problemas microbiológicos en la validación de limpiez

7/27/2019 Problemas Microbiológicos en La Validación de Limpiez

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Microbiological Issues in Process Equipment Cleaning Validation

Problemas microbiológicos en la validación de limpieza de equipos de

proceso.

Part I: Basic Issues

Parte I: Problemas básicos

Destin LeBlancCleaning Validation Technologies

Pharmaceutical Microbiology Forum Newsletter – Vol. 15 (10)

http://www.microbiologyforum.org/PMFNews/PMFNews.15.10.0910.pdf

About the AuthorDestin LeBlanc has over 25 years of Technical Service and ProductDevelopment experience in specialty chemicals and medical technologies, thelast ten of which have been involved with various aspects of cleaning andcleaning validation in pharmaceutical and medical device manufacturing. Theseinclude years with STERIS Corporation at their Cleaning and Microbial ControlTechnology Center in St. Louis, and with Calgon Vestal as part of Merck & Co.,Inc. and then as part of Bristol-Myers Squibb. At the end of 2000 he took earlyretirement to go into full time consulting as Cleaning Validation Technologies.

Acerca del AutorDestin LeBlanc tiene cerca de 25 años de experiencia en Servicio Técnico ydesarrollo de productos en especialidad química y tecnología médica, de loscuales los últimos diez se ha involucrado con varios aspectos de limpieza yvalidación de limpieza en la manufactura de farmacéuticosy dispositivosmédicos. Estos incluyen años con STERIS Corporation y su centro deTecnología de limpieza y control microbiológico. En St. Louis, y con CalgonVestal como parte de Merck & Co., Inc. Y después como parte de Bristol MyersSquibb. A fines del 2000 el tomó la jubilicación anticipada para irse de tiempocompleto a consulta como Cleaning Validation Technologies.

Since 1990, he has specialized in pharmaceutical cleaning validation, and haswritten and lectured internationally on cleaning validation, both as part oftechnical symposia as well as on-site company training. He has worked withboth large and small pharmaceutical companies on various aspects of cleaningand cleaning validation.Desde 1990, se ha especializado en validación de limpieza farmacéutica y haescrito y leído internacionalmente sobre validación de limpieza, ya sea comoparte de simposium técnicos o como entrenamiento en sitio en empresas. Hatrabajado con empresas farmacéuticas grandes y pequeñas sobre variosaspectos de limpieza y validación de limpieza.






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He brings a unique perspective because of his expertise in effective design ofcleaning processes as well as validation of those processes.El tiene una perspectiva única debido a su experiencia en diseño efectivo deprocesos de limpieza así como la validación de esos procesos.

The focus of this article is on microbial issues for the cleaning of processequipment “productcontact” surfaces. This emphasis is distinct from cleaningand related validation activities that are done for cleanroom surfaces. Each ofthese areas (cleaning of process equipment and cleaning of cleanroomsurfaces) has a distinct technical and regulatory focus, even though both areconcerned ultimately about the same things – protecting the safety, efficacy,and quality of manufactured drug products. Furthermore, while microbiologicalconcerns may extend to endotoxins, molds, yeasts, viruses and prions, thefocus of this discussion will be on bacteria.El enfoque de este artículo es sobre los problemas microbiológicos para la

limpieza de la superficie en contacto con el producto de los equipos deproceso. Este énfasis es distinto de la limpieza y actividades relacionadas a lavalidación que se hacen para superficies de cuartos limpios. Cada una de esasáreas (limpieza de los equipos de proceso y limpieza de las superficies decuartos limpios) tienen un enfoque regulatorio y técnico distinto, aunque ambosa final de cuentas se refieren a la misma cosa – proteger la seguridad, eficaciay calidad de los medicamentos fabricados. Por otra parte, mientras que laspreocupaciones microbiológicas se pueden extender a endotoxinas, hongos,levaduras, virus y priones, el enfoque de esta discusión será sobre bacterias.

Regulatory basisWhile process equipment cleaning validation (which I will just call “cleaningvalidation”) is not specifically mentioned in the FDA’s written GMPs, since theearly 1990’s it has been considered a necessary consequence of what is givenin CFR part 211.67. (1) The rationale has probably been “How can cleaningprocesses be considered adequate unless they are validated (or continuallyverified)?” Cleaning validation has traditionally focused on the three PQ(Process Qualification) runs that are performed as a protocol. (2, 3) With therecent FDA process validation draft guidance, the definition of processvalidation (and presumably cleaning validation) is expanding to also include

design and development of the cleaning process as well as maintenance of thevalidated state after completion of the PQ runs. (4)Bases regulatoriasSi bien la validación de limpieza de los equipos de proceso (lo cual llamaré“validación de limpieza”) no se menciona específicamente en las GMP´sescritas de la FDA, desde 1990 se ha considerado como una consecuencianecesaria de lo que se dice en el CFR parte 211.67 (1). La razónprobablemente ha sido “¿Cómo puede un proceso de limpieza considerarseadecuado a menos que esté validado (o continumanete verificado)?” Lavalidación de limpieza tradicionalmente se ha enfocado sobre las tres corridasPQ (Calificación del proceso) que se realizan como un protocolo (2, 3). Con el

reciente borrador de validación de proceso de la FDA, la definición devalidación de proceso (y presumiblemente validación de limpieza) se expande



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para también incluir diseño y desarrollo de los procesos de limpieza así comotambién el mantenimiento del estado validado después completar las corridasPQ (4).

Microbial issues for cleaning validation were not necessarily emphasized in the

beginning. In fact the earliest guidance document (the 1993 FDA guidance)states that the “guide is intended to cover equipment cleaning for chemicalresidues only”. (5 ) That said, in the same document microbiological aspects arediscussed in terms related to the clean hold time, in that “There should be someevidence that routine cleaning and storage of equipment does not allowmicrobial proliferation.” In the PIC/S guidance issued later, there are explicitstatements that “control of potential microbial contaminants” is a part of cleaningvalidation. (6 ) However, that document also focuses on microbial issues relatedto the clean hold time. In any case, both for sterile and non-sterile drugmanufacture, addressing the issue of control of bioburden by the cleaning andstorage procedures has become a standard expectation for a cleaning

validation program.Los problemas microbiológicos para validación de limpieza no necesariamentese enfatizaron en el principio. De hecho, en los primeros documentos (la guíade 1993 de la FDA) declara que la “guía está destinada a cubrir la limpieza deequipo para residuos químicos solamente” (5). Dicho esto, en el mismodocumento los aspectos microbiológicos se discuten en términos relacionadosa el clean hold time, en que “Debe haber alguna evidencia de que la ruitna delimpieza y almacenamiento de equipo no permite la proliferación microbiana”.En la guía PIC/S emitida después, hay declaraciones explícitas de que “elcontrol de posibles contaminantes microbianos” es parte de una validación delimpieza (6). Sin embargo, este documento también se enfoca en problemasmicrobiológicos relacionados al clean hold time. En cualquier caso, ya seafabricación etéril o no estéril, el abordar los problemas de control de la cargamicrobiana mediante los procedimientos de la limpieza y almacenamiento hallegado a ser una expectativa estándar para un programa de validación delimpieza.

