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RECOMENDACIONES GENERALES
1.-La hora de entrada tendrá 5 minutos de tolerancia, después de este
tiempo, no se permitirá al acceso al laboratorio
2.-Al entrar al laboratorio, el alumno deberá ponerse la bata y abotonarla
completamente, sólo podrá quitársela al salir de éste.
3.- Las mesas deberán estar siempre limpias y desocupadas, las mochilas
deberán ser colocadas donde se le indique.
4.- No comer ni fumar en el laboratorio, no introducirse ningún objeto a la
boca.
5.- Recogerse el pelo para efectuar el trabajo de laboratorio. 6.- Limpiar y desinfectar el área de trabajo antes y después de usarla.
7.- No pasear entre las mesas del laboratorio, el trabajo deberá efectuarse
sentado y en su equipo de trabajo.
8.-Hablar sólo lo necesario con los compañeros. 9.- Días antes de iniciar la práctica lea cuidadosamente que es lo que se va a
realizar, si no entiende pregunte al profesor.
10.- Si hay necesidad de llevar material biológico para la realización de la práctica, es necesario conseguirlo de lo contrario la práctica se suspenderá
para todo el equipo.
11.- El asa utilizada para el cultivo de microorganismos deberá esterilizarse en la flama del mechero, antes y después de su uso.
12.-Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra.
13.-En caso de derramar material que contenga microorganismos, cúbralo con fenol o benzal y deje actuar diez minutos y de aviso al profesor.
14.- Todo el material que se va a incubar o desechar, debe colocarse en el
sitio indicado por el profesor. 15.-Etiquete todo el material que va a incubar con los siguientes datos:
equipo, grupo, fecha, nombre del material e iniciales del nombre del alumno.
16.- Después de la incubación es necesario la esterilización del material para
eliminar microorganismos que pudieran hacernos daño a nuestra salud. 17.- Lávese las manos con agua y jabón antes de salir del laboratorio.
18.- Es obligación de cada equipo entregar todo el material limpio.
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MONTAJE DE PREPARACIONES FRESCAS Y TEMPORALES
Fecha____________________________
ANTECEDENTES
Para poder observar al microscopio células, tejidos animales o vegetales y
microorganismos es necesario hacer preparaciones sobre portaobjetos. Hacer una preparación consiste por lo tanto en colocar y extender el tejido o
la muestra sobre un portaobjetos, cubriéndolo después con un cubreobjetos.
Las preparaciones pueden ser temporales, frescas y permanentes. Las primeras son aquellas que solo se van a utilizar durante la práctica, unos
días; las frescas se usan solo durante la práctica y posteriormente se lavan. Y
las permanentes son aquellas preparaciones que duran “para siempre”, por
lo que deben hacerse con un material especial (bálsamo de Canadá) para que el cubre-objetos permanezca perfectamente adherido al porta-objetos,
durante años.
OBJETIVOS:
• Aprender a montar preparaciones frescas y temporales.
MATERIAL:
• Portaobjetos
• Cubreobjetos • Aguja de disección
• Agua de charco
• Moho de pan, de tortilla o de cualquier fruta • Tejidos meristemáticos
• Solución fisiológica
• Barniz de uñas.
• Bálsamo de Canadá
PROCEDIMIENTO:
• Para hacer preparaciones frescas, simplemente coloca un corte muy
delgado de tejido meristemáticos, una gota de agua de charco o una muestra
pequeña de moho (extendida con la aguja de disección) sobre el portaobjetos. • Si el material utilizado es moho o tejidos meristemáticos, coloca sobre tu
muestra una gota de agua o solución fisiológica.
• Cubre tu muestra con el cubreobjetos dejándolo caer suavemente para que no haga burbujas. Observa la figura:
A) Células vegetales (Epidermis de cebolla)
1. Se corta la cebolla por la mitad y se separa una de las capas de la
misma.
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2. Marca con el bisturí o con las tijeras una cuadrícula de pequeño
tamaño (1 cm de lado) en la parte interna o cóncava de la capa.
3. Separa el fragmento de epidermis con las pinzas y colócalo en el centro del portaobjetos.
4. Coloca el portaobjeto en la placa de Petri, añade unas gotas de
colorante sobre la muestra y déjalo actuar durante cinco minutos.
5. Lava con cuidado el exceso de colorante y sécalo con un poco de papel de filtro.
6. Añade una gota de agua a la muestra.
7. Coloca el cubre apoyándolo por un lado y dejándolo caer para que no queden burbujas.
8. Observa la preparación al microscopio, utilizando varios objetivos,
realiza un dibujo detallado de las células e indica el aumento del mismo. B) Células animales (Epitelio de la mucosa bucal)
1. Raspa suavemente el interior del carrillo con las pinzas o con un palillo
(siempre por la parte roma, procurando no cortarse). Coloca la mucosa blanca que se obtiene en el portaobjetos.
2. Realiza una extensión (frotis) deslizando el borde de un porta sobre el
que tiene la muestra.
3. Calienta suavemente con el mechero (¡que no llegue a quemar!) la parte inferior del porta que contiene la mucosa.
4. El resto del procedimiento es idéntico al de la epidermis de cebolla.
• Esta preparación está lista para que hagas observaciones microscópicas.
Su duración es de aproximadamente una hora ya que al evaporarse el agua
con el calor de la lámpara del microscopio, las células o los organismos morirán.
• Para hacer preparaciones temporales, coloca un corte o una muestra sobre
el portaobjetos y añade agua o colorante según se te indique. Cubre tu muestra con el cubreobjetos dejándolo caer suavemente para que
no haga burbujas; con un pincel de barniz de uñas cubre los cuatro lados del
cubreobjetos, déjalo secar y tendrás una preparación temporal.
• Esta preparación está lista para que hagas observaciones microscópicas. Su duración es de aproximadamente de un mes o mas dependiendo de la
muestra.
Esquematiza el procedimiento que seguiste para obtener tus preparaciones.
RESULTADOS:
Esquematiza aquí tus resultados.
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CUESTIONARIO:
1.- El hacer estudios biológicos con preparaciones frescas es muy
importante, ¿explica por que?______________________________________________
___________________________________________________________________________
2.- Investiga por qué debe ponerse una gota de agua o de solución fisiológica
a la muestra.______________________________________________________________
___________________________________________________________________________
3.- ¿Cuál es el medio de montaje en una preparación
fresca?_______________________________________________________________________________________________________________________________________________
CONCLUSIONES:
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MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO COMPUESTO
Fecha____________________________
OBJETIVO
El alumno reconocerá el microscopio compuesto, identificará cada una de sus partes y lo manejará correctamente observando la Presencia de
microorganismos en muestras biológicas
MATERIAL. Microscopio compuesto
Sarro dental
Porta y cubre objetos Sol. de yodo-lugol
Palillo, Hisopo
INTRODUCCIÓN.
El microscopio es el instrumento más frecuentemente utilizado y el
más útil en un laboratorio de microbiología, proporciona la amplificación o agrandamiento que nos permite ver organismos y estructuras invisibles a
simple vista. Los microscopios permiten una amplia gama de
amplificaciones, desde cien veces a cientos miles de veces.
Las dos categorías de microscopios disponibles son los microscopios ópticos y los microscopios electrónicos. Los microscopios
ópticos utilizan un sistema de lentes ópticas y comprenden los microscopios
de campo claro, campo oscuro, fluorescencia y contraste de fases. Los microscopios electrónicos emplean haces de electrones en lugar de ondas de
luz para producir una imagen ampliada.
Manejo y uso del microscopio óptico
1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la
platina completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones.
2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas
metálicas. 3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o
colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.
4. Para realizar el enfoque:
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a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el
tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través
del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.
b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el
objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo
nítida la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino. 5.- Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y
suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque
fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3.
El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es
fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión
si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.
