reactividad de nanopartículas metálicas con biomoléculas y microorganismos de ... ·...
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Centro de Investigación de Materiales Avanzados, S.C.
"Reactividad de Nanopartículas Metálicas con Biomoléculas y Microorganismos de Importancia
Ambiental".
Tesis para obtener el grado de
Maestro en Ciencias en Tecnología Ambiental.
Presenta
Ing. Químico Elva Beatriz Díaz Duarte
Directora de tesis
Dra. María Antonia Luna Velasco
Chihuahua, Chih., México, Marzo de 2015.
1
INDICE GENERAL
INDICE DE TABLAS. ........................................................................................................... 3 INDICE DE FIGURAS........................................................................................................... 3
AGRADECIMIENTOS ........................................................................................................ 4
LISTA DE ABREVIATURAS. .............................................................................................. 6
RESUMEN ............................................................................................................................ 7
ABSTRACT ........................................................................................................................... 9
1. INTRODUCCION .......................................................................................................... 11
2.MARCO TEORICO ........................................................................................................ 13
2.1 Origen de las NPs. ........................................................................................................... 13
2.1.1 NPs de origen natural. .................................................................................................. 13 2.1.2 NPs de origen antropogénico. ...................................................................................... 13
2.2 Clasificación de los nanomateriales. ............................................................................... 13
2.3 Aplicaciones de los Nanomateriales. .............................................................................. 14
2.4 Toxicidad de las nanopartículas. ..................................................................................... 14
2.5 Mecanismos de toxicidad. ............................................................................................... 15
2.6 Especies reactivas de Oxigeno (ROS). ........................................................................... 16
2.7 Defensa celular contra ROS. ........................................................................................... 17
2.8 Oxidación de proteínas. .................................................................................................. 18 2.9 Tipos de oxidación de las proteínas. ............................................................................... 19
2.10 Microorganismos de suelos agrícolas. .......................................................................... 20
2.11 Compuestos fenólicos en suelos agrícolas. ................................................................... 22
2.1 Ácidos fenólicos. ............................................................................................................. 22
3. JUSTIFICACION ........................................................................................................... 24
4. HIPOTESIS ..................................................................................................................... 26
5. OBJETIVOS .................................................................................................................... 27
5.1Objetivo general: .............................................................................................................. 27 5.1.1Objetivos específicos: ................................................................................................... 27
6. MATERIALES Y MÉTODOS. ..................................................................................... 28
6.1 Síntesis de nanopartículas. .............................................................................................. 28
6.1.4 Nanopartículas de paladio. ........................................................................................... 29
6.1.5 Nanopartículas de platino e hierro. .............................................................................. 29
2
6.2 Caracterización de NPs. .................................................................................................. 29
6.2.1 Dispersiones de NPs. ................................................................................................... 30
6.2.2 Dispersiones patrón: análisis de microscopía electrónica de barrido (SEM). ............. 30
6.2.3 Dispersiones patrón: ensayos reactividad y exposición de células .............................. 30
6.2.4 Microscopia electrónica de barrido acoplada a EDS. .................................................. 30
6.2.5 Difracción de rayos X. ................................................................................................. 30 6.4.6 Composición elemental. ............................................................................................... 31
6.5 Determinación de ROS extracelular. ............................................................................. 31
6.6 Determinación de la oxidación de proteínas extracelulares. ........................................... 32
6.7 Determinación de ROS intracelular. ............................................................................... 32
6.8 Extracción, cuantificación y oxidación de proteínas intracelulares. ............................... 34
7. RESULTADOS. .............................................................................................................. 36
7.1 Caracterización de NPs. .................................................................................................. 36
7.3 Oxidación de proteínas por NPs. .................................................................................... 46
7.4 Generación de ROS intracelular por NPs. ...................................................................... 47 7.5 Cuantificación de ROS intracelular. ............................................................................... 49
7.5 Oxidación proteínas intracelulares. ................................................................................. 55
8. DISCUSIÓN DE RESULTADOS. ................................................................................. 57
8.1 Síntesis y caracterización de NPs. .................................................................................. 57
8.2 Generación de ROS extracelular. .................................................................................... 57
8.3 Oxidación de la proteína BSA por NPs inorgánicas. ...................................................... 59
8.4 Generación de ROS intracelular. .................................................................................... 59
8.5 Oxidación de proteínas de B. subtilis y P. ananatis expuestas a NPs. ........................... 62 9. CONCLUSIONES. ......................................................................................................... 63
10. RECOMENDACIONES. ............................................................................................. 64
11. BIBLIOGRAFÍA. ......................................................................................................... 65
3
INDICE DE TABLAS. Tabla 1. Concentración esperada y real de NPs en las dispersiones obtenidas de la reacción de síntesis y rendimiento de las reacciones ......................................................................... 367
INDICE DE FIGURAS. Figura 1.- Estructuras químicas del catecol y el ácido cumárico. ..................................... 22
Figura 2.- Micrografías de las NPs inorgánicas tomadas en el SEM utilizadas en la investigación y sus respectivos difractogramas de rayos X. .............................................. 40
Figura 3.- Tratamiento con NPs de Pd en interacción con compuestos fenólicos. ........... 41
Figura 4.- Tratamiento con NPs de Fe en interacción con compuestos fenólicos. ........... 42
Figura 5.- Oxidación del indicador para ROS DCF en presencia de catecol solo y en interacción con NPs inorgánicas en un tiempo promedio de 33 horas. ............................. 44
Figura 6.- Oxidación del indicador para ROS DCF en presencia de ácido cumárico solo y en interacción con NPs. ...................................................................................................... 45
Figura 7.- Oxidación de las proteínas BSA mediante la formación de grupos carbonilo en presencia de NPs inorgánicas. ............................................................................................ 46
Figura 8.- Imágenes de microscopía confocal de B. subtilis expuesta a 50 y 500 mg L-1 NPs de CuO durante 2 h (panel A) y 24 h (Panel B). ........................................................ 48
Figura 9.- Imágenes de microscopía confocal de S. aureus (Panel A) y P. annanatis (Panel B) sin exponer a NPs (control) y expuestos a 500 mg L-1 de NPs CuO y Ag durante 24 h. ....................................................................................................................... 49
Figura 10. Oxidación del indicador ROS en B. subtilis expuesto a NPs 50 mg L-1 durante 2 y 24 h. .............................................................................................................................. 50
Figura 11. Oxidación del indicador ROS en B. subtilis expuesto a 500 mg L-1 de NPs durante 2 y 24 h. ................................................................................................................. 51
Figura 12. Oxidación del indicador ROS en S. aureus expuesto a 500 mg L-1 de NPs durante 2 y 24 h. ................................................................................................................. 53
Figura 13. Oxidación del indicador ROS intracelular en P. ananatis expuesta a NPs 500 mg L-1 en dos periodos de tiempo. ………………………………………………………54
Figura 14.- Formación de grupos carbonilo por la oxidación de proteínas de B. subtilis expuesto a las NPs durante 24 h. ........................................................................................ 55
Figura 15.- Formación de grupos carbonilo por la oxidación de proteínas de P. ananatis expuesto a las NPs durante 24 h. ........................................................................................ 56
4
AGRADECIMIENTOS:
Primero quiero agradecerle a Dios, por sostenerme en los momentos más difíciles y por no
abandonarme nunca, aun y cuando renegaba de lo que me tocaba hacer o vivir, por darme la
fuerza necesaria cada vez que a travesé un momento difícil, por darme claridad y
permitirme crecer como ser humano.
A mi marido Héctor por ser mi fuerza, por tenerme paciencia en mis momentos de estrés y
preocupación, por ser mi compañero y mi pilar, por sus palabras de aliento y no dejarme
desistir, por escucharme aunque no entendiera de lo que hablaba, él es quien me da animo
cada día para lograr mis metas y recordarme que yo no me dejo vencer fácilmente, me
comprende pero sobre todo me apoya y me hace feliz.
A mi hija Helena por ser mi motor, porque cuando más frustrada llegue a sentirme con una
sola sonrisa hizo que me olvidara de los malos momentos, por ser mi principal motivo para
querer superarme, porque quiero que este orgullosa de mi, pero sobre todo porque gracias a
ella eh tenido la entereza para no desistir.
A mis padres ya que sin su apoyo yo no estaría aquí, porque aunque a veces no me
entienden en mis decisiones siempre están ahí para mí, porque se han desvelado conmigo,
han dejado todo lo que conocen por seguirme y porque gracias a ellos soy lo que soy.
A mis hermanos por preguntarme siempre como me siento o como estoy, por preguntarme
por mi trabajo aun y cuando no entienden muchas veces de lo que hablo pero muestran su
interés, a toda mi familia que aunque están lejos no dejan de apoyarme.
A la Doctora Antonia Luna por tomarme como su alumna, por ser no solo mi asesora si no
también mi maestra y por tomarse el tiempo de enseñarme y explicarme cuando no entendí
algún tema, por su paciencia y por su apoyo muchas gracias.
A CONACyT por el apoyo económico brindado durante mi maestría y por permitirme
cumplir esta meta, a CIMAV por permitirme ser parte de esta institución y ser pilar en mi
formación.
5
A mis compañeros de laboratorio Juan, Olga, Gema, Sandra y Adriana por ayudarme y ser
apoyo moral en momentos complicados durante la etapa de experimentación, a la Doctora
Hilda Piñon por compartir conmigo su conocimiento sobre equipos y técnicas.
A los técnicos e investigadores de CIMAV que en algún momento tomaron el rol de
maestros, por su tiempo muchas gracias.
A mi amiga Karen que es la única que me entiende en mis momentos de crisis
existenciales, gracias. A mis amigos en general por ser apoyo moral en momentos
complicados.
A todos aquellos que fueron parte de mi formación muchas gracias, todos han sido una
parte importante de este camino.
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LISTA DE ABREVIATURAS.
ATCC.- American Type Culture Collection.
ADN.- acido desoxirribonucleico.
DCF.- diclorofluorescina.
DCFH DA.- diclorodihidrofluoresceina de acetato.
DCFH.- diclorodihidrofluoresceina.
DNPH.- dinitrofenilhidrazina
ECCM.- European Culture Collections.
GSH.- glutatión.
GSSG.- disulfuro de glutatión.
ELISA.- Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ensayo por inmunoabsorción ligado a
enzimas)
NADPH.- nicotinamida adenina dinucleótido fosfato.
NMs.- nanomateriales.
NPs.- nanopartículas.
ROS.- Reactive oxygen species (especies reactivas de oxigeno)
SOD.- Súper oxido dismutasa.
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RESUMEN
La nanotecnología se está desarrollando muy rápido y actualmente hay varios productos en
el mercado que contienen nanopartículas (NPs), desde geles antibacteriales con NPs de Ag
hasta circuitos de dispositivos electrónicos con NPs de Au. Lo anterior ha motivado a
estudiar el efecto de los nanomateriales en el ambiente y salud humana. A la fecha, varios
estudios han reportado la toxicidad de NPs hacia sistemas biológicos, la cual puede variar
dependiendo de sus características fisicoquímicas y de su interacción con componentes en
medios biológicos. Así como de la capacidad de las NPs de generar especies reactivas de
oxigeno (ROS), ya que este se ha identificado como uno de principales mecanismos de
toxicidad.
En esta investigación el objetivo fue evaluar la reactividad de nanopartículas metálicas en
interacción con biomoléculas y microorganismos de importancia ambiental. Las NPs
evaluadas fueron, Au, Ag, CuO y Pd, Pt y Fe. Estas se sintetizaron (a excepción de Pt y Fe)
y se caracterizaron en cuanto a morfología, tamaño, fase cristalina, composición y análisis
elemental, mediante microscopia electrónica de barrido (SEM) acoplada a espectrometría
de dispersión de energía de rayos X, difracción de rayos X (DRX) y espectrometría de
emisión óptica con plasma inductivamente acoplado (ICP-OES). La reactividad de las NPs
se midió a través de la generación de ROS mediado por biomoléculas fenólicas y por la
oxidación de la proteína BSA. También se evaluó la generación de ROS y oxidación de
proteínas intracelular en células aisladas de suelos agrícolas (B. subtilis, S. aureus y P.
ananatis), expuestas a las NPs. La generación de ROS se midió a través del indicador
clorodihidrofluoresceina (DCFH), el cual se oxida por ROS a su compuesto altamente
fluorescente clorodihidrofluorescina (DCF). La detección de ROS se realizó por
espectroscopia de fluorescencia y en ROS intracelular se complementó con microscopia
confocal. La oxidación de proteínas se midió por la formación de grupos carbonilo
mediante un ensayo ELISA, que se basa en la formación de un complejo de los grupos
carbonilo con dinitrofenilhidrazina detectados a 480 nm.
Los resultados indicaron que la interacción de NPs con los compuestos fenólicos
incrementó la generación de ROS. Las NPs que generaron ROS más rápido en interacción
con compuestos fenólicos fueron las de Pd, seguido de CuO, Pd, Pt, Au, Fe y Ag. Las NPs
de Au y Ag solas, también oxidaron considerablemente el indicador ROS. La oxidación de
8
la proteína BSA fue mayor cuando interaccionó con las NPs de Au y Pt, seguidas de Ag, Pd
y Fe, mientras que el CuO no oxidó esa proteína. En cuanto a la generación de ROS
intracelular, esta fue mucho mayor en las células expuestas a NPs de CuO comparado con
el resto de NPs. La oxidación de proteínas intracelulares se evaluó en células expuestas a
algunas de las NPs más reactivas (Au, Pt y CuO), notándose mayor oxidación por las NPs
de Au y CuO.
La NPs con mayor reactividad química (ej. Au, Ag, CuO, Fe) también tuvieron mayor
reactividad en células aisladas de suelos agrícolas. Además la reactividad química de NPs
se incrementó con la presencia de compuestos fenólicos presentes en suelos agrícolas, por
lo que estos resultados pueden proyectar el daño hacia la biota o microorganismos
autóctonos de suelos agrícolas, incluyendo aquellos involucrados en ciclos biogeoquímicos
o en la calidad del suelo.
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ABSTRACT
Nanotechnology is an area in continious developing and currently there are several products
on the market that contain NPs, from antibacterial gels with Ag NPs to electronic circuit
devices with Au NPs. This has led to study the effects of nanomaterials on the environment
and human health. To date, several studies have reported the toxicity of NPs towards
biological systems, which can vary depending on their physicochemical characteristics and
their interaction with components in biological media. As well as the ability of NPs to
generate reactive oxygen species (ROS), since it has been identified as one of main
mechanisms of toxicity.