Control measuresControl measures for bioburden in a manufactured product may include thefollowing:

Medidas de controlLas medidas de control para la carga microbiana en un producto fabricadopuede incluir lo siguiente:

◊ Limiting bioburden in raw materials- Limitar la carga microbiana en materias primas

◊ Limiting bioburden in packaging components- Limitar la carga microbiana en materiales de empaque

◊ Limiting bioburden in the manufacturing environment

- Limitar la carga microbiana en el medio ambiente de fabricación



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◊ Limiting bioburden on manufacturing equipment product-contact surfaces- Limitar la carga microbiana sobre las superficies en contacto con el

producto del equipo.

It is the latter that is the focus of cleaning validation.En esto último se enfoca la validación de limpieza.

Basic ways of controlling bioburden on equipment surfaces include the cleaningprocess itself, a separate “sanitizing” step after the cleaning process, drying ofthe equipment following cleaning, and storage of equipment so as not to allowrecontamination with bioburden.Las formas básicas de controlar la carga microbiana sobre la superficie de losequipos incluye el proceso de limpieza en si mismo, un paso por separado desanitización después del proceso de limpieza, secado del equipo limpio, yalmacenamiento de equipo de tal forma que no permita la recontaminación con

carga microbiana.

How can the cleaning process itself be related to microbial control? Many of thefactors in a typical cleaning process are factors that are hostile to survival ofmicroorganisms. Those factors include a high temperature (≥60°C) and pHextremes (Ph ≥11.5). Some cleaning procedures involve the use of sodiumhypochlorite which, in addition to oxidation of “soils” to produce smaller, morewáter soluble residues, is also a well know biocide. In addition, good cleaninginvolving surfactants can assist in the physical removal of bacteria, includingbacterial spores, from equipment surfaces. An effective cleaning process alsoreduces potential nutrients, which if left on surfaces following cleaning, can leadto more significant bioburden proliferation if equipment is stored in a wet state.¿Cómo puede el proceso de limpieza por si mismo relacionarse al controlmicrobiológico? Muchos de los factores en un proceso de limpieza típico sonfactores que son hostiles para la sobrevivencia de los microorganismos. Esosfactores incluyen alta temperatura (> 60°C) y pH extremos (pH > 11.5). Algunosprocedimientos de limpieza involucran el uso de hipoclorito el cual en adición ala oxidación de la suciedad para producir residuos más pequeños y solubles enagua, es también un buen conocido biocida. Además, una buena limpiezainvolucra surfactantes que pueden ayudar en la remoción física de bacterias,incluyendo esporas, de la superficie de los equipos. Un proceso de limpieza

efectivo también reduce nutrientes potenciales, los cuales dejados en lasuperficie limpia puede conducir a la proliferación de carga microbiana si elequipo se almacena húmedo.

Separate sanitizing steps following the cleaning process are not very commonin equipment cleaning processes, particularly if the cleaning process involvescleaning with hot, aqueous alkaline cleaning solutions. Remember that sterilityis not expected, because a typical final rinse will involve either purified water orWFI, neither of which is sterile. The need for a separate sanitizing step can beevaluated during the design/development phase of the cleaning validationprocess. Even if there is adequate control by the cleaning process itself, a

separate sanitizing step may be used as part of a “belt and suspenders” approach. However, if the sanitizer has nonvolatile components, then a rinse



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may be required following its use, and testing for residues of that sanitizer maybe appropriate. Separate sanitizer steps are more common in situations wherethe cleaning process involves a neutral pH cleaner at ambient temperature,particularly for manual cleaning of disassembled parts. In such cases the mostcommon sanitizer used is 70% isopropanol (IPA). One additional advantage of

IPA as a sanitizer (in addition to reducing bioburden) is that it also serves as afinal “polishing” rinse to further reduce residues of drug product. A secondadditional advantage is that the IPA application may serve to dry the equipment,which reduces the possibility of bioburden proliferation on storage of cleanedequipment.Los pasos por separado de la sanitización después del proceso de limpieza noson muy comunes en los procesos de limpieza de los equipos, particularmentesi el proceso de limpieza involucra limpieza con agua caliente, solucionesacuosas de limpieza alcalinas. Recuerde que que no se espera esterilidad,debido a que el típico enjuague final involucrará agua purificada o WFI, de lascuales ninguna es estéril. La necesidad para un paso por separado de la

sanitización puede evaluarse durante la fase de diseño/desarrollo del procesode validación de limpieza. Aún si hay controles adecuados mediante el mismoproceso de limpieza, un paso por separado de sanitización puede usarse comoparte de un enfoque “cinturón y tirantes”. Sin embargo, si el sanitizante tienecomponentes no volátiles, entonces puede requerirse un enjuague después desu uso, y pruebas para residuos de que el sanitizante puede ser apropiado. Lospasos por separado de la sanitización son más comunes en situaciones dondelos procesos de limpieza involucran limpiadores de pH neutros a temperaturaambiente, particularmente para limpieza manual de partes desensambladas. Entales casos el sanitizante más común usado es isopropanol al 70% (IPA). Unaventaja adicional del IPA como un sanitizante (además de reducir la cargamicrobiana) es que también sirve como un enjuague pulidor final para reduciraún más los residuos del medicamento. Una segunda ventaja adicional es quela aplicación del IPA puede servir para secar el equipo, lo cual reduce laposibilidad de la proliferación de la carga microbiana en el almacenamiento delequipo limpio.

Setting limits A key point in any cleaning validation program is to set appropriate limits forbioburden for the cleaning process. How limits are set for residues of active

ingredients and cleaning agents is fairly well established. (7, 8 ) Those samecarryover principles can be used to establish acceptance criteria for bioburdenin a cleaning validation protocol. (9) That type of calculation involves input dataon the bioburden limit in the next manufactured product, the batch size of thenext manufactured product, and the shared product contact surface area. Thiswill result in a limit expressed as CFU/cm2. However, an additional factorshould be added to further reduce the calculated surface limit because only partof the bioburden in the next product will come from cleaned equipment surfaces(other sources of bioburden in the next manufactured product include thebioburden of the raw materials, for example). A typical factor for most situationswhere the raw materials are not of natural origin is 0.1 (one-tenth).

Estableciendo límites



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Un punto clave en cualquier programa de validación de limpieza es establecerlímites apropiados para la carga microbiana en el proceso de limpieza. El comose establecen los límites para residuos de ingredientes activos y agentes delimpieza está bien establecido (7, 8). Esos mismos principios de remanentepueden usarse para establecer el criterio de aceptación para la carga

microbiana en un protocolo de validación de limpieza (9). Ese tipo de cálculosinvolucra datos obtenidos sobre el límite de la carga microbiana paras elsiguiente producto fabricado, y la superficie compartida en contacto con elproducto. Esto resultará en un límite expresado como UFC/cm². Sin embargo,se debe sumarr un factor adicional para además reducir el límite de lasuperficie calculada debido a que solo parte de la carga microbiana en elsiguiente producto vendrá de la superficie del equipo limpiado (otras fuentes decarga microbiana en el siguiente producto incluye la carga microbiana de lasmaterias primas , por ejemplo). Un factor típico para muchas situaciones dondela materia prima no son de origen natural es 0.1 (una décima).

