Proteómica de expresión diferencial

Lucía Monteoliva Díaz

TIPOS DE PROTEÓMICA

• PROTEÓMICA DE EXPRESIÓN– Estudio cuantitativo de la expresión de proteínas entre muestras

que difieren en alguna variable.– Comparación de proteomas y subproteomas– Identificación de nuevas proteínas implicadas en transducción

de señales, proteínas específicas de enfermedad, función de las proteínas,...

Proteómica de expresión

Permite estudiar rutas celulares y sus cambios por enfermedad, uso de medicamentos u otros estímulos.

Células hepáticas

Fibroblastos

Proteómica de expresión

SELDI-TOF

Aproximaciones en gel

Aproximacionesbasadas en MS

Proteómicade Expresión

1. Flujo de trabajo clásico: 2-DE y tinción de plata u otros métodos de detección

2. 2D-DIGE: Cy3/Cy5 or Cy3/Cy5/Cy2

Marcaje con isótopos estables y MS:1. Marcaje metabólico (SILAC), 2. Marcaje químico (ICAT) others

(Patterson & Aebersold, Nature genetics, 2003)

Proteómica de expresión

Mapas de expresión de proteínasDetectas isoformas (modificaciones postraduccionales y procesamientos)

CUANTIFICACIÓN Y COMPARACIÓN

Estudio global de los cambios de la expresión de las proteínas en las células utilizando geles bidimensionales y análisis de imágenes

Aproximación en gel

2-DE

Análisis de Imagen

Corte de lasproteínas

Digestión

MALDI-TOF MS (huella peptídica)

Búsqueda en bases de

datos

Identificación poco clara

ESI-MS/MS oMALDI TOF-TOF (MS/MS)

Secuenciación y búsqueda en bases de

datos

MW

pI

Sample A Sample B

o

2-DE: Flujo clásico

b1

b2b3

y1

y2

y3

LF

K

G

G L

K

F

Rela

t ive In

tensi

ty

m/z

Identificación

(Monteoliva and Albar, 2004)

Proteómica de expresión silvestre mutante

1A1B

1C

2A2B

2C

3A3B

3C

1’A1’B

1’C

2’A2’B

2’C

3’A3’B

3’C

1,2,3: variación biológicaA,B,C: variación gel/gel

Melanie, PDQuest, ImageMaster Platinium software programs

ANÁLISIS DE IMAGEN

Proteómica de expresión: Cuantificación y comparación

CUANTIFICACIÓN Y COMPARACIÓN

Resultados obtenidos: 1. Gel con proteínas de expresión diferencial

detectadas

2-DE

Análisis de Imagen

Corte de lasproteínas

Digestión

MALDI-TOF MS (huella peptídica)

Búsqueda en bases de

datos

Identificación poco clara

ESI-MS/MS oMALDI TOF-TOF (MS/MS)

Secuenciación y búsqueda en bases de

datos

MW

pI

Sample A Sample B

o

2-DE: Flujo clásico

b1

b2b3

y1

y2

y3

LF

K

G

G L

K

F

Rela

t ive In

tensi

ty

m/z

Identificación

(Monteoliva and Albar, 2004)

m/z2,0001,9001,8001,7001,6001,5001,4001,3001,2001,1001,000900800700600

Inte

nsity

11,500

11,000

10,500

10,000

9,500

9,000

8,500

8,000

7,500

7,000

6,500

6,000

5,500

5,000

4,500

4,000

3,500

3,000

2,500

2,000

1,500

1,000

500

1881

.89

1773

.884

1753

.809

1687

.825

1639

.921

1632

.953

1615

.852

1597

.751

1581

.751555

.703

1439

.812

1428

.674

1383

.826

1375

.708

1334

.714

1326

.677

1271

.695

1249

.642

1200

.691

1168

.657

1137

.569

1091

.576

1074

.584

1045

.541

1026

.41810

13.4

9399

8.64

699

4.40

898

2.51

977.

5696

4.55

4

927.

51

874.429

855.

083

830.

464

803.

516

795.

425

780.

408

733.

435

712.

326

688.

384

647.