In this study the objective was to evaluate the reactivity of metal nanoparticles interacting with biomolecules and microorganisms of environmental relevance. The NPs evaluated were Au, Ag, CuO, Pd, Pt and Fe. All NPs were synthesized (except for Pt and Fe) and characterized in morphology, size, crystalline phase, composition and elemental analysis, by means of scanning electron microscopy (SEM) coupled with enegy-dispersive X-ray spectroscopy, X-ray diffraction (XRD) and inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES). NPs reactivity was measured through ROS generation mediated by phenolic biomolecules and the oxidation of BSA protein. The intracelular generation of ROS and oxidation of proteins was also evaluated using cells from agricultural soil (B. subtilis, S. aureus and P. ananatis) and exposed to NPs. The ROS generation was measured through the indicator clorodihidrofluoresceina (DCFH), which is oxidized by ROS to its highly fluorescent compound clorodihidrofluorescina (DCF). Detection of ROS was performed by fluorescence spectroscopy and intracellular ROS was complemented by confocal microscopy. Protein oxidation was measured through the formation of carbonyl groups by an ELISA assay, which is based on the formation of a complex of carbonyl groups with dinitrophenylhydrazine detected at 480 nm.
The results indicated that the interaction of NPs with phenolic compounds increased the generation of ROS. The NPs Pd interacting with phenolic compounds generated ROS faster than all other NPS, followed by CuO, Pd, Pt, Au, Ag and Fe. The NPs alone also significantly oxidized the ROS indicator, being Ag and Au NPs the ones with higher oxidation. In the case of BSA oxidation, it was higher when protein interacted with Pt and Au NPs, followed by Ag, Pd and Fe NPs. While CuO NPs did not oxideze the protein. Related to intracellular ROS generation, CuO NPs caused much higher ROS compared with all other NPs. Intracelular protein oxidation was evaluated in cells exposed to the most reactive NPs (Au, Pt and CuO) and major oxidation was noted by Au and CuO NPs.
The NPs with high chemical reactivity (eg. Au, Ag, CuO, Fe) also had a higher reactivity in cells isolated from agricultural soils. Besides the chemical reactivity of NPs increased with the presence of phenolic compounds in agricultural soils, so these results can project the
10
damage to the biota or indigenous microorganisms in agricultural soils, including those involved in biogeochemical cycles or soil quality
11
1. INTRODUCCIÓN.
La nanotecnología es el diseño, caracterización, producción y aplicación de materiales,
dispositivos y sistemas, mediante el control de forma y tamaño a escala nanométrica. Esta
tiene tres aspectos: (1) Un procedimiento de fabricación universal; (2) Una forma particular
de diseñar, modelar y fabricar materiales, dispositivos y sistemas; (3) Creación de
productos novedosos (Ramsden, 2014).
Hoy en día, varios productos a base de nanotecnología se encuentran disponibles en el
mercado, que van desde dispositivos electrónicos, construcción, catalizadores,
recubrimientos antibacterianos, medicamentos, textiles, etc. El desarrollo de la
nanotecnología por un lado permite productos nuevos y soluciones a problemas sociales
relacionados con recursos naturales, como tratamiento de agua, generación y
almacenamiento de energía, fertilizantes, etc. (PEN, 2005); y por otro lado se plantea la
problemática que podría ocasionar a la salud y al medio ambiente por la posible liberación
y exposición de nanomateriales (NMs).
Las propiedades fisicoquímicas de los materiales en tamaños nanométricos, como área
superficial grande, composición y carga de superficie, dictan en gran medida el alcance y
tipo de interacción con sistemas biológicos. Por ejemplo la rapidez de su absorción (Soenen
et al., 2011) o penetración en células.
Durante las últimas dos décadas las investigaciones sobre la toxicidad de NMs ha
aumentado de menos de 10 publicaciones antes de 1998 a más de 200 en 2010 (Kuhlbusch
et al., 2011). En esos estudios se ha evaluado el impacto de diferentes tipos de NMs hacia
microorganismos, células, tejidos y organismos (Kumar et al., 2011; Chow el al., 2011).
También se han propuesto diferentes mecanismos de toxicidad, como necrosis, apoptosis y
estrés oxidativo entre otros. (Kang et al., 2007; Stoimenov et al., 2002; Luna-Velasco et al.,
2011).
El estrés oxidativo causado por especies reactivas de oxigeno (ROS, peróxido de hidrogeno
H2O2, ion superóxido O-2 y el radical hidroxilo H-) es considerado un mecanismo
importante de toxicidad por NPs. En los sistemas biológicos la generación de ROS por NPs
puede generarse por un proceso químico que implica la interacción de las NPs con el O2 y
biomoléculas presentes en biomoléculas (Luna-Velasco et al., 2011). Las proteínas son las
12
biomoléculas más abundantes en células y por tanto más expuestas al estrés oxidativo. De
modo que, la evaluación de la oxidación/daño de proteínas por las NPs es importante en
estudios de toxicidad, para obtener conocimientos fundamentales sobre los mecanismos de
toxicidad (Sun et al., 2012). Con respecto a las biomoléculas fenólicas, estas son muy
susceptibles de oxidación y en ese proceso se puede incrementar la generación de ROS.
El estudio de la reactividad química de NPs con proteínas y biomoléculas fenólicas puede
dar un indicativo del potencial de toxicidad de las NPs evaluadas, lo cual se puede
contrastar y correlacionar con la generación ROS y oxidación de proteínas a nivel
intracelular.
13
2. MARCO TEORICO
2.1 Origen de las NPs.
Las NPs presentes en el ambiente pueden tener un origen natural o antropogénico, el cual
dependerá del proceso de formación.
2.1.1 NPs de origen natural.
Son las que se formaron de manera involuntaria en la naturaleza. Algunas son de origen
biológico como los virus y las bacterias con los que el ser humano interactúa diariamente,
otras pueden ser de origen mineral como los polvos finos que se encuentran expuestos en
los jales de las minas, o polvos finos desprendidos de las rocas por el desprendimiento
generado por el viento o la arena del desierto, otras de origen ambiental derivadas de los
humos provenientes de la actividad volcánica.
2.1.2 NPs de origen antropogénico.
Las nanopartículas generadas como consecuencia de la actividad humana pueden ser
liberadas o expuestas al ambiente de forman involuntaria, como las que se producen en
ciertos procesos industriales, como la pirolisis a la llama del negro de carbono, producción
de materiales a gran escala por procedimientos a altas temperaturas (como el humo sílice,
partículas ultra finas de óxido de titanio y metales ultra finos), procesos de combustión
(diésel, carbón), obtención de pigmentos, o en procesos domésticos (barbacoas, humos de
aceite).
Al ser la nanotecnología una de las ciencias con mayor crecimiento en los últimos años se
estima que los gobiernos alrededor del mundo han gastados alrededor de 18 billones de
dólares entre 1997 y 2005 (Thayer, 2006). Para el año 2015 se estima un costo aproximado
de un trillón de dólares para el desarrollo de productos a partir de la nanotecnología en todo
el mundo (Roco, 2005)
2.2 Clasificación de los nanomateriales.
Los nanomateriales manufacturados se clasifican de manera general en base a su
composición. A continuación se indican los cuatro grupos de NPs de acuerdo la Agencia
del Medio ambiente en los Estados Unidos (Elsaesser y Howard, 2011).
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• A base de carbono.- son los que están formados con un gran porcentaje de carbono,
y donde suelen adoptar formas como esferas huecas, elipsoides o tubos, por ejemplo
los nanotubos de carbono y los fulerenos.
• Basados en metal.- son aquellos nanomateriales que incluyen puntos cuánticos,
metálicos como nanopartículas de oro y plata y óxidos metálicos como el dióxido de
titanio.
• Dendrímeros.- estos nanomateriales tienen la característica de ser polímeros
construidos a partir de unidades ramificadas.
• Compuestos.- este tipo de nanomateriales tiene la capacidad de combinar
nanopartículas con otras similares o con materiales de mayor tamaño.
2.3 Aplicaciones de los Nanomateriales.
El desarrollo de la nanotecnología en conjunción con la biotecnología se ha expandido
significativamente en la aplicación y dominio de las nanomateriales en varios campos.
Algunos de los más utilizados son los nanotubos de carbono tanto de pared sencilla como
de pared múltiple, NPs de Fe magnetizadas, NPs de Au, Ag, CuO, Zn, ZnO, TiO2, Ce2O3.
Las aplicaciones de los nanotubos de Carbono van desde equipos electrónicos,
optoelectrónica, sensores tanto mecánicos, térmicos y electromagnéticos, Las NPs de
origen metálico se utilizan en productos antibacteriales (Au y Ag), pigmentos, tintas y
circuitos electrónicos, mientras que en el área de la agricultura se utilizan por ejemplo las
NPs de Ag para mantener sanos a los frutos (Avalo et al., 2013) o las NPs de TiO2 que se
han utilizado exitosamente en tratamientos para la eliminación de aceites, agroquímicos y
productos de desecho en el agua (Molins, 2008), eliminando así la contaminación para
poder reutilizarla.
2.4 Toxicidad de las nanopartículas.
El desarrollo acelerado de la nanotecnología y la creciente producción de nanopartículas ha
despertado gran interés en conocer los riesgos potenciales de estos en el ambiente y la salud
humana. (Kuhlbusch et al., 2011). El tamaño nanométrico de las NPs se acerca al tamaño
de biomoléculas como proteínas, lípidos, etc. Esta característica hace que puedan
interactuar con componentes celulares como membranas o pared celular e internalizarse en
las células, lo cual no ocurre con la mayoría de partículas de tamaños micrométricos (≥100
15
nm) (Soenena et al., 2011). También las propiedades fisicoquímicas de las NPs contribuyen
al grado de toxicidad en sistemas biológicos (Sun et al., 2012). Así, su forma, tamaño, tipo
de material, pureza, área superficial, carga eléctrica, características estructurales, dosis, vía
de administración, concentración en el órgano diana y duración de la acción, son algunas de
las variables que van a determinar la toxicidad (Elsaesser y Howard, 2011). La cual
depende, entre otros factores, de su persistencia biológica para secuestrar o eliminar estos
sistemas (Gutiérrez-Praena et al., 2009).
Actualmente varios estudios han indicado la toxicidad de nanomateriales en células,
microorganismos y organismos modelos, como la interacción de NPs de CuO Con E. coli
en diferentes dosificaciones, observándose inhibición en el crecimientos de estas a partir de
150 mg L-1 y (Gunawan et al., 2011), Ag con microorganismos como E. coli (McShan et al.,
2012), HfO2 con queratinocitos humanos (Field et al., 2011) y Ag con P. aeruginosa y S.
pyrogens (Su et al., 2009). Los estudios de toxicidad de NPs con bacterias son
relativamente menos que en células humanas, Las bacterias que se han utilizado como
modelo son principalmente E. coli y B. subtilis (Jiang et al., 2009) (Wang et al., 2011)
(Palletier et al., 2010).
2.5 Mecanismos de toxicidad.
La toxicidad de los nanomateriales se ha estudiado en diferentes sistemas biológicos como
líneas celulares humanas y en distintos organismos y los estudios coinciden en que la
toxicidad depende de las características fisicoquímicas propias de cada nanopartícula (Fu et
al., 2014). Incluso las partículas del mismo material pueden mostrar comportamiento
completamente diferente debido a pequeñas diferencias en el revestimiento superficial,
carga o tamaño. Esto hace que la categorización de las nanopartículas y su comportamiento,
al entrar en contacto con los sistemas biológicos, no sea sencillo (Elsaesser y Howard,
2011).
Los mecanismos de toxicidad no están totalmente elucidados para la mayoría de las NPs.
Los que principalmente se han señalado son la disrupción de membranas o del potencial de
membrana que es la separación de cargas positivas y negativas a través de una membrana
celular (Vásquez, 2010), la oxidación de proteínas, genotoxicidad, interrupción en la
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transmisión de energía, formación de especies reactivas de oxígeno y liberación de iones o
componentes tóxicos (Gutiérrez-Praena et al., 2009).
Uno de los mecanismos de toxicidad más común en células o microorganismos que
interactúan con nanomateriales inorgánicos, es la generación de ROS. Por ejemplo, las NPs
de ZnO y TiO2, tienen la capacidad de donar o aceptar electrones en su interacción con
sistemas biológicos aerobios, donde una pequeña parte del oxígeno no se reduce por
completo resultando en la formación de radicales como el anión superóxido, oxigeno
singlete, radical hidroxilo, entre otros (Fu et al., 2014). Estudios anteriores han indicado la
generación de ROS al interaccionar NPs inorgánicas como CuO y CeO2 con compuestos
fenólicos como catecol y L-dopa (Luna-Velasco et al., 2011) y también al interaccionar con
células como E. coli (Kumar et al., 2011).
2.6 Especies reactivas de Oxigeno (ROS).
En la generación de ROS el oxígeno juega un papel importante, ya que puede aceptar
electrones para formar derivados inestables, entre los principales se encuentran el radical
superóxido (O2-), el peróxido de hidrogeno, el radical hidroxilo (�OH) y el oxígeno singlete
(1O2).
La primera ROS que se forma con la oxidación del oxígeno es el radical O2-. Debido a
sus propiedades de solubilidad el O2- produce un daño considerable a los componentes
fosfolípidos de las membranas. Cuando se genera O2- en un ambiente acuoso, este
reacciona consigo mismo para dar lugar a O2 y peróxido de hidrógeno (H2O2) como se
muestra en la ecuación 1:
2H! + O!! O! + H!O! (1)
El H2O2 no es un radical ya que no tiene electrones desapareados. La reactividad limitada
del H2O2 le permite cruzar las membranas y dispersarse generalizadamente. La
consiguiente reacción del H2O2 con el Fe2+ (u otros metales de transición) da lugar a la
producción del radical �OH, una especie muy reactiva (ec. 2).
Fe!! + H!O! Fe!! + OH. + OH! (2)
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El radical hidroxilo, que es muy reactivo, se difunde a una distancia corta antes de
reaccionar con cualquier molécula con la que choque. Es así que al reaccionar el radical
superóxido con el hidrógeno se forma el oxígeno singlete (1O2) que es otra forma de ROS.