PROCEDIMIENTO
TECNICAS DE MONTAJE HÚMEDO La gota pendiente o las preparaciones húmedas permiten examinar
organismos vivos suspendidos en un fluido. Las preparaciones húmedas se
hacen colocando una gota del fluido que contiene el organismo sobre una lámina de vidrio y cubriéndola con una fina pieza de vidrio (cubreobjetos):
para reducir la tasa de evaporación y eliminar corrientes de aire,
generalmente se rodea la gota con vaselina. Cuando se examinan las preparaciones húmedas por microscopía de campo
claro, es importante ajustar la fuente de luz de forma adecuada. Es posible
disminuir la intensidad de la luz mediante la utilización de filtros especiales.
MONTAJE EN SOLUCION SALINA FISIOLÓGICA (NaCl 0.85%) O AGUA
Utilizada para estudiar la movilidad de las bacterias
A)
1.- En el centro de un portaobjetos coloca una gota de solución salina
2.- Con un hisopo toma muestra de sarro dental de un compañero que no se haya lavado los dientes y colócala en la solución salina mezclando
cuidadosamente
3.- Examinar con objetivos de 40X y 60 X.
B)
1.- Centrífuga aproximadamente 10 ml de orina a 2,500 rpm durante 5 minutos.
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2.- Desecha el líquido sobrenadante y procede a mezclar el sedimento
urinario
3.- Coloca una gota del sedimento mezclado en el centro de un portaobjetos limpio y seco
4.- Sobre el sedimento pon un cubreobjetos y observa con el objetivo de
40X y 60X
MONTAJE EN SOLUCIÓN YODO LUGOL
Utilizada para identificar en Protozoos con sus organelos citoplasmáticos 1.- En un portaobjetos limpio y seco, coloca una gota de solución de yodo
lugol.
2.- Con un palillo de madera toma una pequeña cantidad de muestra y deposítala en el portaobjetos mediante movimientos de rotación y
extendiendo la muestra por toda la gota
3.-Coloca un cubreobjeto sobre la preparación y observa en el microscopio
CUESTIONARIO:
1.- ¿Que es poder de resolución?__________________________________________ ___________________________________________________________________________
2.- ¿Qué finalidad te proporciona el utilizar microscopio compuesto:
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________
3.- ¿Cuál es la importancia que tiene el diafragma en el microscopio?________
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
4.- ¿Qué tipo de bacterias pudiste observar en las muestras que se estudiaron
____________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
5.- ¿Qué importancia tiene el estudiar y observar los microorganismos en muestras biológicas? ______________________________________________________
____________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________ 6.- Dibuje y escribe el nombre de cada una de las partes del microscopio
compuesto
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OBSERVACIONES
Dibuja lo observado en los diferentes objetivos para cada muestra que
preparaste durante el experimento.
CONCLUSIONES
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____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
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ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO
Fecha____________________________
OBJETIVO:
El alumno conocerá y aplicará el procedimiento de esterilización por calor húmedo, así como las ventajas del procedimiento.
MATERIAL
Reloj Agua de la llave
Autoclave u olla de presión.
Extran
Mechero Material de cristalería limpio, seco y empacado
Asa de platino
INTRODUCCIÓN
AGENTES FÍSICOS ANTIMICROBIANOS.
A) CALOR HÚMEDO.- La temperatura elevada, combinada con una
humedad elevada, es uno de los métodos más efectivos para matar microorganismos. El calor húmedo mata a los microorganismos coagulando
sus proteínas. Es mucho más rápido y efectivo que el calor seco. El vapor a
presión proporciona temperaturas por encima de las que se pueden obtener
al hervir. Tiene la ventaja de un calentamiento rápido, así como penetración rápida y abundante humedad..
El aparato a esterilizar que utiliza vapor de agua a presión regulada
se denomina autoclave. Consta de una cámara de doble pared que se llena de vapor saturado libre de aire y se mantiene a la temperatura indicada y a la
presión establecida durante un periodo de tiempo determinado.
Generalmente el autoclave funciona a una presión de 15 libras/ pulgada cuadrada a 121·C ( 249·F). El tiempo de funcionamiento para lograr la
esterilidad depende de la naturaleza del material que se va a esterilizar, del
tipo de envase y del volumen del material. Una temperatura de l00·C es la suficiente para matar a todas las formas bacterianas en 2 o 3 minutos,
excepto a las esporas, para matar a estas se requiere una temperatura de
121·C durante 15 minutos y a una presión de 15 libras.
Este método es adecuado para esterilizar aparatos que tienen hule, jeringas que contienen metal, para medios de cultivo que contienen un
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azúcar especial dextrosa. El autoclave se puede sustituir por la olla de
presión.
B) CALOR SECO.- En este tipo de esterilización existe una destrucción de los
microorganismos oxidando sus constituyentes químicos, desnaturalizando
las proteínas y los ácidos nucleicos de las células así como fragmentando las membranas celulares. Para materiales que deben permanecer secos como
ciertos instrumentos de vidrio de laboratorio tales como: cajas de petri,
pipetas, así como aceites, polvos ( por ser impermeables al vapor), los materiales que no se pueden esterilizar por calor seco son: Material textil
(algodón, sedas, lino, etc.), Gomas y Materiales sintéticos
Todo material que se altere a la temperatura de trabajo se dispone de hornos eléctricos por los que circula aire caliente, en vista de que el calor es menos
eficaz en materiales secos, se acostumbra a aplicar una temperatura de
160·C a 170·C durante una hora o más. Para materiales de vidrio de laboratorio es suficiente una exposición de dos horas de duración a 160·C (
320 ·F) para que quede esterilizado. Otras formas útiles de calor seco
incluyen incineración para objetos que deben ser destruidos y flameados por
pasaje de agujas o pequeños instrumentos a través de la llama de un
mechero bunsen
PROCEDIMIENTO
b) ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO (vapor a presión)
1.- Lava el material que te proporcione tu profesor con mezclas adecuadas como Extran, mezcla Crómica con concentraciones adecuadas tomando en
cuenta lo sucio del material, seca en estufa o en forma manual con papel
absorbente y empácalo. Tenlo listo para su esterilización.
2.- Coloca el agua necesaria en la autoclave u olla de presión hasta la marca
e introduce unas gradillas metálicas que servirán de base al material a
esterilizar. Coloca el material a esterilizar dentro de la autoclave u olla de presión, evitando que el material toque las paredes.
3.- Cierra la autoclave u olla de presión, cuidando de dejar abierta la válvula de salida de vapor que ayudará a expulsar el aire contenido dentro y que
éste es desplazado por el vapor que se produce. si el aire no fue eliminado
totalmente de la autoclave, el manómetro aumentará a 15 libras. Pero la temperatura no habrá alcanzado los 121˚C Por esto se debe medir el tiempo
cuando la temperatura llegue a l21˚C
4.- Cierra la válvula cuando el vapor sea continuo. La temperatura de l05·C
indica que está libre de aire. Vigila el termómetro. Cuando vaya en 120·C,
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mantenla durante 15 minutos para que se efectúe la esterilización (15 libras
de presión). Transcurrido este tiempo se apaga.
5.-Deja enfriar hasta que el manómetro marque cero. Abre la válvula de
salida de vapor, para expulsar el vapor restante. Abre el autoclave y retira el
material
6.- Si el material no está en estado líquido la válvula se puede abrir rápido a
la salida de vapor, pero si está en estado líquido la rápida pérdida de presión
las hace hervir o bien saltar los tapones. Por lo tanto se espera unos minutos a que se enfríe perfectamente
CUESTIONARIO.
1.- Cuál material se puede esterilizar por calor seco y cuál no. ¿Porqué?
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2.- Qué tipo de material se puede esterilizar por calor húmedo?_____________ ___________________________________________________________________________
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__________________________________________________________________________ 3.- A qué condiciones de temperatura y presión se destruyen todas las
formas vegetativas?________________________________________________________
___________________________________________________________________________ 4.- A qué condiciones de temperatura y presión se destruyen las esporas?
