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© Curso online “Actualización en Trasplante de Órganos Sólidos” 2014

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Prueba cruzada virtual

Por qué y cómo usarla

Jorge Neumann

Laboratorio de Inmunología de Trasplantes

Santa Casa de Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil

1. Introducción

Entre los diversos problemas que encontramos actualmente en la rutina de los trasplantes renales

con donante fallecido, son dos los que llaman la atención de quien participa en este proceso, tanto

a la vanguardia como en la retaguardia del laboratorio: el tiempo de isquemia fría a que se somete

al órgano y la proporción de pacientes que presentan gran reactividad a los antígenos HLA (Human

Leukocyte Antigens – antígenos de histocompatibilidad humana).

El tiempo de isquemia fría debe ser siempre el menor posible. En la forma ideal, donante y

receptor debieran estar en el mismo bloque quirúrgico, pero esto muy raramente se consigue. Con

el aumento de las donaciones a distancia, es decir, aquellas en que donante y receptor están en

diferentes regiones de un país o continente, la tendencia es a que esos tiempos se prolonguen.

Respecto al grado de sensibilización, cerca del 25% de los pacientes en lista de espera de

trasplante renal, en los tres estados de la región sur de Brasil, presenta anticuerpos anti-HLA

circulantes, ante un abanico de antígenos HLA considerado alto. La presencia de estos anticuerpos

impide, frecuentemente, la realización del trasplante renal, por un resultado de prueba cruzada

pre-trasplante positivo, y, en consecuencia, esos pacientes acaban terminando en lista por

períodos muy largos, bastante por encima del promedio de otros pacientes a los cuales no se les

detectan tales anticuerpos.

Las herramientas diagnósticas actualmente disponibles en los laboratorios de histocompatibilidad

permiten identificar no solo cuáles anticuerpos están presentes en estos receptores sino que,


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además, proporcionan una semicuantificación de estos anticuerpos. Con esto se ha logrado que

sea posible prever el resultado de la prueba cruzada con un alto grado de acierto.

Este ejercicio teórico, si se hace correctamente, puede abreviar el tiempo que gasta el laboratorio

en la ejecución de las pruebas cruzadas, disminuyendo con ello el tiempo necesario para

comunicar el resultado, contribuyendo, de esta forma, a la reducción de los tiempos de isquemia.

Además, es posible evitar que se desperdicie el suero de un paciente en una prueba cruzada

presuntamente positiva, economizando, con ello, además de tiempo, dinero y, sobre todo, el

propio suero de este receptor, indispensable para el estudio de un donante con mayores

posibilidades potenciales de resultado de prueba cruzada negativo.

Esta práctica de prever el resultado de una prueba cruzada, también llamada prueba cruzada

virtual es, desde 2010, de uso corriente en el Laboratorio de Inmunología de Trasplantes de la

Santa Casa de Porto Alegre. Con anterioridad, otros centros habían mostrado que este abordaje

podía ser beneficioso, aunque con criterios distintos a los aquí adoptados.1

Antes de comenzar a emplearlo, analizamos durante un año los resultados de todas las pruebas

cruzadas realizadas en el laboratorio y comparamos esos resultados con la prueba cruzada virtual

realizada en paralelo. Para que esto ocurriese, se necesitó que estuvieran estandarizados y

validados internamente todos los parámetros involucrados en la evaluación virtual. Los dos

principales parámetros fueron el umbral de positividad en la prueba cruzada por citometría de

flujo y el límite de detección de anticuerpos clínicamente relevantes en las pruebas de fase sólida

para evaluación de la reactividad contra el panel, para así definir, de la forma más objetiva posible,

lo que llamamos paciente hipersensibilizado.

2. Métodos

2.1 Prueba cruzada por citometría de flujo

Entre todas las variables que involucra el procedimiento técnico de la prueba cruzada por

citometría de flujo, tal vez la más importante de todas sea la definición del umbral de positividad.