374

644.

015

628.

162

1.96

660

6.02

8

748.

436

847.

502

1019

.529

1305

.689

1346

.747

1351

.697

1392

.69

1533

.738

1571

.749

1606

.855

Resultados obtenidos: 2. Tabla con proteínas de

expresión diferencial

identificadas

AUTOMATIZACIÓN

2-DE: Aplicaciones

•Estudios Microbiologicos

•Interacción huésped-patógeno

•Cancer

Proteómica de expresión

SELDI-TOF

Aproximaciones en gel

Aproximacionesbasadas en MS

Proteómicade Expresión

1. Flujo de trabajo clásico: 2-DE y tinción de plata u otros métodos de detección

2. 2D-DIGE: Cy3/Cy5 or Cy3/Cy5/Cy2

Marcaje con isótopos estables y MS:1. Marcaje metabólico (SILAC), 2. Marcaje químico (ICAT) others

(Patterson & Aebersold, Nature genetics, 2003)

Proteómica de expresión:2D-DIGE

C1 C2 C3 T4 T5 T6

6 geles x triplicado = 18 gelesTinción: SYPRO Ruby

Adquisición de imagen

Análisis de imágenes:

- Software de 2-D análisis

- La abundancia de los “manchas” viene

determinada por el densitometrado

del mismo.

control tratado

Al menos 3 réplicas biológicasCada una de ellas, al menos 3 veces(para reducir la variabilidad de la técnica)

18 imágenes parahacer coincidir!!

Abordaje tradicional para estudiar expresión diferencial con geles 2-DPRINCIPALES PRINCIPALES PROBLEMASPROBLEMAS

Muestra 1marcada con Cy3

Estándar Interno marcado con Cy™2

Muestra 2marcada con Cy5 Cy5

Cy3

Cy2

Sistema Ettan DIGE

Marcaje con fluorocromos y mezcla

de extractos

Marcaje con fluorocromos y mezcla

de extractos2D-PAGE2D-PAGE

Adquisición de imágenes (3 por gel)

Adquisición de imágenes (3 por gel)

Análisis de las imágenes

Análisis de las imágenes

DIGE (Differential in gel electrophoresis) (Amersham Biosciences)

Corte de las proteínas

Identificación por espectrometría

marcaje

Mezcla de extractos marcados

2-D separación: 1 solo gel

Adquisición de imágenes

Análisis de imágenes

Selección de proteínas de

interés

StandardCy2

ControlCy3

TratadoCy5

NHS reactive group

N

N+

N

O O

O

O

Dye+pH 8.5

protein

+H3N-protein

N+

N

O NH

Dye+

Cy-Dye

Hay tres fluorocromos Cy3, Cy5, Cy2.

Marcaje mínimo: De forma que sólo el 1-2% de las proteínas va a estar marcadas

-No modifican el pI, ya que el residuo + que se pierde tras el ataque nucleofílico lo gana porque se lo aporta el fluoróforo.

- Aumenta la masa de la proteína 450 Da

Fluorocromos o Dyes

El fluorocromo se une covalentemente a los grupos epsilon de las Lys.Las muestras deben estar a pH ≈ 8, para que este grupo sea reactivo.

488 520 532 580 633 670λ

Cy2Cy3

Cy5E

Tienen espectros de emisión a diferentes longitudes de onda

Sample Preparation • Cell disruption• Protein precipitation• Solubilization• Protection against protease activities• Removal of:

–nucleic acids–lipids–salts, buffers, ionic small molecules–insoluble material

Marcaje con fluorocromosMarcaje previo a la separación de las muestras

Control Tratado

Protocolo de marcaje

Estándar Interno

Parar la reaccióncon Lys

30 min, 4ºCen la oscuridad

Mezclar el fluorocromo y las proteínas

50 µg proteína 400 pmol Dye

Reconstituir los fluorocromos

30 min, 4ºCen la oscuridad

Cy5 Cy3 Cy2

Cada muestra está marcada con un Dye diferente

50 µg 50 µg 50 µg

Muestra ACy3

Muestra B Cy5

λCy3 λCy5

Sample ACy3

Pooled internal

Standard Cy2

Sample B Cy5

Cy3/Cy2Cy5/Cy2

λCy3 λCy2 λCy5

Normalización Differential expresed

proteins

Cuantificación y análisis estadísticos

DIGE: DISEÑO EXPERIMENTALDIGE: DISEÑO EXPERIMENTAL

Proteínas expresadas diferencialmente

Mezclar extractos marcados

Tinción e identificación

electroforesis 2-D

Captar la imagen del gel

Análisis de imagenes

Marcaje

Cy3/C

y5

Cy3/C

y5/Cy2

(Monteoliva & Albar, Briefings in Functional genomics and proteomics, 2004)

2-D DIGE con standard interno

Muestra 2 (Cy5)Muestra 1 (Cy3)

Gel A

Muestra 3 (Cy3) Muestra 4 (Cy5)

Gel B

Standard (Cy2)

Standard (CyTM2)

Elimina la variación gel/gel y aumenta la precisión estadistica en la medida de las variaciones biologicas

Estos datos pueden llevar a diferentes conclusiones

Sin standard interno

Con standard interno

Standard interno: Mezcla de alicuotas de todas las muestras del experimentoCada “spot” se compara con el mismo en el Standard internoPunto de referencia

2-D DIGE con standard interno

Usar marcaje inverso

STANDARD Control 1 Treated 1

STANDARD Control 2 Treated 2

STANDARD Treated 3 Control 3

STANDARD Treated 4 Control 4

Gel A

Gel B

Gel C

Gel D

DIGE: DISEÑO EXPERIMENTALDIGE: DISEÑO EXPERIMENTAL

52 proteins

42 overlooked without Internal Standard

DIGE: DIGE: ApplicacionesApplicaciones

•Toxicología •Toxicidad hepática en modelos animales:

•Paracetamol •Hydrazine

•Estudios clínicos: •Cáncer

•Carcinoma esofaringeo•Cáncer de pecho•Cáncer colorectal

•Aplicaciones relacionadas con neurociencias:•Expresión de proteínas relacionadas con envejecimiento•Proteínas relacionadas con stress•etc

•Respuesta inmune en Drosophila melanogaster •Etc,

APLICACIÓN DE LA ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL APLICACIÓN DE LA ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

DIFERENCIAL MEDIANTE FLUOROCROMOS (DIGE) EN EL DIFERENCIAL MEDIANTE FLUOROCROMOS (DIGE) EN EL

ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN ACIDEMIA ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN ACIDEMIA

METILMALÓNICA METILMALÓNICA

5

10

1112

1314

16

17

15

18

1920 21

222624

2528 2730

31 3233

34

35 3637

38 39

41

4042

4344 454647

484949 5051

52

53

545556

57

585960

61

1 234

67

8 9

23

29

5*

10

1112

1314

1617

15

18

1920 21

22* 26

24*

25 28* 27*

303132*33

34

35* 3637

38* 39

41

40

42 4

344

45

4647

4849 5051

52

53

545556

57

5859 6061

1 234

67 8 9

23*

29

61 formas proteicas deexpresión diferencial(t-student ≤0.05): -27 aumentan, ratio c/p: ≥1,5 -34 disminuyen,ratio c/p: ≤-1,5

