Recuentos de viables

El recuento directo al microscopio o el recuento electrónico proporcionan un recuento de todas las células, tanto las vivas como las muertas. Un recuento de viables mide sólo las células vivas de una población, es decir, aquellas capaces de reproducirse (viable significa "que puede vivir"). Los recuentos en placa y el NMP son recuentos de viables. Cuando se usa la filtración, se obtiene un recuento de viables. Cada una de estas técnicas tienen sus ventajas y sus inconvenientes.

Recuentos de viables

Recuento en placaFiltración por membranaNúmero más problable

Recuento en placa

Permite la determinación de los microorganismos presentes en una muestra en base a que se desarrollen en medio de cultivo, en placa, formando colonias. Por lo tanto se determinan por este método sólo las células microbianas VIABLES en las condiciones de trabajo (nutrientes, atmósfera, temperatura).

Como las colonias pueden originarse tanto de una célula como de un grupo de células, se utiliza el término: UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (u.f.c.) Además, a los efectos de que todas las células que queden en una placa tengan una adecuada disponibilidad de nutrientes, y que los errores del método sean menores, se establece que las condiciones óptimas de conteo se dan cuando desarrollan

entre 30 y 300 colonias por placa o menos según el caso. Cuando esto no se cumple se considera el valor obtenido como una estimación del recuento, y si es posible se repite hasta caer en las condiciones óptimas.

Procedimiento:

La preparación de la muestra se realiza como para cualquier método utilizando diluyentes adecuados. Se preparan diluciones de 1 en 10 sucesivas, partiendo en general de 10 gramos de muestra para la primer dilución, y tomando 1 mL de ésta descargándolo en 9 mL de diluyente y así sucesivamente.

Cada vez que se prepara una dilución se carga y descarga la pipeta tres veces, descargándola finalmente sobre el tubo con diluyente estéril. Se descarta la pipeta luego de preparada cada dilución.

Según la carga esperada, o permitida, se eligen las diluciones a sembrar. Generalmente, se siembran no menos de tres diluciones consecutivas Ej.: 1:10 (10-1), 1:100 (10-2), 1:1000 (10-3).

Una vez preparadas las diluciones, se siembra dentro de los 15 minutos siguientes .

ANTES DE PROCEDER A LA SIEMBRA SE ROTULAN LAS PLACAS, EN EL FONDO, CON LOS SIGUIENTES DATOS:

Identificación de la muestra: Nombre y/o Número de lote Dilución Volumen sembrado Superficie o incorporado Fecha Operador

Siembra en superficie:

Se deposita en la superficie de las placas que ya contienen el medio de cultivo, 0.1 mL de cada dilución. Se realiza duplicado para cada dilución. Se emplea la misma pipeta para todas las diluciones y se comienza por la más diluída. Luego de realizada la descarga de la muestra, se procede a extenderla sobre toda la superficie de las placas, usando rastrillo estéril, en el mismo orden que la siembra (o sea de la más diluída a la más concentrada).

Siembra incorporada:

Se procede de la dilución mayor a la menor, y se deposita 1 mL de cada dilución en placas estériles, vacías, por duplicado. Posteriormente, se agrega a cada placa 15 a 20 mL del medio de cultivo a emplear, previamente fundido y termostatizado a 45°C en baño o estufa. Se agita moviendo la placa tapada sobre la superficie de la mesa con movimiento circular, horario (4 veces o más para

polvos insolubles) y antihorario (4 veces) y movimiento hacia arriba y hacia abajo (siempre sin levantar la placa de la mesa). En algunas situaciones puede sembrarse un volumen diferente, en general no más de 2.5 mL por placa.

Medio de cultivo:

Se elige según el tipo de microorganismo que se quiere contar pudiendo emplearse medios selectivos o no selectivos.

Incubación:

Una vez enfriado el agar en el caso del incorporado, y secada la muestra en el caso de superficie, las placas se invierten, y se ponen en la estufa que corresponde según los microorganismos a contar, incubándose el tiempo propuesto en la técnica correspondiente.