When such carryover calculations are done, the result is usually a value ≥50CFU/cm2 (or ≥1250 CFU per contact plate area of 25 cm2). Such a level isconsiderably above what can be accurately enumerated for that surface area.Such a level is also considerably below what can be achieved in a relatively welldesigned cleaning process involving cleaning use of hot alkaline cleaningsolutions. For that reason, most companies will set limits considerably lowerthan what a carryover calculation would allow. Limit values of 1 or 2 CFU/cm2 (25 CFU/ 25cm2 to 50 CFU/25 cm2) are typically used for surface sampling. (10,11, 12 ) Limits set that way are typically specified in a company’s cleaning validation master plan as “industry standard practice”. Cuando se realizan tales cálculos para el remanente, el resultado usualmentees un valor >50 UFC/cm² (o > 1250 UFC/por plato de contacto con un área de25 cm²). Tal nivel se considera superior de lo que se puede enumerarexactamente para esta área superficial. Tal nivel también se considera pordebajo de lo que se puede realizar en un proceso de limpieza relativamentebien diseñado involucrando el uso de soluciones de limpieza alcalinas ycalientes. Por esta razón, muchas compañías establecerán límitesconsiderablemente más bajos de lo que el cálculo para el remanente permitiría.Los valores límites de 1 o 2 UFC/cm² (25 UFC/25cm² a 50 UFC/25 cm²) sonusados típicamente para muestreo de superficies (10, 11, 12). Los límites seestablecen de tal forma que son especificados típicamente en en los planes

maestros de validación de compañías como “prácticas estándar de la industria”.

For rinse sampling (as in a CIP rinse), a carryover calculation can also be done.These calculations generally result in values significantly above values typicallyused for Purified Water (PW) - 100 CFU/mL. Therefore, companies involved innon-sterile manufacture will typically establish rinse limits at that level.Para muestreo por enjuague (como un enjuague CIP), se puede realizartambién un cáclulo para el remanente. Estos cálculos generalmente resultan envalores significativamente arriba de los usados para agua purificada – 100UFC/mL. Por lo tanto, las compañías involucradas en fabricación no estérilestablecerán típicamente niveles a ese nivel.



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How are limits for sterile manufacturing different? If we focus on asepticprocessing, where much of the equipment is steamed-in-place (SIPed), onemight argue that the level of bioburden left after cleaning is not relevant; thesteaming process is validated to handle a significantly larger number ofmicroorganisms, including bacterial spores (not likely to be present following

water processing).¿Cómo son de diferentes los límites para la fabricación de estériles? Si noscentramos en el proceso aseptico, donde mucho del equipo es vaporizado ensitio (SIPed) uno puede argumentar que el nivel de la carga microbiana dejadadespués de la limpieza no es relevante, el proceso de vaporización es validadopara manejar un gran número de microorganismos, incluyendo esporasbacterianas (no como las que se presentan en el proceso del agua).

While the rationale for this argument can be appreciated, as a practical mattermost companies in aseptic processing will set limits similar to how they are setin non-sterile manufacturing. One reason for this approach is that those levels

of 1-2 CFU/cm2 are readily achievable, and gross bioburden levels would not beconsistent with cGMPs. A second reason is that if the bioburden is a gramnegative, an SIP process may adequately deal with the bioburden, but not theendotoxin which is released as a consequence of cell wall disruption. Therefore,companies involved in aseptic processing will actually set surface samplingbioburden limits (after cleaning but before a SIP process) at the same level (oreven slightly higher) as is done for non-sterile manufacturing because of thesubsequent SIP process.Si bien la justificación de este argumento se puede apreciar, en la práctica lamayoría de las empresas en el proceso aséptico establecerán límites similaresa como ellos los establecieron en la fabricación de no estériles. Una razón paraeste enfoque es que los niveles de 1-2 UFC/cm² son fácilmente realizables y elgrueso de la carga microbiana no sería consistente con las cGMPs. Unasegunda razón es que si la carga microbiana es un gram negativo, un procesoSIP puede ser adecuado para la carga microbiana, pero no para lasendotoxinas las cuales se liberan como consecuencia del rompimiento de lapared celular. Por lo tanto, las empresas dedicadas en el proceso asepticoestablecerían límites de carga microbiana en la superficie de muestreo(después de la limpieza pero no antes del proceso SIP) al mismo nivel (o aúnligeramente más alto) como se hace para la fabricación de no estériles debidoal siguiente proceso SIP.

For rinse samples, companies involved in aseptic processing could conceivablyset rinse limits at the WFI limits (10 CFU/100 mL) because the final rinseusually involves a WFI rinse. A rationale for not doing this is that the WFI limit isthe limit for the water in the recirculating WFI loop. As soon as it is removedfrom that loop and passed through equipment, there is not necessarily anexpectation that it maintains that value. For this reason, some companies willset rinse limits at a value intermédiate between the PW and WFI values, suchas 100 CFU/100 mL or 1000 CFU/100 mL. Again, bioburden at these levels isreadily dealt with by typical SIP processes.Para las muestras de enjuague, las empresas involucradas en el proceso

aseptico posiblemente podrían establecer límites de enjuague en los límites delWFI (10 UFC/100 mL) debido a que el enjuague final usualmente involucra un



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enjuague con WFI. Una razón para no hacer esto es que el límite de WFI es ellímite para el agua en el loop de recirculación de WFI. Tan pronto como esta seremueve de este loop y a pasa a través del equipo, no hay necesidad deesperar que se mantenga este valor. Por esta razón, algunas compañíasestablecerán límites de enjuague en un valor intermedio entre los valores del

PW y el WFI tales como 100 UFC/100 mL o 1000 UFC/100 mL. Otra vez, lacarga microbiana a esos niveles es fácilmente tratable con los procesos típicosde SIP.

Some microbiologists with cleanroom experience might view these limits asextremely high. Values such as 25 or 50 CFU per 25 cm2 are well above actionor alert levels typically set for cleanroom surf aces. So, shouldn’t bioburden onequipment product-contact surfaces be more stringent than on cleanroomsurfaces, which are not direct productcontact surfaces? One reason such acomparison is not valid is that values for process equipment cleaning validationprotocol are true limits; if exceeded, the cleaning process fails, and equipment

so cleaned should not be used for GMP manufacturing. Algunos microbiólogos con experiencia en cuartos limpios pueden ver estelímite como extremadamente alto. Los valores tales como 25 o 50 UFC/ 25cm²están por arriba de los niveles de aleta típicamente establecidos parasuperficies de cuartos limpios. Por lo tanto, ¿no debería la carga microbiana enla superficie en contacto con el producto ser más extrica que en las superficies,las cuales no son superficies en contacto directo con el producto? Una razónde que tal comparación no es válida es que los valores en el protocolo para lavalidación de limpieza de los equipos de proceso son límites verdaderos; si sonexcedidos, el proceso de limpieza falla, y el equipo así limpiado no debe usarsepara faricación GMP.

The values used for cleanroom environmental monitoring are action levels oralert levels.Los valores usados para el monitoreo ambiental de cuartos limpios son nivelesde acción o niveles de alerta.

If exceeded, an investigation is done to find out what the effect on manufacturedproduct is. Exceeding an action or alert level is not necessarily a failure. Asecond reason is that the analysis is comparing two different things. Sincecleanrooms are typically associated with aseptic manufacture, a more valid

comparison is the bioburden level on the product contact surfaces after the SIP process, not the bioburden after the cleaning process. When focusing onaseptic processing involving a SIP process for the equipment, then it is truly thecase that the bioburden on the equipment product contact surfaces is held to amore stringent criterion than bioburden on non-product-contact environmentalsurfaces.Si se exceden, se realiza una investigación para encontrar cual es el efectosobre el producto fabricado. El exceder un nivel de acción o alerta nonecesariamente es una falla. Una segunda razón es que el análisis comparados diferentes cosas. Ya que los cuartos limpios son típicamente asociados confabricación aseptica, una comparación más válida es el nivel de carga

microbiana sobre la superficie en contacto con el producto después del procesoSIP, no la carga microbiana después del proceso de limpieza. Cuando nos



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centramos sobre procesos aseptciso involucrando un proceso SIP para elequipo, entonces esto es cierto el caso de que la carga microbiana sobre lasuperficie en contacto con el producto del equipo se mantiene a un criterio másestricto que la carga microbiana sobre las superficies del ambiente que noestán en contacto con el producto.