5

10

1112

1314

16

17

15

18

1920 21

222624

2528 2730

31 3233

34

35 3637

38 39

41

4042

4344 454647

484949 5051

52

53

545556

57

585960

61

1 234

67

8 9

23

29

5*

10

1112

1314

1617

15

18

1920 21

22* 26

24*

25 28* 27*

303132*33

34

35* 3637

38* 39

41

40

42 4

344

45

4647

4849 5051

52

53

545556

57

5859 6061

1 234

67 8 9

23*

29

50

60

17

61

56

46

5

10

1112

1314

16

17

15

18

1920 21

222624

2528 2730

31 3233

34

35 3637

38 39

41

4042

4344 454647

484949 5051

52

53

545556

57

585960

61

1 234

67

8 9

23

29

5*

10

1112

1314

1617

15

18

1920 21

22* 26

24*

25 28* 27*

303132*33

34

35* 3637

38* 39

41

40

42 4

344

45

4647

4849 5051

52

53

545556

57

5859 6061

1 234

67 8 9

23*

29Changes in expression levels of protein isoforms

1112

18 16 17

5

Alpha 2 type VI collagen

12

18

CONTROL/PATIENT

12

1818

5

CONTROL/PATIENT

Identificaction of global protein changes during Candida albicans yeast-to hypha

transition using a novel proteomic workflow based on 2D-DIGE and

preparative IEF

http://www.ucm.es/info/mfar/U1/index.htm

Candida albicans

• Hongo dimórfico, patógeno oportunista

• Importancia de la candidiasis sistémica en pacientes inmunocomprometidos

• Factores de virulencia:- Capacidad de adhesión-Secreción de hidrolasas y proteasas-Transición dimórfica

6h Medio de Lee

37ºC pH 6.7

hifas

37ºC pH 4.3

levadura

105 cells/ml

Candida albicans

Extractos citoplasmáticos

(Monteoliva & Albar, Briefings in Functional genomics and proteomics, 2004)

Muestra ACy3

Standardinterno

Cy2Muestra B

Cy5

Cy3/Cy2Cy5/Cy2

λCy3 λCy2 λCy5

NormalizaciónProteinas de expresion

diferencial

Cuantificación y análisis estadístico

Mezcla de extractos marcados

Tinción del gelCorte e identificación por MS

2-DE

Obtención de imágenes

Análisis de imágenes

Marcaje

2D-DIGE

488 520532 580 633 670λ

Cy2 Cy3

Cy5E

150μg de proteína (3 muestras) 1D: IPG strips 18 cm, 3-11NL 2D: 12,5% Acrilamida

Gel Cy2 Cy3 Cy5

1 Estándar interno Yeast 1 Hypha 4

2 Estándar interno Hypha 3 Yeast 2

3 Estándar interno Yeast 3 Hypha 2

4 Estándar interno Hypha 1 Yeast 4

pH 3 11

Gel1:Y1 + St + H4

Gel2: H3+ St +Y2

Gel3: Y3 + St + H2

Gel4: H1 + St + Y4

Análisis de las imágenes

Software de análisis de imagen “automático”.Permite la detección / cuantificación / emparejamiento / análisis de Geles

Capacidad “multiplexing analyses”.

Aumentan

1060 1073

1082

1084

1094 1116

1123 1132

1142

1145

1154 1168

1340

261 265

272

285 287

288

289

293

326 328

367

441 513 516

563 593

646

647

649

665 667 670

671

681 683

684 689

692 719

773 814 833 849

854 857

864

865 892

929

“spots” detectados: 2974106 con variación significativa: Y/H(t-student ≤0.05) (9 images):

-41 aumentan, ratio ≥1,3 -65 disminuyen, ratio ≤-1,3

1060 1073

1082

1084

1094 1116

1123 1132

1142

1145

1154 1168

1340

261 265

272

285 287

288

289

293

326 328

367

441 513 516

563 593

646

647

649

665 667 670

671

681 683

684 689

692 719

773 814 833 849

854 857

864

865 892

929

665: 2,59/7.0e-005

1060 1073

1082

1084

1094 1116

1123 1132

1142

1145

1154 1168

1340

261 265

272

285 287

288

289

293

326 328

367

441 513 516

563 593

646

647

649

665 667 670

671

681 683

684 689

692 719

773 814 833 849

854 857

864

865 892

929

1082: 2,33/0.00028

1000 1006

1011 1040

1093 1096

1166

117

1173 1185

1258 1270

209

218

294 312

333 358

415

420 432

478 488

504 533

608

633

653

680 703 714

726

735 760 761 765 767

872 909

922 923

924 940 941 945

Disminuyen

• Tinción de geles (plata)• Nuevos geles (Coomassie coloidal)• Corte y digestión de las proteínas