Interpretación:

Finalizado el período de incubación, observar con buena luz a efectos de visualizar las colonias puntiformes y diferenciar cualquier partícula de muestra que pueda haber. Si molesta, borrar la escritura.

Contar las colonias desarrolladas por placa. Se cuentan como colonias individuales, todas aquellas que disten de las colonias próximas una distancia al menos igual al diámetro de la colonia más pequeña.

Cuando se utilizan medios NO SELECTIVOS se procede de la siguiente forma:

Se cuentan en primer lugar las placas que tengan entre 30 y 300 colonias. Se hace el cálculo promediando los valores y multiplicando por la inversa de la dilución.

Si sólo hubiera placas con menos de 30 colonias, se informa igualmente el resultado, expresándolo por g o mL de muestra.

Si no hubiera colonias en ninguna de las placas, se informa como: Menor que 1 o 10 (según sea incorporado en superficie) por la inversa de la dilución menor.

Si en todas las placas hubiera más de 300 colonias, se ESTIMA el resultado contando las colonias en una superficie conocida de la placa y luego llevando a la superficie total de la placa: 65 cm2 para las de vidrio comunes, o 57 cm2 para las de plástico.

Se siguen las siguientes reglas:

1) Si hay menos de 10 colonias por cm2, se cuentan 13 cuadrados de 1 cm de lado: 7 consecutivos horizontales y 6 consecutivos verticales. El total de colonias contadas se multiplica por 5 o 4.4 según el tipo de placa, para estimar el número de colonias en toda la

placa. 2) Si hay más de 10 colonias por cm2, se cuentan 4 cuadrados de 1 cm de lado, y el promedio se multiplica por 65 o 57 según el tipo

de placa. 3) Si hay más de 100 colonias en 1 cm2, no se cuentan sino que se estima el resultado como Mayor de 6500 o 5700 por placa.

Una vez estimado el número de colonias por placa, se aplica el factor de corrección para expresar el resultado por gramo o mL de muestra, de acuerdo al método (incorporado o superficie), y a las diluciones plaqueadas.

Es frecuente que desarrollen colonias extendidas, sobre la superficie, o el fondo y bordes de la placa, o que se den cadenas de colonias unidas. Este tipo de crecimiento se denomina "spreaders" y se cuentan como uno.

Cuando el spreader cubre más del 50% de la placa, esta no debe contarse. Cuando el spreader cubre una superficie menor del 50%, se cuentan las colonias en el resto de la placa, SOLO si están uniformemente

distribuídas. Si en todas las placas hay spreaders se informa : Spreaders

Todas las situaciones en las que no se pueda informar el recuento por no caer en los casos anteriores, (ej: contaminación, mal funcionamiento del medio), se informa como: "Accidente de laboratorio"

Para alimentos se utilizan los límites de 25 a 250 ufc/placa.

Cuando se emplean medios SELECTIVOS, el número de colonias que se considera óptimo para contar, suele ser menor de 300, es necesario referirse a la técnica correspondiente (de referencia) a los efectos de la interpretación de los resultados.

Expresión de los resultados:

Se informan los resultados de recuento con sólo DOS CIFRAS SIGNIFICATIVAS, redondeando los valores cuando corresponda.

Ej: 142 se informa 140 155 se informa 160

El informe debe decir:

Recuento de microorganismos (tipo): X u.f.c. /g o mL

Ventajas y desventajas de ambos métodos: Incorporado Superficie

Mayor cantidad de muestra. Menor cantidad de muestra

Menor error Mayor error

Mejor aprovechamiento de nutrientes

Peor aprovechamiento de nutrientes

Dificultades al subcultivar colonias

Facilidad para subcultivar colonias incorporadas.

