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Ciencias básicas en cardiología

Prevalencia y efectos funcionales y bioquímicosde los anticuerpos antirreceptores autonómicoscardíacos en pacientes con arritmias ventricularesy disfunción sinusal

PABLO A. CHIALE, INES FERRARI, EVELINA MAHLER, MARINA A . VALLAZZA,MARIANO J . LEVIN, MARCELO V. ELIZARI, MAURICIO B . ROSENBAUM

RESUMENAntecedentesLos anticuerpos circulantes que reconocen y estimulan los receptores autonómicos (RA) ((3-adre-nérgicos y M 2 colinérgico) se han demostrado en diversas cardiopatías . Sin embargo, el vínculopotencial entre las arritmias presentes en esas cardiopatías y los anticuerpos anti-RA y los efec-tos funcionales y bioquímicos de esos anticuerpos no se han investigado en forma sistemática .Objetivos1. Evaluar la prevalencia de anticuerpos anti-RA de las células miocárdicas en pacientes conarritmias ventriculares y/o disfunción sinusal . 2. Determinar los efectos funcionales y bioquí-micos de esos anticuerpos .MétodosSe estudiaron 28 pacientes con arritmias ventriculares (grupo I),13 con disfunción sinusal (gru-po II) y 5 con ambas anormalidades (grupo III), de etiología primaria o debidas a miocardiopa-tía crónica chagásica o dilatada idiopática y 10 voluntarios sanos (grupo IV) . Se evaluaron losefectos cronotrópicos de las fracciones IgG sobre cultivos de cardiomiocitos de ratas neonatasantes y después de la exposición a la atropina y el propranolol, para detectar los anticuerposanti-RA y estudiar su acción funcional sobre los receptores correspondientes . En 10 casos selec-cionados se inmunopurificaron los anticuerpos antirreceptor (3 1-adrenérgico o M2 colinérgico yse exploraron sus efectos funcionales en el mismo sistema in vitro . Los efectos bioquímicos dela IgG de 9 pacientes del grupo I, de 6 del grupo II, de 2 del grupo III y de 3 controles sanos seestudiaron en células COS7 transfectadas con los genes de los receptores 0 1 y (32 adrenérgicos (através del aumento en la producción de AMPc) y M 2 colinérgico (por el aumento en la produc-ción de fosfatidilinositol [PI]) .ResultadosLas IgG de los controles sanos no modificaron la frecuencia de latidos de los cardiomiocitos nipresentaron anticuerpos anti-RA . Las IgG de los pacientes del grupo I desarrollaron una accióncronotrópica positiva, con una prevalencia elevada de anticuerpos antirreceptores (3-adrenérgi-cos (75%) y baja de anticuerpos antirreceptor M 2 colinérgico (10,7%) . En marcado contraste, las

División Cardiología, Hospital General de Agudos J. M. Ramos Mejía e Instituto de Ingeniería Genética y Biología Molecular (INGEBI) -CONICETTrabajo recibido para su publicación: 6/99 . Aceptado : 8/99Dirección para separatas : Dr. Pablo A. Chiale, División Cardiología, Hospital J. M . Ramos Mejía, Urquiza 609, (1221) Buenos Aires, Argen-tinaEste estudio fue subsidiado por la Fundación de Investigaciones Cardiológicas Einthoven (FICE) y por subvenciones de la EuropeanCommission - The World Health Organization/Special Program for Research and Training in Tropical Diseases, la Universidad de Bue-nos Aires (Proyecto 01/TW 18) y ANPC-FONCYT-SECYT-Argentina (Proyecto BID 802-OC-AR-PICT 05-00103-02030)Trabajo de Temas Libres, XXVI Congreso Argentino de Cardiología 1999

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IgG de los pacientes del grupo II deprimieron el cronotropismo de los cardiomiocitos, con unaprevalencia elevada de anticuerpos antirreceptor M 2 colinérgico (76,9%) y baja de anticuerposantirreceptores (3-adrenérgicos (15,4%). Es de destacar que las IgG de los 5 pacientes del grupoIII no tuvieron un efecto cronotrópico significativo pero presentaron una prevalencia elevadade anticuerpos antirreceptor M 2 colinérgico (80%) e intermedia de anticuerpos antirreceptores(3-adrenérgicos (40%) . El estudio de los efectos cronotrópicos de los anticuerpos anti-RA inmu-nopurificados confirmó los resultados que se obtuvieron con las IgG correspondientes . En con-cordancia con los resultados de los estudios funcionales, las IgG de los pacientes del grupo Iindujeron un aumento marcado y sostenido del AMPc, pero no del PI, mientras que las IgG delos pacientes del grupo II produjeron un incremento ostensible y persistente del PI, pero no delAMPc.

ConclusionesLos resultados de este estudio demuestran: 1) Una correlación muy marcada entre anticuerposcirculantes antirreceptores (3-adrenérgicos y arritmias ventriculares (primarias o debidas a lasmiocardiopatías dilatada idiopática o crónica chagásica) y entre anticuerpos circulantes antirre-ceptor M2 colinérgico y disfunción sinusal (primaria o chagásica) . 2) Que los anticuerpos anti-rreceptor M 2 colinérgico son infrecuentes en los pacientes con arritmias ventriculares sin dis-función sinusal concomitante y que los anticuerpos antirreceptores (3-adrenérgicos son excep-cionales en aquellos con disfunción sinusal "pura" . 3) Que los anticuerpos anti-RA producenuna estimulación sostenida de los receptores correspondientes, con un aumento marcado en laproducción de AMPc por parte de los anticuerpos antirreceptores (3-adrenérgicos e inhibiciónpor parte de los anticuerpos antirreceptor M 2 colinérgico. Nuestros hallazgos permiten avizorarnuevas perspectivas para el conocimiento de la etiología y la fisiopatología de las arritmiasventriculares y la disfunción sinusal y pueden tener implicaciones para la terapéutica de esasanormalidades eléctricas . REV ARGENT CARDIOL 2000; 68: 399-413.

