Si los contribuyentes estn muy desequilibrados suele ser muy til


Introduccin



Asignacin de alelos




Clculo del LR

Perfiles LLDNA

Clculo del LR

Establecimiento de las hiptesis:

Dos contribuyentes:

Hp: la mezcla procede de la vctima y el sospechoso

Hd: la mezcla procede de la vctima y otro individuo al azar de

la poblacin de inters no emparentado con el sospechoso

Formulacin del LR:

Marcadores con 1 slo alelo

Marcadores con 2 alelos



High template DNA:

Sin drop-out

Sin drop-in

Clculo del LR

1 alelo

a

LOD

Evidencia

a

Sospechoso

a

Vctima

LR=Pr(|)

Pr(|)=Pr(|+)

Pr(|+)

: (| + )=1 Porque la probabilidad de obtener esa mezcla de alelos

si la muestra es una mezcla entre el ADN de la vctima

y del sospechoso es 1

: (| +U) Un donante desconocido debe explicar los alelos de la mezcla que no son explicados por

la vctima, y no debe mostrar alelos que no aparezcan en la mezcla

En este caso, el nico posible genotipo del donante

desconocido es: a-a (fa)2

LR = 1 / (fa)2

Clculo del LR

2 alelos

a

Sospechoso

a

Vctima

LR=Pr(|)

Pr(|)=Pr(|+)

Pr(|+)




: (| +U) Posibles genotipos del donante desconocido:

ab 2 fa fb

bb fb2

LR = 1 / 2 fa fb + (fb)2

a

LOD

Evidencia

b

b

Clculo del LR

3 alelos

LR=Pr(|)

Pr(|)=Pr(|+)

Pr(|+)





ab 2 fa fb

ac 2 fb fc

bb fb2

LR = 1 / 2 fa fb + 2 fb fc + (fb)2

a

Sospechoso

b

a

LOD

Evidencia

b c

a

Vctima

c

Clculo del LR

4 alelos

LR=Pr(|)

Pr(|)=Pr(|+)

Pr(|+)

: (| + )=1 Porque la probabilidad de obtener esa mezcla de

alelos si la muestra es una mezcla entre el ADN

de la vctima y del sospechoso es 1


ab 2 fa fb

LR = 1 / 2 fa fb

a

Sospechoso

b c

Vctima

d

a

LOD

Evidencia

b c d


Introduccin



Asignacin de alelos




Clculo del LR

Perfiles LLDNA

Perfiles LLDNA (LTDNA)

High template DNA

Los epgs reflejan la composicin de la muestra

No drop-out

No drop-in

Hb0.6

Low Level DNA

Los epgs no reflejan la composicin de la muestra:

Drop-out

Drop-in

Stutters

Hb

Cantidad limitada de ADN

Puede ocurrir drop-out y drop-in

El perfil de ADN puede no representar de forma precisa los perfiles de la(s) personas que depositaron la

muestra Interpretado de forma diferente bajo las hiptesis de la defensa

y del fiscal

QU ES UN PERFIL LOW LEVEL-DNA ?

Efectos estocsticos: qu son?

Supongamos que tenemos un extracto de ADN con

volumen = 50 ul que contiene el ADN de slo 7 clulas

Supongamos que el donante es heterocigoto

Habr 7 copias del alelo A y otras 7 del alelo B.

Tomamos una alcuota de 25uL

Cuntos alelos habremos cogido?

Peter Gill

Efectos estocsticos: qu son?

Si repitiramos la operacin infinitas veces obtendramos los siguientes resultados:

Peter Gill

Efectos estocsticos: qu son? Tras la extraccin: tomamos una alcuota para cuantificar otra para diluir otra para la PCR

La PCR no es 100% eficaz, pero esto tiene menos efecto que la toma de alcuotas

Todo esto da lugar a diferentes resultados:

Peter Gill

Efectos estocsticos: cmo influyen?

Los efectos estocsticos producen: Drop-out de loci: no se observan alelos en un locus

Desequilibrio de heterocigotos (diferencias en la altura de los dos

alelos de un heterocigoto)

Drop-out allico: no se observa uno de los alelos en un heterocigoto (es el desequilibrio llevado al extremo)

Aumento de stutters: el porcentaje (en altura o rea) respecto al alelo real est incrementado

Drop-in allico: 1 o 2 alelos extra procedentes del ambiente del lab, de reactivos o de plsticos

Diferencias entre duplicados de la misma muestra, debido a: Diferencias en el nmero de molculas de partida en los replicados Diferencias inducidas por la variabilidad en la PCR

Se necesita un marco de interpretacin que pueda aplicarse a todos los tipos de muestras: High template DNA

Low template: incertidumbre sobre la composicin de la muestra debido a los efectos estocsticos

Efectos estocsticos: cmo influyen

en la interpretacin?

Los expertos pueden formular proposiciones que sern

evaluadas dentro del marco del LR

Veremos cmo se puede modificar la aproximacin clsica del

LR para tener en cuenta los datos inciertos debidos a

condiciones LL-DNA

LR binario

Inclusin: Match

LR = 1/2(freq10)(freq14)

Suspect Evidence

Exclusin: No match

LR = 0/2(freq11)(freq11.3)

Evidence Suspect

En las prximas diapositivas veremos que

Si usamos LR no es necesario decidir exclusin / inclusin

NO ES NECESARIO QUE LAS MUESTRAS DE REFERENCIA Y LA MEZCLA COINCIDAN EN TODOS LOS ALELOS

Gill and Buckleton, A universal strategy to interpret DNA profiles that does not require a definition of low-copy-

number, FSI Genet. 4 (2010) 221-227

Nuevas recomendaciones ISFG (2012) sobre low level DNA

LR binario

Pero que ocurre cuando tenemos dudas?