Este último no es un radical, aunque es más reactivo que el radical hidroxilo y por tanto es
un potente oxidante (McKee y McKee, 2003).
En la ecuación 3, se indica que un estado muy excitado de oxígeno se crea cuando el
dioxígeno absorbe energía suficiente para desviar un electrón desapareado a un orbital
superior, esto puede ocurrir a partir de un superóxido. También, en la ecuación 4 se puede
observar la formación general del oxígeno singlete a partir de un radical:
2O!! + 2H! H!O! + 𝑂! ! (3)
2ROOH 2ROH+ 𝑂! ! (4)
2.7 Defensa celular contra ROS.
La desintoxicación ROS es un proceso requerido en todas las formas de vida aerobias.
Como tal un número de mecanismos de defensa han evolucionado para cumplir con esta
necesidad y proporcionar un balance entre la producción y la remoción de las ROS.
Las células tienen una variedad de mecanismos de defensa para mejorar los efectos nocivos
de ROS. El mecanismo más importante se basa en la enzima superóxido dismutasa (SOD)
que cataliza la conversión de dos aniones superóxido en una molécula de peróxido de
hidrógeno (H2O2) y el oxígeno (O2). Luego, la enzima catalasa convierte H2O2 en agua y
oxígeno, y completa así la desintoxicación iniciado por SOD. Estos mecanismos ocurren
por ejemplo, en los peroxisomas de las células eucariotas. La glutatión peroxidasa es un
grupo de enzimas que contiene selenio, que también catalizan la degradación del peróxido
de hidrógeno, así como peróxidos orgánicos a alcoholes. Los antioxidantes también juegan
un papel en la desintoxicación celular por ROS. Estas son moléculas pequeñas no
enzimáticas, como el glutatión, el cual puede ser el más importante a nivel intra-celular.
Este tripéptido (glutamil-cisteinil-glicina) proporciona un grupo expuesto sulfidrilo, que
sirve como un blanco abundante contra ROS, lo cual causa la oxidación del glutatión. El
cual posteriormente es regenerado o reducido por una reductasa NADPH. La relación de la
forma oxidada del glutatión (GSSG) y la forma reducida (GSH) es un indicador de la
18
dinámica del estrés oxidativo de un organismo (Held., 2012). La vitamina C o ácido
ascórbico es otro antioxidante, soluble capaz de reducir ROS, mientras que la vitamina E
(α-tocoferol) es una molécula soluble en lípidos, que juega un papel similar en las
membranas.
La sobreproducción de ROS puede inducir al estrés oxidativo y causar, daño en la función
celular por la oxidación de proteínas, peroxidación de lípidos, ruptura de DNA,
modificación de ácidos nucleicos, modulación de la expresión genética y la modulación de
las respuestas inflamatorias a través de la transducción de señales que conducen a la muerte
celular y a la genotoxicidad (Fu et al., 2014).
2.8 Oxidación de proteínas.
De entre las biomoléculas que son más susceptibles a la oxidación generada por las ROS
(como el H2O2) se encuentran el DNA, proteínas, lípidos, hidratos de carbono etc. (Davies,
2005). Las proteínas son las biomoléculas más abundantes en las células y por tanto más
expuestas al estrés oxidativo (Sun et al., 2012).
El proceso de oxidación de proteínas por especies reactivas de oxigeno como intermediario,
causa una modificación covalente. En estudios anteriores se encontró que dependiendo del
tipo de ROS, existen dos tipos de oxidación en las proteínas, la específica que es una
oxidación catalizada por un metal que daña a las proteínas con cúmulos de hierro-azufre o
con hierro libre dándose la formación de radical hidroxilo; o la inespecífica que es una
(oxidación por radiación en la cual se produce el oxígeno singlete. (Díaz-Acosta y
Membrillo-Hernández, 2006).
Las modificaciones de las proteínas por su oxidación con ROS generan la perdida de
actividad catalítica, cambios en sus cadenas laterales de aminoácidos, alteración de la
estabilidad térmica, cambio en propiedades físicas como la viscosidad, se da una
fragmentación, y hay formación de enlaces covalentes inter o intraproteicos, etc. (Díaz-
Acosta y Membrillo-Hernández., 2006).
Algunos agentes que generan la oxidación en proteínas son:
• Formación de grupos carbonilo (lis, cis, arg, pro)
• Reactivos químicos (H2O2, Fe2+, glutatión, HOCl, HOBr, 1O2, ONOO- )
• Ruptura de enlaces peptídicos.
19
• Peróxidos lipídicos (HNE, MDA, acroleína).
• Mitocondria (cadena de transporte de electrones fuga).
• Enzimas Oxidoreductasa.
2.9 Tipos de oxidación de las proteínas.
Existen varios tipos de oxidación en las proteínas, los cuales se pueden clasificar en
oxidación reversible e irreversible. La oxidación reversible puede funcionar como una
forma de activación o desactivación de proteínas que cumplen la función de regulación
redox en las células. De acuerdo a investigaciones anteriores, la oxidación reversible es una
especie de modulador metabólico que se asocia con la estabilización de proteínas tanto intra
como extracelulares (Díaz-Acosta y Membrillo-Hernández., 2006; Cavia et al., 2007). Otro
tipo de oxidación reversible en las proteínas es la S-nitrosilación, que es un mecanismo de
los más importantes e implicado en la transmisión de señales en la célula. Este proceso se
basa en el óxido nítrico y sucede en la mayoría de sistemas biológicos, según lo que indican
estudios recientes (Guzmán et al., 2013).
Con respecto a la oxidación irreversible, hay varios mecanismos de oxidación entre los que
se encuentran: la nitración y carbonilación. En la primera, en términos generales se anexa
un grupo nitro a una proteína, por ejemplo cuando se adiciona un grupo nitro a la tirosina
que se encuentra como residuo en las proteínas, lo que puede provocar la muerte celular
(Franco et al., 2013). La carbonilación se refiere a la formación de carbonilos libres
principalmente en aminoácidos laterales arginina, lisina, prolina e histidina. Los grupos
carbonilo de proteínas, se utilizan como un biomarcador para identificar el daño generado
por el estrés oxidativo, la mayoría de los ensayos utilizados en la detección de los grupos
carbonilo formados durante la oxidación de proteínas implica la derivatización del grupo
carbonilo con el 2-4 dinitrofenilhidrazina (DNPH), el cual conduce a la formación de un
compuesto más estable que es la dinitrofenilhirazona. Los grupos carbonilo derivados con
DNHP pueden cuantificarse por colorimetría, particularmente en muestras con cantidades
de proteína mayores a las de muestras clínicas. Otros métodos mucho más sensibles, son
por medio de ensayo ELISA y de transferencia (“blotting”), los cuales se han aplicado en
muestras con 10 µg mL-1 como máximo (Alamdari et al., 2005).
20
2.10 Microorganismos de suelos agrícolas.
Como se notó antes, los estudios de toxicidad de NPs en microorganismos, en su mayoría
son con microorganismos de colecciones como la ATCC (colección americana de cultivos
tipo) o ECCM (Colección Europea de cultivos celulares). Considerando una liberación de
NPs en el ambiente, éstas interaccionarían con microrganismos nativos. De aquí el interés
en evaluar el impacto de NPs en microrganismos aislados de suelos, específicamente de
suelos agrícolas.
En el suelo es parte fundamental de la base para la vida en el planeta y la base para una de
las actividades económicas más importantes como lo es la agricultura, donde la actividad
microbiana es muy importante. En estudios previos sobre la biota presente en el suelo han
indicado que hay aproximadamente entre 107 y 109 células por cada gramo de suelo y que
hay en promedio alrededor de 104 especies microbiana diferentes por cada gramo de suelo.
Los géneros que más destacan en la composición del suelo son: Pseudomona, Bacillus,
Azotobacter y Azospirillum, siendo esta última la más estudiada (García de Salamone,
2011).
Las bacterias del suelo se pueden clasificar de forma general en dos grupos:
• Especies nativas o autóctonas.- se mantienen en concentraciones constantes, su
única excepción son las bacterias “zimógenas” o fermentadoras aunque también se
les conoce como bacterias oportunistas.
• Especies alóctonas.- estas bacterias no forman parte de la biota natural del suelo, ya
que llegan a él por fenómenos tanto antropogénico como el riego con aguas negras o
por el fenómeno de erosión del suelo.
En el ámbito agronómico, las bacterias se clasifican específicamente por su funcionalidad:
• Bacterias amonificadoras: transforman en amonio o en sales amoniacales a
sustancias orgánicas que fueron nitrogenadas.
• Bacterias nitrificadoras: llevan a cabo el proceso de oxidan del amoníaco hasta
convertirlo en nitrato.
21
• Bacterias fijadoras de nitrógeno: toman el N atmosférico (N2) y lo transforman
en compuestos benéficos para los vegetales.
• Bacterias celulolíticas: degradan la celulosa. Abundan en los residuos vegetales.
• Bacterias pectinolíticas: degradan la pectina y sus derivados.
Las bacterias también se pueden clasificar por su tipificación la cual se basa en ciertas
características que se pueden determinar mediante una tinción sencilla en el laboratorio
llamada tinción de gram y su observación posterior en un microscopio, de acuerdo al color
del que se tiña la bacteria se puede clasificar en grampositiva o gramnegativa, la mayoría de
las bacterias entra en la clasificación de estos dos grupos o en un tercero el cual depende de
su resistencia acido-alcohol (Molina & Uribarren, 2015).
Las bacterias grampositivas tienen como característica que se tiñen de color azul, esto
debido a que su pared celular es resistente a solventes orgánicos como el alcohol-cetona, ya
que este deshidrata los poros de la bacteria y los cierra generando que el violeta de genciana
y el yodo utilizado durante la tinción quede dentro de la pared celular de la bacteria y quede
teñida de azul. Por el contrario en el caso de las gramnegativas las cuales tienen una pared
celular más débil y susceptible a los solventes orgánicos utilizados durante la tinción, lo
cual provoca que el violeta de genciana y el yodo utilizados durante la tinción salgan de la
pared celular y esta quede teñida de rosa solamente.
En esta investigación se utilizaron bacterias tanto Gram positivas como negativas,
utilizando B. subtilis siendo el género Bacilus grampositiva, uno de los más comunes en la
composición del suelo como se mencionó con anterioridad además de ser un mecanismo
modelos en muchos tipos distintos de estudios, por otro lado P. ananatis gramnegativa de
la cual hay pocos estudios relacionado esta bacteria y su importancia al encontrarse en
contacto con compuestos fenólicos que son encontrados fácilmente en el suelo agrícola, lo
que le da un papel importante en esta investigación al ser novedoso y finalmente S. aureus
grampositiva la cual es común encontrar en superficies como el suelo aunque normalmente
se encuentran en mamíferos, también es utilizada como un mecanismo modelo.
22
2.11 Compuestos fenólicos en suelos agrícolas.
Los compuestos fenólicos son estructuras químicas que se encuentran formadas por un
anillo aromático unido a uno o varios grupos hidroxilo y a un grupo funcional como
esteres, glicosidos, etc. Estos compuestos están distribuidos en la mayoría de los
ecosistemas naturales, es más común encontrarlos conjugados con uno o más residuos de
glucosa unidos a los grupos hidroxilo, aunque en algunos casos se pueden producir uniones
directas entre una molécula de glucosa y un carbono aromático. También es probable
encontrarlos unidos a ácidos carboxílicos, ácidos orgánicos, aminas, lípidos y a otros
compuestos fenólicos (Soler, 2009).
Los compuestos fenólicos como el catecol el cual se utiliza como un antioxidante y el L-
dopa que se utiliza como tratamiento para el Parkinson y está asociado a la dopamina que
es un neurotransmisor, ambos son altamente susceptibles a la oxidación (Luna-Velasco et
al., 2011) . En los suelos la cantidad y el tipo de compuestos fenólicos dependen del tipo de
suelo (Malá et al., 2013), aunque los ácidos hidroxicinámicos como el p-cumárico y el
catecol se encuentran presentes en la pared de las células vegetales (Pérez et al., 2009).
Catecol Ácido p-cumárico.
Figura 1. Estructuras químicas del catecol y el ácido cumárico.
2.1 Ácidos fenólicos.
Los ácidos fenólicos funcionan como antioxidantes debido a su composición química tanto
en plantas como en vegetales y se pueden clasificar según su estructura como derivados del
ácido benzoico o del ácido cinámico. Dentro de este grupo se encuentran ejemplos de
ácidos fenólicos presentes tanto en tallos como raíces de plantas como el ácido cafeico,
ácido vainílico, ácido ferúlico, ácido siringico, ácido p-cumárico, acido o-cumárico, ácido
protocatequico, ácido sináptico, ácido gallico, ácido benzoico y ácido p-hidrocibenzoico
23
(Soler, 2009). El ácido p-cumárico es conocido por su actividad antioxidante y es utilizado
en la industria química, alimentaria, salud, etc. En los vegetales se encuentra presente en las
paredes celulares (Kilic y Yessiloglu, 2013). Por otra parte el catecol el cual es utilizado
como un quelante natural de metales como el hierro y que al igual que el ácido p-cumárico
se encuentra presente en la naturaleza. La capacidad quelante de los poli fenoles se da
principalmente en aquellos que tienen al grupo catecol (Andjelkovic et al., 2006).
24
3. JUSTIFICACION:
El desarrollo de la nanotecnología ha crecido de una manera considerable durante los
últimos años, lo cual se nota en el incremento del número de productos en el mercado a
base de nanotecnología en áreas desde construcción, medicina, fármacos, industria
alimentaria, textiles, agricultura, ambiental, etc. En esta última, se están desarrollando
tecnologías nuevas para la producción y distribución de energía de fuentes renovables,
tratamiento de aguas residuales y purificación de agua, desarrollo de nuevos nanopesticidas
en el área de agricultura, entre otras. La amplia gama de aplicaciones de las NPs,
incluyendo en el área ambiente, conlleva su posible liberación hacia el ambiente. Por eso es
importante desarrollar investigación sobre el comportamiento de las NPs en interacción con
el ambiente y analizar su comportamiento, degradación y prever un posible riesgo
ambiental y salud humana.