Objectionable organisms An additional criterion for bioburden control in process equipment cleaningvalidation is the absence of “objectionable” organisms. The FDA (13) has listedfactors that determine whether an organism is objectionable. Those factorsinclude the species, the number (level), the dosage form, intended use, patientpopulation, and route of administration.Organismos ObjetablesUn criterio adicional para el control de carga microbiana en la validación delimpieza del equipo de proceso es la ausencia de organismos objetables. La

FDA (13) ha enlistado factores que determinan si un organismo es objetable.Esos factores incluyen especies, el número (nivel), la forma de dosis, usoentendido pacientes y ruta de administración.

Objectionable criteria include effects on patient safety, but may also includeeffects on product stability, container/closure integrity, and bioavailability of theactive ingredient. The criteria for what is objectionable should be specified orreferenced in a cleaning validation protocol.Los criterios objetables incluyen efectos sobre la seguridad del paciente, perotambién incluye efectos sobre la estabilidad del producto, envase/integridad delcierre, y la biodisponibilidad del principio activo. El criterio para lo que esobjetable debe especificarse o referenciarse en un protocolo de validación delimpieza.

Identification of objectionable organisms may include specific culturingtechniques to eliminate the possibility of a certain classification (such ascoliforms).La identificación de organismos objetables puede incluir técnicas específicas decultivo para eliminar la posibilidad de una cierta clasificación (tal comocoliformes).

Other approaches are to identify every colony down to a genus and/or specieslevel. Some companies will identify all colonies found in a cleaning validationprotocol. The reason for this is that they have systems set up to routinelyperform identification in a detailed way. That data then serves as a valuabledatabase or baseline in case there are problems in the future. Other companiesmay only try to identify organisms if the total count is above a certain threshold(that threshold being less than the acceptance limit). Of course, in a failure of aprotocol for exceeding the bioburden limit, identification of species should beconsidered as part of the investigation to determine the cause of the failure.

Otros enfoques son identificar cada colonia hasta un nivel de género y/o

especie. Algunas compañías identificarán todas las colonias encontradas en unprotocolo de validación de limpieza. La razón para esto es que ellas tienen



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sistemas establecidos para realizar la identificación rutinaria en una formadetallada. Los datos entonces sirven como una base de datos evaluable o líneabase en caso de que haya problemas en el futuro. Otras empresas sólo puedentratar de identificar organismos si la cuenta total está por arriba de cierto umbral(este umbral debe ser menor que el límite de aceptación). Claro, en la falla de

un protocolo excediendo el límite de la carga microbiana, la identificación deespecies debe considerarse como parte de la investigación para determinar lacausa de la falla.

Sampling and testing methodsThe sampling and analytical methods used for cleaning validation are the typicalprocedures used by microbiological laboratories. (14) Those methods includemembrane filtration for water samples, contact plates for surface sampling, andswab sampling with desorption and a pour plate or spread plate count. Ingeneral, provided these methods are “approved” microbiological laboratory method, no additional “method validation” is required.

Métodos de muestreo y análisisLos métodos analíticos y de muestreo usados para la validación de limpiezason procedimientos típicamente usados por los laboratorios de microbiología(14). –esos métodos incluyen filtración por membrana para muestras de agua,placas de contacto para muestreos de superficie, y muestreo con hisopos condesorción y vertido sobre una placa o espreado sobre una placa de conteo. Engeneral, siempre que esos métodos sean métodos aprobados por el laboratoriomicrobiológico, no se requiere validación adicional del método.

Sampling recoveryIt is well recognized that recovery from surfaces in microbiological testing ishighly variable and is generally not very high. Part of the reason for this is thevariability of microbiological enumeration.Recobro del muestreoEs bien conocido que el recobro de superficies en pruebas microbiológicas esaltamente variable y generalmente no es muy alta. Parte de la razón para estoes la variabilidad del conteo microbiano.

For example, USP <1111> specifies that a limit of 102 CFU means less than200 CFU. (15 ) While such a description mystifies most analytical chemists, it is

readily accepted by microbiologists because conventional microbial proceduresmeasure “colony forming units” (which may be comprised of multiple cells), andnot necessarily individual cells.Por ejemplo, la USP <1111> especifica que un límite de 10 2 de UFC significamenos de 200 UFC (15). Si bien esta descripción mistifica la mayoría de losquímicos analistas, es fácilmente aceptable por microbiólogos debido a que losprocedimientos microbiológicos convencionales miden “unidades formadorasde colonia” (la cual puede componenerse de varias células) y nonecesariamente de células individuales.

A second reason is that recovery studies as they are typically done for chemical

residues are difficult to perform for microbial residues. (16 ) Spiking an incoulumonto a surface and allowing it to dry prior to performing a swab or contact plate



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sampling will result in a variable level of baseline bioburden. This is due todrying of the incoulum, which causes a reduction of viable vegetativeorganisms.Una segunda razón es que los estudios de recobro tal como se hacen pararesiduos químicos son difíciles de realizar para residuos microbianos (16).

Spikear sobre una superficie y permitir que se seque antes de realizar elmuestreo por hisopado o con placa de contacto resultará en un nivel variablede la línea base de la carga microbiana. Esto es debido al secado, lo cualcausa una reducción de organismos viables vegetativos.

This effect can be reduced to some extent by performing “exhaustive” sampling(similar to what is done for bioburden levels for medical device sterilization).Este efecto puede reducirse en cierta medida, realizando un muestreo“exhaustivo” (similar a lo que se hace para la carga microbiana para laesterilización de dispositivos médicos).

Exhaustive sampling involves spiking the surface, allowing the incoulum to dry,and then swabbing the surface multiple times with separate swabs that areindividually enumerated. The recovery of the swabbing procedure thenbecomes the bioburden of the first swab as a percent of the total bioburdenfrom the sum of all swabs. While this technique helps with swab sampling, it isprobably not practical for contact plate sampling because of the transfer ofmedia to the sampled surface. Another technique used to get around this issueis to spike bacterial spores; with spores the issue of death on drying is notpresent.El muestreo exhaustivo involucra spikear la superficie, permitiendo que seseque el inóculo, y entonces hisopear la superficie varias veces con hisoposseparados que se enumeran individualmente. El recobro del procedimiento dehisopado llega a ser entonces en la carga microbiana del primer hisopo comoun porcentaje de la carga microbiana de la suma de todos los hisopos. Si bienesta técnica ayuda con el muestreo de hisopos, es probable que no seapráctico para muestreo con placas de contacto debido a la transferencia delmedio a la superficie muestreada. Otra técnica usada para solucionar esteproblea es spikear esporas; con las esporas, no se presenta el problema demuerte por desecación.

However, the use of spores brings up a third issue involving what organism(s)

to spike. Are recoveries going to be the same for all species? Is the recovery fora spore former the same whether it is in the vegetative state or spore state?Sin embargo, el uso de esporas plantea un tercer problema involucrando queorganismos spikear. ¿Los recobros serán lo mismo para todas las especies?¿Es el recobro para esporas el mismo si está en estado vegetativo o estado deespora?

