FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

TEMA

: PROPIEDADES CINTICAS DE LAS ENZIMAS

CURSO PROFESOR

: BIOQUIMICA I : CALDERON GOMEZ; JAVIER JACK

INTEGRANTES

:

TRUJILLO MUCHA; MILAGROS

ESPECIALIDAD

:

FARMACIA Y BIOQUIMICA

CICLO

:

V

2011

BIOQUIMICA I FUNDAMENTO TERICO

2011

La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones qumicas que son catalizadas por las enzimas. El estudio de la cintica de una enzima nos mostrar los detalles del mecanismo cataltico de esa enzima, su papel en el metabolismo, cmo es controlada su actividad en la clula y cmo puede ser inhibida su actividad por drogas o venenos o potenciada por otro tipo de molculas. Las enzimas son macromolculas con la capacidad de manipular otras molculas, denominadas sustratos. Un sustrato es capaz de unirse al centro cataltico de la enzima que lo reconozca y transformarse en un producto a lo largo de una serie de pasos denominados mecanismo enzimtico. Algunas enzimas pueden unir varios sustratos diferentes y/o liberar diversos productos, como es el caso de las proteasas al romper una protena en dos polipptidos. En otros casos, se produce la unin simultnea de dos sustratos, como en el caso de la DNA-polimerasa, que es capaz de incorporar un nucletido (sustrato 1) a una hebra de ADN (sustrato 2). Aunque todos estos mecanismos suelen seguir una compleja serie de pasos, tambin suelen presentar una etapa limitante que determina la velocidad final de toda la reaccin. Esta etapa limitante puede consistir en una reaccin qumica o en un cambio conformacional de la enzima o del sustrato. El conocimiento adquirido acerca de la estructura de las enzimas ha sido de gran ayuda en la visualizacin e interpretacin de los datos cinticos. Por ejemplo, la estructura puede sugerir cmo permanecen unidos sustrato y producto durante la catlisis, qu cambios conformacionales ocurre n durante la reaccin, o incluso el papel en particular de determinados aminocidos en el mecanismo cataltico. Algunas enzimas modifican su conformacin significativamente durante la reaccin, en cuyo caso, puede ser crucial saber la estructura molecular de la enzima con y sin sustrato unido (se suelen usar anlogos que se unen pero no permiten llevar a cabo la reaccin y mantienen a la enzima permanentemente en la conformacin de sustrato unido). Los mecanismos enzimticos pueden ser divididos en mecanismo de nico sustrato o mecanismo de mltiples sustratos. Los estudios cinticos llevados a cabo en enzimas que solo unen un sustrato, como la triosafosfato isomerasa, pretenden medir la afinidad con la que se une el sustrato y la velocidad con la que lo transforma en producto. Por otro lado, al estudiar una enzima que une varios sustratos, como la dihidrofolato reductasa, la cintica enzimtica puede mostrar tambin el orden en el que se unen los sustratos y el orden en el que los productos son liberados.

BIOQUIMICA I

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Sin embargo, no todas las catlisis biolgicas son llevadas a cabo por enzimas proteicas. Existen molculas catalticas basadas en el ARN, como las ribozimas y los ribosomas, esenciales para el splicing alternativo y la traduccin del ARNm, respectivamente. La principal diferencia entre las ribozimas y los ribosomas radica en el limitado nmero de reacciones que pueden llevar a cabo las primeras, aunque sus mecanismos de reaccin y sus cinticas pueden ser estudiados y clasificados por los mismos mtodos. PRINCIPIOS GENERALES La reaccin catalizada por una enzima utiliza la misma cantidad de sustrato y genera la misma cantidad de producto que una reaccin no catalizada. Al igual que ocurre en otros tipos de catlisis, las enzimas no alteran en absoluto el equilibrio de la reaccin entre sustrato y producto. Sin embargo, al contrario que las reacciones qumicas, las enzimas se saturan. Esto significa que a mayor La velocidad de la reaccin va cantidad de sustrato, mayor nmero aumentando a medida que aumenta la de centros catalticos estarn concentracin de sustrato hasta que la enzima se satura. ocupados, lo que incrementar la eficiencia de la reaccin, hasta el momento en que todos los sitios posibles estn ocupados. En ese momento se habr alcanzado el punto de saturacin de la enzima y, aunque se aada ms sustrato, no aumentar ms la eficiencia. Las dos propiedades cinticas ms importantes de una enzima son: el tiempo que tarda en saturarse con un sustrato en particular y su punto mximo de saturacin. El conocimiento de estas propiedades nos permitir hipotetizar acerca del comportamiento de una enzima en el ambiente celular y cmo responder frente a un cambio de esas condiciones. CINTICA DE LAS REACCIONES ENZIMTICAS En principio, las consideraciones generales de la cintica qumica pueden aplicarse a las reacciones catalizadas enzimticamente, aunque estas ltimas tienen la particularidad de mostrar el fenmeno de saturacin por el sustrato.