En el ambiente, los microrganismos nativos estarían sujetos a exposiciones primarias de
NPs por lo que son modelos representativos para evaluar o predecir el posible impacto eco
toxicológico por NPs. Además, los microorganismos tienen tasas de crecimiento rápido y
son sistemas biológicos sensibles a exposición de contaminantes. Por ello, en este estudio
se evaluó el impacto de NPs en microorganismos aislados de suelos agrícolas, lo cual se
podrá contrastar con la mayoría de estudios previos que utilizan microorganismos modelos
provenientes de colecciones.
En cuanto a la reactividad y toxicidad de las NPs, éstas pueden variar de acuerdo a sus
características fisicoquímicas las cuales son muy particulares para cada tipo de NP, ya que
influyen aspectos como el tamaño, morfología, pureza, área superficial, actividad redox,
etc.
En el caso de los nanomateriales de origen inorgánico, sus aplicaciones son muy amplias y
su toxicidad se relaciona al estrés oxidativo generado por su actividad redox. Por lo que la
actividad redox de los materiales es un parámetro que determina en gran medida que tan
reactivo y tóxico podría ser hacia sistemas biológicos. En estudios anteriores se ha
comprobado que un mecanismos de toxicidad de NPs inorgánicas es por la generación de
ROS en ambientes acuosos, los cuales se incrementan cuando interaccionan con
compuestos fenólicos.
25
Lo anterior permitió plantear la importancia de evaluar la reactividad química de NPs con
aplicaciones comerciales durante su interacción no solo con células de suelo, sino también
con los compuestos fenólicos que se encuentran en éste y establecer su potencial de generar
ROS tanto a nivel celular como de forma química con los compuestos fenólicos. Lo cual es
relevante para conocer el efecto toxico de las NPs sobre esos ambientes y correlacionar la
reactividad química de las NPs con su efecto tóxico en microorganismos aislados de ese tipo de
suelos.
26
4. HIPOTESIS:
� La interacción química de nanopartículas metálicas con biomoléculas como
proteínas y compuestos fenólicos presentes en suelos agrícolas, causa la oxidación
de proteínas e incrementa la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS),
respectivamente. La reactividad de las NPs con esas biomoléculas correlacionará
con la oxidación de proteínas y la formación de ROS intracelular en
microorganismos aislados de suelos agrícolas expuestos a las NPs.
27
5. OBJETIVOS:
5.1Objetivo general:
� Evaluar la reactividad de nanopartículas metálicas hacia biomoléculas y
microorganismos de importancia ambiental.
5.1.1Objetivos específicos:
� Sintetizar y caracterizar las NPs.
� Determinar el incremento en la generación de ROS por la interacción de
nanopartículas metálicas con compuestos fenólicos presentes en suelos agrícolas.
� Evaluar la oxidación de proteínas por nanopartículas metálicas.
� Evaluar la formación de ROS y oxidación de proteínas a nivel intracelular en
bacterias aisladas de suelos agrícolas.
� Determinar la correlación entre la oxidación de proteínas y de generación de ROS a
nivel intracelular y extracelular.
• Evaluar la formación de ROS y oxidación de proteínas a nivel intracelular en
bacterias aisladas de suelos agrícolas y expuestas a NPs.
� Establecer la correlación entre la oxidación de proteínas y de generación de ROS a
nivel intracelular y extracelular.
28
6. MATERIALES Y MÉTODOS.
6.1 Síntesis de nanopartículas.
6.1.1 Nanopartículas de Oro.
La síntesis de NPs de Au se realizó basándose en el método de precipitación reductiva que
fue reportado con anterioridad (Chen et al., 2012), cuya reacción química se especifica en
la ec. 5. El método se basa en la utilización glucosa como un agente reductor y acido cloro
áurico (HAuCl4) como un precursor metálico (ec. 5) y la adición de dodecilsulfato sódico
(SDS) como un estabilizador en la síntesis de NPs. En la reacción se hicieron cambios en
la temperatura como se detalla a continuación: En 200 ml de agua destilada o desionizada
se adicionó glucosa (0.63 g) y SDS (0.65 g) en agitación a una temperatura que osciló entre
13 y 17°C. Cuando la solución estuvo cristalina, se agregó acido cloro áurico (HAuCl4) 25
mM (1000 uL) y se mantuvo en agitación durante 24 h. La formación de las NPs torna en
color morado y éstas se separaron por centrifugación a 20000 rpm por 15 minutos. Luego
se les realizaron 3 lavados con agua destilada o desionizada dejando en el último lavado
una cantidad mínima de agua para sonicar las NPs de 5 a 10 minutos para obtener una
dispersión homogénea de las NPs.
𝐶!𝐻!"𝑂! + 8𝐻𝐴𝑢𝐶𝑙! + 6𝐻!𝑂 8𝐴𝑢 + 6𝐶𝑂! + 32𝐻𝐶𝑙 (𝑒𝑐. 5)
6.1.2 Nanopartículas de plata.
La sintesis de NPs de Ag fue por el método de precipitación reductiva, utilizando
borohidruro de sodio (NaBH4) como agente reductor y nitrato de plata (AgNO3) como
precursor metálico (ec. 6) (Barrena et al., 2009). El método tuvo algunos cambios como se
describe brevemente a continuación. A 300 ml de una solución de NaBH4 (3 Mm) a
temperatura de 4°C, se le administraron 100 ml de AgNO3 (1 Mm) por goteo (50
gotas/minuto). La reacción se dejó en agitación durante 24 horas a 4°C y la formación de
las NPs tomó un color amarillo. Las NPs se recuperaron y lavaron igual que las NPs Au.
Sólo que la dispersión homogénea en un volumen mínimo de agua, se vertió en un vidrio de
reloj y se dejó secar a temperatura ambiente para recuperar las NPs en polvo.
8𝐴𝑔𝑁𝑂! + 𝑁𝑎𝐵𝐻! + 3𝐻!𝑂 8𝐴𝑔 + 𝐻!𝐵𝑂! + 𝐻𝑁𝑂! + 𝑁𝑎𝑁𝑂! + 2𝐻! (𝑒𝑐. 6)
29
6.1.3 Nanopartículas de CuO.
La sintesis de NPs de CuO se realizó a partir de acetato de cobre II (Cu (CH3COO)2)
como agente precursor e hidróxido de sodio (NaOH) como agente precipitante (ec. 7), por
el método de precipitación alcalina (Rahnama y Gharagozlou, 2011). Brevemente, se
mezclaron 300 mL de (Cu (CH3COO)2) 0.02 M con 1 mL de ácido acético glacial en
agitación hasta que se alcanzó la temperatura de 95 °C aproximadamente. Enseguida se le
agregaron 0.4 g de NaOH y se mantuvo la reacción a la misma temperatura durante 30 min.
Luego se dejó enfriar la solución y las NPs se separaron por centrifugación a 12500 rpm
durante 30 min y se lavaron, dispersaron y secaron de la misma forma que las NPs Ag.
5𝐶𝑢(𝐶𝐻!𝐶𝑂𝑂)! + 10𝑁𝑎𝑂𝐻 + 𝐻!𝑂 5𝐶𝑢𝑂 + 10𝑁𝑎 𝐶𝐻!𝐶𝑂𝑂 + 6𝑂𝐻! + 3𝐻! (ec. 7)
6.1.4 Nanopartículas de paladio.
Estas NPs se obtuvieron por el mismo método que las NPs Ag, sólo que a partir de
tetracloropaladato de potasio (K2PdCl4) como precursor (ec. 8) (Nguyen et al 2010). Esto
mediante la adición de 300 mL de NaBH4 (3 Mm) en 100 mL K2PdCl4 (1 Mm), a una
velocidad de 50 gotas/minuto con agitación constante, que se mantuvo durante 24 h. Las
NPs se recuperaron, lavaron y almacenaron igual que las NPs Au. Sólo que cada
centrifugación se realizó por 30 min.
𝐾!𝑃𝑑𝐶𝑙! + 2𝑁𝑎𝐵𝐻! + 6 𝐻!𝑂 𝑃𝑑 + 2𝐻!𝐵𝑂! + 2𝑁𝑎𝐶𝑙 + 2𝐾𝐶𝑙 + 7𝐻! (𝑒𝑐. 8)
6.1.5 Nanopartículas de platino e hierro.
Las NPs de platino se adquirieron a través de la compañía Sigma-Aldrich, en polvo con
tamaño de partícula menor a 50 nm (TEM), densidad de 21.45 g/cm3 y área superficial de
90.8 m2/g (BET). Las NPs de hierro se compraron a la compañía Nanoiron, NANOFER
25S: nZVI, como dispersión acuosa de NPs Fe0 modificadas en la superficie con óxidos de
Fe y tamaño menor a 100 nm (TEM). El dispersante contenía parte orgánico e inorgánico
no especificados.
6.2 Caracterización de NPs.
El enfoque principal de la caracterización de las NPs sintetizadas y comerciales, fue el de
conocer su tamaño primario, cristalinidad, morfología y composición elemental mediante
30
técnicas de microcopia electrónica de barrido (SEM) acoplada a un detector de
espectrometría de dispersión de energía de rayos X (EDS) y difracción por rayos X (XRD).
Así mismo se verificó la concentración de las NPs en dispersiones patrón, mediante análisis
elemental por espectroscopia de absorción atómica (AAS) y espectrometría de emisión
óptica con plasma inductivamente acoplado (ICP-OES), como se detallará más adelante. A
continuación se detallan tanto la preparación de las muestras como las técnicas que se
utilizaron para llevar a cabo caracterización.
6.2.1 Dispersiones de NPs. 6.2.2 Dispersiones patrón: análisis de microscopía electrónica de barrido (SEM).
Previo al análisis, se prepararon dispersiones de NPs de aproximadamente 100 mg mL-1 en
etanol-agua 50% v:v en un tubo eppendorf nuevo, posteriormente el tubo se sónico en un
sonicador de baño durante 15 minutos en un sonicador de baño.
6.2.3 Dispersiones patrón: ensayos reactividad y exposición de células
Las dispersiones de NPs utilizadas en los experimentos de generación ROS y la
determinación de grupos carbonilo en el ensayo ELISA, fueron de 2 mg mL-1 en buffer de
fosfatos 5 mM y pH 7.4. Estas se prepararon justo antes de realizar los experimentos y se
sonicaron en un sonicador tipo baño durante 15 minutos
6.2.4 Microscopia electrónica de barrido acoplada a EDS.
Esta técnica se utilizó para conocer el tamaño promedio y la morfología de las NPs. El
análisis EDS da un resultado cualitativo de la composición elemental de las NPs, por medio
de los rayos X se forma un perfil de la muestra para conocer su composición en porcentaje
de cada uno de los elementos que la componen. Para el análisis las muestras deben estar
secas y ser conductoras. Para esto, se utilizó un soporte especial de aluminio donde se
depositó una micro gota de la dispersión sonicada y luego se evaporó el agua/etanol a
temperatura ambiente.
6.2.5 Difracción de rayos X.
El análisis XRD sirve para obtener información acerca de la cristalinidad del nanomaterial
así como sus parámetros de red, ángulo entre ejes de simetría, sus posiciones atómicas,
textura, cuantificación de fases y su grupo espacial. La muestra debe estar en polvo fino
con un tamaño menor a 100 nm, la cual se homogeniza en un mortero de ágata. Para
31
analizar los resultados se utiliza un software que hace un análisis comparativo de los
difractogramas obtenidos con tablas de ICDD (Centro internacional de datos de difracción)
de referencia y con las incidencias obtenidas se conoce el material que se tiene y sus
características.
6.4.6 Composición elemental.
La concentración de NPs en las dispersiones de patrón se determinó con el fin de corregir
cualquier pérdida de éstas en el proceso de preparación y dosificación en los experimentos.
La cuantificación de la fracción metálica de las NPs se realizó mediante AA para las NPs
de Au y para las NPs de Pd se utilizó ICP-OES. Previo al análisis, las muestras se
digirieron en base a un protocolo de digestión acida para metales reportado con anterioridad
por el Instituto Nacional de Seguridad y Salud Ocupacional (NIOSH) de EEUU (método
7303, 2003). En el caso de la cuantificación de las NPs en las dispersiones obtenidas de las
reacciones de síntesis, se utilizó para determinar el rendimiento de reacción, comparando lo
calculado de forma teórica por estequiometria contra con los resultados relacionados por
gravimetría o cuantificado por análisis químico.
6.5 Determinación de ROS extracelular.
La generación química de ROS por NPs en interacción con biomoléculas fenólicas (catecol
y ácido cumárico), se determinó mediante mediciones de intensidad de fluorescencia del
compuesto sensible a ROS, DCFH (clorodihidrofluoresceina). Partiendo del compuesto
estable, diclorodihidrofluoresceina de acetato (DCFH-DA), el cual se sometió a una
esterificación alcalina para liberar el acetato. En la reacción se mezclaron DCFH-DA 20µM
con NaOH al 0.01 N por 30 min a temperatura ambiente y el producto DCFH
(diclorofluoresceina) es altamente oxidable por ROS a su forma fluorescente. El ensayo de
ROS extracelular se realizó en viales de 10 mL cubiertos completamente de la luz con
papel aluminio y con un volumen total de reacción de 4 mL que consistió de: 2 ml DCFH
20 µM, 200 mg L-1 de dispersión de NPs como concentración final, del compuesto fenólico
(catecol o ácido cumárico) 500 µM y el resto del volumen fue de amortiguador de fosfatos
5 mM pH de 7.4. Entre la adición de los reactivos, el vial se mezcló en un vortex para una
completa homogenización. También se prepararon controles que contenían: amortiguador
de fosfatos 25 mM pH de 7.4 con el indicador DCFH y NPs sin compuesto fenólico, así
32
como compuesto fenólico sin NPs y aquel sin compuesto fenólico y sin NPs (negativo).
Todos los viales se incubaron a 37 °C y se tomaron muestras del sobrenadante a diferentes
intervalos de tiempo para medir fluorescencia en el equipo Varioskan Flash a 490 nm de
excitación y 530 nm de emisión. Las lecturas se tomaron en 100 uL muestra/pozo en
placas negras de 96 pozos. Si el valor de fluorescencia de las muestra sobrepasaba el
máximo obtenido en la curva de calibración, se procedía a realizar una dilución 10X como
máximo. Después de cada toma de muestras, los viales se homogenizaban en un vortex.