diferenciales

1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800m/z0

100

%

1619.28968.64

836.58

893.67

1251.93

969.70

970.69

1013.80

1060.23

1061.26

1252.97

1254.00

1570.17

1448.14

2313.69

2312.761621.14

1670.25

1671.24

1672.14

1873.46

1853.38 2019.571876.41

2271.83

2036.57

2314.75

2315.80

2366.83

2367.90

2368.85

2369.912718.09

• Identificación: MALDI-TOF/TOF

Identificaión por huella peptídica o fragmentación

Ipf6629

Hps10.3

Pmm1

Rib3Rib3

Rib5

Aco1p

Ipf17186

Eft2

Bmh1

Rpl10E

Tal1

Yst1

Atp2

Ilv5

Sti1

(Hsp70)Ssa4

Ade1

IPF3923

Cdc19

Ade17

Gdh3Hxk2.3

Tdh3

Pgk1Adh1

Cys3

Aat1

Hsp90

Uba1

Pgm2

Ilv5 Pot14

Ipf4065

Rpl10E+Yst1

Thi13

Hem13Gre3

Thi4+Ifd4Thi4+IPF1943

Tsa1

Rps12

Tkl1

Zwf1

Tpm2

pH 3 11

Rps5

Act1

Hsp60

Rib3

Rib5

Ipf17186

Bmh1

Rpl10E

Tal1

Yst1

Atp2

Ilv5

Sti1

(Hsp70)Ssa4

Ade1

Hsp90

Uba1

Pgm2

Ilv5

Ipf4065

Rpl10E+Yst1

Tsa1

Rps12

Tpm2

Rps5

Hsp60

Identificación de 46 proteínas de

expresión deferencial (61 spots):

-22 proteínas-24 proteínas

Fraccionamiento según pI: -20 mg de extracto citoplásmico de levaduras

Se recogen 20 fracciones en distintos intervalos de pHs: - Fracciones 1-4: pH 4,5-5,5: subproteoma ácido

IEF preparativo en solución

geles 2D (pH 4,5-5,5 IPGs)

LC-LTQ

Análisis del subproteoma ácido de C. albicans

Identificación de proteínas

MALDI-TOF/TOF

88 proteínas identificadas

48 proteínas identificadas

(58 spots)

104 Proteínas identificadas

Diseño de estrategias para el análisis de de la expresión diferencial de proteínas entre

levaduras e hifas de C. albicans en el subproteoma ácido:

Mejora de la resolución y sensibilidad del DIGE

Yeast Cytoplasmic extract

Hyphae Cytoplasmic extract20 Fraction collected

after separation according to pH by

means of ROTOFOR20mg 20mg

4,5 5,5 6,5pH 4,5 5,5 6,5pH

Fractions 1-4(pH 4,5-5,5)

Fractions 5-6(pH 5,5-6,5)

Fractions 1-4(pH 4,5-5,5)

Fractions 5-6(pH 5,5-6,5)

Two different strategies

+250ug50ug Cy525ug Cy2

250ug50ug Cy325ug cy2

Fractions 1-4(pH 4,5-5,5)

Fractions 1-4(pH 4,5-5,5)

4,5 5,5+

500ug Fractions 1-4(pH 4,5-5,5)

+

4,5

5,5

5,5

5,5

5,5 6,5

500ug Fractions 5-6(pH 5,5-6,5)

+

6,5

500ug Fractions 1-4(pH 4,5-5,5)

4,5 5,5

40ug Cy3 yeast cytoplasmic extract40ug Cy5 hyphae cytoplasmic extract40ug Cy2 (yeast+hyphae cytoplasmic extracts)

500ug Fractions 5-6(pH 5,5-6,5)

40ug Cy5 yeast cytoplasmic extract40ug Cy3 hyphae cytoplasmic extract40ug Cy2 (yeast+hyphae cytoplasmic extracts)

pH 4,5-5,5

pH 4,5-5,5 pH 5-6

Pst3

Orf19.2755

Ino1

Sti1

Ilv5

Orf19.1862

Ahp1

Tkl1

Thi13

Snz1 + Mdh1

Ara1

Pfy1IPF4065

Ahp1

Rdi1

Ilv5Ilv5+Gre2 Ade1Cip1 Sou1

Asr2Orf19.7269+Tsf1

Rps12

Pdi1

Hsp31

Tsa1

Pdi1

pH 4.5 5.5 pH 5 6

Tal1

Rpl10Yst1

Yst1 (2)