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__________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________
5.- Cuáles son las condiciones necesarias de tiempo y temperatura para
esterilizar por calor seco?__________________________________________________ ___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
6.- Cuáles son las condiciones necesarias de tiempo y temperatura para esterilizar por calor húmedo?_______________________________________________
___________________________________________________________________________
7.-Cómo actúa la esterilización por calor seco en los microorganismos?
___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
8.- Cómo actúa la esterilización por calor húmedo en los microorganismos?
___________________________________________________________________________
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9.- Qué tipo de esterilización es más recomendable y por qué?
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________
OBSERVACIONES:
Realiza esquemas y dibujos correspondientes a la esterilización por calor húmedo que realizaste en la práctica
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PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS
Fecha____________________________
OBJETIVO: Adiestrar al alumno en la preparación de diferentes medios de
cultivo.
MATERIAL Frasco Schot
1 Baño maría
Tripies Mecheros Fisher
Telas de asbesto o placas de calentamiento
Agitador
Vaso de precipitado de 250 ml 1 Espátula
Cajas de petri
Tapones de algodón Autoclave u olla de presión
Papel estraza
Tubos de ensayo 16X150 Medios de cultivo
INTRODUCCIÓN
Uno de los sistemas más importantes para la identificación de
microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias
artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que
crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo.. Para que las bacterias crezcan
adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de
condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de
cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y
debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición
a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos
medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes. El Agar es un elemento solidificante muy
empleado para la preparación de medios de cultivo. En los diferentes medios
de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como
hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el
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valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los
microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa
se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes. Por su aspecto físico.
Los medios de cultivo preparados pueden ser clasificados por su
aspecto en: : Líquidos, Semisólidos, Sólidos. Y por su uso en: I.- Medios de
cultivos básicos II:_ Medios de cultivos especiales como: mejorados,
selectivos, diferenciales, de transporte.
PROCEDIMIENTO:
1- Primeramente se desinfecta el área de trabajo con fenol al 5% o alcohol y
se enciende el mechero
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS
1.- Leer las instrucciones del fabricante para cada medio de cultivo y pesar la cantidad necesaria según el volumen requerido.
2.- Colocar el medio en un vaso de precipitado que contenga el agua
destilada en el volumen requerido, agitar y calentar a ebullición para disolver el Agar. En el último paso se debe tener cuidado ya que el recipiente se
calienta en exceso y el producto tiende a hervir y proyectarse, lo cual puede
producir serias quemaduras. El Agar disuelto hace transparente al medio
que originalmente estaba turbio. Puede utilizarse un baño maría para aumentar la solubilidad.
3.- Si se va a envasar en cajas de petri, es necesario conservar el medio en
un frasco schot y esterilizarlo a 121·C durante 15 minutos. Al terminar, es conveniente mantener el mechero encendido para formar un área de
esterilidad al momento del vaciado en las cajas de petri aproximadamente de
15 ml a 20 ml de medio de cultivo por caja procurando que no se forman burbujas. Tapar la caja inmediatamente
4.- Si se desea que el Agar quede en tubos, entonces se esterilizará el Agar
directamente en ellos a 121·C durante 15 minutos tapados con algodón, gasa y papel estraza. Si desea que solidifiquen inclinados, colocarlos en una
superficie lisa inclinándolos en un ángulo de 20 a 30 · sobre una varilla de
vidrio.
A) VACIADO EN CAJAS DE PETRI
3.- No destapar las cajas de petri, sino hasta el momento que vayan a ser
utilizadas. Es conveniente colocarse un cubre bocas la persona que va a
realizar el vaciado y evitar hablar en todo momento para no contaminar el medio de cultivo.
4.- Es conveniente mantener el mechero encendido y trabajar cerca del
área estéril al momento del vaciado en las cajas de petri. Levantar la tapadera de la caja petri con la mano izquierda , sin soltarla y sin retirarla
demasiado de la base de la misma caja mientras que con la mano derecha
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tomar el matraz que contiene el medio de cultivo y realizar el vaciado de
aproximadamente 15 ml a 20 ml de Agar por caja procurando que no se
forman burbujas, se procede a tapar la caja inmediatamente 5.- Si se forman burbujas, tomar el mechero, flamear el medio de cultivo
sobre la superficie de la caja de petri y de manera rápida. Se procede a tapar
la caja.
6.- Esperar a que el medio solidifique, Se rotulan los medios de cultivo, anotando la fecha y con iniciales el tipo de medio de cultivo. Si las placas no
se van a utilizar el mismo día se sujetan con cinta y se colocan en el
refrigerador de manera invertida para evitar que el vapor condensado caiga sobre el medio de cultivo y lo pueda contaminar.
7.- Cuando se vayan a utilizar los medios de cultivo preparados, será
necesario secar las placas invertidas en estufa a 37 °C. Antes de realizar el sembrado de microorganismos.
CUESTIONARIO
1.- ¿Qué es un medio de cultivo? ___________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________
2.- Qué es un cultivo de microorganismo? ____________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
3.- Qué finalidad tiene utilizar medios de cultivo sólidos? ____________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
4.- Escribe el nombre de 5 medios de cultivo que pueden ser empleados en el laboratorio de microbiología.
____________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________ 5.- De dónde es obtenido el extracto Agar- Agar para la preparación de
medios de cultivos?________________________________________________________
6.- Por qué es necesario esterilizar la mesa entes de realizar el vaciado del
medio de cultivo en las cajas de petri?______________________________________ ___________________________________________________________________________
7.-Por qué la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos
de carne y Peptona?_______________________________________________________ ___________________________________________________________________________
8.- Escribe la composición química un medio medio de cultivo que
utilizaste.__________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
OBSERVACIONES. Dibuja todos los pasos realizados en la preparación de los medios de cultivo.
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CONCLUSIONES: ____________________________________________________________________________
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TÉCNICAS DE SEMBRADO
Fecha____________________________
OBJETIVOS
- Observar la gran variedad de microorganismos presentes en el medio
ambiente, determinando las diferentes morfologías de colonias que se
obtienen. - Los efectos de un desinfectante por medio del crecimiento de colonias
de bacterias en un medio de cultivo en cajas de Petri.
MATERIAL cajas de Petri estériles preparadas con medio de cultivo PDA
Cinta pegante
Marcador permanente o lápiz de cera
Un desinfectante con 70% de solución de alcohol, 10% de una solución blanqueadora, jabón líquido Extran o alkox.
INTRODUCCIÓN La población microbiana existente en nuestro entorno es grande y compleja.
Cientos de especies microbianas habitan normalmente en distintas. Ellos
flotan alrededor hasta que entran en contacto con una superficie que ofrezca comida y resguardo. Se encuentran más frecuentemente en la oscuridad, en
objetos húmedos que a menudo entran en contacto con la comida, la
suciedad o la vegetación. Un estudio adecuado de microorganismos que hay en estos hábitat requiere
técnicas que permitan conocer y ordenar la compleja población mixta o
cultivo mixto, separándole en sus distintas especies como cultivos puros. Un cultivo puro consta de una población de células derivadas todas ellas de una
célula parental. Los microorganismos se cultivan en el laboratorio sobre
materiales nutritivos denominados medios. Se dispone de una gran cantidad
de medios y la clase que se debe de utilizar depende de muchos factores, uno de los cuales es la clase de microorganismos que se va a cultivar. El material
que se inocula sobre el medio se denomina inóculo mediante alguna técnica
(siembra por estría en placa o siembra en masa en placa). Durante la incubación a 37˚C, las células microbianas individuales se reproducen tan
rápidamente que en un lapso de 18 a 24 horas producen masas visibles de
células denominadas colonias. Una colonia es visible a simple vista. Cada colonia diferente es presumiblemente un cultivo puro de una sola clase de
microorganismo. Si dos células microbianas procedentes del inóculo original
quedan muy cerca una de otra sobre el medio de Agar, la masa de células observables no será un cultivo puro. La mayoría de los microbios en nuestro
cuerpo y otras superficies son inofensivas, pero algunos son patógenos o
causan enfermedad. Por esta razón, queremos controlar el número de
microbios que nos rodea. La posibilidad de infectarnos aumenta con el
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número de microbios en los objetos circundantes. Pero ¿qué podemos hacer
para reducir el número de microbios en las superficies que nos rodean?