Más detalles sobre la metodología se encuentran en un reporte previo (Luna-Velasco et al.,
2011).
6.6 Determinación de la oxidación de proteínas extracelulares.
La oxidación química de la proteína modelo BSA (suero de albumina bovino) por su
interacción con las NPs se determinó a través de la detección de grupos carbonilo, los
cuales son característicos de la oxidación de las proteínas. Los ensayos se realizaron en
viales de 10 ml cubiertos completamente de la luz con papel aluminio, con un volumen
total de reacción de 2 ml, adicionando 200 mg L-1 NPs, 100 mg L-1 de BSA y amortiguador
de fosfatos 10 Mm pH 7.4 para completar el volumen total. También se incluyeron
controles negativos los cuales fueron BSA sin exponer a NPs y las NPs solas. Todos los
viales se incubaron a 37°C durante 4.5 días. Después de ese tiempo se tomaron muestras
del sobrenadante y se centrifugo a 10000 rpm durante 10 min, luego se diluyeron 10X para
asegurar una concentración final de BSA de 10 mg L-1, limitante en el ensayo ELISA para
la detección de grupos carbonilo. Finalmente se tomaron 100 uL de las muestras diluidas y
se procedió a hacer la reacción ELISA de acuerdo al protocolo del kit OxiSelectTM Protein
Carbonyl ELISA STA-310.
6.7 Determinación de ROS intracelular.
La generación de ROS intracelular se determinó en bacterias ambientales aisladas de suelo
agrícola de una nogalera de Delicias Chihuahua, como S. aureus (S18), P. ananatis (S 35) y
B. subtilis (S12), las cuales se expusieron a las distintas NPs inorgánicas evaluadas. La
generación de ROS intracelular se midió con el mismo indicador señalado para ROS
extracelular. Primeramente, en tubos Corning de 50 ml esterilizados y cubiertos de la luz
con papel aluminio, se colocaron las células en su fase exponencial (1*108) en medio LB (4
33
mL) con 50 y 500 mg L-1 de NPs. También se incluyó un control positivo con la bacteria
expuesta a peróxido de hidrogeno (H2O2) 500 µM y un control negativo las bacterias sin
exponer a NPs. Todo se manejó en condiciones estériles y los tubos se incubaron con una
inclinación aproximada de 45° a 37 °C y 200 rpm.
La generación de ROS intracelular se midió a 2 y 24 h de incubación en muestras
homogenizadas en vortex. Para la preparación de la muestra se tomaron 200 uL de cada
tubo en condiciones estériles y se colocaron en un tubo eppendorf. Luego se centrifugó a
10000 rpm durante 10 minutos, se descartó el sobrenadante y el pellet de las células fue
lavado dos veces con solución salina estéril 0.85 % p/v bajo las mismas condiciones. El
pellet lavado se re suspendió 198 uL de solución salina estéril y se le agregó el indicador
ROS DCFH (100 uM en DMSO) para obtener una concentración final 10 µM. La mezcla se
homogenizó bien con micropipeta y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min, todo
el proceso bajo condiciones estériles y cubierto lo más posible de la luz. Después de ese
tiempo se centrifugaron nuevamente las células durante 10 minutos a 10000 rpm, se
descartó el sobrenadante y el pellet se sometió a dos lavados con las mismas condiciones.
El pellet resultante se re suspendió nuevamente en solución salina y se homogenizó muy
bien con micropipeta para tomar 150 uL y colocarlos en los pozos de las placas negras,
enseguida se procedió a la medición de fluorescencia como se indicó arriba. En todo el
proceso se cuidó en lo posible de proteger contra la luz.
Parte de cuantificar la cantidad de ROS intracelular por espectroscopia de fluorescencia,
también se tomaron imágenes de las células por Microscopia confocal, que es una
herramienta que permite observaciones a una resolución mayor que la que se puede lograr
con la microscopía óptica convencional. Emplea un sistema láser que aplica el haz de luz
en forma de barrido, en una pequeña parte del espécimen. El láser aplicado a una longitud
de onda determinada en la muestra, hace que moléculas excitadas de la misma, emitan
fluorescencia a una longitud de onda mayor a la aplicada.
El método utilizado para poder llevar a cabo esta técnica es el mismo que se describió en el
punto anterior, la diferencia radicó en la parte final de la preparación de la muestra en la
cual después de exponerla al DCFH con una concentración final 10 µM realizar los lavados
posteriores, se tomaron 10 uL y se colocaron en un portaobjetos y luego se protegió con un
34
cubreobjetos fijado con esmalte para uñas. Enseguida las muestras se observaron al
microscopio para notar las células fluorescentes debido a ROS intracelular. Entre más
células fluorescen, se relaciona con mayor ROS intracelular, ya que todos los ensayos se
hicieron con mismo número de células.
Las condiciones para la toma de imágenes se fueron primero en modo automático en el
microscopio y posteriormente se fue modificando tanto en la intensidad del láser como en
la cantidad de tiempo y fotografías tomadas para cada muestra en específico dependiendo
de la fluorescencia que presentara al tomar la imagen en automático.
6.8 Extracción, cuantificación y oxidación de proteínas intracelulares.
La oxidación de proteínas intracelulares se midió en células expuestas a las NPs y en
células sin exponer como referencia. Para esto, se expusieron las células con NPs bajo las
mismas condiciones que indicaron arriba. Después de 24 h de exposición se procedió a
extraer las proteínas de las células S12, S18 y S35 previamente lavadas con solución salina
estéril Luego el pellet de células se re suspendió en 10 ml de buffer de lisis (PBS 10 Mm,
lisozima 1 mg mL-1, CHAPS 2% y DTT 1%). La lisozima se agregó al buffer de lisis a
temperatura ambiente justo en el momento del pre tratamiento de las células con la enzima,
el cual se dejó en reposo 25 min aproximadamente para promover el rompimiento de la
membrana. Posteriormente las células pre tratadas se transfirieron con el buffer de lisis a
morteros estériles y pre-atemperados a -80, enseguida se les agregó 75 uL de inhibidor de
proteasa (SigmaFastTM) 10 mM para evitar la degradación de las proteínas durante la lisis.
La lisis se llevó a cabo mediante congelación-maceración utilizando nitrógeno líquido para
la congelación de la muestra y su posterior maceración hasta obtener un polvo fino blanco,
el cual se recuperó con una espátula a un tubo eppendorf y se separó en diferentes alícuotas
para su almacenamiento a -80°C posterior a su análisis
Previo a la determinación de oxidación de proteínas en los extractos celulares, éstos se
trataron con estreptomicina al 1% para precipitar restos de DNA y ácidos nucleicos que
pudieran interferir con el ensayo ELISA para la detección de grupos carbonilo. Luego del
tratamiento, se cuantificaron las proteínas por el método de Bradford que se leyó con una
longitud de onda de 595 nm. Después del tratamiento con estreptomicina al 1% y la
cuantificación de proteínas se procedió a medir la oxidación de proteínas, detectando los
35
grupos carbonilo por medio del ensayo ELISA. Las muestras se diluyeron apropiadamente
para no utilizar más de 10 µg mL-1 de proteínas en las muestras. La oxidación de proteínas
en células expuestas se comparó con células sin exponer a NPs.
36
7. RESULTADOS.
7.1 Caracterización de NPs.
La síntesis de las NPs evaluadas se realizó mediante dos tipos de reacción: precipitación
alcalina (Au) y precipitación reductiva (CuO, Ag y Pd). Con el fin de establecer la
eficiencia de las reacciones de síntesis de NPs, se estimaron los rendimientos de la síntesis
en base a la relación del valor teórico esperado (estequiométrico) con el valor real obtenido,
mediante análisis químico de las NPs en dispersión (Au y Pd) por ICP previo a una
digestión ácida o por gravimetría de las NPs obtenidas en polvo (Ag y CuO). En el caso de
las NPs en polvo, las cantidades obtenidas al final de la reacción fueron muy cercanos a los
estequiométricos o esperados. Por ejemplo en promedio se obtuvieron 8 mg NPs Ag y 0.35
NPs CuO y los valores esperados eran de 10 mg y 0.47 mg, respectivamente. En cuanto a
las NPs obtenidas en dispersión, en la Tabla 1 se muestran los valores respectivos de la
concentración esperada y real de NPs y el rendimiento de las reacciones. Los valores de
NPs de Au en dispersión mostraron un rendimiento muy bajo del 25.5 % de lo esperado, lo
que se atribuyó al método utilizado para su recuperación que incluían lavados por
centrifugación y era difícil separarlas del sobrenadante, ya que estaban muy dispersas. Las
NPs de Pd en la dispersión final mostraron valores de recuperación promedio muy buenos
con respecto a lo esperado (72%), ya que estas dispersiones eran menos estables, es decir se
precipitaban con mayor facilidad.
Tabla 1. Concentración esperada y real de NPs en las dispersiones obtenidas de la reacción de síntesis y rendimiento de las reacciones.
NPs Cantidad
esperada
(mg L-1)
Cantidad
reportada
(mg L-1)
Volumen
aforo
(mL)
Cantidad real
(mg L-1)
Rendimiento
(%)
Au 1428 7.3 50 365.13 25.57
Pd 2100 30.1 50 1505.48 71.69
37
Otros parámetros importantes en la caracterización de las NPs fueron, morfología por
medio de SEM y análisis elemental por EDS. Tanto la composición como la morfología de
las NPs va a influir en los efectos en sistemas biológicos, contribuyendo de distintas
maneras a la interacción y el daño generado en estos. En la Figura 2 se describen los
parámetros de caracterización, como tamaño, morfología y composición elemental de las
NPs. En las NPs de Ag no se observaron aglomeraciones, además de que se pudo apreciar
una morfología esférica definida con un tamaño primario promedio de 33.6 nm. Las NPs de
CuO y Pd tuvieron la misma morfología pero fueron las más pequeñas, con tamaños de 7
nm y 7.25 nm, respectivamente. En cuanto a las NPs de Au su morfología fue semi esférica
con un tamaño primario promedio de 21.5 nm. Por otro lado las NPs comerciales de Pt
tuvieron morfología esférica y mayor tamaño dentro del grupo de NPs (57 nm). Las otras
NPs comerciales fueron las de NPs Fe con morfología semiesférica y tamaño primario
promedio de 25.98 nm.
En relación a la composición elemental, todas las NPs presentaron un porcentaje mucho
mayor de la fracción metálica con respecto a otros componentes no metálicos como
oxígeno o carbono. Excepto las NPs de CuO, estas mostraron un porcentaje menor de la
fracción metálica (65.5) y el porcentaje mayor de O (32), lo cual se esperaba por ser NPs de
tipo oxido metálicas. También las NPs de Au, tuvieron porcentajes de O similares a los de
NPs de CuO y un porcentaje considerable de carbono (23%), lo cual se atribuyó a la
presencia de SDS que se utilizó como agente dispersante en la síntesis. En el caso de las
NPs de Fe, el porcentaje del 10.7 % es porque las NPs estaban oxidadas en la superficie con
óxidos de Fe.
Con el fin de confirmar las fases minerales y cristalinidad de las NPs, así como detectar
cualquier contaminación o residual de los materiales de síntesis, se hizo un análisis de
difracción de rayos X. A continuación en la Figura 2 se ilustran los difractogramas
obtenidos para cada NP. El difractograma de las NPs de Ag presentó picos con forma
alargada y delgada, que deducen que el tamaño del cristal es grande y tuvieron una
incidencia del 100% la base de datos identifico a la muestra como Silver 3C esto debido a
la incidencia con el difractograma de referencia. Para las NPs de CuO su difractograma
presento picho anchos y pequeños lo cuan nos indica que el tamaño de sus cristales era
38
pequeño además de que la base de datos arrojo como resultado la identificación del material
como tenorita esto debido a la incidencia de este con los difractogramas de referencia. En el
difractograma de las NPs de Pd se encontraron varias interferencias como halita, fosfuro de
paladio y fosfuro de boro esto se puede atribuir a restos de reactivos de síntesis que no s
eliminaron con los lavados de las NPs. En las NPs de Au se encontró una incidencia casi
del 100% en el difractograma con picos anchos y pequeños indicándonos que el tamaño de
los cristales es pequeño lo cual es consistente con lo observado en el SEM y de acuerdo a la
base de datos identifico a las NPs como Oro. Para las NPs comerciales como lo fueron el Fe
donde los picos que se observan en el difractograma muestran que el material tiene un
tamaño de cristal grande, el equipo para DRX identifico al elemento con el nombre de iron
diiron(III), por otro lado las NPs de Pt en el difractograma se encontraron picos altos y
delgados, indicando un tamaño de cristal grande lo que coincide con el tamaño de la NP
que se observa en las micrografías del SEM.
39
Position [∞2Theta] (Copper (Cu))
30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Counts
0
5000
10000
Pt SIGMA (1)
Fe
Ag
CuO
Pt
40
Figura 2. Micrografías de las NPs inorgánicas tomadas en el SEM utilizadas en la
investigación y sus respectivos difractogramas de rayos X.
7.2 Generación de ROS extracelular por NPs.
La capacidad de generación de ROS extracelular por las NPs se evaluó en interacción con
biomoléculas fenólicas presentes en el suelo agrícola, como ácido cumárico y catecol. Este
tipo de biomoléculas son fácilmente oxidables y en el proceso de oxidación generan ROS,
por lo que se espera que su interacción con NPs, incrementen la generación de ROS. El
ensayo consistió en poner en contacto las NPs inorgánicas (200 mg L-1) con la moléculas
fenólicas (500 µM) en buffer de fosfatos pH de 7.4, utilizando como indicador ROS,
DCFH-DA 20 µM. También se incluyeron controles sólo con NPs sin compuesto fenólico y
compuesto fenólico sin las NPs. A continuación se muestran los resultados representativos
de la medición de ROS extracelular con respecto al tiempo en ensayos con las NPs más
reactivas (Pd), seguido por los resultados de las NPs de Fe, representativas del
comportamiento del resto de NPs.
Pd
Au
41
En la figura 7 se muestra la cinética de oxidación del indicador ROS por las NPs de Pd en
contacto con catecol y ácido cumárico. En esta se observa que la oxidación del indicador
ROS fue mucho más rápida en los tratamientos de NPs de Pd con los compuestos fenólicos.