Aat1 (2)

Hxk2,3 (1)

Pgm2

Hxk2,3 (2)

Tpm2

Hsp60

Hsp90

Pot14 (1)

Adh1 (1)

Adh1 (2)

Sti1

Hsp10,3

Rps5

Tsa1 (1)

Aat1 (1)

Act1

Adh1 (3)

IPF3367

Rib5

Pot14 (2)

Tsa1 (2)

Cys3

IPF14662 (GRE3)

Adh1 (4)

Hem13

Rpl10E (2)

Tsa1 (3)

Ssa4

Tal1

Bmh1

Pmm1

Uba1

Rps12

Ifd4

Thi4 (1)

IPF1943

Thi4 (2)

Gdh3

IPF4065

Thi13

Eft2 (2)

Ade17

Cdc19 (2)

Zwf1

IPF17186 (1)

Ade1

Atp2

Aco1

Ade1

Ahp1 (2)

Ara1

Asr2

Cip1 (2)

Ilv5 (3)

Ino1

IPF4605

IPF24655.1 (2)

Pdi1, Pdi1

Pfy1

Pst3

Rdi1

Rpl10

Sou1

Sti1

Tal1

Thi13

Tkl1

Tsa1 (2)

Yst1

Geles 3-11Geles ácidos

Cdc19 (1)

Ilv5 (2)

Tkl1

IPF3923

Tdh3

IPF6629

Ilv5 (1)

Eft2 (1)

Rib3 (1)

Pgk1

Rib3 (2)

Rpl10E (1)

Yst1 (1)

Validación

Análisis e integración de datos

Category p-value In Category from Cluster

sugar, glucoside, polyol and carboxylate anabolism 4.785e-07 GAL1 SEC53 INO1 TAL1 PGM2

sugar, glucoside, polyol and carboxylate catabolism 3.245e-05 GAL1 SEC53 GRE3 TAL1 PGM2

protein folding and stabilization 6.327e-05 PDI1 SSA4 HSP10 STI1 HSP82

cell growth / morphogenesis 0.00169 BMH2 ACT1 TPM1 STI1 PFY1

protein binding 0.001841BMH2 SSA4 UBA1 TPM1 HSP10 STI1 PFY1

protein modification 0.002084 PDI1 SEC53 APE2

metabolism of energy reserves (e.g. glycogen, trehalose)

0.002195 BMH2 PGM2 HSP82

budding, cell polarity and filament formation 0.002866 RDI1 BMH2 ACT1 RPS0A TPM1 PFY1

unfolded protein response (e.g. ER quality control) 0.003982 SSA4 HSP10 STI1

translation elongation 0.004238 TEF4 RPP0

actin dependent transport 0.004695 ACT1

pentose-phosphate pathway 0.005984 TAL1 PGM2

bud / growth tip 0.009114 ACT1 TPM1

actin cytoskeleton 0.00997 RDI1 TPM1 PFY1

Aumentan en hifas

GO Biological Process

Análisis e integración de datos

GO Biological Process (1695 categories)

Category p-value In Category from Cluster

oxidation reduction [GO:0055114]2.841e-10

GDH3 ADH5 ARA1 TDH3 MDH1 XYL2 AHP1 ACO1 ILV5 ARA2 ZWF1 GRE2 GCY1 YPL088W

metabolic process [GO:0008152]2.583e-07

GDH3 ADH5 PAA1 YGR012W TDH3 MDH1 XYL2 ACO1 ILV5 SNZ1 ZWF1 GRE2 TKL1

vacuolar protein catabolic process [GO:0007039]

0.0009331

GDH3 PDI1 AHP1 ACO1 PRC1

mitochondrial genome maintenance [GO:0000002]

0.001618 THI4 ACO1 ILV5

thiamin biosynthetic process [GO:0009228] 0.001742 THI13 THI4 SNZ1

'de novo' IMP biosynthetic process [GO:0006189]