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A una concentracin constante de enzima, si vemos el grfico de la velocidad de la reaccin catalizada enzimticamente en funcin de la concentracin del sustrato, es evidente que a bajas concentraciones del mismo la velocidad de formacin de producto es proporcional a la concentracin del sustrato. A medida que se aumenta la concentracin de sustrato se aprecia una prdida de la proporcionalidad, en esta zona la reaccin es de orden mixto y finalmente, a altas concentraciones, la velocidad de la reaccin es independiente de esta. Ya se ha dicho que el sustrato se une a la enzima en una regin determinada del mismo llamada sitio activo. El fenmeno de saturacin junto con otras evidencias llevaron a postular la existencia de un complejo enzima sustrato (E S) como etapa previa a la formacin de productos. CENTRO ACTIVO DE UNA ENZIMA Ya se haba mencionado que la porcin de la molcula en la enzima que se una al o a los sustratos es una zona relativamente pequea de la misma. Esta zona, responsable de la actividad cataltica, que favorece la orientacin de los grupos qumicos (que reaccionan para dar los productos de la reaccin) recibe el nombre de centro activo. Los grupos responsables de la actividad cataltica propiamente dicho se los denomina sitios catalticos. En algunos casos esos grupos pueden corresponder a los grupos prostticos de los cuales ya se ha hablado. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMTICAS Temperatura: Un aumento en la temperatura provoca un aumento de la velocidad de reaccin hasta cierta temperatura ptima, ya que despus de aproximadamente 45C se comienza a producir la desnaturalizacin trmica. Las enzimas de muchos mamferos tienen una temperatura ptima de 37C, por encima de esa temperatura comienzan a inactivarse y se destruyen Sin embargo existen especies de bacterias y algas que habitan en fuentes de aguas termales y en el otro extremo ciertas bacterias rticas tienen temperaturas ptimas cercanas a 0C. Efecto Del pH Sobre La Actividad Enzimtica: El pH no afecta la actividad enzimtica directamente sino que modifica la concentracin de protones. Los protones adems de alterar la estructura de la enzima y el substrato, pueden participar tambin en la reaccin como substrato o producto. En esos casos, la concentracin de protones afecta directamente la velocidad de la reaccin.

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Cualquier cambio brusco de pH, sabiendo que las enzimas son protenas, puede alterar el carcter inico de los grupos amino y carboxilo en la superficie proteica, afectando as las propiedades catalticas de una enzima. A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacin de la enzima y en consecuencia su inactivacin.

BIOQUIMICA I PROCEDIMIENTOSVelocidad de Reaccin versus Concentracin de Enzimas Materiales: 10 tubos de ensayo 5 pipetas Pasteur Amilasa Agua destilada Almidn Lugol

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a.- Para obtener la amilasa tomamos 20 ml de agua destilada y hacemos enjuague por 2 minutos y luego ponemos la muestra en un becker. b.- Cada tubo debe estar rotulado.

Primera Batera

1er tubo 1/10

2do tubo 1/20

3er tubo 1/40

4to tubo 1/80

5to tubo 1/160

Amilasa 1/10 1/20 1/40 1/80 Agua Destilada

1ml 1ml 1ml 1ml 1ml A cada uno agregarle 9ml

c.- Cada solucin debe estar homogenizada. d.- Preparar una segunda batera de 5 tubos cada uno de ellos rotulados.

BIOQUIMICA I

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Segunda Batera

1er tubo 1/10

2do tubo 1/20

3er tubo 1/40

4to tubo 1/80

5to tubo 1/160

1/10 1/20 Primera Batera 1/40 1/80 1/160 Almidn

2ml 2ml 2ml 2ml 2ml A cada tubo agregarle 8ml

e.- Llevar a bao mara (38C) junto con una pipeta de Pasteur. Luego tomar una alcuota cada 5 minutos para comprobar la hidrolisis con reactivo de lugol (1gota). Vamos a observar lo sgte:

Tiempo de Reaccin

1/10

1/20

1/40

1/80

1/160

5 minutos

+++

+

-

-

-

10 minutos

++

-

-

-

15 minutos

++

-

-

-

BIOQUIMICA I

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20 minutos

++

-

-

-

25 minutos

++

-

-

-

30 minutos

++

-

-

-

35 minutos

++

-

-

-

40 minutos

++

-

-

-

45 minutos

++

-

-

-

50 minutos

+++

-

-

-

Resultados: En la primera alcuota el primer tubo dio una hidrolisis total dando un coloracin amarillo pardo, en cambio el segundo tubo dio una hidrolisis parcial dando un color rojo concha y vino los sgte tubos dieron hidrolisis negativa ya que en estos se vio una coloracin azul intenso. Despus vamos a observar que el primer tubo (1/10) reacciono a los 5 minutos y el segundo tubo (1/20) a los 50 minutos esto quiere decir que a los 95 minutos reaccionara el tercero (1/40), a los 140 minutos reaccionara el cuarto y finalmente a los 185 minutos reaccionara el quinto tubo (1/160).