Notándose a las 12 h una oxidación completa del indicador ROS (20µM) en el tratamiento
de NPs Pd con ácido cumárico, la cual fue 5 veces mayor comparado con el tratamiento con
ácido coumárico solo. En el tratamiento de NPs de Pd en contacto con el catecol, la
oxidación fue 3 veces mayor en comparación con el tratamiento con catecol solo. En menor
proporción, las NPs de Pd solas también oxidaron el indicador ROS (5 µM), lo que indica
su reactividad en medios acuosos o directamente con el indicador ROS.
Figura 3. Cinética de oxidación del indicador ROS por las NPs de Pd en interacción con compuestos fenólicos. Con los controles de compuesto fenólico solo y NPs solas.
Al igual que las NPs de Pd, la interacción de NPs de Fe con compuestos fenólicos generó la
mayor oxidación del indicador ROS con respecto al tiempo, sólo que la oxidación completa
se llevó a cabo en un tiempo mayor (~ 25 h) comparado con las NPs de Pd (12 h). En la
Figura 4, se nota que el tratamiento de NPs de Fe con ácido cumárico generó la mayor
oxidación del indicador ROS, la cual fue 2 veces mayor que la obtenida en el tratamiento
con ácido cumárico solo. En cambio en el tratamiento con NPs de Fe en contacto con
catecol hubo un aumento en la oxidación del indicador ROS de sólo 0.7 veces comparado
con el catecol solo. De forma comparativa, se puede notar claramente que las NPs de Fe
0
5
10
15
20
25
0 5 10 15
DCF (µM)
Tiempo (h)
Buffer
Catecol
Ac. Cumarico
Pd
Pd+catecol
Pd+Ac. Cum.
42
son menos reactivas que las NPs de Pd, ya que las primeras tomaron mayor tiempo en
oxidar totalmente el indicador ROS en interacción con los compuestos fenólicos. Además
las NPs de Fe solas aunque oxidaron el indicador ROS, fue en menor proporción que los
compuestos fenólicos solos y que las NPs de Pd solas.
Figura 4. Cinética de oxidación del indicador ROS por las NPs de Fe en interacción con compuestos fenólicos. Con los controles de compuesto fenólico solo y NPs solas.
En la figura 5 se muestra la oxidación del indicador ROS por todas las NPs evaluadas en
interacción con catecol en un tiempo promedio de 33 h a excepción del Pd y Fe que
correspondió a 12h y 45 h, respectivamente. En el caso de las NPs solas se observa que si
existió una oxidación del indicador estando en contacto con las NPs de Ag y Au, lo que
podría significar que es posible que en presencia de otras biomoléculas si se genere una
oxidación mayor a la del control (catecol solo), mientras que en el caso de las NPs de CuO
y Pt la oxidación de las NPs solas fue igual a la del control (buffer de fosfatos solo, pH
7.4), lo que indica que si se interacciona con otro tipo de biomolécula es probable que se
genere una oxidación mayor que la que se generó con el catecol. En el caso de las NPs de
Au las cuales tuvieron una de las oxidaciones mayores al estar en contacto con el catecol
pero mostraron un comportamiento similar a cuando la NP no tuvo contacto con la
biomolécula. En la cinética de oxidación del indicador para ROS DCF generada por las
NPs de Pt y de CuO en presencia del compuesto fenólico se puede observar que el
0
5
10
15
20
0 10 20 30 40
Buffer
Np´S Fe
Fe+cat
Fe+Ac. Cum.
Catecol
Ac. Cumarico
Tiempo (h)
DCF (µ
M)
43
incremento de la oxidación de estos tratamientos fue 0.8 veces mayor que el catecol solo y
mientras que el tratamiento Ag se observa que su comportamiento al estar en contacto con
el catecol tiene un aumento de 0.1 veces aproximadamente con lo cual se puede ver que la
oxidación del indicador para ROS DCF no tiene un aumento significativo en este
tratamiento. Para finalizar se puede observar en el grafico que en los tratamientos donde las
NPs como el Pd y el Au tuvieron una mayor reactividad estando solas tuvieron
comportamientos similares al entrar en contacto con el catecol, reaccionando muy poco (Au
fue prácticamente el mismo, mientras que para la Pd el aumento fue de 1.18 veces) por el
contrario en los tratamientos donde las NPs solas tuvieron una oxidación menor como lo es
el caso del CuO y del Pt el incremento al ponerse en contacto con el compuesto fenólico
fue de 18 y 11 veces respectivamente, concluyendo de este modo que en estos dos
tratamientos la interacción con el catecol genera una oxidación alta en el indicador DCF, lo
que sugiere una mayor generación de ROS , en la figura se muestra el comportamiento
general de las NPs restantes (Ag, Au, CuO y Pt) tanto solas como en contacto con el
compuesto fenólico. En el caso de las NPs solas se observa que si existió una oxidación del
indicador estando en contacto con las NPs de Ag y Au, lo que podría significar que es
posible que en presencia de otras biomoléculas si se genere una oxidación mayor a la del
control (catecol solo), mientras que en el caso de las NPs de CuO y Pt la oxidación de las
NPs solas fue igual a la del control (buffer de fosfatos solo, pH 7.4), lo que indica que si se
interacciona con otro tipo de biomolécula es probable que se genere una oxidación mayor
que la que se generó con el catecol. En el caso de las NPs de Au las cuales tuvieron una de
las oxidaciones mayores al estar en contacto con el catecol pero mostraron un
comportamiento similar a cuando la NP no tuvo contacto con la biomolécula. En la cinética
de oxidación del indicador para ROS DCF generada por las NPs de Pt y de CuO en
presencia del compuesto fenólico se puede observar que el incremento de la oxidación de
estos tratamientos fue 0.8 veces mayor que el catecol solo y mientras que el tratamiento Ag
se observa que su comportamiento al estar en contacto con el catecol tiene un aumento de
0.1 veces aproximadamente con lo cual se puede ver que la oxidación del indicador para
ROS DCF no tiene un aumento significativo en este tratamiento. Para finalizar se puede
observar en el grafico que en los tratamientos donde las NPs como el Pd y el Au tuvieron
una mayor reactividad estando solas tuvieron comportamientos similares al entrar en
44
contacto con el catecol, reaccionando muy poco (Au fue prácticamente el mismo, mientras
que para la Pd el aumento fue de 1.18 veces) por el contrario en los tratamientos donde las
NPs solas tuvieron una oxidación menor como lo es el caso del CuO y del Pt el incremento
al ponerse en contacto con el compuesto fenólico fue de 18 y 11 veces respectivamente,
concluyendo de este modo que en estos dos tratamientos la interacción con el catecol
genera una oxidación alta en el indicador DCF, lo que sugiere una mayor generación de
ROS.
Figura 5. Cinéticas de oxidación del indicador para ROS DCF por las NPs en presencia de catecol en un tiempo promedio de 33 horas. Con los controles de compuestos fenólicos y NPs solas.
Se puede observar en la Figura 6 la presentación de los resultados generales de la
interacción del ácido cumárico con las NPs utilizadas en este trabajo de investigación, con
anterioridad se describieron los resultados de las NPs de Pd y Fe las cuales resultaron ser
las más reactivas al interaccionar con los compuestos fenólicos mencionados con
anterioridad en tiempos menores al resto de los tratamientos (12 y 25 h respectivamente),
enseguida se describen los resultados de las NPs restantes (Au, Ag, CuO y Pt) tanto solas
como en contacto con el ácido cumárico. En la Figura 4 se puede apreciar que al igual que
0
5
10
15
20
25
DCF (µM)
45
en el grafico anterior las NPs solas más reactivas al entrar en con el indicador DCF fueron
las de Au. Al comparar el comportamiento entre las NPs solas más reactivas y su cinética
de oxidación al estar en interacción con el ácido cumárico sugiere que en el caso de las NPs
de Au el aumento entre estos dos tratamientos fue a penas de 1.41 veces, mientras que al
igual que los tratamientos con catecol en el caso del ácido cumárico los tratamientos como
el de las NPs de CuO solas reaccionaron de una manera similar al control negativo pero
cuando se interaccionaron con el compuesto fenólico aumentaron 18.44 veces, mientras que
las NPs de Pt tuvieron un aumento de 10.6 veces en comparación a lo observado cuando el
tratamiento no entro en contacto con el ácido cumárico. Las NPs de Ag presentaron el
incremento más pequeño en la oxidación del indicador ROS al comparar el comportamiento
de las NPs solas y con ácido cumárico (1.41 veces).
Figura 6. Cinéticas de oxidación del indicador para ROS DCF por las NPs en presencia de ácido cumárico en un tiempo promedio de 33 horas. Con los controles de compuestos fenólicos y NPs solas.
0
5
10
15
20
25
30
DCF (µM)
46
7.3 Oxidación de proteínas por NPs.
Las proteínas son las biomoléculas más abundantes en las células, por lo que la exposición
de éstas a NPs expondría a las proteínas celulares a daños de oxidación. Con el fin de
conocer y predecir la reactividad de las NPs en interacción con proteínas, se expuso la
proteína modelo BSA (100 mg L-1) a 200 mg L-1 de cada una de las NPs evaluadas y se
midió la oxidación de la proteína. La oxidación se midió por la formación de grupos
carbonilo a través de un ensayo ELISA como se indicó en materiales y métodos. En la
Figura 7 se observa que las NPs que generaron mayor generación de grupos carbonilo
(oxidación) en la proteína fueron las Au y Pt las cuales tuvieron una oxidación de 3 veces
en comparación con el control (BSA solo), mientras que las NPs de Ag, Pd, CuO Y Fe
mostraron un comportamiento similar al del control. Para la obtención de estos resultados
se restaron los valores de la oxidación de las NPs solas a los de las NPs en contacto con el
BSA.
Figura 7. Oxidación de la proteína BSA mediante la formación de grupos carbonilo en presencia de NPs inorgánicas.
0 0.5 1
1.5 2
2.5 3
3.5 4
4.5 5
5.5 6
6.5 7
7.5
Carbon
ilo nm/ mg proteina
Tratamientos
47
7.4 Generación de ROS intracelular por NPs.
La generación de ROS intracelular se midió en células aisladas de suelos agrícolas (B.
subtilis, S. aureus y P. annanatis) expuestas a 50 y 500 mg L-1 de NPs por 2 y 24 h. Esta se
midió a través del indicador ROS, DCFH, el cual entra a las células y en presencia de ROS
se oxida a su forma fluorescente DCF. Por lo que sólo las células con ROS intracelular
fluorecerán si se exponen a la λ de excitación de la DCF. Primeramente se determinó la
generación de ROS cuantitativamente mediante la toma de imágenes por microscopía
confocal y mediante esta técnica se estableció la concentración del indicador ROS 10µM y
la eliminación de interferencias en las mediciones de fluorescencia, como amortiguador de
fosfatos. Enseguida se mostrarán imágenes representativas de algunas de las NPs que
generaron ROS intracelular. En la Figura 12 se muestran imágenes de B. subtilis sin
exponer a NPs (control) y expuesto a 50 y 500 mg L-1 de NPs de CuO durante 2h (panel A)
y 24 h (panel B). En general se observó que en las células sin exponer a NPs, las células
con fluorescencia son muy pocas tanto a 2 y 24 h. En cuanto a las células expuestas a 50 y
500 mg L-1 por 2 h, también se mostraron pocas células fluorescentes. En cambio su
exposición a 50 y 500 mg L-1 por 24 h mostró mucho más células fluorescentes, indicando
un incremento en la generación de ROS intracelular bajo esas condiciones.
48
Figura 8. Imágenes de microscopía confocal de B. subtilis expuesta a 50 y 500 mg L-1 NPs de CuO durante 2 h (panel A) y 24 h (Panel B).
La generación de ROS intracelular en S. aureus (panel A) y P. ananatis (panel B) se llevó a
cabo de la misma forma como se describió en la figura anterior, los tiempos de exposición
de las células así como las concentraciones que se manejaron fuero solo de 500 mg L-1 pero
la célula se expuso tanto a NPS de CuO como de Ag. En la figura 9 se puede analizar en el
panel A el control negativo (células sin exponer) se aprecia que la fluorescencia es poca, lo
que indica que la generación de ROS se está dando por el estrés generado por la propia
célula durante el experimento ya que S. aureus es una célula delicada. En las siguientes
micrografías en el panel A se puede observar a las células expuestas a las NPs tanto de CuO
como de Ag con una concentración de 500 mg L-1 en un lapso de tiempo de 2 h, en donde
se pusieron en contacto las células con las NPs de CuO se puede apreciar que hay muy poca
fluorescencia generada por el indicador de ROS DCF, mientras que donde se
interaccionaron a las células fueron expuestas a NPs de Ag, se aprecia que la cantidad de
fluorescencia generada es mayor que con las NPs de CuO.
Control 50 mg L!! 500 mg L!!
2h
24h
49
Por otro lado en el panel B el control negativo (células sin exponer a NPs) se puede
observar que la fluorescencia generada es muy poca, las células P. anantis fueron expuestas
a las mismas NPs que en el panel A con las mismas concentraciones, por lo tanto la
fluorescencia generada fue poca lo que sugiere una baja producción de ROS, en la imagen
del resultado donde las células se expusieron a las NPs de Ag se aprecia la similitud de lo
con las NPs de CuO obteniendo un resultado donde la fluorescencia generada en las células
por el indicador para ROS es baja.
Figura 9. Imágenes de microscopía confocal de S. aureus (Panel A) y P. ananatis (Panel B) sin exponer a NPs (control) y expuestos a 500 mg L-1 de NPs CuO y Ag durante 24 h.
7.5 Cuantificación de ROS intracelular.
En la Figura 10 se observa que la generación de ROS mediante la oxidación del indicador
DCF (10 µM) en las células de B. subtilis (1 exp9) expuestas a 50 mg L-1 de las NPs +(Ag,
Au, Pd, Pt, CuO y Fe) por se puede analizar el comportamiento de la célula en el tiempo de
Control CuO 500 mg L!! Ag 500 mg L!!