PROCEDIMIENTO
A partir de una suspensión bacteriana o cultivo mixto:
- Agotamiento, con asa de platino y en placa de AN. Tomar una muestra del cultivo mixto, con ayuda del asa de siembras previamente flameada.
Debe flamearse la boca del tubo antes y después de tomar la muestra. La
muestra se extiende con suavidad con el asa sobre la superficie del medio de agar nutritivo en placa Petri. Para ello la placa se destapa ligeramente en las
proximidades del Mechero bunsen. Una vez finalizado se vuelve a tapara la
placa y está se dispone en posición invertida para llevar a incubar. Este es el proceso general para la siembra de placas.
- Estrías escocesas, con asa de platino y en placa de AN Para obtener
colonias aisladas por este procedimiento, según se índice en el esquema, se realizan una serie de estrías sobre la superficie del medio, tras lo cual se
cierra la placa y se flamea el asa. Con el asa estéril se realizan nuevas estrías
arrastrando células de las estrías anteriores, y por tanto diluyendo la
muestra. El proceso se repite varias veces, flameando el asa entre cada nuevo paso de estrías. Al final se puede realizar un pequeño agotamiento. La placa
se lleva a incubar, invertida, como en el caso anterior. Ello permitirá obtener
colonias aisladas. Incubar a 27º C
Ver esquema:
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CUESTIONARIO
1.- Qué es un cultivo puro de microorganismos? ___________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
2.- Qué es in inóculo? ___________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________ 3.- Físicamente en un medio de cultivo de microorganismos cuando se dice
que no forma un cultivo puro?_____________________________________________
___________________________________________________________________________4.- Qué tipo de técnica empleaste para la siembra de microorganismos?
____________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________ 5.- ¿En cuál caja crecieron más y más grandes las colonias? ¿Por qué
piensas eso? ______________________________________________________________
___________________________________________________________________________
6.- ¿Cómo podemos controlar la contaminación microbiana? ___________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
OBSERVACIONES: Dibuja todos los pasos empleados en el sembrado de las
cajas de petri con Agar nutritivo.
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CONCLUSIONES___________________________________________________________
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AISLAMIENTO DE HONGOS MEDIANTE EL MÉTODO EXTENSIÓN
EN PLACA
Fecha____________________________
OBJETIVO:
El alumno aislará poblaciones fúngicas del suelo mediante el método
extensión en placa utilizando una varilla angular de vidrio
MATERIAL
Muestra de suelo
1 varilla de vidrio doblada
pipetas de 1 ml
cajas con medio de cultivo estéril PDA Tubos de ensayo con tapón de rosca
Asa bacteriológico
Alcohol al 70%
INTRODUCCIÓN
Uno de los problemas más frecuentes en Microbiología es el
aislamiento de un cultivo puro de una especie bacteriana dada. A pesar de
que es muy difícil aislar una sola célula, existen técnicas capaces de aproximar este ideal
En Microbiología, todas las manipulaciones deben ser llevadas a cabo
de modo que se impida cualquier tipo de contaminación en el área de
trabajo. Los procedimientos utilizados para conseguirlo se conocen con el nombre de técnica aséptica, y se citan a continuación:
-Las asas deben esterilizarse antes de utilizarlas y enfriarse sobre el agar o el
material de vidrio (en zonas estériles) antes de tomar la muestra de microorganismos, con objeto de no destruirlos por calor.
-Después de utilizarlas, las asas se vuelven a esterilizar.
-Las bocas de los tubos y matraces de vidrio se flamean ligeramente una vez destapadas, y después de la inoculación.
-Durante la inoculación, los tapones se mantienen en la mano sujetándolos
por la parte que no entra en contacto con tubos y matraces. -Los tubos abiertos deben mantenerse en posición inclinada para que el
riesgo de contaminación sea mínimo.
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-Las tapas de las placas Petri no deben colocarse nunca sobre la mesa de
trabajo.
Técnicas de siembras: La siembra de microorganismos puede realizarse en medios líquidos o en
medios sólidos.
En el primer caso, para la inoculación se utilizará asa estéril si el medio de
partida es sólido, o pipeta estéril (Pasteur o graduada) si es líquido. En el segundo caso, cuando se parte de otro medio sólido, se utiliza el asa de
platino normal para siembra en placa o tubo inclinado y el asa recta para
siembra en picadura en tubos rectos o, en general, cuando se quiere introducir el microorganismo en el seno del medio de cultivo sólido; cuando
el medio de partida es líquido, se puede pasar al medio sólido con un asa de
platino calibrada, con la que se extiende la muestra directamente, o con pipeta (Pasteur o graduada), depositando la muestra que luego se extenderá
sobre la placa con un asa de platino o con una varilla doblada.
En general, en Microbiología se trabaja con cultivos puros de
microorganismos. Un cultivo puro es aquél en que todas las células
provienen de una sola célula inicial. Una colonia de cualquier
microorganismo es un cultivo puro, ya que todas sus células proceden de una inicial; por lo tanto, cuando se desea aislar un microorganismo de una
muestra cualquiera, es preciso ver colonias del mismo, lo que implica que el
aislamiento ha de realizarse en medio sólido en placa. Los pasos de un proceso de aislamiento de una especie microbiana se
pueden resumir en los siguientes:
-Siembra en placa de la muestra de partida. -Tomar una colonia de la placa una vez incubada, resuspenderla en agua
estéril y sembrar una segunda placa, en la que todas las colonias que
crezcan deben ser idénticas. -A partir de la segunda placa se puede resuspender una de las colonias en
medio líquido, consiguiéndose ya un cultivo puro.
-Para la conservación de los cultivos puros de un microorganismo existen
diversos métodos, el más simple es la resiembra en tubos inclinados que se mantienen, normalmente refrigerados, durante 3-6 meses.
PROCEDIMIENTO Técnica se aislamiento y recuento. Diluciones en serie. Técnica que consiste
en obtener una suspensión de la mezcla de microorganismos y hacer
diluciones seriadas que se vierten en una placa Petri hasta conseguir colonias aisladas.
Instrucciones: Se debe trabajar, como siempre, en condiciones estériles,
flameando la boca de los tubos antes y después de introducir la pipeta, en las proximidades del mechero.
Mediante una pipeta estéril, tomar una muestra del cultivo mixto, y depositar
1ml en el primer tubo con 9ml de suero fisiológico (ó en nuestro caso: 0,5ml
en 4,5ml respectivamente) (dilución 10-1).
23
Agitar hasta conseguir una suspensión homogénea. Tomar otra pipeta
estéril, y transferir de esta primera dilución 0.1ml al siguiente tubo con 10ml
de suero fisiológico (10-2), y así sucesivamente. A partir del tubo con dilución 10-2 y 10-4, con una pipeta estéril , inocular 0,1ml en placa AN extendiendo
la muestra sobre la superficie con el asa de vidrio, la cual se debe esterilizar
mediante su introducción en alcohol y posterior flameado, por lo que se pasa
el asa impregnada en alcohol por el mechero y se deja consumir el alcohol completamente.
Tras incubar se podrán obtener colonias aisladas. El recuento de estas
colonias permitirá conocer el número de células existentes en el cultivo original.
1.- Hacer diluciones decimales a partir de la muestra de suelo hasta 10-5
2.- Sólo vas a necesitar las últimas dos diluciones es decir: 10-4 , 10 –5 las demás se desecharán.