Palabras clave Arritmias ventriculares primarias - Miocardiopatía crónica chagásica -Miocardiopatía dilatada idiopática - Receptores (3-adrenérgicos - Receptor M 2 colinérgico - Propranolol - Atropina

INTRODUCCIONEn los últimos años se han demostrado anticuer-

pos circulantes que reconocen y estimulan los recep-tores P-adrenérgicos y M 2 colinérgico de la membra-na de las células miocárdicas en diversas cardiopa-tías, en las cuales las taquiarritmias ventriculares ylas bradiarritmias son un componente habitual delcuadro clínico . (1-6) Es conocido que el predominiodel tono simpático y los niveles elevados de cateco-laminas circulantes pueden desempeñar un papelimportante en la fisiopatogenia de las arritmias ven-triculares (7, 8) y que la estimulación vagal puededeprimir la actividad del nódulo sinusal y deterio-rar la conducción nodal AV. (9, 10) En consecuencia,es razonable suponer que los anticuerpos que esti-mulan los receptores (3-adrenérgicos y M2 colinérgi-co cardíacos podrían participar en la patogenia delas arritmias ventriculares y de las bradiarritmias,respectivamente .

Se ha sugerido que los anticuerpos antirrecepto-res (3-adrenérgicos están vinculados a las arritmiasventriculares de la miocardiopatía dilatada idiopá-tica (4, 11) y que los anticuerpos antirreceptor M 2colinérgico se asocian con la disfunción sinusal "pri-

maria" y chagásica (5) y con otras arritmias presen-tes en la miocardiopatía crónica chagásica . (6) Sinembargo, la prevalencia y los efectos funcionales ybioquímicos de esos anticuerpos no se han investi-gado de manera sistemática en pacientes con dife-rentes arritmias cardíacas . Los objetivos de este es-tudio fueron: 1) evaluar el nexo potencial entre losanticuerpos antirreceptores autonómicos y las arrit-mias (ectopia ventricular frecuente y/o disfunciónsinusal) que se observan en diferentes cardiopatías,2) establecer los efectos funcionales de esos anticuer-pos en cultivos de cardiomiocitos de ratas neonatasy 3) estudiar sus efectos bioquímicos sobre prepara-dos de células transfectadas con los genes que codi-fican para las proteínas de los receptores 51 y 02 adre-nérgicos y M2 colinérgico .

METODOS

PacientesEn el estudio se incorporaron 46 pacientes y 10

voluntarios sanos (Tabla 1) que integraron cuatrogrupos .

El grupo I incluyó 28 pacientes con arritmias ven-

ANTICUERPOS ANTIRRECEPTORES AUTONOMICOS Y ARRITMIAS / Pablo A . Chiale y col .

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Tabla 1Características clínicas de la población estudiada

AV: Arritmia ventricular. DNS: Disfunción del nódulo sinusal . CS : Controles sanos . F: Femenino . M: Masculino. p : Pacientes .

triculares (14 no presentaban anormalidades cardía-cas estructurales, 9 padecían miocardiopatía crónicachagásica y 5 miocardiopatía dilatada idiopática) .

El grupo II lo constituyeron 13 pacientes con dis-función sinusal de etiología chagásica (9 pacientes)o idiopática (4 pacientes) .

El grupo III incluyó 5 pacientes con arritmias ven-triculares y disfunción sinusal (4 por miocardiopa-tía crónica chagásica y el restante sin sustrato estruc-tural evidente) .

El grupo IV (control) estuvo compuesto por 10individuos sanos .

Evaluación cardiológicaLa evaluación de los pacientes incluyó un examen

clínico y cardiológico completo, serología para la en-fermedad de Chagas, un electrocardiograma en re-poso, un ecocardiograma bidimensional, un estudiode perfusión miocárdica con Talio 201 en esfuerzo yreposo y un electrocardiograma Holter de 24 horas .En 5 pacientes con miocardiopatía dilatada idiopá-tica se realizó una cinecoronariografía para excluirla etiología isquémica por patología de las arteriascoronarias. Veintisiete pacientes (12 con arritmiasventriculares, 13 con disfunción sinusal y 2 con am-bas anormalidades) fueron sometidos a un estudioelectrofisiológico .

Los diagnósticos de miocardiopatía crónica cha-gásica y miocardiopatía dilatada idiopática se reali-zaron sobre la base de criterios publicados con ante-rioridad. (12,13) Se consideró que las arritmias eran"primarias" cuando se detectaron anormalidadescardíacas estructurales y las pruebas serológicas parala enfermedad de Chagas eran negativas .

Todos los pacientes con arritmias ventricularespresentaron más de 30 extrasístoles ventriculares porhora en el electrocardiograma de Holter de 24 ho-ras. En nuestra población con elevada densidad de

actividad ectópica ventricular (33 pacientes), el nú-mero de extrasístoles ventriculares (uniformes o mul-tiformes) varió de 866 a 18.615/24 horas . Veintiúnpacientes presentaron formas repetitivas (duplas en20 pacientes, 6 de los cuales también tuvieron episo-dios autolimitados de taquicardia ventricular, y sal-vas de taquicardia ventricular autolimitada en el res-tante) . Siete pacientes tuvieron uno o más episodiosde taquicardia ventricular sostenida antes de ser in-cluidos en el estudio, y en 5 de ellos la arritmia sepudo inducir por estimulación ventricular progra-mada durante el estudio electrofisiológico .

El diagnóstico de disfunción sinusal se realizó so-bre la base de criterios publicados con anterioridad .(14) Se consideró disfunción sinusal "pura" a la queno se acompañó de arritmias ventriculares (10 pa-cientes) o coexistió con un número no significativode extrasístoles ventriculares (menor de 1/hora, 3pacientes) durante el estudio electrocardiográficoHolter.