A)
B)
50
2 h, donde el tratamiento que presento una mayor oxidación en el indicador para ROS fue
el de CuO el cual aumento de 13 a 14 veces aproximadamente en comparación con el
control negativo (células sin exponer a NPs), mientras que el resto de los nanomateriales
tuvieron un comportamiento en el cual su oxidación no supero a la oxidación generada en
el control negativo siendo menores hasta 1 vez en su concentración, en el segundo periodo
de tiempo de 24 horas se observa que al igual que en el tiempo de exposición de 2h las NPs
de CuO son las que generan una respuesta de oxidación más alta a comparación del resto de
los tratamientos, siendo mayor la oxidación hasta 6 veces en comparación con el control
negativo, y teniendo comportamientos parecidos el resto de las NPs que se encontraron en
contacto con la célula. La reacción generada al poner en contacto a las células con la NP se
sugiere como producto de la generación de ROS al entrar en contacto los compuestos
fenólicos presentes en la célula ya que en el experimento de ROS extracelular las NPs de
CuO reaccionaron generando cantidades altas de ROS al interaccionarse con el ácido
cumárico y el catecol específicamente lo que pudiera indicar que es probable que las NPs
generen ROS al entrar en contacto con otros compuestos fenólicos.
Figura 10. Oxidación del indicador ROS en B. subtilis expuesto a NPs 50 mg L-1 durante 2 y 24 h.
0 0.005 0.01
0.015 0.02
0.025 0.03
0.035 0.04
DCF (µ
M)
Tratamientos.
2 horas
24 horas
51
La generación de ROS intracelular en B. Subtilis también se evaluó durante su exposición a
500 mg L-1 de las NPs por 2 y 24 h (Figura 11). Al interaccionar B. subtilis con una
concentración mayor de las NPs se generó una oxidación del indicador par ROS DCF, se
utilizó una concentración de 500 mg L-1 de NPs durante dos periodos de tiempo (2 y 24 h)
al igual que en experimento que se explicó anteriormente. En la figura 11 se observa que en
el caso específico del tratamiento con NPs de CuO durante el periodo de tiempo de 2 horas
la oxidación en comparación con el control negativo aumento aproximadamente entre 20 y
21 veces esto probablemente sea por la interacción de las NPs con los compuestos fenólicos
que se encuentren en la célula y que se ven afectados por la generación del estrés oxidativo
que se da como resultado de la interacción célula-NP, seguida del tratamiento con NPs de
Ag la cual tuvo un aumento en la oxidación del indicador ROS de 3 veces en comparación
con su control negativo, en el resto de los tratamiento con las NPs faltante la oxidación
medida tiene una concentración muy similar a la del control negativo o incluso menor como
sucedió en el caso de los tratamientos con NPs de Fe y Pd. Para el segundo periodo de
tiempo el cual fue de 24 horas al igual que en el periodo anterior el tratamiento en el que se
observó una mayor oxidación del indicador para ROS es en el que estuvieron presentes las
NPs de CuO, donde se pudo observar una oxidación de entre 11 y 12 veces mayor a la del
control negativo, seguida de los tratamientos donde se utilizaron NPs de Ag y Fe, en las
cuales la oxidación observada fue de hasta 2 veces mayor que la que se tuvo en el control
negativo. Solo en el caso de las NPs de Pd la oxidación del indicador ROS fue menor que
en el control negativo. La generación de estrés oxidativo entre las dos diferentes
concentraciones de NPs es notoria, por lo que se puede concluir que causa una mayor
oxidación en el indicador para ROS DCF los tratamientos donde se encuentra la
concentración de 500 mg L-1.
52
Figura 11. Oxidación del indicador ROS en B. subtilis expuesto a 500 mg L-1 de NPs durante 2 y 24 h.
La generación del estrés oxidativo en las células de S. aureus expuestas a NPs (Ag, Au, Pd,
Pt, CuO y Fe) en una concentración de 500 mg L-1 , durante dos periodos de tiempo de 2 y
24 horas, arrojo como resultado que para el periodo de tiempo de 2 horas el tratamiento en
el que se generó una mayor oxidación del indicador para ROS DCF fue en donde se
interaccionaron las NPs de CuO en el cual la oxidación presentada fue de hasta 24 veces
mayor a la oxidación que se observó en el control negativo (células sin exponer) lo que
indica una alta concentración en la generación de ROS con esta NP en particular, seguida
del tratamiento con NPs de Fe la que presenta una oxidación de 17 veces en comparación
con el control negativo siendo esta la segunda NP que genero la mayor cantidad de ROS en
esta célula, seguido de los experimentos donde estaban presentes las NPs de Pt (14 veces
mayor oxidación que en el control negativo) y las NPs de Pd (13 veces más oxidación que
el control negativo), Au (15 veces mayor oxidación que en control negativo) y Ag que fue
la que presento una menor oxidación al momento de compararse los resultados con su
control negativo, la cual solo fue 11 veces mayor siendo esta la que genero una menor
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08
DCF (µM)
Tratamientos
2 horas
24 horas
53
cantidad de ROS en este periodo de tiempo. A las 24 h las mediciones de fluorescencia
indicaron que la NP que presento una mayor oxidación en comparación al control negativo
fue la de CuO teniendo una oxidación mayor 5 veces que su control negativo el cual es el
punto de referencia, en el tratamiento con NPs de Fe, Pd y Pt sus oxidaciones fueron muy
similares entre ellas siendo 3 veces mayores a la generada en el control negativo del
experimento, el tratamiento que presento una menor cinética de oxidación fue en el que se
interacciono a las NPs de Au con la célula pues su oxidación fue a penas de 2 veces mayor
a la que se presentó en el control negativo del experimento.
Figura 12. Oxidación del indicador ROS en S. aureus expuesto a 500 mg L-1 de NPs durante 2 y 24 h.
La medición de la generación de ROS intracelular en P. ananatis causada por las diferentes
NPs inorgánicas as (Ag, Au, Pd, Pt, CuO y Fe) en una concentración de 500 mg L -1 se
realizó en dos periodos de tiempo (2 y 24 h) bajo las mismas condiciones que los
experimentos anteriores, en el periodo tiempo de 2 horas al igual que con las otras dos
células, el tratamiento que presento una mayor oxidación con respecto al control negativo
fue donde se interaccionaron las NPs de CuO donde fue mayor entre 23 y 24 veces como se
puede apreciar en la figura 13, seguido por el tratamiento con NPs de Au el cual tuvo una
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08
DCF (µM)
Tratamientos
2 horas 24 horas
54
oxidación mayor al control negativo de 16 veces. En los tratamientos restantes la oxidación
generada no fue mayor a una vez, a excepción de las NPs de Pd en donde la oxidación
presentada fue menor a la del control negativo. Para el segundo periodo de tiempo el cual
fue de 24 horas nuevamente el tratamiento en donde estuvieron presentes las NPs de CuO
fue donde la oxidación del indicador para ROS que se presento fue de entre 6 y 7 veces con
respecto al comportamiento presentado por el control negativo, este comportamiento fue
similar al que se presentó en la interacción de las NPs de Au con las células pues la
oxidación del indicador ROS que se presentó en este experimento la cual fue 5 veces
mayor a la generada en el control negativo, para el resto de las NPs en este experimento la
oxidación en el indicador ROS fue muy similar llegando a tener como valor máximo en
todas las restante (Ag, Pd, Fe y Pt) una oxidación ligeramente mayor a la del control
negativo, apenas 2 veces mayor en cada uno de estos tratamientos.
Las NPs de CuO en ambas concentraciones (50 y 500 mg L-1) generaron altas
concentraciones de ROS en las tres células analizadas, pero fue en P. ananatis donde la
generación fue mayor.
Figura 13. Oxidación del indicador ROS intracelular en P. ananatis expuesta a NPs 500 mg L-1 en dos periodos de tiempo.
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
DCF 10 (µ
M)
Tratamientos.
2 horas
24 horas
55
7.5 Oxidación proteínas intracelulares.
La oxidación de proteínas de células de B. subtilis y P. ananatis expuestas a las NPs
inorgánicas (Ag, Au, CuO, Pt, Pd y Fe) se midió con el fin de comparar su reactividad con
la proteína modelo BSA. Así como para relacionar la reactividad de las NPs en la
formación de ROS y oxidación de proteínas a nivel extracelular con respecto su reactividad
intracelular.
En la Figura 14 se muestra la oxidación de las proteínas de B. subtilis expuesto a 200 mg
L-1 NPs de Au, Pt y CuO durante 24 h, Donde se nota que las NPs de NPs de Au, la cual
fue mayor 19 veces con respecto al control negativo, estos resultados fueron seguidos del
tratamiento con las NPs de CuO donde la oxidación fue mayor 14 veces con respecto a su
control negativo (proteínas sin exponer a NPs), para el tratamiento donde se
interaccionaron las proteínas extraídas de B. subtilis con las NPs de Pt la oxidación
presentada con respecto al control negativo fue solo 7 veces mayor, siendo este tratamiento
el que se presentó una menor oxidación de las proteínas durante el tiempo de exposición.
Figura 14. Formación de grupos carbonilo por la oxidación de proteínas de B. subtilis expuesto a las NPs durante 24 h.
0 1 2 3 4 5 6 7
Carbon
ilo nmol/ mg de
proteína
S12 S12+Au (500 mg L↑−1 )
S12+Pt (500 mg L!!)
S12+CuO (500 mg L!!)
56
La cinética de oxidación que se observa en la figura 15 fue generada por la interacción de
las proteínas extraídas de la células de P. ananatis con las NPs de Au, CuO y Pt, el
tratamiento donde se observó una mayor con NPs de CuO el cual genero una mayor
producción de grupos carbonilo sugiere una mayor oxidación de proteínas, en comparación
con el control negativo (proteínas sin exponer a NPs) este tratamiento aumento 13 veces su
oxidación en comparación con el control seguido de la oxidación generada en las proteínas
expuesta a NPs de Pt donde la oxidación llego a ser mayor al control negativo 9 veces
aproximadamente, en el caso de las NPs que fue el tratamiento donde se aprecia una menor
oxidación en los resultados, la oxidación en comparación con su control negativo fue a
penas de 7 veces, siendo este tratamiento en el que hubo una menor respuesta de oxidación.
Figura 15. Formación de grupos carbonilo por la oxidación de proteínas de P. ananatis
expuesta a NPs durante 24 h.
0 1 2 3 4 5 6 7
Carbon
ilo nmol/ mg de
proteína
S35 S35+Au (500 mg L↑−1 )
S35+Pt (500 mg L↑−1 )
S35+CuO (500 mg L!!)
57
8. DISCUSIÓN DE RESULTADOS.
8.1 Síntesis y caracterización de NPs.
Las NPs se caracterizaron con respecto a su tamaño, morfología y composición elemental,
mediante SEM, EDS y DRX. Las NPs de Ag tuvieron un tamaño primario promedio de 33
nm, el cual se acercó al tamaño reportado (11.5-29.9 nm) por Barrena et al. (2009). En
reportes previos con métodos de síntesis similares, se observó que a mayor temperatura es
mayor la velocidad de reacción. Morales et al. (2009) corroboraron la relación temperatura-
velocidad de reacción en la síntesis de NPs de Ag, notando que a mayor temperatura se
aceleraba la reducción del AgNO3 y por tanto disminuía el tiempo de formación de las NPs
de Ag (15 minutos, 140 °C, 20-40 nm), en cambio a menor temperatura hubo un mejor
control del proceso y una dispersión menor de tamaño. La síntesis de NPs de Pd se realizó a
temperatura ambiente de acuerdo al método de referencia (Nguyen et al. 2010), sólo que en
ese protocolo se utilizó polivinil pirrolidona (PVP) como agente estabilizante y el tamaño
de NPs reportado fue mayor (24 nm) que el obtenido en la síntesis (7-10 nm). Viet Long y
colaboradores (2012) sintetizaron NPs de Pd con morfología esférica con tamaño que varió
entre 2-50 nm, mediante un método que consistió en calentar el agente reductor (etilen
glicol) a 160°C durante una hora en agitación y luego se agregó el precursor de NPs (estaba
a temperatura ambiente) y se dejó reaccionar por 3 h aproximadamente. En la síntesis de
NPs de Au se controló la temperatura entre 15-18 °C, tratando de mantener 17 °C para
evitar una síntesis incompleta con formación de precipitados de color rosa. En esas
condiciones se obtuvo un tamaño similar al reportado por Chen y et al. (2012), donde se
utilizó temperatura ambiente. Sin embargo hubo diferencias en la morfología, ya que las
NPs de Au sintezadas tuvieron morfología semi-esférica y en el trabajo de referencia se
obtuvieron NPs de Au octaédricas (20-30 nm). Las NPs de CuO se sintetizaron entre 90-
95°C obteniendo formas esféricas con tamaño promedio de 7 nm. De acuerdo a lo
reportado por Ranhama y Gharagozlou (2011) la variación del tamaño de las NPs va
relacionado con la temperatura de síntesis, por ejemplo, en ese trabajo se reportaron NPs de
CuO con tamaño de 16-27 nm utilizando una temperatura de 115 °C.
8.2 Generación de ROS extracelular. En este estudio se evaluó la generación de ROS por las NPs en contacto con catecol y ácido
cumárico, los cuales forman parte de los componentes de suelos agrícolas (Malá et al.,
58
2013). La generación de ROS se determinó mediante la oxidación del indicador ROS,
DCFH. De las NPs evaluadas, las NPs de Pd fueron las más reactivas al estar en contacto
con el ácido cumárico y con catecol, logrando la oxidación casi en su totalidad del
indicador ROS a las 12 h de interacción. La alta reactividad de estas NPs se atribuye a sus
características catalíticas, ya que estudios anteriores se ha reportado como catalizador en
reacciones de deshidrogenación y esa actividad está fuertemente ligada con su tamaño,
aumentando conforme disminuye el tamaño de la NP (Viet Long et al., 2012). Las NPs de
CuO también generaron una oxidación alta del indicador ROS. En estudios anteriores se
comprobó que la interacción de compuestos fenólicos con NPs inorgánicas como CuO (40
nm) incrementan la producción de ROS extracelular (Sun et al., 2012). La reactividad de
las NPs de Fe fue similar a las del CuO al estar en contacto con el catecol y con el ácido
cumárico. La generación de ROS por estas NPs igual se atribuye a la oxidación del Fe
cuando entra en contacto con el oxígeno (Phenrat et al., 2009). Las NPs de Pt también
generaron ROS en interacción con los compuestos fenólicos, debido a que tienen
propiedades catalizadoras, las cuales se incrementan conforme disminuye su tamaño
(Narayanan y El-Sayed, 2004). Las NPs de Ag y Au reaccionaron de forma similar al Pt al
entrar en contacto con el catecol y con el ácido cumárico pero su oxidación se generó en un
tiempo mayor (36-48 h). La generación de ROS por NPs en interacción con componentes
de medios biológicos puede ser un buen indicador de sus efectos tóxicos, los compuestos
fenólicos como el catecol forman parte de los biofluidos altamente susceptibles a la
oxidación (Luna-Velasco et al., 2011). Los compuestos fenólicos al entrar en contacto con
las NPs se oxidan esto debido a una desprotonación en los grupos OH tanto del catecol
como del ácido p-cumárico generando que el oxígeno quede con un electrón desapareado,
este a su vez queda deslocalizado por todo el anillo bencénico formando una semiquinona
la cual es una especie de radical libre, está en presencia de ROS forma una quinona que es
un agente oxidante. La fácil oxidación de estos compuestos también se puede deber a que
tiene electrones en resonancia y que son fotosensibles.
