validación de métodos microbiológicos 3m™petrifilm™frente...

Verificación de métodos microbiológicos 3M™Petrifilm™frente a

métodos de referencia, para matrices específicas

Rocío Sanabria Aguirre y Olga Velázquez Madrazo

UNAM, Facultad de Química. 2018

Trabajo colaborativo2010 a 2017

Métodos de referencia

Métodos tradicionales, basados en cultivo

• Microbiológicos en México: • NOM-210-SSA1-2014. Productos y servicios. Métodos de prueba microbiológicos.

Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de microorganismos patógenos.

• NOM 092-SSA1-1994, CUENTA DE BACTERIAS AEROBIAS EN PLACA.

• NOM-110-SSA1-1994. PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE MUESTRAS DE ALIMENTOS

• NOM-111-SSA1-1994, CUENTA DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS

• NOM-113-SSA1-1994, MICROORGANISMOS COLIFORMES TOTALES EN PLACA.

NOM-210-SSA1-2014.

• 3.15 Métodos alternativos aprobados: a aquéllos que se encuentran referidos en las referencias internacionales como AOAC . . . y que cuentan con validación internacional y verificación en el laboratorio de prueba, sólo pueden ser usados en el análisis del producto para el cual fue validado.

• Complejidad de las matrices.

• Requiere verificación, del laboratorio interesado, en la matriz específica.

Single laboratory validation ó In-house validation(Nordval, 2009).

NordVal, NMKL. Protocol for the validation of alternative microbiological methods. 2009. National VeterinaryInstitute. Norway. Disponible en: http://www.nmkl.org/NordVal/NordValprotocolmarch2009.pdf

http://www.nmkl.org/NordVal/NordValprotocolmarch2009.pdf

Métodos Alternativos

• 3M Petrifilm

• Indudablemente más cómodos, confiables, económicos.

• ¿Aceptados por la autoridad? • NOM-210-SSA1

3M Petrifilm

• Tiempo de preparación

• Volumen en incubadora

•Estandarización

•Costo

3M Petrifilm

• Menor consumo de energía

• Menor gasto de agua

• Menos emisiones

• Menos residuos

Objetivo • Presentar resultados de verificaciones Petrifilm en matrices alimentarias mexicanas en 8 años.

• Resaltar la importancia de la adecuada verificación en matriz específica, para aprovechar las ventajas que tienen los métodos rápidos.

METODOLOGÍA

Metodología: MATRICES mexicanas

Miel de abeja

Lácteos:

Queso panela

Queso Oaxaca

Crema ácida

Arroz con leche

Yogures,

petitsuis

Alimentos de

bajo pH

Cárnicos:

Jamón de pavo,

de pavo y cerdo

Salchichas de pavo

Tortillas

Fécula de maíz

Humus, mayonesa

Y otros aderezos

Diluyentes

Metodología

• > 30 réplicas

• Muestras pareadas para MT y 3M Pf

• Blanco y

• 3 niveles de inóculo

• Estandarización de inóculos con Densimatde Biomerieux y cuenta en placa

Análisis Estadístico:

• t-student

• Diagrama cajas y bigotes

Metodología. Cepas utilizadas Matriz Determinaciones Microorganismos

Miel de abeja AC CCEsporulados en AC

S. aureus ATCC-6538 + E. coli ATCC-1122E. coli ATCC-1122B. cereus CFQ + Clostridium sp. CFQ

Alimentos de bajo pH:Jugo naranja y Aquafrut, yogures y PetiZoo

AC CCYM

S. aureus ATCC-6538 + E. coli ATCC-1122E. coli ATCC-1122Sacch. cerevisiae CFQ-L-25 + Penicillium sp. CFQ-H-75

Efecto de Diluyentes AC CC

S. aureus ATCC-6538 + E. coli ATCC-1122E. coli ATCC-1122

Lácteos: Q. Panela, Q. Oaxaca, crema, arroz con leche, yogures, PetiZoo

AC CCYM

S. aureus ATCC-6538 + E. coli ATCC-1122E. coli ATCC-1122Sacch. cerevisiae CFQ-L-25 + Penicillium sp. CFQ-H-75

Derivados cereales:Tortillas y Fécula de maíz

RYM

Pbas de no-interferencia :

Aspergillus niger CFQ-H-18-3 + P. chrysogenum CFQ-H-63-1Sacch. cerevisiae CFQ-L-26-3S. aureus ATCC-6538 + E. coli ATCC-1122

BAL en Cárnicos: Jamón: pavo,

pavo y cerdo, salchicha de pavo

LAB Leuconostoc mesenteroides NRRL 512FLactococcus lactis ssp lactis + Lactobacillus brevis

BAL en hummus y mayonesa LAB Leuconostoc mesenteroides NRRL 512FLactococcus lactis ssp lactis + Lactobacillus brevis

RESULTADOS

Resultados. Miel de Abeja

Xolalpa, A. 2012. Evaluación de características de inocuidad y calidad en mieles mexicanas. Tesis maestría, FMVZ, UNAM (Asesor: S. Rubio L.)