Procesamiento de los suerosUna vez completados los estudios clínicos, se ob-

tuvieron muestras de sangre y se separaron y codi-ficaron los sueros y las fracciones IgG para evaluarsus efectos cronotrópicos sobre un cultivo de cardio-miocitos de ratas neonatas con actividad automáti-ca espontánea, método que sirvió para el doble pro-pósito de detectar los anticuerpos antirreceptoresautonómicos y estudiar sus efectos funcionales . En10 pacientes seleccionados se inmunopurificaronanticuerpos antirreceptor (3 1-adrenérgico o M2 coli-nérgico para estudiar sus efectos cronotrópicos so-bre la misma preparación in vitro y corroborar losresultados obtenidos con las fracciones IgG corres-pondientes . El efecto bioquímico de las fraccionesIgG de 9 pacientes con arritmias ventriculares, de 6con disfunción sinusal, de 2 con arritmias ventricu-

Grupo N° de pacientes Edad Sexo Tipo de arritmia Diagnóstico

I 28 46,2 (31-68) F : 18 Extrasistolia ventricular frecuente Arritmia ventricular primaria : 14 p(AV) M: 10 Miocardiopatía crónica chagásica : 9 p

Miocardiopatía dilatada idiopática : 5 p

II 13 45,4 (22-68) F : 9 Disfunción del nódulo sinusal Disfunción del nódulo sinusal primaria : 4 p(DNS) M: 4 Miocardiopatía chagásica crónica : 9 p

III 5 48,2 (22-60) F : 1 Extrasistolia ventricular frecuente Arritmia ventricular y disfunción del nódulo(AV y M: 4 y disfunción del nódulo sinusal sinusal primaria : 1 pDNS) Miocardiopatía crónica chagásica : 4 p

IV 10 45,5 (30-65) F: 5 Ninguna Individuos sanos(CS) M: 5

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lares y disfunción sinusal y de 3 controles normalesse estudió con células COS7 transfectadas conplásmidos que contenían los genes que codificanpara los receptores R1 y (3 2-adrenérgicos y M2 coli-nérgico .

Fraccionamiento de las inmunoglobulinas GLos sueros se diluyeron al 1 :5 en cloruro de sodio

150 mM y fosfato de sodio 10 mM a un pH de 7,4(PBS) y las fracciones IgG se separaron por precipi-tación en (NH4 )2S04 a saturación. El precipitado sedisolvió en PBS en una dilución 1 :1 . Se realizó uninmunoensayo enzimático con anticuerpos de conejoanticadena µ humana biotinilados para demostrarque los niveles de contaminación con la fracción IgMeran menores del 10% . A continuación, las fraccio-nes IgG se dializaron por lo menos durante 36 horascontra PBS.

Inmunopurificación de los anticuerposantirreceptores autonómicos

Los anticuerpos monoespecíficos contra los recep-tores M 2 y 01adrenérgico se inmunopurificaron utili-zando péptidos sintéticos con la misma secuencia deaminoácidos que el segundo bucle extracelular de losreceptores humanos correspondientes :M2 : VRTVEDGECYIQFFSNAVVTFGTAI;(3 1 : HWWRAESDEARRCYNDPKCCDFVTNR. Lospéptidos M2 o (3 1 se acoplaron a sefarosa-CNBr (Phar-macia Diagnostics AB, Uppsala, Suecia). La fracciónIgG se incubó durante toda la noche a 4°C con 300i g de los péptidos M 2 o (3 1 acoplados a la sefarosa .Antes de lavar la columna repetidas veces con PBS,se recuperó la fracción de anticuerpos no retenida(flow through-IgG fraction) . La elución de los anticuer-pos antirreceptor R 1 -adrenérgico se realizó en untampón de glicina 0,2 M a un pH de 2,8 y se neutra-lizó con tampón TRIS 1M a un pH de 8,0 . Los anti-cuerpos antirreceptor M2 colinérgico se eluyeron contiocianato de potasio 3M y se dializaron de inme-diato contra PBS . A continuación se realizó un ensa-yo de Bradford, para evaluar la concentración pro-teica, y un inmunoensayo enzimático (14) contra lospéptidos utilizados para purificar los anticuerpos,con todas las fracciones .

Detección de los anticuerpos antirreceptoresautonómicos y evaluación de sus efectosfuncionales

Los efectos cronotrópicos de las fracciones IgG yde los anticuerpos inmunopurificados se evaluaronen cultivos de cardiomiocitos de ratas neonatas conactividad autonómica espontánea . Las células se ob-tuvieron de corazón de ratas Wistar de 1 a 4 días deedad por disgregación con una solución de tripsina-colagenasa. Los cardiomiocitos se cultivaron como

monocapas durante 4 días a 37°C con una atmósferaque contenía 5% de CO2 en un medio Eagle Dulbeccomodificado-F12 (DMEM/F-12, Life Technologies,Gaitherburg, MD, USA) con 5% de suero fetal bovi-no. La frecuencia de latidos de los cardiomiocitos encondiciones basales (medida en 10 campos diferentesa 37°C en la platina termostatizada de un microscopioinvertido) fue de 120 ± 24/minuto . Las mediciones serepitieron una hora después de la exposición de loscardiomiocitos a las fracciones IgG (dilución 1 :50) conel agregado ulterior de atropina (10 -7M) y de propra-nolol (10-7M) . Por último, se estimularon los cardio-miocitos con el agonista betaadrenérgico isoprotere-nol (10 -5M) . Todas las pruebas funcionales se realiza-ron sin que el operador tuviera conocimiento deldiagnóstico clínico, y se repitieron como mínimo entres oportunidades para determinar la reproducibili-dad de los resultados .

Se consideró que las pruebas funcionales indica-ban la presencia de anticuerpos antirreceptores (3-adrenérgicos cuando la fracción IgG indujo un in-cremento estadísticamente significativo de la fre-cuencia de latidos de los cardiomiocitos (en compa-ración con las fracciones IgG del grupo control) quefue neutralizado por el propranolol .

Se consideró que los anticuerpos antirreceptor M2colinérgico estaban presentes cuando la fracción IgGprodujo una disminución estadísticamente signifi-cativa de la frecuencia de latidos de los cardiomioci-tos (en comparación con las fracciones IgG del gru-po control) que fue antagonizada por la atropina .

