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Pruebas BioquímicasDeterminan la actividad metabólica de una cepa pura. Son
empleadas principalmente la identificación y clasificación de bacterias y hongos.
Pruebas Bioquímicas
Se pueden resumir en los siguientes puntos:
•Sustrato (contenido en el medio de cultivo)
•Enzima o vía metabólica (secretada o en el interior del
microorganismo)
•Producto
•Revelador y/o indicador (aunque algunas no los emplean)
E + S ↔ ES ↔ E + P
Los fundamentos completos de estas pruebas y demás información pueden
encontrarlos en el libro: Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias
de importancia clínica de Jean F. MacFaddin, Editorial Médica Panamericana.
Hidrólisis del Almidón
Agar Almidón
Sustrato: Almidón (polímero de glucosa).
Enzima: Amilasa (exoenzima).
Producto: Glucosa.Revelador: Lugol.
El lugol con el almidón forman un complejo color café-púrpura
que desaparece cuando el almidón ha sido degradado.
El almidón es producido principalmente por
plantas superiores, está
compuesto de amilosa y
amilopectina. Diversas enzimas amilolíticas
hidrolizan almidón y sus
productos.Prueba negativa Prueba positiva
Degradación de la caseína
Prueba negativa Prueba positiva
Agar Leche Descremada
Sustrato: Caseína (proteína).
Enzima: Caseinasa (Proteasa, exoenzima).
Producto: Aminoácidos.
Revelador: No requiere.
Las proteasas son excretadas al medio para la degradación de
proteínas, la caseína es la proteína de la leche que le confiere el color blanco, cuando la caseína es hidrolizada desaparece el
color blanco alrededor del crecimiento microbiano.
Hidrólisis de la lecitina y
reducción del telurito
Algunos microorganismos producen lecitinasa que hidroliza la
lecitina (fosfolípido). Se utiliza el agar yema de huevo. Las colonias
productoras de lecitinasa forman una zona opaca a su alrededor.
El medio de Baird Parker es empleado para el aislamiento y
cuantificación de estafilococos cuagulasa positivos, al que se adicionan componentes que lo hacen selectivo. Las colonias
típicas de S. aureus son oscuras por la reducción del telurito,
además presentan el halo de hidrólisis de la lecitina.
Agar yema de huevo/Agar Baird ParkerSustrato: Lecitina.
Enzima: Lecitinasa.
Producto: Fosforilcolina.
Revelador: No requiere.
Licuefacción de la gelatina
Gelatina Nutritiva
Sustrato: Gelatina (proteína).
Enzima: Gelatinasa (Proteasa,
exoenzima).
Producto: Aminoácidos.Revelador: No requiere o puede
emplearse el carbón activado en
polvo.
La gelatina es una proteína que tiene la capacidad de gelificar,
cuando es hidrolizada por la gelatinasa en los aminoácidos que la
componen pierde su característica de gelificar. Se pueden
emplear varios medios que permiten la visualización
macroscópica como la gelatina adherida a carbón activado.
Prueba negativa Prueba positiva
Fermentación de carbohidratos
Medio base rojo de fenol más carbohidrato o polialcohol, con
campana de fermentación (Durham).
Sustrato: Carbohidrato o polialcohol.
Vía: Fermentativa.Producto: Ácidos orgánicos.
Indicador: Cualquier indicador de pH.
Los compuestos de carbono (carbohidratos o polialcoholes)
deben ser incorporados, algunos requieren de ser degradados
en monómeros y transportados a la célula para posteriormente
en condiciones anaerobias ser metabolizados por la vía fermentativa. La fermentación (degradación) de un compuesto
orgánico se observa por la acidez en el medio de cultivo y la
formación de gas capturado en la campana de fermentación.
Negativo/Positivo(A)/Positivo(AG)
Oxidación/Fermentación
Las bacterias utilizan hidratos de carbono por uno de dos procesos
metabólicos, fermentativo u oxidativo. La principal diferencia es la
necesidad de oxígeno atmosférico y una fosforilación inicial. Por
prueba se inoculan dos tubos de medio y uno de ellos se sella con
aceite mineral o parafina para impedir la entrada de oxígeno.
La fermentación requiere de una fosforilación inicial, utiliza
principalmente la vía de la Glucólisis (Embden-Meyerhof-Parnas
EMP), aunque también puede utilizar las vías de las Pentosas
fosfato o Entner-Doudoroff en combinación con EMP.
Hugh and Leifson
Sustrato: Carbohidratos.
Vías: Fermentativa y/u Oxidativa.Producto: Acido pirúvico.
Indicador: Azul de bromotimol u
otro indicador ácido/base.
Oxidación/Fermentación
La oxidación de la glucosa
produce ácido pirúvico por una vía de derivación, ocurre en
condiciones aerobias y no
requiere de fosforilación inicial.