La proporción volumen de suero vs número de células blanco, la titulación de conjugados, la

titulación de los controles positivos y los tiempos y temperaturas de incubación son, en la

citometría de flujo, parámetros que deben ser ajustados. Además, en la prueba cruzada debemos,

igualmente, arbitrar a partir de qué punto pasamos a considerar el resultado del análisis como


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positivo y en cuál escala se van a leer e interpretar las pruebas, si en la lineal (1-10.000) o en la

logarítmica (104). La opción más simple es la de adoptar un umbral sugerido por alguna

publicación o institución. Esto podría ser adecuado para quien hace estas pruebas de forma

esporádica, pero no es el mejor procedimiento para quien emplea esta herramienta en forma

habitual.

Una alternativa es medir el grado de reactividad que alcanzan los sueros provenientes de

individuos considerados normales y que no presentan en su historial eventos relacionados con la

inmunización anti-HLA. De esa forma, una selección de 15 a 30 voluntarios del sexo masculino, que

nunca han sido transfundidos ni trasplantados, se contrasta con 15 a 30 donantes de órganos,

seleccionados aleatoriamente. El promedio de esa reactividad, ampliado con los tres desvíos

estándar, es considerado el límite de negatividad, siendo los valores superiores a ese límite

considerados como positivos.

La mejor opción, no obstante, es usar a los propios receptores de órganos como parámetro. Esto

se hace evaluando el promedio de reactividad de los receptores que no presentan anticuerpos

anti-donante, según la evaluación de un ensayo en fase sólida basado en single antigens beads. De

esa forma, obtenemos una evaluación más realista, ya que no hay selección de sueros y se puede,

entonces, usar un número mucho mayor de pruebas, haciendo, por consiguiente, que la

estadística sea más confiable y potente.

Se demuestran a continuación los resultados de umbral (cutoff) contra linfocitos T y contra

linfocitos B, obtenidos en un equipo FacsCalibur (BD), en el Laboratorio de Inmunología de

Trasplantes de la Santa Casa de Porto Alegre. Se incluyeron 540 sueros de receptores sin

anticuerpos anti-donante (sin anti-HLA A, B, C, DR, DQ y DP), probados en 302 donantes de

órganos sólidos.

En la escala lineal 1-10.000:

• Linfocitos T: promedio: 22,30; SD: 18,5; promedio + 3 SD: 77,8

• Linfocitos B: promedio: 65,0; SD: 646; promedio + 3 SD: 258,8

Basados en estos números, pasamos a utilizar valores superiores a 80 como positivos, en linfocitos

T, y superiores a 260, en linfocitos B, en la escala lineal.

2.2 Evaluación de reactividad contra panel


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Pocas áreas en la inmunología de trasplantes evolucionaron tanto en los últimos 15 años como la

evaluación de reactividad contra panel. Originalmente diseñada para representar el grado de

positividad que un determinado suero presentaba, en pruebas cruzadas reales, evolucionó hacia

pruebas que no analizaban más células vivas, evitando con ello el grado de complejidad que la

célula exige para su manipulación y disminuyendo los factores de confusión inherentes a un

ensayo biológico.

La primera evolución fue adherir moléculas HLA a placas Elisa. Eso evitaba el uso de células

enteras y viables, y permitía la creación de kits comerciales de evaluación del painel. Por otro lado,

estas facilidades se vieron acompañadas por la baja sensibilidad, lo que fue demostrado por un

número de pruebas cruzadas reales positivas, en individuos aparentemente sin anticuerpos anti-

HLA circulantes. En nuestro laboratorio, constatamos hasta un 11% de falsos negativos en

exámenes basados en Elisa.2

La más reciente generación de reactivos para la evaluación de reactividad contra panel se sirve de

principios comunes a la citometría de flujo, con empleo de esferas plásticas a las cuales se adhirió

moléculas HLA purificadas. El equipo usado, conocido como Luminex®, es capaz de identificar

decenas de diferentes esferas, permitiendo, de esa manera, el análisis simultáneo de decenas de

antígenos HLA. Con esta tecnología se puede, de una forma muy rápida, saber si el receptor es

portador de anticuerpos anti-HLA y contra cuáles antígenos HLA, así como evaluar de forma

semicuantitativa la dimensión de esta inmunización.