La fracción IgG de un paciente puede contenertanto anticuerpos antirreceptor M 2 colinérgico comoantirreceptores (3-adrenérgicos, cuyos efectos crono-trópicos pueden neutralizarse mutuamente . Por lotanto, un aumento significativo del cronotropismode los cardiomiocitos después del agregado de atro-pina, a su vez antagonizado por el propranolol, seinterpretó que era indicativo de la presencia de am-bos tipos de anticuerpos antirreceptores autonómi-cos, aun cuando la fracción IgG no hubiese modifi-cado la actividad cronotrópica de los cardiomioci-tos antes de la exposición a los bloqueadores auto-nómicos .

Estudio de los efectos bioquímicos de losanticuerpos antirreceptores autonómicos

En la Figura 1 se esquematiza la secuencia de losprocedimientos de inclusión del ADNc en losvectores, transfección, expresión y medición de laproducción de adenosinmonofosfato cíclico (AMPc)o de fosfatidilinositol (PI) luego del agente inductor .

Vectores de expresión . Se utilizaron diferentesvectores de expresión de acuerdo con el receptorautonómico cuya estimulación por los anticuerposfuese explorada: 1) los vectores de expresión pBC,


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entocon : Agonista

o lgG

que contenía el ADNc que codifica para el receptor3 1-adrenérgico humano, y pSVL, con el ADNc quecodifica para el receptor (32adrenérgico de rata (pro-vistos por el Dr. Jurgen, National Institute of Health,Maryland, Estados Unidos) y 2) los vectores de ex-presión pCEFL, que contenían el ADNc del receptorM1 colinérgico, OB, con el gen del receptor M 2 coli-nérgico, y pcDNA1, con el gen de la proteína Gi/q(quimera de las proteínas Gq y Gi) (donados por elDr. Gutkind, National Institute of Health, Maryland,Estados Unidos). (15) Como control de transfecciónse utilizó el plásmido de expresión pCMV con el gende la R galactosidasa. (16) Los plásmidos se amplifi-caron en cultivo de Escherichia col¡ XL1 Blue(Stratagene) y se purificaron en columnas de croma-tografía Quiagen Maxiprep Kits, antes de ser utiliza-dos para transfectar las células COS7 . (17)

Cultivo de células COS7 y transfección . Las cé-lulas COS7 (18,19) se cultivaron en medio de culti-vo Eagle Dulbecco modificado (D-MEM), con 10%(v/v) de suero fetal bovino (D-MEM/FCS), 100 uni-dades/ml de penicilina y 100 .tg/ml de estreptomi-cina. Veinticuatro horas antes de la transfección, lascélulas se colocaron en placas de cultivo de 60 mmpara obtener una densidad de 1 x 10 6 células/placa .El día de la transfección se aspiró el medio y se loreemplazó por 4 ml de medio que contenía 100 µMde cloroquina, 250 µg/ml de DEAE-dextrano y 1 µgdel plásmido de expresión seleccionado . Se incubódurante 2 horas a 37°C, luego se aspiró y se agregóun tampón fosfato (PBS) al 10% (v/v) con dimetilsulfóxido. Las células se lavaron de inmediato conPBS y se incubaron durante 48 horas en 4 ml de me-dio completo D-MEM/FCS. Doce horas antes de ladeterminación de la concentración de AMPc o de PIse cambió el medio por otro sin suero . Cuando se

~Determinación dela producción deAMPc o de

Fosfatidil Inositol

Fig . 1 . Esquema de la transfección de lascélulas COS7 con los ADNc que codificanpara los receptores autonómicos cardíacos .El ADNc de los receptores autonómicos yde la proteína G i/q es incorporado a unplásmido con el cual son transfectadas lascélulas. Durante un período de 48 horas,los receptores son sintetizados por las cé-lulas y se expresan a nivel de la membra-na celular. Los transfectantes ricos en unreceptor determinado se emplean paraevaluar los efectos de agonistas o de la IgGsobre la producción de AMPc o de PIL

transfectó con el plásmido control pCMV, la activi-dad de la [3 galactosidasa se midió por una reaccióncolorimétrica . La eficiencia de la transfección fue del75% .

Determinación de la concentración intracelularde AMPc. La determinación de la concentración in-tracelular de AMPc (20) se realizó en células COS7transfectadas con los genes que codifican para losreceptores (3 1 y (32-Zadrenérgicos y que presentaron unporcentaje de confluencia del 90% . Doce horas antesde la determinación, se hambrearon las células in-cubándolas en medio sin suero y lavándolas dosveces con PBS para incubarlas luego en 2 m1 de PBSsuplementado con inhibidor de la fosfodiesterasa delAMPc, 10 µM. La expresión correcta de los recepto-res (3 1 y (32-adrenérgicos y el acoplamiento al sistemade transducción de señales se evaluó por el aumen-to en la producción de AMPc en las células transfec-tadas con esos receptores, en respuesta a la estimu-lación con concentraciones crecientes de isoprotere-nol y comparándolo con el obtenido en células trans-fectadas con el gen de la R galactosidasa (Figura 2) .Para construir las curvas del efecto de las fraccionesIgG en función del tiempo, los cultivos se incubarondurante 5, 30 y 60 minutos a una concentración finalde 1 :50. Cuando se realizaron curvas del efecto delas IgG en función de la concentración, se utilizarondiluciones al 1 :100, 1 :50 y 1 :25. Se tomaron alícuotasde 500 µl, que fueron liofilizadas y luego diluidasen 100 µl de tampón tris-EDTA. Se determinó la con-centración de AMPc utilizando un kit comercialmarcado con tritio [3H]cAMP (Diagnostic ProductsCorporation) basado sobre el principio de compe-tencia con una proteína que reconoce y se une alAMPc, manteniendo esta proteína y el [ 3H]cAMPconstantes y agregando cantidades crecientes de

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0 25M

20u

d15

i

1o °

lo'

1o'

Concentración de isoproterenai

Fig . 2 . Efecto de concentraciones crecientes de isoproterenol so-bre la producción de AMPc en células COS7 transfectadas conlos genes de la (3 galactosidasa (p Gal) y de los receptores t'1 y P2adrenérgicos. El isoproterenol activa la producción de AMPc enlas células transfectadas con los genes de los receptores G3-adre-nérgicos pero no en las células transfectadas con el gen de la (3Gal (control negativo) . El aumento en la producción de AMPc esproporcional a la concentración molar de isoproterenol y los ni-veles alcanzados dependen de la densidad de los receptores au-tonómicos expresados en las células transfectadas .