3.- Rotula 4 cajas de petri con el nombre del medio de cultivo PDA, en dos
anota la dilución 10-4, y en las otras anota la dilución 10-5.
4.- Rotula dos cajas de petri con el nombre del medio de cultivo (PDA) en una anota la dilución 10-4, y en la otra anota la dilución 10-5
5.- Esteriliza el asa bacteriológica en el mechero, espera que se enfríe cerca
del área estéril e introdúcela en la dilución 10-4 6.- Inocula con 0.5 ml de cada dilución 10-4 en el centro de la superficie del
Agar en el primer medio de cultivo, tapa la caja de petri
7.- Vuelve a introducir en la misma dilución 10-4 y coloca 0.5 ml en el siguiente medio (PDA), repite lo mismo y coloca una gota en el tercer medio
de cultivo. No olvides tapar las cajas para evitar que se contamine.
8.-Esteriliza el asa bacteriológica y ahora introdúcela en la dilución 10-5 repite los pasos anteriores, pero ahora para todas las cajas que están
rotuladas con la dilución 10-5 No olvides tapar los medios de cultivo.
9.- Vierte una o dos gotas de alcohol al 70% sobre el brazo más corto de la
varilla de vidrio y con el mechero enciende el alcohol que se encuentra en la varilla . Permite que arda hasta que se queme todo el alcohol. Deja que la
varilla de vidrio se enfríe por un minuto
10.- Utiliza el brazo corto de la varilla para dispersar uniformemente la gota de cada dilución sobre toda la superficie de cada placa de Agar inicia con
las diluciones 10-5
11.- Invierte la caja de petri, incúbala a temperatura de 28ºC por 48 horas.
CUESTIONARIO
1.- A qué grupo de microorganismos pertenecen los actinomicetos?
___________________________________________________________________________
3.-Qué tipo de técnica utilizaste para sembrar hongos?
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___________________________________________________________________________
4.- Menciona otra técnica para aislar cultivos puros de microorganismos?
___________________________________________________________________________
5.- ¿Cuál fue la finalidad de quemar el alcohol sobre la varilla de vidrio?
____________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________ 6.- ¿Por qué iniciaste a distribuir con la varilla en forma uniforme las
diluciones l0-5 que contenían a los microorganismos y no con las diluciones
de l04? ____________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
7.-¿Qué apariencia presentaron las colonias después del tiempo de incubación?
____________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
8.- Esquematiza el proceso de dilución para la muestra de tierra que
realizaste
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Figura: Diluciones seriadas
OBSERVACIONES
Dibuja todo el proceso llevado a cabo para el aislamiento del cultivo puro de microorganismo por extensión en placa, así como los resultados obtenidos al
cabo de 24 horas.
CONCLUSIONES ____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
________________
26
CUENTA DE MICROORGANISMOS VIABLES POR DILUCIÓN EN PLACA
INTRODUCCIÓN Existen diferentes técnicas para determinar el número de microorganismos
en suelos o aguas, tanto directas como indirectas, Para la determinación de
microorganismos heterótrofos totales e hidrocarbonoclastas aerobios, se
seleccionó la cuenta microbiana por dilución en placa. Es una técnica indirecta de cuantificación; sin embargo, provee una medición de la
viabilidad microbiana, permite determinar indirectamente el potencial de
biodegradación en un suelo contaminado, es la más adecuada para medios con hidrocarburos como substrato, es rápida de efectuar y no requiere de
mucho material (Lorch et al., 1995; Bossert y Kosson, 1997).
MÉTODO
El conteo de poblaciones microbianas por dilución en placa es un método
simple y rápido para la cuenta viable de células microbianas en el suelo. Sin
embargo, la cuenta obtenida es generalmente 10 a 100 veces menos que aquella determinada por cuenta directa por microscopia. Las razones para
esta discrepancia incluyen la exclusión de la cuenta no viable directamente
en el suelo y la inhabilidad para proveer apropiados nutrimentos en el medio de crecimiento, para obtener la cuenta total en placa.
FUNDAMENTO
El método de dilución en placa se fundamenta en que cualquier célula viable inoculada en un medio de cultivo se multiplica y produce datos de fácil
identificación, como la formación de colonias en placas de agar. Este método
consiste en la preparación de una serie de diluciones de una muestra de suelo en un diluyente apropiado, esparciendo una alícuota de una dilución
sobre la superficie de un medio de cultivo sólido e incubando la placa de agar
bajo condiciones ambientales apropiadas. La dilución debe permitir generar
colonias separadas, cada colonia puede proceder de una sola célula o de una agrupación (unidad viable), la cual se contará como una bacteria. Bajo este
fundamento, estas placas pueden ser usadas no sólo para el conteo de
poblaciones microbianas, sino también para el aislamiento de organismos. Un medio selectivo o no selectivo puede ser usado dependiendo de la
naturaleza del microorganismo que se desea contar o aislar (Ramírez et al., 1992). Interferencias
Los errores más frecuentes en este método son:
a) Que durante la realización de las diluciones no se logre separar perfectamente los agregados bacterianos y más de una bacteria forme una
colonia.
b) Cuando el diluyente se esteriliza en tubos tapados con torundas de
algodón el volumen inicial generalmente se altera, por lo que se recomienda el uso de tubos con tapón de rosca o la esterilización separada del diluyente
y tubos, a fin de pipetear en cada tubo el volumen exacto del diluyente al que
se agrega el volumen exacto de la muestra.
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c) Debe evitarse el choque osmótico cuando se hacen las diluciones; se
recomienda el empleo de agua peptonada, solución salina isotónica; el medio
de cultivo utilizado para su crecimiento o diferentes soluciones amortiguadoras.
d) La temperatura de la varilla para extender el inóculo en la placa. Cuando
la varilla queda muy caliente después de ser esterilizada con alcohol y
flameada, puede quemar el inóculo. e) Durante el recuento se pueden producir dificultades ocasionadas por la
carencia de uniformidad en la extensión de los microorganismos (Ramírez et al., 1992). Material y equipo
� Tubos de vidrio de 15 ml para cultivo con 9 ml de solución salina 0.85%
estéril.
� Matraz Erlenmeyer con tapa con 99 ml de solución salina 0.85% estéril. � Pipetas de 1 ml y de 0.2 ml, estériles.
� Vórtex.
� Balanza. � Espátulas.
� Campana de flujo laminar o área estéril.
� Cajas de Petri con medio de cultivo-agar. � Varilla de vidrio.
� Muestra de suelo o agua.
� Incubadora. � Papel aluminio estéril.
Soluciones y reactivos
1) Solución salina 0.85% estéril. Adicionar 8.5 g de cloruro de sodio (NaCl) en 1 L de agua destilada.
2) Cajas de Petri con medio de cultivo adecuado para el crecimiento.
3) Etanol (CH3-CH2-OH).
Procedimiento 1) En condiciones estériles (trabajar en campana de flujo laminar), adicionar
1 g del suelo a una botella de dilución o matraz con tapa de rosca con 99 ml
de solución salina isotónica estéril (dilución 10-2). Dispersar el suelo y homogeneizar con agitación vigorosa en vórtex.
2) Tomar 1 ml y transferirlo a un tubo con 9 ml de solución salina estéril
(dilución 10-3). De ahí se hacen diluciones sucesivas hasta completar diluciones decimales hasta 10-10 o las adecuadas, asegurándose de utilizar
una punta o pipeta estéril diferente en cada paso. Agitar de forma constante
con vórtex en cada paso. 3) Tomar 0.1 ml de la dilución seleccionada y colocarla en el centro de la
superficie del medio de cultivo seleccionado para el crecimiento.