Esta nueva generación de análisis en fase sólida, también conocida como single antigen beads,

trajo, por un lado, informaciones que de otra manera sería muy difícil obtener, y, por otro,

también algunos nuevos desafíos. Lo más importante, quizás, sea definir cuál es el patrón de

reactividad mínimo que debe ser considerado como clínicamente relevante. Agréguese a eso que,

en el proceso de fabricación, algunas moléculas HLA pueden sufrir un proceso de

desnaturalización total o parcial. Esto, a su vez, puede conducir a resultados falso-positivos, desde

el momento en que no encontraremos en la naturaleza, en la membrana de las células de un

donante, moléculas HLA desnaturalizadas.

Tomando en cuenta estas dificultades, el laboratorio deberá determinar el nivel de reactividad a

partir del cual el anticuerpo será considerado positivo, y estar alerta ante posibles reacciones

falso-positivas.

En nuestro laboratorio, donde usamos los kits One Lambda Single Antigens Beads, en base a

análisis realizados con suero de 24 hombres no transfundidos y no trasplantados (Fig. 1 y Fig. 2),


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adoptamos 1.000 unidades de fluorescencia (mfi) como valor de cutoff, a partir del cual

consideramos presente un anticuerpo.

2.3 Correlación entre los resultados Luminex® Single Antigen Beads y la

prueba cruzada por citometría de flujo

Entre el 1º de enero y el 31 de diciembre de 2010 realizamos, en paralelo, 1.316 pruebas cruzadas

por citometría de flujo, con 161 donantes fallecidos y 620 receptores en lista de espera de riñón,

en Rio Grande do Sul (promedio de 2,1 pruebas por receptor). Los resultados de las pruebas

cruzadas por citometría se compararon con los niveles de anticuerpos anti-HLA presentes en el

donante, según el análisis Single Antigen Beads.

Se clasificó a los sueros en tres grupos:

• sin anticuerpos anti-donante (DSA),

• con bajos niveles de anticuerpos (1.000 a 5.000),

• con altos niveles de anticuerpos, superiores a 5.000.

En la franja de fluorescencia baja, de 1.000 a 5.000 de mfi, observamos un 60,9% de pruebas

cruzadas por citometría positivas (con 39,1% negativas). En presencia de anticuerpos anti-donante

(anti-HLA A, B o DR), a niveles superiores a 5.000 de mfi, observamos un 97,6% de pruebas

cruzadas por citometría de flujo positivas, (o 2,4% negativas).

Asimismo, para los casos en que el receptor, aisladamente, no presentase ningún anticuerpo a

niveles superiores a 5.000, pero tuviese dos o más anticuerpos cuya suma fuese superior a 5.000,

la positividad observada fue del 94,6%.

A partir de estos datos, y de común acuerdo con los grupos de trasplante que utilizan los servicios

del laboratorio y la Central de Trasplantes de Rio Grande do Sul, sur de Brasil, pasamos a eliminar

de la lista de candidatos a un riñón a todos los potenciales receptores que presenten anticuerpos

anti-donante con nivel lo suficientemente alto como para configurar una probabilidad superior al

97% de presentar prueba cruzada positiva. Ello resultó en la esperada economía de tiempo –

traducida en menos isquemia fría– y dinero, y en ahorro de suero del receptor hipersensibilizado.