AMPc sin marcar. Con los valores obtenidos se cons-truyó una curva de calibración a partir de la cual laproducción de AMPc para determinar en las mues-tras (AMPc marcado) se expresó en pico M/tubo .

Determinación de la producción de fosfatidili-nositol . La transducción de señales del receptor M 2colinérgico (17, 18) se hace, primordialmente, a tra-vés de la subunidad a inhibitoria (ai) de la proteínaG, que actúa sobre la adenilatociclasa para produciruna disminución del AMPc, y de la activación delos canales de potasio . Sin embargo, la disminucióndel AMPc es difícil de cuantificar, ya que primero sedebería activar el sistema de la adenilatociclasa conun agonista betaadrenérgico y luego inhibirlo conun agonista colinérgico o, para los propósitos denuestro estudio, con las fracciones IgG que conten-gan anticuerpos antirreceptor M 2 colinérgico. Peropara ello se deben tener en cuenta no sólo las con-centraciones de ambos agonistas, sino también laduración del efecto de cada uno y la posible desen-sibilización de los receptores inducida por ellos, fac-tores que afectan la confiabilidad de las mediciones .La transducción de señales del receptor M 1 colinér-gico se hace principalmente a través de la subunidadaq de la proteína G, que activa a la fosfolipasa C,con lo cual se incrementa la producción dediacilglicerol y de PI como segundos mensajeros .Decidimos utilizar una quimera de las subunidadescei y aq de la proteína G, que contiene la porciónaminoterminal de la subunidad al (que es activadapor el receptor M 2) y los últimos cinco aminoácidosde la subunidad aq (que son los que interactúan conel efector) . Con el empleo de células COS7 cotrans-fectadas con el gen correspondiente al receptor M 2colinérgico y la proteína G quimera i/q, es posibleactivar el receptor M 2 colinérgico y medir el aumen-

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M1

M2

Mr2+Gdq

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Fig . 3 . Efecto del agonista colinérgico carbachol sobre la produc-ción de PI en células COS7 transfectadas con el ADNc de losreceptores M1 yM2 colinérgicos y cotransfectadas con el ADNcdel receptor M 2 colinérgico y de la proteína Gi/q. El agonistacolinérgico aumenta la producción de PI en las células transfec-tadas con el gen del receptor M 1 colinérgico, pero no en aquellasque contienen el gen del receptor M2 colinérgico o el de la 13 Gal(control negativo) . Sin embargo, en las células cotransfectadascon los genes del receptor M 2 colinérgico y de la proteína Gi/q,el carbachol estimula la producción de PI en forma ostensible .

lo de PI. Para evaluar el acoplamiento correcto delsistema, las células cotransfectadas se incubaron concarbachol (agonista de los receptores colinérgicos)100 µM , se midió el aumento de PI y se comparócon el obtenido con el mismo agonista en célulastransfectadas sólo con el receptor M 1 colinérgico(control positivo) y con el gen de la (3 galactosidasa(control negativo) (Figura 3) .

Cultivos subconfluentes de células COS7 trans-fectadas con el ADNc del receptor M1 (control posi-tivo) o cotransfectadas con el ADNc del gen del re-ceptor M2 y la proteína Gi/q se incubaron hasta elequilibrio (24 horas) en medio con 2 ptCi/ml demyo[3H] inositol (20 Ci/rnmol, American Radiolabe-led Chemical Inc). Las células se lavaron dos vecescon PBS y luego se incubaron por 20 minutos enmedio D-MEM sin suero con LiCl 10 mM . Luego seagregó carbachol o la fracción IgG de un control ode un paciente (concentración final 1 :50) y se incubópor una hora a 37°C . Finalmente, el medio se aspiróy se detuvo la reacción con 0,5 ml de NaOH 0,1 M yse incubó nuevamente a 37°C por una hora . Estasolución alcalina se neutralizó con 0,25 ml de ácidofórmico 0,2 M . La fracción de PI se aisló por croma-tografía de intercambio fónico y se cuantificó en uncontador de centelleo líquido .

El protocolo del estudio fue aprobado por el Co-mité de Docencia e Investigación del Hospital Ge-neral de Agudos J . M. Ramos Mejía. Los pacientesfueron informados acerca de las características delestudio y prestaron su conformidad por escrito .

Análisis estadísticoPara establecer la significación estadística de los

cambios en la frecuencia de latidos de los cardio-miocitos inducidos por las diferentes intervenciones


405

se utilizaron pruebas ANOVA y de Tukey, y paracomparar los resultados entre los grupos, la pruebaMANOVA (Software Statistica 5 .1/97) .

Los efectos de las fracciones IgG sobre la produc-ción de AMPc en las células transfectadas con losgenes de los receptores (3 1 y (32adrenérgicos se eva-luaron mediante pruebas no paramétricas (Kruskal-Wallis y Dunns). Para el análisis de los cambios enla producción de PI en las células cotransfectadascon los genes del receptor M2 colinérgico y la proteí-na Gi/q se empleó la prueba de Mann-Whitney ranksum . Se consideraron significativas las diferenciascon un nivel de probabilidad p < 0,05 .