It should be noted that recovery discussed here is not the same as “recovery” inUSP <1227>. (17 )Debe observar que el recobro aquí discutido no es el mismo “recobro” en laUSP <1227> (17).



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That recovery is dealing with things such as adequate neutralizers in therecovery medium (and a 70% recovery is the minimum acceptable). Therecovery discussed here is recovery from surfaces in the sampling process.Ese recobro se ocupa de cosas tales como neutralizantes adecuados en elmedio de recobro (y un recobro de 70% es el mínimo aceptable). El recobro

aquí discutido es el recobro de superficies en el proceso de muestreo.

As a general rule for process equipment cleaning validation, studies involvingbioburden recovery from surfaces are not done. In a risk-based approach, theconcerns from unacceptable levels of product contamination due to lowbioburden recoveries (10%-30%) is acceptable in situations where bioburdenlimits are typically set on criteria that are much more stringent than what wouldbe aceptable by a carryover calculation. While manufacturers would like to havea more scientific rationale for not doing recovery studies (or would like to haveclearly established and acceptable procedures for doing recovery studies), thisrisk-based rationale is probably the best and most appropriate at this time.

Como una regla general para la validación de limpieza de equipos de proceso,los estudios involucrando recobro de las superficies no se realiza. N un enfoquebasado en el riesgo, las preocupaciones respecto de los niveles inaceptablesde contaminación del producto debido a la baja recuperación de la cargamicrobiana (10% - 30%) es aceptable en situaciones donde los límites de lacarga microbiana se establecen sobre criterios que son mucho más estrictos delo que sería aceptable para un calculo para el remanente (carryover). Mientrasque a los fabricantes les gustaría tener una razón más científica por no hacerlos estudios de recobro (o les gustaría tener procedimientos claramenteestablecidos para hacer estudios de recobro), este razonamiento basado en elriesgo es probablemente lo mejor y lo más apropiado en este momento.

(Note: Part II of this article will continue with a focus on microbial control issuesin clean hold time studies.)(Nota: La parte II de este artículo continuará con un enfoque sobre problemasde control microbiológico en estudios de clean hold time).

References1. 21 CFR Part 211, Current Good Manufacturing Practice for FinishedPharmaceuticals, U.S. Food and Drug Administration, Washington, D.C., U.S.

Government Printing Office, Updated April 1, 2005.

2. Guide to Inspections of Validation of Cleaning Practices, U.S. Food and Drug Administration, Washington, D.C., U.S. Government Printing Office, July 1993.

3. Recommendations on Validation Master Plan, Installation and OperationalQualification, Non-Sterile Process Validation Cleaning Validation,Pharmaceutical Inspection Convention Pharmaceutical Inspection Co-OperationScheme (PIC/S), (2004), Document PI 006-3, Geneva, Switzerland, September15, 2007.

4. Guidance for Industry: Process Validation: General Principles and Practices,U.S. Food and Drug Administration, November 2008.



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6. Recommendations on Validation Master Plan, Installation and Operational

Qualification, Non-Sterile Process Validation Cleaning Validation,Pharmaceutical Inspection Convention Pharmaceutical Inspection Co-OperationScheme (PIC/S), (2004), Document PI 006-3, Geneva, Switzerland, September15, 2007.

7. DA LeBlanc. “Establishing Scientifically Justified Acceptance Criteria ofFinished Drug Products”. Pharmaceutical Technology 19:5, pp. 136-148(October 1998)

8. DA LeBlanc, “Setting ‘Dose’ Limits without Dosing Information”, Chapter 9 inCleaning Validation: Practical Compliance Solutions for Pharmaceutical

Manufacturing , PDA, Bethesda, Maryland, 2006, pp. 45-47.

9. DA LeBlanc, “Equipment Cleaning Validation: Microbial Control Issues”.Journal of Validation Technology 8:4, 40-46 (August 2002).

10. SE Docherty. “Establishing Microbial Cleaning Limits for Non-sterileManufacturing Equipment”. Pharmaceutical Engineering 19:3, pp. 36-40(May/June 1999).

11. AM Cundell. “Microbial Monitoring”. Presented at the 4th IIR CleaningValidation Conference, October 20-22, 1997.

12. DA LeBlanc, “Equipment Cleaning Validation: Microbial Control Issues”.Journal of Validation Technology 8:4, 40-46 (August 2002).

13. Human Drug CGMP Notes, March 1998. US FDA.

14. S. Sutton, “Surface Sampling Methods for Bioburden”, PMF Newsletter , vol.14 (6), pp. 9-11 (June 2008).15. USP Chapter <1111>, “Microbiological Examination of Nonsterile Products: Acceptance Criteria for Pharmaceutical Preparations and Substances for

Pharmaceutical Use”, United States Pharmacopeial Convention, USP Rockville,MD.

16. S Sutton, “Validation of Microbial Recovery from Surfaces”. PMFNewsletter , vol. 13 (10), pp. 4-5+ (October 2007).

17. USP Chapter <1227>, “Validation of Microbial Recovery fromPharmaceutical Articles”, United States Pharmacopeial Convention, Rockville,MD, 2006.



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Microbiological Issues in Process Equipment CleaningValidation

Part II: Clean Hold Studies

PMF NEWSLETTERVolume 15, Number 12 December, 2009


Destin LeBlancCleaning Validation Technologies

This is the second part of a discussion of microbial issues for the cleaning ofprocess equipment “product-contact” surfaces. (1) This emphasis for thissecond part is a discussion of microbial issues in clean hold time studies.Esta es la segunda parte de una discusión de problemas microbiológicos parala limpieza de superficies en contacto con el producto de equipos de proceso(1).

“Clean hold” deals with the time between the end of the cleaning process andthe start of the next “use” of that cleaned equipment. “Clean hold” se refiere al tiempo entre el final del proceso de limpieza y el iniciodel siguiente “uso” del equipo limpio.

That next use may be manufacture of a product, but may include a SIP (steamin place) process to sterilize or sanitize the equipment. Concerns about storageconditions are related to possible recontamination of the equipment, includingrecontamination by micro-organisms. Therefore, the clean hold time isconcerned about the hold time under defined storage conditions.El siguiente uso puede ser fabricar un producto, pero puede incluir un procesoSIP (Stem in place) para esterilizar o sanitizar el equipo. Las preocupacionessobre las condiciones de almacenamiento se relacionan a la posiblerecontaminación del equipo incluyendo recontaminación por microorganismos.Por lo tanto, el clean hold time se refiere al tiempo que se mantiene bajo

condiciones de almacenamiento definidas.

Regulatory backgroundThe regulatory basis of addressing the clean hold time is apparent from theFDA cleaning validation guidance:

“There should be some evidence that routine cleaning and storage ofequipment does not allow microbial proliferation. For example, equipmentshould be dried before storage, and under no circumstances should stagnantwater be allowed to remain in equipment subsequent to cleaning operations.”(2)

Antecedentes regulatorios






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Las base regulatorias de abordar el clean hold time se desprende de la guía devalidación de limpieza de la FDA:

“Debe existir evidencia de que la limpieza de rutina y almacenamiento de losequipos no permita proliferación microbiana. Por ejemplo, el equipo debe

secarse antes de almacenarse, y bajo ninguna circunstancia debe permitirseque se quede agua estancada en el equipo después de las operaciones delimpieza (2)”.