De forma paralela, con el aumento de las remesas de riñones provenientes de otras regiones de

Brasil, pasamos, con relativa frecuencia, a tener que lidiar con situaciones en que recibíamos un

riñón apto para ser trasplantado, pero que venía sin ningún material biológico viable –por


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ausencia o mala calidad– que nos permitiese realizar las necesarias pruebas cruzadas pre-

trasplante. El dilema residía en tener que desperdiciar un órgano o trasplantarlo sin realizar el

análisis.

La experiencia previamente adquirida mediante la prueba cruzada virtual nos permitió pasar a

seleccionar un receptor de la lista que se había originado mediante compatibilidad HLA, que no

presentase anticuerpos anti-HLA presentes en el donante, por ende, con prueba cruzada virtual

negativa. Realizamos, desde el 2010, 12 trasplantes renales en esas condiciones. En cinco de ellos,

fue por ausencia de material (ganglio, bazo o propiamente sangre) que permitiera la realización de

cualquier examen físico. En siete situaciones, el riñón llegó a nuestro hospital con prolongados

tiempos de isquemia, superior a 24 horas (en promedio, 28,5 horas). En estos doce casos, la

evaluación de la prueba cruzada se hizo de forma virtual, se la consideró negativa por ausencia de

anticuerpos anti-donante (anti-HLA A, B, C, DR y DQ) y se realizó el trasplante. En los 7 casos de

larga isquemia, en los cuales había material para la prueba cruzada, se llevó a cabo el trasplante,

basándose únicamente en la prueba cruzada virtual, realizando la prueba cruzada real

retrospectivamente. En estos 7 casos, la prueba cruzada real confirmó la negatividad señalada por

la prueba cruzada virtual. La totalidad de los receptores permanece con injerto funcionando, con

un seguimiento de 5 a 38 meses.

3. Discusión

Desde la introducción de las pruebas cruzadas pre-trasplante, a finales de los 60, se vio la

necesidad de mejorar su especificidad y sensibilidad. La introducción de la antiglobulina humana

(AGH) y, posteriormente, de las pruebas cruzadas por citometría de flujo mejoró mucho esas dos

carencias, no obstante, continúan siendo estudios muy trabajosos y que demandan muchas horas

para su ejecución.

La evolución inexorable de la tecnología motivó que surgiesen, más recientemente, herramientas

capaces de informar con gran precisión si un determinado receptor presenta o no anticuerpos pre-

formados contra blancos HLA presentes en el donante. Siempre que se realicen en un laboratorio

con dominio de las técnicas de fase sólida, Single Antigen Beads, y con los cuidados necesarios

para la determinación de la relevancia del anticuerpo encontrado –nivel de fluorescencia (mfi)–,

las informaciones obtenidas podrían permitir tanto la exclusión de un receptor, por presentar alto

riesgo de prueba cruzada positiva, como, incluso, la realización del trasplante sin una prueba


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cruzada física. Hoy en día, diversos centros, en diferentes regiones del mundo, usan la prueba

cruzada virtual en sus rutinas.3-8

El protocolo para la prueba cruzada virtual vigente en la Santa Casa de Porto Alegre permite que

se realice el trasplante antes que la prueba cruzada física, siempre que no se demuestren

anticuerpos anti-HLA presentes en el donante, es decir: no se evidencian reacciones en el estudio

de fase sólida, con fluorescencia superior a 1.000 mfi.

En los casos en que encontramos anticuerpos anti-donante en la franja de fluorescencia de 1.000 a

4.999, la prueba cruzada por citometría de flujo se hace indispensable en el pre-trasplante, ya que

en cerca del 60% de los casos la prueba cruzada real será positiva.