RESULTADOS

La prevalencia de anticuerpos antirreceptoresautonómicos en relación con las arritmiascardíacas

En la Figura 4 se muestra el efecto cronotrópicode las fracciones IgG de los 46 pacientes y de los 10controles sanos en los cultivos de cardiomiocitos deratas neonatas. Las fracciones IgG de los controlessanos no indujeron cambios ostensibles . En marca-do contraste, las fracciones IgG de los pacientes conarritmias ventriculares incrementaron de maneranotable la frecuencia de latidos y las de los pacien-tes con disfunción sinusal desarrollaron una accióndepresora pronunciada del cronotropismo. El pro-medio de la frecuencia de latidos de los cardiomio-citos expuestos a las fracciones IgG de los pacientescon arritmias ventriculares y disfunción sinusal fuesimilar al que se obtuvo con las fracciones IgG delos voluntarios sanos . No obstante, la dispersión delos valores fue mucho mayor en este grupo que enlos restantes, hecho que se podría atribuir a la pre-sencia de anticuerpos con acción depresora o esti-mulante de la actividad cronotrópica de los cardio-miocitos, respectivamente (véase más adelante), yal número reducido de pacientes que presentabanambos tipos de anormalidades eléctricas .

En la Figura 5 se muestra la prevalencia de anti-cuerpos antirreceptores (3-adrenérgicos y M 2 colinér-gico en los cuatro grupos, de acuerdo con los efectoscronotrópicos de las fracciones IgG antes de la ex-posición a la atropina y al propranolol y despuésde ella. En los voluntarios sanos no se detectaronanticuerpos antirreceptores autonómicos. Los pa-cientes con arritmias ventriculares presentaron unaprevalencia elevada de anticuerpos antirreceptores(3-adrenérgicos (75% ; p < 0,001 en comparación conlos grupos II y IV) y relativamente baja de anticuer-pos antirreceptor M 2 colinérgico (10,7% ; p < 0,05 encomparación con el grupo IV) . En marcado contras-te, los pacientes con disfunción sinusal presentaronuna prevalencia elevada de anticuerpos antirrecep-

220

200

120W

•

•100

w 80

60

40

o

I

o

Io

o

AV

DNS

AVIDNS Cs

Fig. 4 . Efectos cronotrópicos de las fracciones IgG sobre los car-diomiocitos de ratas neonatas . Los cuadrados pequeños repre-sentan el promedio de la frecuencia de latidos y los rectángulosgrandes, el error estándar. AV: Arritmias ventriculares. DNS : Dis-función del nódulo sinusal. AV/DNS : Arritmias ventriculares ydisfunción sinusal . CS : Controles sanos. La línea horizontal alnivel de 122 latidos/minuto corresponde al promedio de la fre-cuencia basal de los cardiomiocitos . Para su descripción, véaseel texto .

tor M2 colinérgico (76,9% ; p < 0,001 en comparacióncon los grupos I y IV) y una prevalencia baja de an-ticuerpos antirreceptores (3-adrenérgicos (15,4% ; p< 0,10 en comparación con el grupo IV) . Por lo tan-to, la prevalencia de los anticuerpos antirreceptores(3-adrenérgicos en los pacientes con arritmias ven-triculares y de los anticuerpos antirreceptor M2 coli-nérgico en los pacientes con disfunción sinusal fueclaramente mayor que en los controles sanos . Ade-

•

140

Fig . 5 . Prevalencia de anticuerpos antirreceptores (3-adrenérgi-cos y M2 colinérgico en los cuatro grupos, evaluados por los efec-tos de las fracciones IgG sobre el cronotropismo de los cardio-miocitos de ratas neonatas, antes del agregado de atropina ypropranolol y después de él . Las barras representan los porcen-tajes de las fracciones IgG que contenían anticuerpos antirrecep-tores (3-adrenérgicos (en azul) o M 2 colinérgico (en púrpura) . acsanti-RM2: Anticuerpos antirreceptor M2 colinérgico. acs anti-R(3 :Anticuerpos antirreceptor betaadrenérgico . Para el resto de lasabreviaturas, véase la Figura 4 . Véase el texto para su descrip-ción detallada.

406

Fig. 6 . Correlación entre los hallazgos electrocardiográficos (arriba) y los efectos cronotrópicos in vitro de las fracciones 1gG (abajo) de unpaciente con disfunción sinusal primaria "pura" (A) y de otro paciente con miocardiopatía crónica chagásica, arritmias ventriculares yfunción sinusal normal (B) . En A se muestra un registro simultáneo de las derivaciones I, II, III y IV y los electrogramas de la aurículaderecha alta (ADA) y del haz de His (EHH). En B se muestran tres derivaciones simultáneas de un registro ECG Holter (Cl, C2, C3) . Lasbarras representan la frecuencia de latidos de los cardiomiocitos . Atrop : Atropina . Prop : Propranolol . Para su descripción, véase el texto .

más, la prevalencia de los anticuerpos antirrecepto-res (3-adrenérgicos fue mucho mayor en los pacien-tes con arritmias ventriculares que en los que pre-sentaban disfunción sinusal y la situación inversase observó en relación con los anticuerpos antirre-ceptores M2 colinérgicos. Por otra parte, en los pa-cientes con arritmias ventriculares y disfunción sin-usal, la prevalencia de anticuerpos antirreceptor M 2colinérgico (80%) fue similar a la hallada en los pa-cientes con disfunción sinusal (76,9%), mientras quela prevalencia de los anticuerpos antirreceptores ¡3-adrenérgicos (40%) fue intermedia entre los valoresencontrados en los pacientes con arritmias ventri-culares (75% ; p S 0,10, ns) o con disfunción sinusalpura" (15,4% ; p<_ 0,30, ns) .En la Figura 6 se correlacionan los hallazgos elec-

trocardiográficos con los efectos cronotrópicos in vi-tro de las fracciones IgG de dos pacientes : uno conuna disfunción sinusal idiopática "pura" (A) y el otrocon extrasístoles ventriculares frecuentes y repetiti-vas de etiología chagásica y función sinusal normal(B) . En el paciente con disfunción sinusal (Figura 6A),la bradicardia sinusal se corrigió con la administra-ción endovenosa de atropina . El efecto cronotrópicode la fracción IgG de ese paciente sobre el cultivo decardiomiocitos antes del agregado de atropina y des-pués de él fue concordante con los hallazgos clíni-

11

A

BI

IV

ADAI

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I

Basal 44 lat/min.