Visualización de colonias dificultada

Fácil visualización

Temperatura del agar puede afectar

No se afectan las células termosensibles a ciertos microorganismos

Desarrollan microaerofilicos En aerobiosis sólo crecen aerobios y

anaerobios facultativos

NUMERO MAS PROBABLE o METODO DE LOS TUBOS MULTIPLES

Se basa en la determinación de la presencia o ausencia de un determinado tipo de microorganismo (en función de que crezcan o de que produzcan determinada reacción en el medio o no), en diferentes cantidades de muestra. Se analizan en forma paralela por triplicado o quintuplicado porciones de la muestra cada vez menores que se dejan crecer en medio líquido. Por ejemplo se utilizan un total de nueve tubos con medio de cultivo, en tres de los cuales se siembra 0.1 g. de muestra, en tres 0,01 g. y en los otros tres 0.001 g. Luego de la incubación, se observan y cuenta el número de tubos positivos.

Según el tipo de microorganismo que se desea contar se utilizan medios de enriquecimiento selectivo, o medios de propagación.

En función de esto se pude considerar como positivos aquellos tubos en los que:

a) hubo crecimiento b) hubo crecimiento y se produjo gas que se ve en campana invertida (Durham) c) hubo crecimiento y se produjo viraje de indicador d) hubo crecimiento y se produjo pigmento

Ocasionalmente, es necesario subcultivar cada uno de los tubos positivos, o sospechosos de serlo a placa, o a otro tubo a efectos de confirmarlo.

El número (de tubos positivos) que se busca en las tablas para el informe final es el que resulta de esta etapa de confirmación, siendo el valor anterior sólo un valor presuntivo. Cada tubo positivo, significa que en la cantidad de muestra en él sembrada había por lo

menos 1 microorganismo de los que se está contando. La interpretación de los resultados, se hace en base a una distribución de tipo Poisson, y en general se emplean tablas preparadas de acuerdo a la cantidad de muestra que se siembra en cada serie de tubos.

Ejemplo 1:

Nº de tubos sembrados: 5 5 5 Volumen de muestra en c/u (mL): 10 1 0,1 Número de tubos positivos: 2 0 0 (dos tubos positivos para la primera dilución, ninguno en las siguientes)

De la tabla adecuada surge el valor: 5 en 100 mL

Se informa: Número más probable de (tipo de microorganismo) = 5/100mL

Ejemplo 2:

Nº de tubos sembrados: 3 3 3 Volumen por tubo (mL) 1 1 1 Dilución de la muestra: 10-2 10-3 10-4 Equivalente en gramos/tubo 0.01 0.001 0.0001 Tubos positivos 3 2 0

El resultado 3-2-0 se busca en tabla y se obtiene un valor de 93/gramo, cuando en la primer serie de tubos se siembra 0.1 g, como en

nuestro caso sembramos 0.01 gramos debe aplicarse el factor de corrección = 0.1/0.01 o sea 10 por lo que el resultado a informar es: NMP de (tipo de microorganismo) = 930/gramo

Es de fundamental importancia antes de leer la tabla, asegurarse que esté construída para condiciones similares a las de trabajo, que

sea para igual número de tubos por serie, y para cantidades de muestra que sean múltipo o submúltiplo. La corrección se hace utilizando proporcionalidad inversa. En todos los casos el valor informado se considera un índice de la carga microbiana, y se conocen los límites de confianza para cada valor.

Ventajas y desventajas del método:

Este método es especialmente útil para determinar cargas microbianas bajas, menores de 10 por gramo, pero puede igualmente emplearse para cargas mayores utilizando las diluciones apropiadas.

Asimismo, es el único método a utilizar en el caso de muestras como por ejemplo polvos insolubles, en los que no es aplicable el

método de filtración ni recomendable el de placas debido a la presencia de partículas. Se prefiere también este método cuando los microorganismos son de lento crecimiento, o cuando han sido sometidos a condiciones

adversas (temperatura alta, desecación, etc.). Es posible enumerar también por este método microorganismos anaerobios utilizando en los tubos medio prerreducido, que se tapan

con vaselina-parafina luego de inocular, e incuban en condiciones aerobias.