Reacción Tubo con reacción positiva Tubo abierto Tubo sellado
Oxidación Abierto Amarillo (+) Verde (-)
Fermentación Sellado Amarillo (+) Amarillo
Ni fermentación,
ni oxidaciónNinguno Azul o verde Verde
Fermentación y oxidación
Ambos Amarillo Amarillo
La producción de ácido se observa por el vire del indicador al
amarillo. En los tubos positivos puede haber generación de gas.
Rojo de Metilo/Voges Proskauer
Caldo RM/VP
Sustrato: Glucosa.
Vías: Fermentación ácida o neutra.
Producto: Acido orgánicos o acetoína.
Reveladores: Solución de Rojo de Metilo,
Alfa Naftol y KOH 40%.
Fermentación ácido mixta: Los productos finales son ácidos
orgánicos que provocan un descenso brusco del pH inicial del medio (viraje del indicador de amarillo pH por encima de 5,1) y rojo
(pH por debajo de 4,4). Estos microorganismos por cada 4
moléculas de piruvato formadas, reducen dos a ácido láctico y dos
las metabolizan para formar ácido acético y fórmico; parte del
acetato pasa a etanol y parte del fórmico a CO2 y H2 en
cantidades iguales.
Rojo de Metilo/Voges Proskauer
Fermentación butilenglicólica: en ésta,
parte del piruvato se metaboliza
produciendo cantidades menores de ácido láctico, fórmico y acético, la
mayor parte del piruvato se condensa
formando acetilmetilcarbinol, que es
reducido a 2,3-butilenglicol, productos que son neutros.
Para determinar la presencia de los productos neutros (prueba
de Voges-Proskauer): Se agrega un poco de a-naftol al 5% en etanol (medio adquiere aspecto lechoso), luego se le añade
(KOH 40%) que desaparece el aspecto lechoso, se agita
fuertemente. (Prueba positiva color rosado - violáceo en la parte
superior del tubo; Prueba negativa no tiene coloración).
Utilización de citrato
Prueba negativa Prueba positiva
Medio de Citrato de Simmons
Sustrato: Citrato de sodio.
Vía: Varias dependientes del pH del medio.
Producto: Acetato/formato en
condiciones alcalinas y Acetato,
CO2, lactato/Acetoína y CO2 en condiciones ácidas.
Indicador: Azul de bromotimol.
Un microorganismo que puede utilizar el citrato como única
fuente de carbono también utiliza las sales de amonio del medio como única fuente de nitrógeno. La extracción de
nitrógeno de las sales de amonio producen amoniaco y se
alcaliniza el medio virando el indicador al alcalino.
Agar Hierro de Kligler (KIA)
Agar hierro de Kligler
Sustratos: Glucosa 0.1%, lactosa 1% y
Tiosulfato o grupos –SH de la cisteína. Vía: Fermentativa y Enzimas: Tiosulfato
reductasa y cisteína desulfurilasa-
Productos: Ácidos mixtos y H2S.
Indicadores: Rojo de fenol y sales de Fe2+ .
En presencia de tiosulfato en el medio o la degradación de
proteínas liberando aminoácidos azufrados, algunos microorganismos forman H2S gaseoso por medio de las enzimas
tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa. El gas incoloro H2S se forma en condiciones ácidas y reacciona con el citrato de
amonio férrico para producir un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso metálico.
Agar Hierro de Kligler (KIA)
No fermentadores
Pico de flauta
alcalino y fondo alcalino
No fermentadores de lactosa
Péptidos
Aminas
O2
Glucosa
Ácidos Mixtos
Reacción inicial:
Pico de flauta
ácido y fondo
ácido
Reacción final:
Pico de flauta
alcalino y
fondo ácidoPéptidos
Aminas
O2
Glucosa
Ácidos Mixtos
Fermentadores de lactosa
Péptidos Aminas
O2
Glucosa + Lactosa
Ácidos Mixtos
Pico de flauta
ácido y fondo
ácido
Péptidos Aminas
O2No fermenta
pH = 7.4
•Las bacterias incapaces de fermentar utilizan las peptonas y
liberan aminas que alcalinizan todo el
medio.
•Las bacterias que solo fermentan la glucosa, inicialmente también utilizan
aeróbicamente la glucosa. Debido a
la baja concentración de glucosa
(0.1%), metabolizan las peptonas alcalinizando la superficie del medio.
•Las bacterias fermentadoras de glucosa y lactosa, fermentan la
glucosa 0.1% y al término de esta, fermentan la lactosa 1%, permitiendo
la acidificación completa del medio.
Agar Hierro de Kligler (KIA)
Tubo C 1 2 3 4 4A 5
Fermentación de Glucosa - - + + + + +
Producción de gas de la
fermentación
- - - + + + +
Fermentación de Lactosa - - - - + + +
Producción de H2S - - - + - - +
El medio de Kligler está diseñado para la
identificación de
enterobacterias y otras
bacterias Gram negativas.