Mesófilos aerobios (Petrifilm AC): No hay diferencia significativa entre métodos (p > 0.05), a partir de dilución 10-2 o 2500UFC/gEn diluciones < 10-2 hay inhibición.

Coliformes totales (Petrifilm CC): No hay diferencia significativa entre métodos (p > 0.05), a partir de dilución 10-2 o 1500UFC/gEn diluciones < 10-2 hay inhibición.

Specs:Higiene, AC: 1000 UFC/g; Y: 100 UFC/g

Resultados. Miel de Abeja

Xolalpa, A. 2012. Evaluación de características de inocuidad y calidad en mieles mexicanas. Tesis maestría, FMVZ, UNAM (Asesor: S. Rubio L.)

Bacterias esporuladas aerobias y anaerobias (Petrifilm AC): No hay diferencia significativa entre métodos (p > 0.05), a partir de dilución 10-2 o 2500UFC/gEn diluciones < 10-2 hay inhibición.

Mohos y Levaduras (Petrifilm YM):No hay diferencia significativa entre métodos (p > 0.05)

Límite Levaduras 100 UFC/g

Resultados. Alimentos de bajo pH

Muestras semisólidas:

• Yogur de fresa

• Yogur bebible de fresa

• Petit suiss sabor mora

Se analizaron con y sin dilución.

Huerta Márquez, L. 2011. Comparación de método 3M Petrifilm™ con método tradicional para determinación de indicadores microbiológicos en alimentos de bajo pH. Tesis Licenciatura. UNAM, FQ. (Asesor: OVM).

Muestras líquidas:

• Aquafrut sabor uva

• Jugo de naranja Natural’es


Aquafrut sabor uva:

• Si hay diferencia estadísticamente significativa, p<0,05 para los 3 indicadores

• Mejor desempeño de Petrifilm en los 3 indicadores

Aquafrut

Requiere BUFFER

DE FOSFATOS

PARA AC Y CC,

pH es inestable en

otros diluyentes.

Importancia de estandarización


MT Petrifilm

Log

UFC

/g

MT Petrifilm


Jugo Natural’es:

No hay diferencia significativa para AC

Si hay diferencia significativa para CC (MT mejor desempeño)

Si hay diferencia significativa para YM (Pf mejor desempeño)

MT PF

MT PF

MT PF

YM

CC

AC


Muestras semi-sólidas:

• DEBEN DILUIRSE 1:10

• Falsos negativos sin dilución

• Fermentación, bacteriocinas, inhibición en ambos métodos,

• Petrifilm más afectado

Petrifilm no es útil para AC en las matrices lácteas con fermentación por BAL, por presencia de inhibidores.

NOM-110-SSA1-1994:• Solución reguladora de fosfatos• Agua peptonada

Guía Petrifilm:

• Solución reguladora de fosfatos

• Agua peptonada

• Buffer de sal peptona (ISO 6887);

• Solución salina isotónica estéril

Resultados. Diluyentes

Olvera Barrón, G. 2016. Evaluación del efecto de diferentes diluyentes para la recuperación de microorganismos indicadores en alimentos, empleando placas 3M Petrifilm. Tesis licenciatrua, FQ, UNAM. (Asesor: OVM)

NOM-210-SSA1-2014:• Agua peptonada• Buffer agua peptonada• Diluyentes + indicadores• Diluyente con tween 80


Matrices lácteas: queso, crema, yogur, arroz con leche

Jugo de naranja

Petrifilm AC y Petrifilm CC Métodos de Referencia

• Solución reguladora de fosfatos• Agua peptonada• Buffer de sal peptona (ISO 6887); • Solución salina isotónica estéril


Arroz con leche


CONCLUSIONES • Buffer de fosfatos da las mejores

recuperaciones• Petrifilm es menos afectado por el

diluyente• Agua peptonada tamponada genera

mayores diferencias entre métodos • Jugo de naranja por Petrifilm,

únicamente con buffer de fosfatos, pH inestable

Resultados. Productos Lácteos

Validaciones:

• “NMX -F-717-COFOCALEC-2006. Sistema Producto Leche-Alimentos-Lácteos-Análisis Microbiológicos de Leche y Derivados-Métodos de Prueba Rápidos”.

• AOAC

• AFNOR

MUESTRAS: crema ácida, queso panela, queso Oaxaca y el arroz con leche.

Ramírez Lima I.X. 2012. Validación de Petrifilm™ en matrices lácteas producidas en México. Tesis Licenciatura, FQ, UNAM. (Asesor: O.V.M.)