FILTRACION POR MEMBRANAEste método consiste en hacer pasar un volumen determinado de muestra líquida, o solución en agua o en solvente apropiado (miristato de isopropilo) a través de un filtro de membrana estéril (diámetro 50 mm, poro 0.45 mm), colocado en un equipo de

filtración. Luego de enjuagar con soluciones estériles apropiadas se retira el filtro, y se lo coloca sobre la superficie de una placa de Petri con el medio de cultivo a utilizar e incuba.

Los filtros pueden ser de distintos materiales; en microbiología se emplean de nitrato o acetato de celulosa generalmente, y pueden tener bordes hidrofóbicos, que minimizan la adsorción de conservadores y antimicrobianos.

Luego de transcurrido el tiempo de incubación, se cuentan las colonias desarrolladas en el filtro. Se considera que las condiciones óptimas del método se dan cuando desarrollan entre 20 y 200 colonias en el filtro. Se utilizan filtros reticulados, y existen reglas para el

conteo:

1) Si hay 1 o 2 colonias por cuadrado del retículo, o menos, se cuentan todas.

2) Si hay entre 3 y 10 por cuadradito, se cuentan 10 cuadrados, y se promedia, multiplicando por 100 para obtener el número de

colonias en el filtro (se multiplica por 100 porque el area del cuadrado representa la centésima parte del área total del filtro). 3) Si hay entre 10 y 20 se cuentan 5 cuadrados y promedia, multiplicando luego por 100. 4) Si hay más de 20 se considera >2000 por filtro

Toda vez que se utilice el promedio por cuadrado, el recuento se informa como ESTIMADO.

Ventajas y desventajas:

1. Sirve para determinar cargas muy bajas, pues se puede filtrar volúmenes de 100 y hasta 500 mL por vez. 2. Es además el método de elección para muestras líquidas o solubles que contienen agentes antimicrobianos, por cuanto no es necesario neutralizarlos.

Expresión de los resultados:

Una vez conocido el número de colonias por filtro, se expresa el valor en u.f.c. al igual que el recuento en placa expresándolo por

gramo, o mililitro de muestra.

Recuento en Placa

porHomogenización en

Masa

Apartados de este ejercicio

A. IntroducciónB. Obtención de diluciones seriadas

C. Siembra de las placasD. Incubación

E. Recuento de las coloniasF. Cálculo y Presentación de los resultados

A. Introducción Determinación del número de microorganismos

La medida del número de microorganismos en una muestra es una determinación muy utilizada en microbiología. Para ello se utilizan varios tipos de técnicas. Algunas técnicas son medidas indirectas. Estas miden una propiedad - como la turbidez, el peso seco, o una concreta actividad metabólica - de la masa de células de una población. Otras técnicas son directas. Las medidas directas incluyen los recuentos directos al microscopio o recuento electrónico y los recuentos de viables.

Determinación del número de microorganismos

Técnicas indirectas(Ver descripción)

Técnicas directas

Recuentos al microscopio (Ver descripción) Recuento electrónico (Ver descripción)

Recuentos de viables

Recuentos de viables

El recuento directo al microscopio o el recuento electrónico proporcionan un recuento de todas las células, tanto las vivas como las muertas. Un recuento de viables mide sólo las células vivas de una población, es decir, aquellas capaces de reproducirse (viable significa "que puede vivir").

La técnica mas utilizada en Microbiología de los alimentos tanto para el recuento de viables como para la determinación del número de microorganismos es el recuento en placa objeto de este ejercicio. La filtración por membrana y la determinación del número más probable (NMP) son también recuentos de viables, aunque usados con menor

frecuencia.