BIOQUIMICA I1/VRx

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5 50 95 140 185 1/160 1/80 1/40 1/20 1/10 1/[E]

Por lo cual se dice que a mayor concentracin de enzima, ah menor tiempo de reaccin por lo cual la velocidad de reaccin es mayor. En cambio a menor concentracin de enzima, el tiempo de reaccin es mayor y la velocidad de reaccin es menor.

BIOQUIMICA IVelocidad de Reaccin versus temperatura Materiales: 6 tubos de ensayo 3 pipetas Pasteur Amilasa Almidn Lugol

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a.- Para obtener la amilasa tomamos 20 ml de agua destilada y hacemos enjuague por 2 minutos y luego ponemos la muestra en un becker. b.- Cada tubo debe estar rotulado.

1er tubo

2do tubo

3er tubo

Amilasa Bao Maria Hirviente Bao de Hielo Almidn Bao Maria 38C Reactivo de Lugol

0.5ml Por 5 minutos

0.5ml

0.5ml

Por 5 minutos 1ml 1ml Por 15 minutos 1 gota a cada tubo 1ml

Resultados: Vamos a observar que en el 1er tubo se ve una coloracin azul marino intenso, en el segundo tubo se ve una coloracin amarillo pardusco y finalmente en el tercer tubo se ve un rojo violceo. Por lo cual en el 1er tubo vamos a ver que se dio una hidrolisis negativa (no hubo hidrolisis del sustrato)por lo cual solo llega el

BIOQUIMICA I

2011almidn por producto de la desnaturalizacin en este caso ya no se reactiva la enzima. En el segundo se da una hidrolisis total ya que est a una temperatura optima y en este caso la actividad enzimtica es muy eficiente por lo cual su velocidad de reaccin es mucho mayor y su tiempo reaccin es menor osea inversamente proporcional. Y finalmente en el tercer tubo se observa una inhibicin parcial porque estamos retardando la velocidad con la cual la amilasa hidroliza al sustrato pero igual se ve una actividad enzimtica pero en menor grado que en el segundo tubo. En este caso se da una inhibicin reversible porque si lo ponemos a su temperatura optima este hidrolizara al sustrato por completo.

VRx.

38C

5C

0

100

T

BIOQUIMICA IVelocidad de Reaccin versus Ph Materiales: 6 tubos de ensayo 3 pipetas Pasteur Buffer de 5, 6.8, 8 Amilasa Almidn Lugol

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a.- Para obtener la amilasa tomamos 20 ml de agua destilada y hacemos enjuague por 2 minutos y luego ponemos la muestra en un becker. b.- Cada tubo debe estar rotulado.1er tubo 2do tubo 3er tubo

Buffer 5 Buffer 6.8 Buffer 8 Amilasa Almidn Bao Maria 38C Reactivo de Lugol

2ml 2ml 2ml 2ml 4ml 2ml 4ml Por 15 minutos 1 gota a cada tubo 2ml 4ml

Resultados: En el primer tubo el cual tiene un Ph 5 por lo cual este ha sufrido una hidrolisis casi incompleta o negativa ya que presenta una actividad

BIOQUIMICA I

2011mucho ms reducida. En este caso se observa una coloracin azul negruzco con precipitado del mismo color. En segundo tubo que tiene un Ph 6.8 se aprecia mayor actividad de la enzima por que este se encuentra dentro del parmetro ptimo de la amilasa salival (6.7-7.2) en este caso se vio una hidrolisis total porque hubo mayor eficiencia de la enzima. En este caso se ve una coloracin madia amarilla con precipitado pardusca amarillenta. Y finalmente a Ph 8 se da un hidrolisis negativa, en este caso hubo una desnaturalizacin por lo cual se ve una coloracin azul con presencia de precipitado.

VRx.

5

6.8

8

9

Ph

BIOQUIMICA I CONCLUSIONES

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En esta prctica hemos visto la velocidad con la cual puede catalizar una reaccin hipntica durante el metabolismo, en el cual sometemos a la enzima diferentes condiciones en el medio donde se encuentre para ver si la enzima va a seguir actuando normalmente frente a otros factores. El primer factor que vimos fue el de concentracin de enzima versus la velocidad de reaccin, en este caso vemos una variacin de la concentracin enzimtica presente en el medio por lo cual su actividad tiende a variar dependiendo del tiempo. En el segundo factor que es la temperatura, en la cual la enzima fue sometida a distintas temperaturas en el cual su actividad metablica comienza a variar hasta produce una desnaturalizacin a temperaturas altas (100C). Y por ltimo vimos el factor del Ph en la cual la enzima en este caso la amilasa salival trabaja a un Ph ptimo (6.7-7.2) por lo cual si el pH es alto o bajo se puede producir la desnaturalizacin de la enzima y en consecuencia su inactivacin.