This concern is also reflected in the PIC/S recommendations for cleaningvalidation:Esta preocupación se refleja también en las recomendadiones de la PIC/S paravalidación de limpieza:

“The period and when appropriate, conditions of storage of equipment … andthe time between cleaning and equipment reuse, should form part of the

validation of cleaning procedures. This is to provide confidence that routinecleaning and storage of equipment does not allow microbial proliferation.“El período y cuando sea apropiadado, condiciones almacenamiento delequipo… y el tiempo entre la limpieza y el reuso del equipo deben formar partede los procedimientos de la validación de limpieza. Esto es para proveerconfianza de que la limpieza de rutina y el almacenamiento del equipo nopermiten la proliferación microbiana.

In general, equipment should be stored dry, and under no circumstances shouldstagnant water be allowed to remain in equipment subsequent to cleaningoperations.” (3)En general, el equipo debe almacenarse seco, y bajo ninguna circunstanciadebe permitirse que se quede agua estancada en el equipo después de lasoperaciones de limpieza (3)”.

In both these documents, the major concern is bioburden proliferation duringstorage (during the clean hold time). It should be noted that there may be otherconcerns from manufacturers, such as recontamination from other sources(particles, for example) that may also be addressed in a clean hold study.However, the major concern is generally bioburden proliferation.En ambos documentos, la mayor preocupación es la proliferación de la carga

microbiana durante el almacenamiento (durante el clean hold time). Debeobservarse que puede haber otras preocupaciones de los fabricantes, tal comorecontaminación de otras fuentes (partículas, por ejemplo) que puede tambiénser abordadas en un estudio de hold time. Sin embargo, la mayor preocupaciónes generalmente la proliferación de la carga microbiana.

Bioburden proliferationFor bioburden proliferation in a clean hold study, bioburden is measured at thebeginning of the storage time (which is also the end of the cleaning process)and at the end of the storage time (which is also the beginning of the next use).

Proliferación de la carga microbiana



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Para la proliferación de la carga microbiana en un estudio de hold time, la cargamicrobiana se mide al inicio del tiempo de almacenamiento ( el cual es tambiénel final del proceso de limpieza) y al final del tiempo de almacenamiento (el cuales también e inicio del siguiente uso).

A clean hold study generally follows validation of the cleaning process itself,because the initial storage state or condition depends on the cleaning processused. The variables that affect possible changes in bioburden include the initialstorage state (including initial bioburden, the initial organic nutrient load, and thepresence of water, particularly pooled water), the time of storage, thetemperatura of storage, and protection from external recontamination.Un estudio de clean hold generalmente sigue a la validación del proceso delimpieza, debido a que el estado o condición inicial de almacenamientodepende del proceso de limpieza usado. Las variables que afectan los posbilescambios en la carga microbiana incluyen el estado inicial del almacenamiento(incluyendo la carga microbiana inicial, la carga inicial de nutrientes orgánicos,

y la presencia de agua, particularmente el agua estancada), el tiempo dealmacenamiento, la temperatura de almacenamiento, y la protección derecontaminación externa.

Protocol strategiesSome companies may include the validation of the clean hold time as part of anoverall protocol, including the cleaning process validation. That is, one protocolis executed which measure residues at the end of the cleaning process. Amongthose residues is bioburden.Estrategias del protocolo Algunas empresas pueden incluir la validación del clean hold time como partede un protocolo general, incluyendo la validación del proceso de limpieza. Estoes, un protocolo se ejecuta el cual mide residuos al final del proceso delimpieza. Entre esos residuos está la carga microbiana.

That bioburden at the end of the cleaning process provides an assurance thatthe cleaning process produces acceptable level of bioburden. See Part I(October 2009 PMF Newsletter ) for a discussion of setting bioburden limits atthe end of the cleaning process. Those values at the end of the cleaningprocess are also the baseline (time = 0) for measuring bioburden proliferation

during the clean hold time.La carga microbiana al final del proceso de limpieza provee una seguridad deque los procesos de limpieza producen un nivel aceptable de carga microbiana.Ver la parte I (Octubre 2009 PMF Newsletter) para una discusión deestablecimiento de límites de carga microbiana el final del proceso de limpieza.Esos valores al final del proceso de limpieza son también la línea base (time 00) para la medición de proliferación de la carga microbiana durante el cleanhold time.

Following a maximum allowed storage time (under specified storage conditions,such as location), bioburden is measured again to determine whether bioburden

proliferation occurred.



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Después de un tiempo máximo permitido de almacenamiento (bajo condicionesde almacenamiento especificas, tales como la ubicación), la carga microbianase mide otra vez para determinar si ocurrió proliferación de la carga microbiana.

Some companies will separate the clean hold validation protocol from the

cleaning process validation protocol. Algunas empresas separarán la validación del clean hold del protocolo devalidación del proceso de limpieza.

This can be either a separation by using two protocols, but still having the cleanhold protocol immediately follow the cleaning process validation protocol suchthat the data collected at the end of the cleaning process also serves as thedata for the beginning of the clean hold protocol. In other cases, the twoprotocols can be separate in time, such the baseline data for the clean holdstudy is developed apart from the data at the end of the cleaning processvalidation protocol.

Esto puede ser una separación mediante el uso de dos protocolos, pero aúnteniendo el protocolo del clean hold inmediatamente siguiendo al protocolo devalidación del proceso de limpieza de tal forma que los datos colectados al finaldel proceso de limpieza también sirven como datos para el inicio del protocolodel clean hold. En otros casos, los dos protocolos pueden ser separados entiempo, de tal forma que los datos de la línea base para el estudio del cleanhold se desarrolle aparte de los datos al final del protocolo de validación delproceso de limpieza.

Setting limitsThe key question for a clean hold study is how to set appropriate limits formicrobial or bioburden proliferation.Estableciendo límites.La cuestión clave para un estudio de clean hold es como establecer límitesapropiados para la proliferación de carga microbiana o microbiológica.

The main issue is to prevent significant ‘”proliferation”, and not just any change.El principal problema es prevenir una “proliferación” significativa y no sólocualquier cambio.

One element in determining significant “proliferation” is the issue of bioburden

enumeration (discussed in Part I). Doubling or even tripling of enumeratedbioburden is not considered significant. Generally, a one log increase inbioburden would be considered significant. That is, even though the bioburdenacceptance limit at the end of the cleaning process was 1 CFU/cm2, that valuecould be has high as 10 CFU/cm2 and still be aceptable after the hold time.Un elemento en determinar una “proliferación” significativa es el problema dlconteo de la carga microbiana (discutida en la Parte I). La duplicación otriplicación de la carga microbiana contada no se considera significativa.Generalmente, el incremento de un logaritmo en la carga microbiana pudieraconsiderarse significativa. Es decir, aunque el límite de aceptación de la cargamicrobiana al final del proceso de limpieza fue de 1 UFC/cm², este valor puede

ser tan alto como 10 UFC/cm² y aún ser aceptable después del hold time.



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While it might seem there is an inconsistency here, remember in Part I that thelimit of (for example) 1 CFU/cm2 was not based on a carryover calculation. Itwas based on what was should be achievable by cleaning with hot, aqueousalkaline cleaning solutions. Therefore, it is considerably below what would beacceptable for contamination of the next product. Therefore, an acceptance

criterion of no more than (NMT) a one log increase in bioburden is reasonableto consider for a clean hold study. Aunque podría parecer que hay una inconsistencia aquí, recuerdo que en laparte I que el límite de (por ejemplo) 1 UFC/cm² no se basó sobre cálculos delremanente (carryover). Se basó sobre lo que se debe alcanzar con solucionesalcalinas de limpieza calientes. Por lo tanto, es muy inferior a lo que seríaaceptable para la contaminación del siguiente producto. Por lo tanto, un criteriode aceptación de no más que (NMT, por No More Than) un incremento de unlogaritmo en la carga microbiana es razonable para considerarlo para unestudio de clean hold.