+ Atropina 0 .04 mg.-kg.100lat / min .


IV

ADA

E`!! t, H't M 001'N

B

cos. La lentificación pronunciada de la frecuencia delatidos de los cardiomiocitos inducida por la fracciónIgG fue neutralizada por completo por la atropina,hecho que indica la presencia de anticuerpos circu-lares antirreceptor M 2 colinérgico .

En la parte superior de la Figura 6B, una tira se-leccionada de un registro electrocardiográfico deHolter muestra las características de la ectopia ven-tricular. La fracción IgG de este paciente tuvo un efec-to cronotrópico positivo marcado sobre el cultivo decardiomiocitos, que fue abolido por el propranolol,evidencia de la presencia de anticuerpos circulantesantirreceptores (3-adrenérgicos .

El análisis individual de los efectos de las frac-ciones IgG reveló un espectro amplio de cambioscronotrópicos, tanto cuantitativos como cualita-tivos, atribuibles a una contribución variable de losanticuerpos antirreceptores (3-adrenérgicos y M 2 co-linérgico, en cada caso particular (véase más ade-lante) .

Es de destacar que los efectos cronotrópicos delas fracciones IgG de 9 pacientes con anticuerposantirreceptores (3-adrenérgicos y de 2 pacientes conanticuerpos antirreceptor M 2 colinérgico fueron su-primidos en forma parcial por los bloqueantes delos receptores correspondientes . Este hecho no sepuede atribuir a una concentración insuficiente del


407

bloqueador del receptor autonómico en el medioporque concentraciones de atropina y propranololmayores de 1 tM produjeron un efecto tóxico sobrelos cardiomiocitos, con ausencia total de actividadcronotrópica o aparición de un ritmo lento e irregu-lar. Por lo tanto, la persistencia de un efecto crono-trópico leve o moderado, pero significativo, despuésdel agregado de atropina o propranolol sugeriría lapresencia de anticuerpos que podrían actuar sobreotros receptores de la membrana y/o sobre canalesiónicos que influyen sobre el cronotropismo de loscardiomiocitos .

El efecto cronotrópico de los anticuerposinmunopurificados

Los resultados que se obtuvieron del análisis delos efectos de las fracciones IgG y de sus modifica-ciones luego de la exposición a la atropina y elpropranolol indican, de manera indirecta, la presen-cia de anticuerpos que estimulan específicamente alos receptores M 2 colinérgicos y/o (3-adrenérgicos .Para obtener una evidencia más directa y validarestos hallazgos, se inmunopurificaron anticuerposantirreceptores (3 1-adrenérgico o M2 colinérgico delas fracciones IgG de 10 casos seleccionados y losefectos cronotrópicos de esos anticuerpos y de la frac-ciónflow through IgG se evaluaron en el mismo sis-tema in vitro .

En la totalidad de los casos, los resultados que seobtuvieron en los cultivos de cardiomiocitos con losanticuerpos inmunopurificados fueron concordan-tes con los que se hallaron cuando se emplearon lasfracciones IgG del suero . En la Figura 7 se muestrael efecto cronotrópico de la fracción IgG de un pa-ciente con miocardiopatía crónica chagásica, arrit-mias ventriculares y disfunción sinusal en compa-ración con el de los anticuerpos antirreceptor M2

Fig . 7 . Efecto cronotrópico de la fracción IgG, de los anticuerposantirreceptor M 2 colinérgico inmunopurificados (anti-RM 2 ) y dela fracción flow-through-IgG (FT) de un paciente chagásico conarritmias ventriculares y disfunción sinusal, antes del agregadode atropina y propranolol y después de él . Acs : Anticuerpos .Véase el texto para su descripción detallada .

colinérgico inmunopurificados y la fracción flowthrough IgG (obtenidos de la fracción IgG del mismopaciente), antes del agregado de atropina y pro-pranolol y después de él. La fracción IgG no modifi-có la frecuencia de latidos de los cardiomiocitos . Sinembargo, el agregado de atropina develó un efectocronotrópico positivo muy marcado que fue aboli-do por el propranolol . Estos hallazgos indican lacoexistencia de anticuerpos antirreceptor M 2 colinér-gico y antirreceptores (3-adrenérgicos . Los anticuer-pos antirreceptor M 2 colinérgico inmunopurificadosde esa fracción IgG desarrollaron una accióncronotrópica negativa intensa, que fue antagoniza-da por la atropina, mientras que la fracción flowthrough IgG (que contenía anticuerpos antirrecepto-res (3-adrenérgicos) tuvo un efecto cronotrópico po-sitivo que fue suprimido por el propranolol . Deesta manera, se confirmó que la fracción IgG de esepaciente tenía, en efecto, ambos tipos de anticuer-pos antirreceptores autonómicos, cuyos efectoscronotrópicos se neutralizaban .

Los efectos bioquímicos de los anticuerposantirreceptores autonómicos . Modificación dela producción de segundos mensajeros

Los resultados de los efectos bioquímicos de lasfracciones IgG de 9 pacientes del grupo I (que con-tenían anticuerpos antirreceptores (3-adrenérgicos),de 6 pacientes del grupo II (con anticuerpos antirre-ceptor M2 colinérgico) y 2 pacientes del grupo III(una con ambos tipos de anticuerpos y otra con an-ticuerpos antirreceptores (3-adrenérgicos) en compa-ración con los de las fracciones IgG de 3 controlessanos se resumen en la Figura 8 . Las fracciones IgGde estos últimos no modificaron la producción delos segundos mensajeros . Las fracciones IgG de lospacientes con arritmias ventriculares incrementaronen forma ostensible la producción de AMPc en las

[I (.31• 132•

M2+Gilq

Fig . 8 . Efectos bioquímicos de las IgG de pacientes con arritmiaventricular (AV), disfunción sinusal (DNS) y ambas anormalida-des (AV/DNS) . El aumento en la producción de AMPc o PI seexpresa en veces con respecto al promedio de los controles sanos .(3 1 : Transfectantes R1 . (32: Transfectantes 132. M 2+Gi/q: Cotransfec-tantes M2 + proteína C quimera . Para los transfectantes (3 l Y 02 semidió la producción de AMPc ; para los cotransfectantes M2+Gi/q, la concentración de PI. Véase la descripción en el texto .