0.005149 ADE1 ADE17

glutamate biosynthetic process [GO:0006537]

0.005733 GDH3 ACO1

L-ascorbic acid biosynthetic process [GO:0019853]

0.006058 ARA2

glutamate metabolic process [GO:0006536] 0.006058 GAD1

negative regulation of transcription by carbon catabolites [GO:0045013]

0.006058 ZWF1

carbohydrate metabolic process [GO:0005975] 0.008862 ARA1 MDH1 XYL2 ZWF1

Disminuyen en hifas

Análisis e integración de datos

Análisis e integración de datos

Disminuyen

Aumentan

Análisis e integración de datos

Metabolismo de azúcares

Obtención de energía

Otros procesos metabólicos:-biosíntesis de purinas-biosíntesis de aa-biosíntesis de vitaminas

Polimerización de actina

Plegamiento y síntesis de proteínas

Oxidoreducción

Procesos con cambios significativos en levaduras e hifas de C. albicans

Glucose

Glucose-6-p

Fructose-6-p

Fructose-1-6-bip

Glyceraldehyde-3-p

pyruvate

Hxk2

Tdh3

Pgk1

Cdc19

Glycolysis

Hxk2Fructose

Aerobic respiration (Atp2, Rib3)

TCA

Aco1Adh1

Fermentation

Gdh3glutamate

Ilv5

valine

leucine

Amino acid biosynthesis

Pgm2

Ino1 Phosphatidil inositol biosynthesis

GPI proteins and phospholipids

Pmm1GDP-Mannose

UDP-Glucose-1-p β-Glucans synthesis

Protein N- andO- glycosilation

Cell wall and membrane components biosynthesis

Penthoses phosphate pathway

Glucose-6-pZwf1

Tkl1

Tal1

Fructose-6-pErythrose-4-pTkl1

Glyceraldehyde-3p

Ribose-5-p

Glyceraldehyde-3-p

OxidoreducciónCategory p-value In Category from Cluster

oxidation reduction [GO:0055114] 2.841e-10 GDH3 ADH5 ARA1 TDH3 MDH1 XYL2 AHP1 ACO1 ILV5 ARA2 ZWF1 GRE2 GCY1 YPL088W

Cip1

Polimerización de actina

UNIDAD DE PROTEÓMICA UCM-PARQUE CIENTÍFICO DE MADRID

•Antonio Serna•María Luisa Hernaez •María Dolores Gutierrez•Pilar Ximenez de Embun

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA II

•Lucía Monteoliva Díaz•Raquel Martinez•Aída Pitarch•Concha Gil García

SERVICIO DE PROTEÓMICA.CENTRO NACIONAL DE BIOTECNOLOGÍA

•Juan Pablo Albar

Nombre Fundamento

2D-DIGE® 2D-Difference Gel Electrophoresis(GE Healthcare Life Sciences)

Marcaje del extracto protéico con fluorocromos (Cy2, Cy3, Cy5) y separación mediante 2-DE.

SILAC Stable Isotope Labeling with Amino Acids in cell Culture

Marcaje de las proteínas in vivo mediante crecimiento del cultivo en medios con Lisina, Arginina, Metionina o Tirosina en versiones ligera y pesada.

cICAT® cleavable Isotope-Coded Affinity tags(Applied BioSystems)

Marcaje de las proteínas con etiquetas ligera o pesada que, tras la digestión enzimática, permiten el enriquecimiento en péptidos marcados mediante cromatografía de afinidad

Marcaje enzimático

Incorporación de isótopos estables mediante reacción enzimática

Incorporación de 16O y 18O a los péptidos durante la digestión proteolítica, realizando ésta en agua ligera o agua pesada

iTRAQ® isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification(Applied BioSystems)

Marcaje de los péptidos después de la digestión tríptica con distintas etiquetas isobáricas

(L. Monteoliva, Industria Farmaceútica, nº 139, 2008)

Artículos Reviews

2D-DIGE® 444 27

SILAC 133 9

ICAT® 309 27

iTRAQ® 165 12

PubMed