However, a criterion of no more than a one log increase is difficult to applywhen the swab results come back all zeros. (Let’s ignore for now how that datashould actually be reported.) There is no such value as a “log of zero”. For thatreason, it is reasonable to allow no more than the original acceptance limit inthe cleaning validation protocol. If that is the case, then an additional criterioncan be “NMT 1 CFU/cm2” (for example). Sin embargo, un criterio de no más que el incremento de un logaritmo es difícilde aplicar cuando los resultados del hisopo son todos cero. (Ignoremos porahora la forma en que los datos deben reportarse). No hay un valor como“logaritmo de cero”. Por esta razón, es razonable permitir no más que el límitede aceptación original en el protocolo de validación de limpieza. Si este es elcaso, entonces un criterio adicional puede ser “NMT 1 UFC/cm²” (por ejemplo).

These two criteria can be combined by establishing an acceptance criterion of“the less stringent of NMT 1 CFU/cm2 and NMT one log increase”. Forexample, if the acceptance limit at the end of cleaning was 25 CFU per 25 cm2,and if the measured bioburden value at the end of cleaning is 5 CFU per swabof 25 cm2, then after the clean hold time, the acceptance criterion would be theless stringent of 50 CFU per 25 cm2 (a one log increase) and 25 CFU per 25cm2 (the original specification after cleaning). The less stringent of the two is thehigher value, or 50 CFU per 25 cm2. On the other hand, if the acceptance limit

at the end of cleaning was 25 CFU per 25 cm

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, and if the measured bioburdenvalue at the end of cleaning is 1 CFU per swab of 25 cm2, then after the cleanhold time, the acceptance criterion would be the less stringent of 10 CFU per 25cm2 (a one log increase) and 25 CFU per 25 cm2 (the original specification aftercleaning). The less stringent of these two is the higher value, or 25 CFU per 25cm2.Estos dos criterios pueden combinarse mediante el establecimiento de uncriterio de aceptación de “el menos estricto de NMT 1 UFC/cm² y NMT elincremento de un logaritmo”. Por ejemplo, si el límite de aceptación el final dela limpieza fue de 25 UFC/cm², y si el valor medido de la carga microbiana alfinal de la limpieza fue de 5 UFC por hisopado de 25 cm², entonces después

del clean hold time, el criterio de aceptación sería el menos estricto de 50 UFC/cm² (el incremento de un logaritmo) y 25 UFC/cm² (la especificación original



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después de la limpieza. El menos estricto de los dos es el valor más alto, o 500UFC /cm². Por otro lado, si el límite de aceptación al final de la limpieza fue de25 UFC/cm², y si el valor medido de la carga microbiana al final de la limpiezafue de 1 UFC por hisopado de 25 cm², entonces después del clean hold time, elcriterio de aceptaciópn sería el menos estricto de 10 UFC/cm² (el incremento

de un logaritmo) y 25 UFC/25cm² (la especificación original después de lalimpieza). El menos estricto de esos dos valores es el valor más alto, o 25 UFC/25cm².

Sampling issuesIf multiple swab sites (or contact plate sites) are sampled for a given equipmentitem, it probably is not appropriate to average sites and then compare theaverage value after the clean hold time to the average value before the cleanhold time. In such cases, sampling after the clean hold time should be with sitesadjacent to the sites sampled for the beginning of the clean hold times.Comparisons then should be made for “comparable” sites, that is, for those

adjacent sites.Problemas de muestreoSi varios sitios son muestreados por hisopo (o placas de contacto) para unequipo dado, probablemente no es apropiado promediar sitios y entoncescomparar el valor promedio después del clean hold time contra el valorpromedio antes del clean hold time. En tales casos, el muestreo después delclean hold time debe ser en sitios adyacentes a los sitios muestreados al iniciodel clean hold time. Las comparaciones deben hacerse entonces para sitios“comparables”, esto es, para esos sitios adyacentes.

Problems also arise in clean hold studies when rinse sampling is done forbioburden measurement. One of two types of rinse sampling may be performed.If the initial (time = zero) bioburden rinse sample is a “grab” sample of the finalprocess, then the rinse sample after the clean hold time should be an ambienttemperature rinse. If a hot water rinse were to be used, then any proliferation ofbioburden during the clean hold time may be masked by the killing effect of thehot rinse. If a sufficient quantity of ambient temperature water is not readilyavailable, this approach may be problematic.Los problemas también surgen en estudios de clean hold time cuando serealiza el muestreo por enjuague para la medición de la carga microbiana. Unode los dos tipos de muestreo por enjaugue puede realizarse. Si la carga

microbiana inicial (tiempo = cero) de la muestra de enjuague es una muestra“tomada” del proceso final, entonces la muestra de enjuague después del cleanhold time debe ser un enjuague a temperatura ambiente. Si se uso unenjuague con agua caliente, entonces cualquier proliferación de la cargamicrobiana durante el clean hold time puede ser enmascarado por el efectoletal del enjuague con agua caliente. Si no está disponible la suficiente cantidadde agua a temperatura ambiente, este enfoque puede ser problemático.

The other type of rinse used is a separate sampling rinse. That is, for the initialbioburden determination the process rinse is completed and is then followed bya rinse solely for sampling purposes. If this separate sampling rinse is used,

then the same issue with hot water rinsing arises – if the separate rinse sample



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is with hot water, the data relating to proliferation may be distorted due to thebiocidal effect of the temperature. Another consideration is that if a separatesampling rinse is used at the end of the cleaning process, then it is no longerpossible to use the data from a sampling rinse after storage of the cleanedequipment for that manufacturing run. The reason for this is that using such a

separate sampling rinse is an additional step which distorts the nature of thecleaned equipment during storage. The purpose of the clean hold study is tomeasure bioburden change following the normal cleaning process, not followingthe use of a separate sampling rinse (which is only used for the validationprotocol). In this case, one production run must be used to develop the initial(time = zero) data, and then a separate manufacturing run must be used todevelop the data for the burden at the end of the storage period.El otro tipo de enjuague usado es un muestreo de enjuague separado. Esto es,para la determinación inicial de la carga microbiana se completa el proceso deenjuague y entonces se realiza un enjuague solo para propósitos de muestreo.Si este muestreo de enjuague separado se usa, entonces surge el mismo

problema que con el agua caliente – si el enjuague separado es con aguacaliente, los datos relacionados a la proliferación pueden distorsionarse debidoal efecto biocida de la temperatura. Otra consideración es que si un muestreode enjuague separado se usa al final del proceso de limpieza, entonces ya noes posible utilizar los datos del muestreo por enjuague después delalmacenamiento del equipo limpio para esa corrida de fabricación. La razónpara esto es que usando el muestreo por enjuague separado es un pasoadicional el cual distorsiona la naturaleza del equipo limpio durante elalmacenamiento. El propósito del estudio del clean hold es medir el cambio dela carga microbiana siguiendo el proceso normal de limpieza, no siguiendo eluso de un muestreo de enjuague separado (el cual se usa solo para elprotocolo de validación). En este caso, se debe usar una corrida de producciónpara desarrollar los datos iniciales (tiempo =cero), y entonces se debe usar unacorrida de fabricación separada para desarrollar los datos para la carga al finaldel período de almacenamiento.