Realizar esto por triplicado y con tres diluciones próximas (ej. 10-3, 10-4 y
10-5) para asegurar la cuenta. 4) Extender la alícuota en la superficie de la placa con una varilla de vidrio
previamente esterilizada (inmersa en alcohol y pasándola por la flama del
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mechero permitiendo su enfriamiento). Asegurar una distribución
homogénea por toda la superficie del medio.
5) Incubar las placas de forma invertida a 30ºC en ausencia de luz. 6) Después de un periodo de incubación (de 3 a 7 días, dependiendo del tipo
de microorganismo), contar el número de colonias y reportar como unidades
formadoras de colonias (UFC)/ g de suelo seco.
Cálculos 1) Contar sólo aquellas cajas (diluciones) que contengan de 30 a 300
colonias.
2) Con la siguiente ecuación calcular las UFC/g s.s. UFC/g s.s. = (NC * 1/FD * 1/ V) / (P * FH).
Donde:
UFC/ g s. s. = unidades formadoras de colonias / g de suelo seco. NC= número de colonias en una caja.
FD = factor de dilución que corresponde a la dilución de donde se tomó la
muestra con la que se inocula la caja (10-2 a 10-10). V= volumen inoculado en la caja = 0.1 ml.
P = peso de la muestra húmeda = 1 g.
FH = factor de corrección de humedad (1-(%humedad/100)).
INFORME
Escribir en la tabla siguiente el número de colonias encontradas en cada una de las
diluciones.
Bacteria aerobias
Dilución No. De Colonias UFC/ml
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COLORACIÓN DE GRAM Fecha___________________
INTRODUCCIÓN
Las coloraciones diferenciales se emplean junto con otras técnicas en la identificación y diferenciación de las bacterias.
La coloración de Gram permite separar a las bacterias en dos grandes
grupos, las Gram positivas y las Gram negativas En esta técnica se utiliza el cristal violeta como colorante primario el lugol
como mordente, una mezcla de etanol-acetona o etanol como agente
decolorante y safranina como colorante de contraste. Las bacterias que retienen el cristal violeta después de la decoloración se
observan de color morado y son Gram positivas. Las bacterias Gram
negativas por el contrario pierden el colorante primario por el tratamiento diferencial y toman el colorante de contraste, se observan entonces de color
rojo.
La capa de peptidoglicano de la pared celular bacteriana juega un papel
fundamental en la coloración, el cristal violeta y el lugol forman una laca en el interior de las bacterias. Al aplicar el agente decolorante, las bacterias
Gram + sufren una deshidratación y la red de peptidoglicano que es muy
abundante, se condensa y constituye un obstáculo para la salida del complejo cristal violeta-lugol. Las bacterias Gram – también contienen
peptidoglicano pero en menor cantidad por lo que constituye una barrera
laxa, de modo que las bacterias queda máqs permeables que las Gram + y el complejo cristal violeta-lugol sale con más facilidad dejando asi lugar a la
safranina. A la coloración de Gram están asociadas otras propiedades de las
bacterias como son: su sensibilidad a diferentes antibióticos, a los colorantes del grupo de trifenil metano, a la lisozima, su capacidad de producir toxinas
diferentes entre si, etc.
Objetivo El alumno aplicará una técnica de coloración para la diferenciación de
bacterias.
III. Material Mechero bunsen
Asa bacteriológica
Portaobjetos y cubreobjetos Aceite de inmersión
Solución de cristal violeta
Solución de lugol Solución de alcohol-acetona
Solución de safranina
Puentes de coloración
Cepas
PROCEDIMIENTO
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1) El primer paso es preparar y fijar un frotis de la siguiente manera:
• Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriológica y esperar que
enfríe un poco. - Tomar el asa (previamente flameada) y con ésta tomar un poco de muestra. - Una vez obtenida una pequeña cantidad de la muestra
(con el asa), hacer que ésta tenga contacto con una lámina portaobjetos, la
cual servirá para depositar la muestra contenida en el asa.
• Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lámina portaobjetos, proceder a realizar la extensión de la muestra en el portaobjetos mediante
movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lámina, de tal forma
que al terminar la extensión, tengamos como producto un espiral en la parte media la lámina.
• Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (sólo se
pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfología
celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aquel en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente pare ser colocado sobre el dorso
de la mano.
2) Una vez obtenido el frotis con la muestra, se procede a teñir la misma con violeta cristal o violeta de genciana, utilizando una cantidad suficiente de
dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se
deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tinción de 1 minuto está dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 grados
3) Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lámina conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta
que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, ésta debe
caer sobre la parte superior de la lámina que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro delgado, aproximadamente de medio a un centímetro de
espesor. También el enjuague se debe realizar poniendo la lámina en posición
inclinada hacia abajo.
Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordente yodo o lugol durante 1 minuto más. El mordente es cualquier sustancia que forme
compuestos insolubles con colorantes y determine su fijación a las bacterias
5) Pasado el minuto de haber actuado el mordente, el frotis se decolora con
etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, de 5 a 15
segundos. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. Se van añadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr que éste salga
totalmente transparente.
6) Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que
seque la lámina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la
forma anteriormente descrita.
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7) Una vez que la lámina ya secó, procedemos a teñir nuevamente, pero esta
vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina,
dejar actuar durante 1 minuto.
8) Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lámina con
agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente
descrita.
De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observación
microscópica.
Informe Después de aplicar la técnica de Gram a las cepas proporcionadas y de
acuerdo a sus observaciones indique la morfología microscópica y la reacción
de Gram de cada microorganismo. Realizar esquemas a colores de las preparaciones observadas con los
diferentes pasos.
Cuestionario
1. ¿Qué importancia tiene la técnica de coloración de Gram en la
identificación de las bacterias? 2. ¿Cuál es el paso crítico en la técnica de Gram? Diga porque.
3. Diga el nombre de tres bacterias (genero y especie) Gram positivas.
4. Diga el nombre de tres bacterias (genero y especie) Gram negativas.
5. ¿Por qué en general, las eubacterias son el único grupo microbiano que responden a la coloración de Gram?
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COPROPARASITOSCOPICO
CONCENTRACIÓN POR SEDIMENTACIÓN
INTRODUCCIÓN.
La sedimentación de parásitos intestinales en heces se logra por
centrifugación ligera o por gravedad del material fecal, conduciendo a la recuperación de todos los protozoarios, huevos y larvas, especialmente
huevos de trematodos. Concentra bien estas formas y elimina bastantes
detritus orgánicos. Aunque se inactivan las formas móviles de los protozoarios, se mantiene la integridad de los organismos. Es efectivo aún en
heces con cantidades excesivas de grasas y pueden observarse la mayoría de
los quistes de protozoarios, así como huevecillos y larvas de helmintos,
incluyendo los huevos con opérculo y tiene una eficacia moderada para los huevos de Esquistosoma .
La técnica es útil para examinar heces que contienen substancias grasas que
interfieren en los métodos de flotación.
APLICACIÓN
La técnica de flotación es recomendada generalmente para Oocystis de coccidios, quistes de protozoarios, huevos de nematodos y algunos huevos de
gusanos y planos acintados.
La técnica de sedimentación consiste en concentrar quistes de protozoarios, trematodos, acantocéfalos y algunos huevos de gusanos aplanados.
OBJETIVO
Desarrollo y comprensión de la técnica para identificar parásitos intestinales
en heces.
EQUIPO Y MATERIAL
1. Centrífuga
2. Microscopio 3. Balanza
4. Tubos de centrífuga
5. 2 Pipeta de 10 ml 6. 1 Pipeta de 5 ml
7. Portaobjetos y cubreobjetos
8. Colador de plástico o gasas 9. Pipeta pasteur
10. Aplicador de madera
11. Guantes de plástico
12. Gasa cortada en cuadros de 15 cm por lado 13. Embudos de polietileno
14. Vasos de precipitado de 50 ml
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REACTIVOS:
1. Solución salina(cloruro de sodio 7 g agua destilada 1000 ml)
2. Formalina (10 ml de formol al 40%, 90 ml agua destilada, neutralizar
agregando tetraborato de sodio hasta llevar a un pH de 7.0 o 7.3)
3. Éter etílico (grado analítico)
MÉTODO DE CONCENTRACIÓN Y LAVADO- CUALITATIVO
El examen para la identificación de parásitos y protozoos se realiza por el método de concentración por centrifugación y lavado, el que consta de dos
procedimientos, el de flotación (sulfato de zinc) y el de sedimentación (formol-
éter).