Por último, en los casos en los cuales encontramos anticuerpos anti-donante con niveles

superiores a 5.000 mfi, la prueba cruzada real ni siquiera se realiza, porque la probabilidad de que

sea positiva es superior al 97%. Sin embargo, en los casos en que el paciente presenta algún tipo

de urgencia, sea por falta de acceso adecuado a la diálisis u otro motivo médico, se lo continuará

sometiendo a la prueba cruzada real, aunque se estime que la posibilidad de que la misma sea

negativa es inferior al 3%. Por otra parte, consideramos relevante informar que desde 2013 hemos

adoptado un protocolo rápido y optimizado para la prueba cruzada por citometría de flujo,

denominado Protocolo Halifax9, que ha permitido reducir el tiempo necesario para concluirlo en,

aproximadamente, dos horas, agregando, así, rapidez al proceso, aún en los casos en que la

prueba cruzada pre-trasplante se hace necesaria.


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Figura 1

Perfil de reactividad de 24 sueros de donantes masculinos saludables, en estudio Luminex® Single

Antigen Beads One Lambda, clase I. La línea azul representa la reactividad promedio + 1 desvío

estándar, y la línea roja, promedio + 2 desvíos. Por estos resultados, nuestro laboratorio adoptó

1.000 unidades de fluorescencia (mfi) como mínimo a partir del cual el anticuerpo pasa a ser

considerado positivo. Los anticuerpos contra los antígenos A29, 31, 34, 66, 80 y Cw17 que

presenten resultados superiores deben ser mirados con mucho cuidado, por la probable presencia

de moléculas desnaturalizadas en las esferas del kit.


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Figura 2

Perfil de reactividad de 24 sueros de donantes masculinos saludables, en estudio Luminex® Single

Antigen Beads One Lambda, clase II. La línea azul representa la reactividad promedio + 1 desvío

estándar, y la línea roja, promedio + 2 desvíos. Por estos resultados, nuestro laboratorio adoptó

1.000 unidades de fluorescencia (mfi) como mínimo a partir del cual el anticuerpo pasa a ser

considerado positivo. Los anticuerpos contra los antígenos DP2 y DR52 que presenten resultados

superiores deben ser mirados con mucho cuidado, por la probable presencia de moléculas

desnaturalizadas en las esferas del kit.


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Cuadro 1. Resumen de resultados

DSA Prueba cruzada positiva Prueba cruzada negativa

Grupo 1 (DSA entre 1.000 y

4.999 mfi) 60,9% 39,1%

Grupo 2 (DSA >5.000 mfi) 97,6% 2,4%

En los casos donde encontramos anticuerpos anti-donante con niveles inferiores a 5.000 mfi

(Grupo 1), se considera obligatoria la prueba cruzada pre-trasplante. En los pacientes del Grupo 2,

con anticuerpos anti-donante por encima de 5.000 mfi, se considera positiva la prueba y se

excluye a los pacientes de la lista, a pesar de que aquí existen excepciones. Los pacientes sin

anticuerpos anti-donante detectados por pruebas en fase sólida Single Antigen Beads podrán ser

derivados a trasplante, sin prueba cruzada real prospectiva.


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Referencias

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significantly increases access of highly sensitized patients to deceased donor kidney

transplantation. Transplantation, Vol 86, Nº 12, 1864-1868, 2008).

2. S. Fernandes, J. Neumann y D. Saitovich: O papel da citometría de fluxo na detecção de

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Paulo: Sarvier, 2006, v.9, p. 375-380.

3. Bohming, G., Fidler, S., Christiansen, F., et al: Transnational validation of the Australian

algorithm for virtual crossmatch allocation in kidney paired donation. Hum Immunol,

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5. Sun, Y., Song, Y., Wan, L., et al: Virtual crossmatch versus final crossmatch – review of

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6. Locke, A., Moua, K., Cabarong, M., et al. A comparison of mfi with flow cytometric

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8. Wedermyer, G., Roark, C., Freed, B.: Validation of virtual crossmatch using donor specific

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9. Liwski, R., Adams, G., Peladeu, G., Eckels, D., Bray, R., Gebel, H.: An optimized flow

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Immunol 72; 73. DOI: 10.1016/j.humimm.2011.07.107.

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