While not an ideal situation, it is a required constraint if a separate samplingrinse is used for measuring bioburden. Aunque no es una situación ideal, es una restricción necesaria se se usa unmuestreo por enjuague separado para la medición de la carga microbiana.

When establishing a clean hold time by use of a protocol, it is best to establish agoal and measure for the presence of proliferation only at the end of that timeperiod. Sampling at various intervals to determine the maximum acceptabletime can present problems in terms inadvertent contamination of surfacesduring swab or contact plate sampling at the intermediate times, thus resultingin false failures at later time periods. In addition, rinse sampling at intermediatetimes cannot be performed for one manufacturing run only. For rinse samplingat multiple times, a separate run must be used for each time period.

If such studies involving testing at multiple time points are performed, they are

best done as part of the design/development phase of validation.



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Cuando se establece un clean hold time mediante el uso de un protocolo esmejor establecer una meta y medir la presencia de proliferación sólo al final deese período de tiempo. El muestreo en varios intervalos para determinar eltiempo máximo aceptable puede presentar problemas en términos decontaminación inadvertida de las superficies durante el muestreo con hisopo o

placas de contacto en los tiempos intermedios, resultando así en falsos fallosen períodos de tiempos mas tarde. Además, el muestreo por enjuague entiempos intermedios no se puede realizar para una sola corrida de fabricación.Para el muestreo por enjuague en multiples períodos de tiempo, se debe usarcorridas separadas para cada período de tiempo.

Objectionable organismsIdentification of organisms and exclusion of objectionable organisms may alsobe utilized in a clean hold study. The principles used for the cleaning validationprotocol (See Part I, PMF Newsletter , vol., no., pages, date) will also apply

here. However, if there is no significant proliferation, there may be little rationalefor identification beyond what was done at the end of cleaning. On the otherhand, if there is significant proliferation (i.e., a failure of the clean hold protocol),then identification is certainly appropriate as part of the investigation todetermine the cause of the failure.Organismos ObjetablesLa identificación de organismos y la exclusión de organismos objetables puedeutilizarse también en un estudio de clean hold. Los principios usados para elprotocolo de validación de limpieza (ver la Parte I en October 2009 PMFNewsletter ) también aplicarán aquí. Sin embargo, si no hay proliferaciónsignificativa, puede haber pocas razones para la identificación más allá de loque se hizo al final de la limpieza. Por otro lado, si hay proliferaciónsignificativa, (por ejemplo, una falla del protocolo del clean hold), entonces laidentificación ciertamente es apropaida como parte de la investigación paradetrminar la causa de la falla.

EndotoxinsIf endotoxin is measured for a cleaning validation protocol for sterilemanufacturing, it is not necessary to include endotoxin measurement as part ofthe clean hold protocol. The rationale for this is that excessive endotoxin is onlylikely to be a problem if there is also significant microbial proliferation. That is,

the protocol is likely to fail for endotoxin only if there is also a failure forbioburden. In addition, failure for endotoxin will only occur if the bioburdenproliferation involves gran negative bacteria. While it is theoretically possible fora gram negative to proliferate and then die (thus resulting in no bioburdenproliferation detected at the end of the storage time, but with excessiveendotoxin), such a scenario is not likely.EndotoxinasSi se miden endotoxinas para un protocolo de validación de limpieza parafabricación estéril, no es necesario incluir la medición de endotoxinas comoparte del protocolo del clean hold. La razón para esto es que solo es probableque el exceso de endotoxinas sea un problema si también hay proliferación

microbiana significativa. Es decir, es probable que falle el protocolo paraendotoxinas sólo si también falla para la carga microbiana. Además, la falla



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para endotoxinas sólo ocurrirá si la proliferación de carga microbiana involucrabacterias gran negativas. Si bien es teóricamente posible para que un grannegative prolifere y entonces muera (este resultado no es proliferación de cargamicrobiana detectada al final del tiempo de almacenamiento, pero con excesivaendotoxina) tal escenario no es probable.

Alternative to a formal protocol An approach utilized by some companies is to avoid formal clean hold studiesby providing assurance that the equipment is dry at the beginning of the holdtime.Alternativa a un protocolo formalUn enfoque utilizado por algunas empresas es evitar estudios formales declean hold proveyendo seguridad de que el equipo está seco el inicio y al finaldel hold time.

This is consistent with the FDA’s statement in their cleaning validationguidance:Esto es consistente con lo declarado por la FDA en su guía sobre validación delimpieza:

“This consists largely of preventive measures rather than removal ofcontamination once it has occurred.“Esto consiste en gran parte de las medidas preventivas en lugar de eliminar lacontaminación una vez que ha ocurrido.

There should be some evidence that routine cleaning and storage of equipmentdoes not allow microbial proliferation. For example, equipment should be driedbefore storage, and under no circumstances should stagnant water be allowedto remain in equipment subsequent to cleaning operations.” (4) Debe haber alguna evidencia de que la limpieza de rutina y almacenamientodel equipo no permite proliferación microbiana. Por ejemplo, el equipo debesecarse antes de almacenarse, y bjo ninguna circunstancia debe permitirse queparmanezca agua estancada después de las operaciones de limpieza (4).

In other words, the major issue is one of preventive actions to make sure thatthe equipment is dry. It is a well accepted scientific principle that bioburden will

not proliférate on clean, dry surfaces. Assurance of dryness can be done byproper design of fixed equipment to assist in adequate drainage, properplacement of items cleaned out of place to assist in adequate drainage, use of ahot water final rinse, use of hot air following the final rinse, and/or use of analcohol wipe or rinse following the final water rinse. In addition, it should beestablished that dry surfaces do not become wet following initiation of the cleanhold time. For example, if vessels cleaned by a CIP process are closed upbefore returning to ambient temperature, moist heated air may condense waterin parts of the equipment, possibly allowing microbial proliferation.En otras palabras, la cuestión principal es una de las acciones preventivas paraasegurarse que el equipo está limpio. Es un principio científico bien aceptado

que la carga microbiana no prolifera en superficies limpias y secas. Elasegurarse de la sequedad puede hacerse por un diseño adecuado del equipo



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fijo para ayudar en el drenaje adecuado, la correcta ubicación de los elementoslimpios fuera del lugar para ayudar en el drenaje adecuado, el uso de unenjuague final con agua caliente, el uso de agua caliente tras el enjuague finaly /o el yuso de un wipe con alcohol o enjuague después del enjuague final conagua. Además, se debe establecer que las superficies secas no se mojen tras

el inicio del clean hold time. Por ejemplo, si los recipientes limpiados medianteun proceso CIP se cierran antes de retornar a la temperatura ambiente, lahumeda del aire calentado puede condensar el agua en partes del equipo,posiblemente permitiendo proliferación microbiana.

References1. See PMF Newsletter 15:10, pp. 2-9 (October 2009) for Part I.


3. Recommendations on Validation Master Plan, Installation and OperationalQualification, Non-Sterile Process Validation Cleaning Validation,Pharmaceutical Inspection Convention Pharmaceutical Inspection Co-OperationScheme (PIC/S), Document PI 006-3, Geneva, Switzerland, September 15,2007.


problemas microbiológicos en la validación de limpiez

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