Recuentos de viables

Recuento en placa (Este ejercicio)Filtración por membrana ( Ver descripción )

Número más probable ( Ver descripción )

Métodos de Recuento en Placa

Consiste en realizar diluciones sucesivas de la muestra en condiciones de esterilidad con objeto de sembrar después cantidades conocidas de las mismas en placas de Petri. Evidentemente, alguna de las diluciones será tal que al distribuir una parte de ella en la placa originará colonias separadas.

De igual manera, conocidos el número de colonias, la cantidad sembrada y la dilución correspondiente, esta técnica permite calcular el número de microorganismos viables en la muestra original .

Como las colonias pueden originarse tanto de una célula como de un grupo de células, se utiliza el término: Unidades Formadoras de Colonias (UFC.) Además, a los efectos de que todas las células que queden en una placa tengan una adecuada disponibilidad de nutrientes, y que los errores del método sean menores, se establece que las condiciones óptimas de recuento se dan cuando se desarrollan entre 30 y 300 colonias por placa o menos si se trata de hongos (cuyas colonias son mayores que las de las bacterias). Cuando esto no se cumple se considera el valor obtenido como una estimación del recuento, y si es posible se repiten las diluciones para conseguir una de ellas que al sembrar en placa produzca un número de colonias de entre 30 a 300.

Existen 2 métodos de recuento en placa según el método de siembra de la muestra:

Siembra en superficie: Se deposita en la superficie de las placas que ya contienen el medio de cultivo solidificado, 0.1 mL de la muestra o de cada dilución. Luego de realizada la descarga de la muestra, se procede a extenderla sobre toda la superficie de las placas, usando un asa de Drigalski estéril.Se llevan las placas a incubar (la temperatura y el tiempo de incubación elegidos varía según el tipo de microorganismos) y pasado el tiempo de incubación las colonias habrán crecido sobre la superficie del agar.

Siembra incorporada u homogenización en masa: Se deposita 1 mL de la muestra o de cada dilución en placas estériles, vacías. Posteriormente, se agrega a cada placa 15 a 20 mL del medio de cultivo a emplear, previamente fundido y mantenido a unos 47ºC. Se agita moviendo la placa tapada sobre la superficie de la mesa con movimientos circulares y de vaivén (siempre sin levantar la placa de la mesa). Con esto se consigue mezclar el inóculo con el agar. Se deja solidificar y se llevan las placas a incubar (la temperatura y el tiempo de incubación elegidos varía según el tipo

de microorganismos). Pasado el tiempo de incubación las colonias habrán crecido dentro del agar (en la masa del agar).

B. Obtención de diluciones seriadas

Se realizan diluciones decimales y seriadas del alimento.

La preparación de la muestra se realiza utilizando diluyentes adecuados. Se preparan diluciones de 1 en 10 sucesivas, partiendo en general de 10 gramos de muestra (y 90 mL de diluyente) para la primer dilución, y tomando 1 mL de ésta descargándolo en 9 mL de diluyente y así sucesivamente.

Según la carga esperada, o permitida, se eligen las diluciones a sembrar. Generalmente, se siembran no menos de tres diluciones consecutivas. Ej.: 1:10 (10-1), 1:100 (10-2), 1:1.000 (10-3), 1:10.000 (10-4)

Mezclar mecánicamente o manualmente cada dilución agitándola 25 veces en 7 segundos con movimientos ascendentes y descendentes formando un ángulo de abertura aproximado de 60º entre brazo y antebrazo.

C. Siembra de las placas mediante homogenización en masa

Transferir con una pipeta estéril 1 mL de cada dilución de la muestra a placas de Petri vacías y estériles.

Nota: se recomienda sembrar al menos dos placas por cada dilución.

En la transferencia de las diluciones a las placas es posible emplear tan sólo una pipeta si se comienza por la dilución del factor de dilución más alto (la más diluida). En caso contrario, habrá que emplear una pipeta para cada dilución.

Añadir unos 15-20 mL del medio de cultivo adecuado (según el tipo de microorganismos de los que queremos hacer el recuento).