Diferencia significativa entre MT y MPf

Placa / Matriz Queso panela

Queso Oaxaca

3M™ Petrifilm™ AC

SI SI

3M™ Petrifilm™ CC

SI SI

3M™ Petrifilm™ YM

SI PF mayor

recuperación

SI PF mayor

recuperación


Diferencia significativa entre MT y MPf

Placa / Matriz Crema ácida

Arroz con leche

3M™ Petrifilm™ AC No SI

3M™ Petrifilm™ CC No SI

3M™ Petrifilm™ YMLevadurasHongos

NoSI PF mayor

recuperación

SI PF mayor

recuperación


Resultados de AC en arroz con leche


Matriz INDICADOR t-tablas

t-experimental

Mejor Desempeño

Resultados. Tortilla y fécula de maíz

Sanabria Aguirre, R.A. 2016. Validación de la placa 3M Petrifilm RYM para la determinación rápida de mohos y levaduras en matrices mexicanas. UNAM, FQ, Tesis de licenciatura. (Asesor: OVM)

Fotos: Sanabria, 2015

PETRIFILM RYM en cereales y derivados:Gran facilidad de interpretación


Levaduras: No hay diferencia significativa, no hay interferencia con bacterias.

Mohos: Diferencia significativa, Mejor desempeño de Petrifilm RYM

FACILIDAD DE INTERPRETACIÓN

Resultados. Cárnicos

BAL relacionadas con deterioro de cárnicos al vacío:

Limo, olor, sabor, abombamiento de empaque, coloración o decoloración (Kempton & Bovier, 1970).

• Lactobacillus homofermentativos

• Lb. viridiscens heterofermentativo

• Carnobacterium psicrótrofos

• Leuconostoc spp (Forsythe, 2002)

Durán de León, P. 2013. Evaluación de placas 3M Petrifilm para el recuento de bacterias lácticas en productos cárnicos procesados y para estimación de vida de anaquel. Tesis de Licenciatura, UNAM, FQ. (Asesor: OVM)


Jamón de pavo

Jamón de pavo y cerdo

Salchicha de pavo

Vida de anaquel 40 días

Refrigeración durante 44 días,

9 muestreos 105 UFC/g


72 a 96+2 h

Jarra+GaspackJarra+Gaspack

Resultados. CárnicosDiagramas de cajas y bigotes para jamón de cerdo y pavo, inoculado

con Leuconostoc mesenteorides con Lactococcus lactis spp lactis y Lactobacillus brevis


Detección oportuna de BAL:

PFANA

PFAE

MT

cuantificar bacterias ácido-lácticas en productos cárnicos procesados y para estimación de vida de anaquel

Resultados. Hummus y mayonesa

Lozano R.P. 2018. Comparación de Métodos tradicional y 3M Petrifilm-LAB para la recuperación de bacterias ácido lácticas en matrices alimentarias elaboradas en México. Tesis licenciatura en revisión final (Asesor: OVM)


Hummus (2 marcas):

• Si hay diferencia significativa

• facilita diferenciación UFC (violeta) y alimento (azul)

• MT sobreestima UFC por confusión con partículas

• Diferencia homo y heterofer-mentativas


Mayonesa (3 marcas):

• homogenización

• Temperatura de incubación inadecuada, aún con cepas de referencia

• Óptima: 30 oC

• Inhibición en dilución 10-1, por conservadores (benzoatos o sorbatos, 3 a 6mg/g)

• No hay diferencia significativa entre métodos

Conclusiones

• La verificación para CADA MATRIZ ESPECÍFICA, es INDISPENSABLE.

• El proceso de verificación genera aprendizaje en el analista.

•Petrifilm es excelente opción

• La estandarización de la técnica es muy importante.

GRACIAS!!

Protocolos de validación de métodos

• ISO 16140 Protocol for validationof alternative methods y EU Directive 2073/2005: Microbiological criteria for foodstuffs

• AOAC International Rapid Methods Validation Process

• AOAC Guidelines For Validation Of Qualitative And Quantitative Food Microbiological Official Methods Of Analysis published J. Assoc. Off. Anal. Chem. 85, 1187-1203 (2002)


• ISO 16140 Protocol for validation of alternative methods y EU Directive2073/2005: Microbiological criteria for food stuffs

Requiere:• Métodos ISO O CEN (Comité Europeo de Normalización o European

Committee for Standardization y• Certificación por terceros

• AFNOR: French National Organization for Standardization• MicroVal: European certification body for microbiology methods• NordVal: Nordic certification body: Denmark, Finland, Iceland,

Norway, Sweden


• AOAC

Requiere:

Precolaborativo y colaborativo

Resultados de “First action” y

“Final action”

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