Las NPs que presentaron mayor reactividad al encontrarse sin un compuesto fenólico y en
presencia del indicador DCFH fueron las NPs de Au, las cuales a pesar de ser un metal
noble, estas han mostrado adquirir actividad redox en tamaño nanométrico (Yah C.S., 2013;
Suresh et al., 2013). Las NPs de Ag y Fe solas también generaron ROS, lo cual igual se
59
debe a su actividad redox y a su ionización en medios acuosos, lo cual incrementa
conforme disminuye su tamaño (Wei L. et al., 2015. Las NPs de Pt y CuO solas
presentaron un comportamiento similar al del control con una oxidación mínima. La
oxidación de estas NPs solas indica que es probable que se generen ROS en interacción con
otras biomoléculas.
8.3 Oxidación de la proteína BSA por NPs inorgánicas.
Dentro de la biología molecular, los componentes celulares más vulnerables al estrés
oxidativo son las proteínas, lípidos y el ADN. En particular las proteínas, por ser las
biomoléculas más abundantes en las células. La proteína BSA es ampliamente utilizada
como modelo en la industria biomédica y uno de sus usos es como estabilizador de
proteínas conjugadas, etc. La mayor generación de oxidación de proteína BSA fue generada
por la NPs de Pt y Au. Estudios previos con NPs de Pt han relacionado su reactividad en
biomoléculas como el ADN que tiene similitud en cuanto a su estructura con las proteínas,
donde el Pt se ionizó al ión Pt+2 generando una oxidación en el ADN (Gehrke et al., 2011).
La NPs de Au mostraron toxicidad dependiendo de su tamaño, morfología, área superficial,
etc, lo que va asociada a la producción de ROS en diferentes sistemas biológicos y
biomoléculas como el ADN según lo reportado por Yah C.S. (2013). La oxidación de
proteínas por las NPs de Ag está relacionado con su capacidad de ionizarse y facilitar la
interacción de los iones con las proteínas (Wei et al., 2015). La generación de grupos
carbonilo en presencia de Pd se debe a su tamaño al ser las segundas NPs más pequeñas y
con una mayor superficie de contacto con la proteína. La oxidación de la proteína BSA por
las NPs de Fe fue un comportamiento esperado ya que en experimentos anteriores como el
realizado por Sun et al. (2012) tuvieron como resultado la generación de grupos carbonilo
por NPs de Fe donde las NPs funcionaron como un catalizador para la formación de ROS
debido a que su oxidación mediante una reacción fenton genero H2O2 y eventualmente esto
condujo a la oxidación de biomoléculas tales como las proteínas. Las NPs donde no se
generó oxidación de grupos carbonilo fue CuO.
8.4 Generación de ROS intracelular.
Las células evaluadas se aislaron de un suelo agrícola y se eligieron dos gram positivas y
una gram negativa. B. Subtilis es una bacteria gram positiva la cual tiene una carga negativa
60
neta debido a la presencia de ácidos teicoicos en la pared celular (Brook et al., 2004) y se
utiliza como control biológico de enfermedades en plantas debido a su propiedad para
producir antibióticos y su actividad antimicrobiana y anti fúngica que impide el
establecimiento de patógenos vegetales (Reinoso Y. et al., 2006). Así como S. aureus que
también es una bacteria gram positiva con una carga negativa neta en su pared celular y
altamente patógena para el ser humano y los animales, resistente a los antibióticos (Morales
M. et al., 2006). Por ultimo P. ananatis que es una bacteria gram negativa y debido a la
presencia de lipopolisacáridos en su pared celular los cuales poseen una naturaleza
altamente cargada y son los que confieren la carga negativa total en la pared celular (Brook
et al., 2004), siendo esta una bacteria patógena y de la que no se tiene muchos estudios. La
generación de ROS por NPs de CuO se debe principalmente a que el CuO actuó como
agente reductor al momento de comenzar a producir ROS. Debido a las cargas negativas de
las respectivas paredes celulares estas NPs generaron una mayor cantidad de ROS en las
tres células debido a la interacción existente entre las cargas de la NP al momento de que el
Cu se ionizo y origino un cambio en los estados de oxidación de Cu+2 a Cu+1. Debido a la
capacidad de ionización del Cu entra a la célula por sus canales iónicos desactivándolos
para así poder internalizarse generando daño a los biofluidos, volviéndolas más toxicas ya
que adquieren propiedades antibacteriales. En estudios anteriores se sugirió que las
nanopartículas pueden formar complejos estables con enzimas dentro de la célula que
obstaculiza el funcionamiento celular y conduce a la apoptosis (Cronholm P. et al., 2013;
Suresh et al., 2013). Gunawan y colaboradores en 2011 analizaron la generación de ROS
con el indicador H2DFFDA en E. coli con NPs de CuO (480 mg L!!) y partículas
micrométricas de CuO (480 mg L!!) donde hubo una generación de ROS por las NPs de
CuO a partir de las 2 h de exposición debido a que el mecanismo de defensa de la célula fue
afectado por la generación de peróxidos y radicales hidroxilo que se originaron a partir del
ciclo redox del cobre intracelular. Mientras que para la forma ionizable de CuO la
generación de ROS fue apenas perceptible en el microscopio de fluorescencia. Por otro lado
hay estudios donde se utilizó una metología similar a la utilizada en este estudio con NPs de
CuO en interacción con las bacterias C. metallidurans y E. coli (Simon-Deckers et al.,
2009). Aquí se expusieron las bacterias a concentraciones de 500 mg L-1 siendo la E. coli la
más propensa a la generación de ROS y C. metallidurans la más resistente a todas las NPs.
61
Para B. subtilis las otras NPs no mostraron una generación más alta de ROS en
comparación con la oxidación generada por las NPs de CuO, aunque las NPs de Fe, Au y
Ag mostraron una leve generación de ROS con respecto a su control negativo.
Las NPs de Fe generaron ROS extracelular de manera notable tanto en S. aureus como en
P. ananatis esto relacionado a la fácil oxidación del Fe lo que facilita la producción de ROS
al entrar en contacto con las cargas negativas de las paredes celulares respectivamente. La
generación de ROS en interacción con células se le atribuye principalmente a su alta
actividad redox, la cual a través de reacciones fenton generadas principalmente por H2O2 el
Fe actúa como un donador de electrones. En estudios previos Phenrat y colaboradores
(2009) encontraron que en la célula neuron n27 al ponerla en contacto con NPs de Fe
durante varios periodos de tiempo (30 m, 1,6 y 24 h) en diferentes concentraciones (1 y 10
mg L!!)se observó la generación de ROS, además de la reducción de los niveles de ATP
intracelulares, despolarización mitocondrial y daño en la membrana celular. La generación
de ROS por las NPs de Ag en S. aureus es debido a que esta bacteria es sensible a agentes
antibacteriales, a los cuales se les atribuye la generación de estrés oxidativo mediante
citotoxidad lo que interfiere con sus funciones mitocondriales (Majdalawieh et al., 2014) y
muere en poco tiempo (www.higieneysalud.edu.uy). En estudios previos se determinó que
las NPs de Ag inducen a la formación de ROS una vez que están expuestas al ambiente
acido de los lisosomas en las células y donde también se acumulan iones de Ag+, los cuales
se forman al reaccionar estas NPs con ROS como el H2O2, que es uno de los factores para
la formación de estos iones que pueden escapar de los lisosomas e inducir una mayor
cantidad de ROS intracelular. Las NPs de Ag y los iones Ag+ interactúan fácilmente con los
grupos tiol presentes en la membrana celular lo que se puede traducir en la fuga del
contenido citoplasmático y eventualmente generar necrosis, así como la ruptura de la
membrana del lisosoma lo que genera apoptosis (Wei et al., 2015). Las NPs de Au
generaron ROS en la célula P. ananatis lo que se atribuye a su morfología y a su tamaño
(Fadeel & García-Bennett, 2010) esto se explica debido a que el oro en tamaño
micrométrico no presenta reactividad debido a su comportamiento como un material inerte,
sin embargo en tamaño nanométrico presenta alta reactividad (Majdalawieh et al., 2014).
Debido a que su tamaño es pequeño el área superficial aumenta y por lo tanto hay cambios
en sus propiedades físico químicas como por ejemplo una mayor carga de electrones en su
62
superficie (Suresh et al.,2013). Esto genera un intercambio entre las cargas de los electrones
y las cargas de las proteínas generando ROS. En estudios previos se encontró que la
reactividad de las NPs de Au va directamente ligada con su concentración; en
concentraciones bajas (menores a 10 mg L-1 , 2-20 nm) en líneas celulares de macrófagos de
maurinos, mientras que en concentraciones superiores se observó apoptosis (Das et al.,
2011). En P. ananatis se observó una menor sensibilidad a la generación de ROS esto
debido a que los lipopolisacáridos presentes en su pared celular generan una resistencia a la
toxicidad de las NPs (Suresh et al., 2013).
El impacto que tienen las NPs sobre las células es diferente dependiendo de las
características fisicoquímicas que tenga cada uno de los materiales y como impacte sobre la
ella.
8.5 Oxidación de proteínas de B. subtilis y P. ananatis expuestas a NPs.
En este estudio se evaluó la oxidación de proteínas en extractos de B. subtilis y P. ananatis
expuestas a NPs de Au, Pt y CuO. Estas NPs se eligieron por que generaron mayor cantidad
de ROS intracelular. Los resultados obtenidos en este experimento indican que en el caso
de las proteínas de B. subtilis la generación de grupos carbonilo fue mayor con las NPs de
Au, en estudios posteriores se habla de que la citotoxidad de las NPs de Au en macrófagos
la cual de muchos factores que van desde su tamaño, absorción, etc. (Diego M. et al., 2013)
o incluso deberse a la actividad redox de las NPs de Au los cuales cambian al entrar en
contacto con las proteínas y generan una mayor producción de grupos carbonilo debido al
intercambio de electrones generado por las cargas que puedan tener estos biofluidos en
interacción con las cargas de las NPs. En estudios realizados previamente donde se
utilizaron NPs de Au en interacción con células epiteliales y células de melanoma entre
otras se encontró que cuando las NPs de Au (1.4 nm) se internalizaron en las células
mostraron signos de estrés tales como daño a la membrana y muerte celular por necrosis
mientras que NPs de Au de 1.2 nm generaron apoptosis (Johnston et al., 2014). Las NPs
de CuO fueron las segundas más reactivas, en investigaciones anteriores donde se estudió el
daño generado por oxidación a proteínas extraídas de B. subtilis que se expusieron a NPs de
CuO con tamaño entre 8-10 nm se generó un daño celular por la liberación de iones Cu+2 y
su interacción electrostática genero daño a la pared celular y hubo una ruptura de la
63
membrana plasmática, además de la interrupción de procesos bioquímicos. En cambio en el
caso de las proteínas de P. ananatis el comportamiento con las NPs de CuO fue distinto ya
que este nanomaterial fue el que genero una mayor generación de ROS, mientras que las
NPs de Au tuvieron un comportamiento similar en la oxidación de proteínas la cual fue
menor en comparación con CuO, pero similar a lo sucedido con las proteínas extraídas de
B. subtilis. Las NPs de Pt para las proteínas extraídas de las dos bacterias la oxidación de
las proteínas fue la más baja debido a que el Pt funciona como un antioxidante que elimina
ROS como el O2- y el H2O2, ya que en estudios anteriores se demostró que NPs de Pt con
un tamaño promedio de 2.4 nm funcionan como una superóxido dismutasa (SOD) mimética
en la bacteria C. elegans (Kim et al., 2009).
9. CONCLUSIONES.
• La interacción de los compuestos fenólicos presentes en suelos agrícolas con las
NPs metálicas evaluadas incrementó considerablemente la generación química de
ROS, notandose el mayor incremento por las NPs de Pd, CuO, Au y Fe.
64
• Las NPs de Au, Ag, Pd y Fe solas, generaron considerable cantidad de ROS
extracelular, indicando su potencial de reactividad con otro tipo de biomoléculas.
Lo cual se corroboró por la oxidación de la proteína BSA con las NPs de Ag, Au, Pt
seguidas por Pd CuO y Fe.
• Todas las NPs evaluadas generaron considerable ROS intracelular, notándose
mucho más ROS por las NPs de CuO, seguidas por Au, Ag y Fe. Así mismo, S.
aureus y P. ananatis fueron los mas sensibles a la formación de ROS.
• Las NPs de CuO, Au y Pt causaron la oxidación de proteínas intracelulares en
células de B. Subtilis y P. ananatis, notándose mayor oxidación por las NPs de CuO
y Au.
� La NPs con mayor reactividad química (ej. Au, Ag, CuO, Fe) también tuvieron
mayor reactividad en células aisladas de suelos agrícolas. Además la reactividad
química de NPs se incrementó con la presencia de compuestos fenólicos presentes
en suelos agrícolas, por lo que estos resultados pueden proyectar el daño hacia la
biota o microorganismos autóctonos de suelos agrícolas, incluyendo aquellos
involucrados en ciclos biogeoquímicos o en la calidad del suelo.
10. RECOMENDACIONES.
� Se recomienda realizar estudios de viabilidad celular para comprobar si existe o no
relación entre la generación de ROS y la muerte celular y a que concentraciones
sucede.
65
� Utilizando los resultados obtenidos en esta investigación realizar un estudio alterno
sobre oxidación de proteínas con un organismo ATCC como referencia para la
comparación de resultados.
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