Lo que hacemos habitualmente es intentar anlisis adicionales (minis, otros kits, etc)

Eliminar un marcador dudoso de un perfil es un error (es como si el LR = 1 para ese marcador)

Cual es el valor del LR en esta situacin?

Evidence Suspect

LR binario

Hasta ahora, este tipo de resultados se trataban de la siguiente forma:

Sospechoso 10-14

Mancha 14-14

Ninguno de estos mtodos tiene en cuenta la NO coincidencia en el numerador, se contina asumiendo que hay match bajo Hp

Buckleton et al., 2006 ha demostrado que la regla 2p no es siempre conservadora (no siempre est a favor de la defensa)

Regla 2p

LR = 1/2fr(14)

LR = 1 / 2fr(14)fr(1-14) +

fr(14)2

Evidence Suspect

Este hallazgo no es neutral (LR 1)

En casos de parentesco no eliminamos el marcador que no es

compatible, contemplamos la posibilidad de mutacin

Hoy en da se pueden incorporar otro tipo de probabilidades en el

LR: probabilidad de drop-out, de drop-in, etc. (el numerador del

LR ya no ser 1 0, sino un nmero entre 0 y 1)

Clculo de LRs en

muestras

problemticas

Evidence Suspect

ISFG recommendations 2012

Desde el punto de vista del fiscal (Hp) esta situacin slo puede

explicarse si el alelo b ha sufrido drop-out y el alelo a no ha sufrido drop-

out. No hay drop-in.

Podemos calcular la probabilidad de que esto ocurra

No hay necesidad de definir exclusin / inclusin

SOSPECHOSO = ab

EVIDENCIA = aa

MATCH?

Clculo de LRs en muestras problemticas


Definiciones para drop-out: Probabilidad de drop-out en heterocigotos: d

La probabilidad de que ambos alelos sufran drop-out ser d2

Probabilidad de drop-out en homocigotos: D D d2 pero los consideraremos iguales

Definiciones para no drop-out: En heterocigotos: 1 d

La probabilidad de que ninguno de los dos alelos sufra drop-out ser (1-d2)

En homocigotos: 1 - D Definiciones para drop-in y no drop-in: Probabilidad de drop-in: c, pero siempre multiplicada por la

frecuencia del alelo que consideramos que es drop-in. Probabilidad de no drop-in: 1 - c

Hp: el perfil de la evidencia procede el sospechoso, dando por hecho que no hay drop-in (PrC=0):

El alelo a no ha sufrido drop-out: 1 - d

El alelo b ha sufrido drop-out: d

(1 d) * d

Clculo de LRs en muestras problemticas: ejemplo sin

considerar drop-in (Caso B de Haned et al., 2012)

suspect evidence

d = prob. de que un alelo

sufra drop-out

Hd: el perfil procede de otro (no hay drop-in). Posibilidades: Si el otro es aa:

Los aa aparecen en la poblacin con frecuencia a2

No ha ocurrido drop-out en ninguno de los dos alelos: 1 d2

Si el otro es aQ, siendo Q cualquier alelo excepto a

(es decir su frecuencia es 1-fa): Los aQ aparecen en la poblacin con frecuencia

2a(1-a) El alelo a no ha sufrido drop-out: 1- d El alelo Q ha sufrido drop-out: d

SOSPECHOSO = ab

EVIDENCIA = aa

aa

No drop-out

aQ

No drop-out de a

Drop-out de Q

Clculo de LRs en muestras problemticas: ejemplo sin considerar

drop-in (Caso B de Haned et al., 2012)

Hp: la evidencia procede el sospechoso:

Hd: la evidencia procede de otro:

SOSPECHOSO = ab

EVIDENCIA = aa

aa

No drop-out

aQ

No drop-out de a

Drop-out de Q +


(1 d) * d

fa2 (1 - d2) + 2faf(1-a) (1 d) d

Gill and Buckleton, FSI Genet. 4 (2010) 221-227

Suspect

Crime stain Match??

No dropout Drop-inDrop-out

Suspect

Crime stain Match??


Suspect

Crime stain Match??


SOSPECHOSO = ab

EVIDENCIA = ax

Desde el punto de vista del fiscal (Hp) esta situacin slo puede

explicarse si el alelo b ha sufrido drop-out y el alelo x es un drop-in

Podemos calcular la probabilidad de que esto ocurra

No hay necesidad de definir exclusin / inclusin


Hp: el perfil procede el sospechoso: El alelo a no ha sufrido drop-out: 1 d

El alelo b ha sufrido drop-out: d

El alelo x es un drop-in: c fx

Hd: el perfil procede de otro al azar no relacionado Si el otro es ab

Si el otro es ax

Si el otro es aa

Si el otro es xx

Si el otro es aQ

Si el otros es xQ

Si el otro es QQ

Si el otro es QQ

SOSPECHOSO = ab

EVIDENCIA = ax

Suspect

Crime stain Match??


Suspect

Crime stain Match??


Suspect

Crime stain Match??



En LRs binarios, los analistas se ven forzados a tomar decisiones

subjetivas sobre los alelos por debajo del umbral.

ALLELE 13 IS

PRESENT

ALLELE 13 IS

NOT

PRESENT

LETS

USE

LRMIX!!

En el mtodo semi-continuo, que tiene en cuenta la probabilidad

de drop-out, no es necesario tomar decisiones arbitrarias,

evitando la subjetividad y promocionando as la estandarizacin

de resultados.

recomendaciones isfg en la interpretación de mezclasfamilias.name/01-recomendaciones...

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