•Interpretación:
Medio SIM
(Sulfhídrico Indol Movilidad)
Medio SIM (medio semisólido)Sustratos: Tiosulfato o grupos –SH de la cisteína y triptófano.
Enzimas: Tiosulfato reductasa, cisteína desulfurilasa y tiptofanasa.
Producto: H2S e Indol.
Revelador: Sales de Fe2+ y p-Dimetilaminobenzaldehído (DMABA).
Prueba positiva Prueba negativa
En presencia de tiosulfato en el medio o la
degradación de proteínas liberando aminoácidos azufrados, algunos microorganismos
forman H2S gaseoso por medio de las enzimas
tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa. El gas
incoloro H2S reacciona con el citrato de amonio
férrico para producir un precipitado negro
insoluble de sulfuro ferroso metálico.
Medio SIM
(Sulfhídrico Indol Movilidad)
El medio de cultivo tiene consistencia semisólida
por lo que la movilidad se observa por el crecimiento del microorganismo en todo el tubo,
más allá de la zona de inoculación (picadura). Los microorganismos inmóviles solo crecerán en
la zona inoculada.
Prueba positiva Prueba negativa
Prueba negativa Prueba positiva
Las enzimas triptofanasas oxidan el triptófano
para formar tres metabolitos: indol, metil indol y
ácido indolacético. Los reactivos de Erhlich o
Kovacs contienen DMABA que reacciona con el
indol producido formado un compuesto
quinónico color violeta, que se observa por la
aparición de un anillo en la superficie del medio.
Ureasa
Caldo urea o agar urea de
Cristensen.
Sustrato: Urea.
Enzima: Ureasa.
Producto: Amoníaco.Indicador: Rojo de fenol.
La hidrólisis de la urea por la enzima
ureasa libera dos moléculas de
amoniaco que alcaliniza el medio,
entonces se vira el indicador de pH, en el caso del rojo de fenol una
prueba positiva es color bugambilia.
Prueba negativa Prueba positiva
Reducción de Nitratos
Caldo nitratos
Sustrato: Nitrato de sodio.Enzima: Nitrato reductasa.
Producto: Nitritos.
Revelador: Reactivos de Griess.
N03- → NO2
- → NO → N2O → N2
•Nitrato reductasa (NAR).
•Nitrito reductasa (NIR).
•NO reductasa (NOR).
•N2O reductasa (N2OR).
Reducción de Nitratos
El nitrito reacciona
con dos reactivos:
ácido sulfanílico y dimetil-a-naftilamina
(o a-naftilamina). La
reacción de color
se debe a la formación de un
compuesto
diazonio, p-
sulfobenceno-azo-
a-naftilamina.
NH2
SO3H
Acido sulfanílico
(incoloro)
+ HNO2
Acido nitroso
Acido sulfanílico diazotizado
(sal de diazonio)
N
SO3H
N
+ H2O +
NH2
a-naftilamina
(incolora)
p-sulfobenceno-azo-a-naftilamina
(colorante rojo azo hidrosoluble)
NH2
+ H2O
N
SO3H
NAcoplamiento
Cuando la prueba resulta negativa para nitritos se utiliza la prueba
del zinc para reducir químicamente los nitratos presentes a nitritos y formar con los reactivos de Griess el compuesto colorido.
Descarboxilasas
Los aminóacidos al perder el grupo carboxilo se convierten en
diaminas lo que incrementa el pH del medio y el indicador
(púrpura del bromocresol) vira a violeta. Las descarboxilasas
son útiles en la diferenciación de enterobacterias.
Medio base de descarboxilasas u otros
medios como LIA o MIO.
Sustrato: Aminoácidos (lisina, ornitina o
arginina) .
Enzimas: Lis.Producto: Amoníaco.
Indicador: Púrpura de bromocresol.
Prueba de la coagulasa
Plasma de conejo
Sustrato: Factores de la coagulación.
Enzima: Coagulasa
(estafilocoagulasa).Producto: Coagulo.
Revelador: No requiere.
La enzima producida por S. aureus es excretada al medio
extracelular, el mecanismo propuesto es la acción de esta enzima sobre los factores de la coagulación presentes en el
plasma y formar un coagulo visible.
Prueba positiva Prueba negativa
Oxidasa
Se basa en la producción bacteriana de una enzima oxidasa
intracelular. Esta reacción se debe a un sistema de citocromo
oxidasa que activa la oxidación del citocromo reducido por el
oxígeno molecular, el que a su vez actúa como un aceptor de electrones en la fase terminal del sistema de transferencia de
electrones. La prueba positiva se observa por la oxidación del
reactivo incoloro en pocos segundos formándose un producto
colorido.
Cultivo de medio nutritivoSustrato: Compuesto reducido.
Enzima: Oxidasa.
Producto: Compuesto oxidado.
Revelador: Reactivo de Kovacs, diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina
(TPD) al 1%, solución incolora.