TÉCNICA DE SEDIMENTACIÓN
Método del Formol-éter (Método de Ritchie):
1. Coloque en un vasito 1 g de heces (aprox. el tamaño de un cacahuate)
mediante la ayuda con un abatelenguas y adicione 10-12 ml de solución
salina fisiológica. Mezcle con un aplicador de madera y homogenice. 2. Filtre la suspensión a través de un colador o malla y reciba el filtrado en
un tubo de centrífuga de vidrio de 14 ml
3. Centrifugue 1 min a 2000 r.p.m. Elimine el sobrenadante y resuspenda en solución salina.
4. Repita el paso anterior, dos o tres veces para lavar, resuspendiendo el
sedimento en solución salina y homogenizando con un aplicador, para obtener un sedimento más limpio.
5. Agregue al sedimento 10 ml de formol al 10% en solución salina, mezcle y
deje en reposo durante 5 min. 6. Añada 3 ml de éter y agite vigorosamente 30 segundos.
7. Centrifugue 1 min a 1500 r.p.m.
8. Después de centrifugar, se observan 4 capas en orden descendente.
1) éter y lípidos en la superficie 2) un tapón de restos fecales
3) formaldehido
4) sedimento en el fondo del tubo conteniendo los parásitos. 9. Se decanta la muestra y se conserva el sedimento. Se le adiciona unas
gotitas de lugol y se homogeniza. Se toma una gotita con una pipeta Pasteur
y se monta entre portaobjeto y cubreobjetos. Se observa a 10 y a 40 X. 10. Fuentes comunes de error: una suspensión fecal demasiado cargada,
suspensión fecal pobre, centrifuga mal equilibrada, tiempo y velocidad de
centrifugación inadecuados Haga dibujos detallados de los parásitos encontrados e identifíquelos
mediante la comparación de su morfología con los manuales y libros.
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FLOTACIÓN DIRECTA CON CENTRÍFUGA (F.D.C.):
Solución concentrada de sacarosa (Sheather) 1. Coloque en un vasito 1 g de heces (aprox. el tamaño de un cacahuate)
mediante la ayuda con un abatelenguas y adicione 10-12 ml de solución
Sheather’ sugar. Mezcle con un aplicador de madera y homogenice. 2. Filtre la suspensión a través de un colador o malla y reciba el filtrado en
un tubo de centrífuga de vidrio de 14 ml
3. Se centrifuga a 500 r.p.m. durante 5 min. 4. Se toma un poco de la superficie y se coloca en portaobjetos y
cubreobjetos. Se observa con 10 y a 40 X.
RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES. En caso de encontrar algún parasito durante la realización de esta prueba se
Deberá anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito así como su
estadío evolutivo (trofozoito o quiste en el caso de los protozoos y huevo o larva en caso de helmintos)
Haga dibujos detallados de los parásitos encontrados e identifíquelos
mediante la comparación de su morfología con los manuales y libros.
35
TÉCNICA DE ZIEHL NEELSEN
MODIFICADA PARA OBSERVAR COCCIDIAS:
FUNDAMENTO: Se basa en el comportamiento acido-resistente de la
cubierta de estos
parásitos, los cuales se tiñen de rojo y destacan sobre un fondo verde o azul , dependiendo del colorante de contraste usado.
MATERIAL Y EQUIPO:
Portaobjetos Cubreobjetos
Puente para tinción
Fucsina fenicada Verde de malaquita o azul de metileno acuoso
Metanol
Hidróxido de sodio al 4%
Alcohol acido MÉTODO:
a) Realizar un frote de heces en el portaobjetos y dejar secar.
b) Colocar las láminas sobre el puente de tinción c) Fijar la lamina con alcohol metílico de 2 a 3 minutos y dejar secar
d) Agregar hidróxido de sodio, sobre el preparado por un minuto y eliminar el
exceso con agua de la llave. e) Cubrir la lamina con fucsina fenicada (previa agitación del frasco que
contiene dicho reactivo). Por 5 minutos. Es importante recordar que la
fucsina debe ser diluida previamente con agua al tercio (1 ml de colorante mas 2 ml de agua).
f) Lavar suavemente la lamina con agua corriente
g) Cubrir el portaobjetos con alcohol acido por unos segundos hasta quitar el
colorante. h) Lavar suavemente la lamina con agua corriente
i) Colocar el colorante de contraste a la lamina que puede ser verde de
malaquita al 1% o azul de metileno al 1.4%, durante 5 minutos( diluidas previamente al tercio)
j) Lavar suavemente la lamina con agua corriente y secar a temperatura
ambiente. k) Realizar el montaje con cytoseal, bálsamo de Canadá o Permount, cubrir
con un portaobjetos.
l) Observar al microscopio. NOTA:
Los ooquistes de Cryptosporidium, Isospora y Cyclospora, aparecen de un
color rojo fucsina, sobre un fondo verdoso (verde de malaquita). En algunos
no se colorean bien, pero la refringencia característica permite diferenciarlos. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
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En caso de encontrar algún parasito acido alcohol resistente en la tinción se
deberá anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito así como su
estadio evolutivo.
Método del embudo de Baerman
El método del embudo de Baerman se utiliza para extraer nematodos del suelo o de material vegetal macerado. Se basa en la movilidad que presentan
los nematodos, que tienden a emigrar hacia el fondo del embudo, cuando la
muestra de suelo o vegetal está saturada de humedad. Algunos géneros se obtienen rápidamente y en grandes cantidades con este método pero otros,
de movimientos torpes son difíciles de obtener. Para los nematodos que
presentan una estructura hinchada algunas hembras) o cutícula segmentada el papel filtro utilizado en este método les forma una barrera
difícil de atravesar.
MATERIAL NECESARIO
Soporte universal
Anillo Embudo de vidrio
Manguera de goma de 10 cm
Pinza mohr Pizeta
Malla de plástico
PROCEDIMIENTO
1. El dispositivo consiste en un soporte metálico con un anillo donde se
suspende el embudo de cristal de cuello largo unido al tubo del embudo va
un trozo de manguera que se cierra en su extremo libre mediante una pinza mohr.
2. El embudo se llena de agua con una pizeta, dejando vacios unos 2 cm
bajo el borde, sobre el embudo se coloca una malla de plástico.
3. Para poseer datos cuantitativos, se pesan aproximadamente 100 gramos de suelo y se depositan sobre el papel y cuidadosamente se coloca
sobre la malla de plástico.
4. Asegúrese que el nivel del agua rebase ligeramente la muestra de suelo drenando agua o agregando por la parte de arriba depositándola por un lado.
5. Doble los bordes del papel sobre la muestra, de manera que ningún
borde el papel salga de los límites del embudo. 6. Solamente cuando los nematodos sean numerosos se podrán extraer.
Por lo general conviene dejarlos de 24 horas hasta cinco días. Se sugiere un
término medio de 48 horas. Los nematodos por movimiento propio atravesarán el papel filtro y
sedimentarán en la parte inferior del embudo. Las partículas de suelo
37
quedarán retenidas en el papel filtro. Debe evitarse que los borde del papel
sobrepasen el diámetro del embudo.
7. Terminado el periodo de espera, habrá las pinzas mohr, recoja en un frasquito unos 10 ml del agua del fondo que contiene los nematodos.
8. observe bajo el microscopio estereoscópico los nematodos colectados.
RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
Haga dibujos detallados de los nematodos encontrados e identifíquelos
mediante la comparación de su morfología con los manuales y libros.
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FERMENTACIÓN Fecha _____________________
ANTECEDENTES
El complemento de la fotosíntesis es la respiración, pues los productos de uno son empleados en el otro y viceversa, formando un ciclo de vital
importancia, pues gracias a ellas se produce ATP, que es la molécula
energética de los organismos. Todos los seres vivos respiran, sean bacterias, protozoarios, hongos, vegetales o animales. Sin embargo, no todos lo hacen
de la misma manera; hay organismos que no requieren el oxígeno para poder
respirar, incluso en su presencia pueden morir. Éste tipo de organismos reciben el nombre de anaerobios.
La fermentación, es también conocida como respiración anaerobia, es la
respiración que se realiza en ausencia de oxígeno y consiste en el rompimiento de compuestos orgánicos granes (azucares) formándose
compuestos pequeños que contienen menos energía química que las
moléculas con que se inicia el proceso. En ésta vía metabólica la glucosa se
rompe en dos moléculas de ácido pirúvico; cada molécula de este ácido tiene tres átomos de carbono y además se producen dos moléculas de CO2 y dos
moléculas de ATP.
Las variantes de la fermentación se refieren al destino del ácido pirúvico. Por ejemplo, en las células animales (cuando la ausencia de oxígeno impide la
respiración aerobia), este ácido se convierte en ácido láctico. En células
vegetales, levaduras y algunas bacterias que tienen condiciones pobres de oxígeno, el ácido pirúvico se convierte en CO2 y etanol.
OBJETIVOS: Conocer el proceso de fermentación, a través de la degradación de la glucosa
hasta la obtención de CO2
MATERIAL: 5 tubos de ensayo grandes
5 tubos de ensayo pequeños
1 gradilla 1 balanza
1 probeta de5 ml
Levadura de pan Suspensión de levaduras en sacarosa al 5%
Jugo de naranja, manzana o uva
PROCEDIMIENTO:
1. Con uno de los tubos de ensayo grandes mide primero con agua el
volumen necesario para que el jugo cubra ¾ partes del tubo.
2. Coloca en los cinco tubos de ensayo grandes la misma cantidad de jugo de fruta. Cada equipo puede realizar la experiencia con diferente jugo.
3. Etiqueta y numera cada uno de los tubos.
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4. Pesa las siguientes cantidades de levadura: 1.0g, 1.5g, 2.0g, 2.5g y 3.0g.
5. Agrega las diferentes cantidades de levadura a cada tubo de ensayo.
6. Introduce los tubos pequeños, boca abajo, en los tubos grandes. Debes llenar el tubo pequeño con la mezcla del jugo y levadura, procurando que no
quede ninguna burbuja de aire.
Para llenar los tubos pequeños con la mezcla del tubo grande introdúcelo en
este último inclinándolo, después mueve lentamente el tubo hacia abajo. Cuando ambos tubos estén en posición horizontal enderézalos, de ésta
manera el tubo pequeño se llenará con el contenido del tubo grande.
7. espera de 20 a 40 minutos el experimento; al término de este tiempo mide con una regla milimétrica la longitud de la burbuja de cada tubo.
RESULTADOS: Haz aquí tus esquemas y anota tus observaciones.
Con tus resultados elabora la siguiente gráfica:
g. de levadura
CUESTIONARIO.
1. ¿Qué puedes concluir acerca de la relación entre la cantidad de
sustrato y la producción de
CO2?______________________________________________________ ____________________________________________________________________________
__
2. ¿Qué usos industriales tienen el proceso de fermentación?_______________
3. ¿Qué tipo de organismos son las levaduras?
Conclusiones:
Longitud de la
burbuja en
mm
Cantidad Número de tubo de levadura
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CONTROL BIOLÓGICO
PRUEBAS DE ANTAGONISMO Fecha ____________
INTRODUCCIÓN
El uso de agroquímicos ha permitido obtener incrementos en la producción no obstante sus efectos adversos están impactando de manera significativa la
sostenibilidad de la agricultura. La práctica del monocultivo y la
contaminación por el uso indiscriminado de agroquímicos han reducido la biodiversidad de los agroecosistemas, causando la inestabilidad de los
mismos, la cual se manifiesta en otros efectos nocivos, en una mayor
incidencia de plagas y enfermedades en los cultivos, esto y los problemas de seguridad pública inherentes a la fabricación y uso de agroquímicos han
conducido a la búsqueda y establecimiento de alternativas de manejo y
enfermedades. Así surge el interés por el control biológico que puede
definirse como “cualquier forma de control que reduce la incidencia o severidad de la enfermedad o incrementa la producción del cultivo aun
cuando no haya aparentemente un efecto significativo en la reducción de la
enfermedad o inóculo y su impacto nocivo en el ambiente sea mínimo o nulo.
Los agentes de control biológico de plagas del suelo son bacterias, hongos y otros organismos no patógenos que compiten por el espacio y los nutrientes
de patógenos o son antagónicos de alguna manera contra éstos en el área de
la rizósfera y, en algunos casos, pueden actuar como protectores contra
posibles infecciones de la raíz.
Varios ejemplos de patógenos como Sclerotium rolfsii Socc, Rhizoctonia solani y Pythium spp. han sido controlados biológicamente utilizando antagonistas
como Trichoderma spp, Penicillium spp, Aspergillus spp y algunas bacterias.
OBJETIVO: El alumno conocerá la capacidad antagónica de los organismos para controlar el crecimiento de otro.
Para la evaluación comparativa de la actividad antagónica en cultivos duales
se utilizaran como Fitopatógenos Sclerotium sepivorum, Fusarium spp y Botritis cinérea y como potenciales biocontroladores serán evaluados
Trichoderma spp., y Bacillus subtilis.
MATERIAL Y EQUIPO NECESARIO:
1. Cajas con medio de cultivo PDA 2. Campana de flujo laminar 3. Navaja con bisturí 4. Cepas fitopatógenos
5. Cepas antagónicas
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PROCEDIMIENTO
1. De la periferia de las colonias se cortan discos con sacabocados de 0.5
cm de diámetro que serán transferidos a caja petri con PDA en posiciones
opuestas de tal modo que queden enfrentadas uno del fitopatógeno y otro del
antagonista a probar en cada tratamiento. 2. Para la siembra de Bacillus subtilis se realiza por estría a lo largo del
medio de cultivo en un extremo y en el otro extremo un disco de 0.5 cm
tomado del borde del crecimiento del fitopatógenos. 3. Cada prueba debe realizarse con tres repeticiones como mínimo.
4. Se realizará la siembra de un testigo que consistirá en el crecimiento
de los distintos aislamientos de fitopatógenos sin la presencia de antagonistas.
5. Las cajas serán mantenidas en incubación a una temperatura de 25 -
27⁰C.
6. Se medirá el diámetro de las colonias a las 24, 48 y 72 horas
efectuándose un análisis de varianza y prueba de Tukey de los valores
obtenidos.
RESULTADOS:
Observe las placas bajo lupa y/o microscopio. Describa las alteraciones que
se observan. RESULTADOS:
Mediante una grafica reporte los resultados
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BIBLIOGRAFÍA:
Cúndom, María A. - Mazza, Silvia - Gutiérrez, Susana A. - Mazzanti de
Castañón, María A. Evaluación de Tricoderma spp. contra Rhizoctonia solani in vitro e ivernáculo Cátedra de Fitopatología - Facultad de Ciencias Agrarias –.E:mail: [email protected].
E. Savaleta Mejía. 1999. Alternativas de manejo de las enfermedades de las
plantas. Terra latinoamericana. Julio-septiembre año/vol. 17, núm. 003.
Gaviño de la Torre Gonzalo.1993. Técnicas Biológicas Selectas de Laboratorio y de Campo. Editorial Limusa S. A. de C. V. Primera edición pag.147-
155.