En este método el medio ha de ser siempre un medio sólido (agar). En el momento de añadir el agar a las placas éste debe estar estéril y encontrarse fundido y a una temperatura de unos 50ºC.

Homogenizar el agar con el inóculo imprimiendo a la placa suaves movimientos circulares y de vaivén.

Esperar a que el agar solidifique en las placas.

D. Incubación

Incubar las placas a la temperatura necesaria y durante el tiempo necesario, siempre en posición invertida.

E. Recuento de las colonias

Pasado el tiempo de incubación examinar las placas. Las colonias aparecerán en la masa del agar. Cada colonia representa los descendientes de una bacteria o, lo que es más correcto, de una unidad formadora de colonia (UFC).

Elegir de entre todas las placas las dos correspondientes a aquella dilución que presenten un número de entre 30 y 300 colonias /placa (esto proporciona una precisión estadística suficiente y no es engorroso de hacer).

Para realizar el contaje, se utiliza un cuenta-colonias; se pone la placa de Petri con la base hacia arriba y, si es preciso, se divide en sectores marcando mediante un lápiz graso a lo largo de los diámetros.

F. Cálculo y Expresión de los resultados

El número de unidades formadoras de colonia o UFC/g de alimento original será:

Número de UFC/g = Número de colonias x factor de dilución

Tener en cuenta que en la expresión anterior

"Número de colonias" = media del número de colonias contadas en cada una de las placas de la dilución elegida

"Factor dilución" = inverso de la dilución elegida

Obtener el valor del recuento total de gérmenes expresado de la siguiente manera:

El informe debe decir:

Recuento de microorganismos (tipo): N UFC /g o mL de alimento.

Nota: La diferencia entre los resultados extremos de la determinación efectuada por duplicado, no deberá exceder del 10% de la media aritmética de los 2 resultados; en caso contrario, debe repetirse el examen.

RedondeoCuando se dan los valores del recuento en placa (N) deben utilizarse únicamente dos cifras significativas. Estas dos cifras corresponden a los dígitos primero y segundo (empezando por la izquierda) de la media de las colonias halladas. Los dígitos restantes tienen que ser sustituidos por ceros. Por ejemplo, si el valor calculado es de 523.000, este ha de darse como 520.000 (52 X 104) . Si el tercer dígito empezando por la izquierda es 5 o superior, se le añade una unidad al segundo dígito (se redondea). Por ejemplo si el valor calculado es 83.600, este debe hacerse como 84.000 (84 X 103).

Cuando no se encuentran colonias en ninguna de las placas sembradas, expresar el recuento como inferior a (<) 1 multiplicado por el factor de la dilución más concentrada.Ejemplos: *Si hemos sembrado placas de las diluciones 10-1, 10-2, 10-3 y 10-4 y no aparece ninguna colonia en ninguna de las placas el resultado será: <1 X 10= <10 UFC/ g o mL de alimento.

*Si hemos sembrado placas de las diluciones 10-2, 10-3 , 10-4 y 10-5 y no aparece ninguna colonia en ninguna de las placas el resultado será: <1 X 102= <100 UFC/ g o mL de alimento.

Cuando se encuentran más de 300 colonias en todas las placas sembradas, expresar el recuento como superior a (>) 300 multiplicado por el factor de la dilución más diluida.Ejemplos:*Si hemos sembrado placas de las diluciones 10-1, 10-2, 10-3 y 10-4 y en todas las placas hay más de 300 colonias el resultado será: >300 X 104= >3000000 = 30 X 105 UFC/ g o mL de alimento.

N= C x Ddonde: N= Unidades formadoras de colonia por gramo de muestra. C= Número de colonias.

D= Factor de dilución.

*Si hemos sembrado placas de las diluciones 10-2, 10-3 , 10-4 y 10-5 y en todas las placas hay más de 300 colonias el resultado será: >300 X 105= >30000000 = 30 X 106 UFC/ g o mL de alimento.