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REVISTA ARGENTINA DE CARDIOLOGIA, MAYO-JUNIO 2000, VOL. 68, N° 3

i It'.cta t

Transfectantes ~31

) s1ectailtes

Fig . 9 . Efectos del isoproterenol (Iso) y de las fracciones IgG de 2 pacientes con arritmias ventriculares y anticuerpos antirreceptores(3-adrenérgicos (IgG I e IgG 2) y de un paciente con disfunción sinusal y anticuerpos antirreceptor M 2 colinérgico (IgG3) sobre la produc-ción de AMPc en células COS7 transfectadas con los genes de los receptores P, (izquierda) y a2adrenérgicos (derecha) . C : Fracción IgG deun control sano . La IgG1 aumenta más la producción de AMPc en las células transfectadas con el gen del receptor

N1 -adrenérgico que enlas que contienen el gen del receptor 43 2adrenérgico y lo opuesto ocurre con la IgG 2. En cambio, la IgG3 no modifica la producción deAMPc. En la parte inferior de la figura se observan los efectos cronotrópicos de las mismas fracciones IgG antes del agregado de atropina,bisoprolol (bloqueante (-adrenérgico selectivo) e ICI 118 .551 (bloqueante (32- Zadrenérgico selectivo) y después de él .

células transfectadas con los receptores (3, (2,8 ± 1,1 la concentración de PI. En marcado contraste, las frac-veces versus 0,25 ± 0,36 veces en el grupo II ; p < 0,001) ciones IgG de los pacientes con disfunción sinusalo RZadrenérgicos (7,4 ± 5,4 veces versus 0,55 ± 0,26 sólo indujeron un aumento del PI en cotransfectan-veces en el grupo II; p < 0,001), pero no modificaron

tes receptor N12 colinérgico/proteína G i/q (5,8 ± 4,5

Transfectantes P2

Fig . 10 . Estimulación de la producción de AMPc en células COS7 transfectadas con los genes de los receptores Nl y (3 Zadrenérgicos,inducida por isoproterenol y por las fracciones IgG de 3 pacientes con efecto cronotrópico positivo (IgG,, IgG 2,IgG3) sobre los cardiomio-citos de ratas neonatas, en comparación con la fracción IgG de un control sano (CS) . El isoproterenol provoca un aumento rápido peroefímero de la producción de AMPc (debido al fenómeno de desensibilización rápida de los receptores) . Las IgG, en cambio, desarrollanuna acción estimulante más gradual pero sostenida (ausencia de desensibilización) .


veces versus 0,13 ± 0,12 en el grupo I ; p < 0,05). Porúltimo, en los 2 pacientes con arritmias ventricularesy disfunción sinusal sólo se observó aumento delAMPc. Estos hallazgos indican que los anticuerposantirreceptores (3 1 y (3Zadrenérgicos estimulan el re-ceptor correspondiente e interactúan con la proteínaGs , lo que induce un aumento en la producción deAMPc e, indirectamente, que los anticuerpos antirre-ceptor M2 colinérgico interactúan con la proteína Gipara disminuir la producción de AMPc . Ello explicalos efectos de ambos anticuerpos sobre el cronotro-pismo de los cardiomiocitos .

En la Figura 9 se muestra el efecto de las fraccio-nes IgG de 2 pacientes con arritmia ventricular yanticuerpos antirreceptores (3-adrenérgicos (IgG1 eIgG2) y de un paciente con disfunción sinusal y anti-cuerpos antirreceptor M 2 colinérgico sobre la pro-ducción de AMPc en células COS7 transfectadas conlos genes de los receptores rl y (32adrenérgicos. LaIgG 1 , que contenía una proporción mayor de anti-cuerpos antirreceptor (3 1-adrenérgico que de anti-cuerpos antirreceptor (3Zadrenérgico, estimuló mu-cho más la producción de AMPc en las células COS7transfectadas con el gen del receptor (3iadrenérgi-co. En cambio, la IgG2 , con una proporción mayorde anticuerpos antirreceptor P2adrenérgico, indujoun incremento más marcado de la producción deAMPc en las células COS7 transfectadas con el gendel receptor f 2 adrenérgico. La IgG3 , por su parte, aligual que la IgG de un control sano, no modificó laconcentración de AMPc. La estimulación de los re-ceptores (3-adrenérgicos que producen los anticuer-pos, evaluada a través del incremento en la produc-ción de AMPc, es persistente, al contrario de lo queocurre con el isoproterenol (Figura 10) . Ello indicaque los anticuerpos no inducen el fenómeno de des-ensibilización rápida de los receptores, que es carac-terístico de los agonistas, hecho que contribuiría apotenciar sus efectos funcionales y miocardiopáti-cos (véase más adelante) .

En la Figura 11 se ilustran los efectos cronotrópicosy bioquímicos (sobre la producción de PI en célulasCOS7 transfectadas con los genes del receptor M 2colinérgico y de la proteína G i/q) de las fraccionesIgG de 2 pacientes con disfunción sinusal (IgG I eIgG2 ) y de uno con arritmia ventricular (IgG 3 ) . LaIgG 1 contenía sólo anticuerpos antirreceptor M2 co-linérgico, la IgG2 contenía anticuerpos antirrecepto-res M2 colinérgico y (3-adrenérgicos y la IgG 3 , sóloanticuerpos antirreceptores (3-adrenérgicos . La IgG 1y la IgG2, al igual que el agonista colinérgicocarbachol, estimularon en forma marcada la produc-ción de PI. La IgG3, en cambio, careció de efecto so-bre la concentración de este segundo mensajero . Es-tos cambios indican, de manera indirecta, que la IgG 1y la IgG 2 estimularon al receptor M2 colinérgico, he-

Transfectantes M2 + G i/q

IgG I

Carb

Efecto Funcional

IgG2

• IgG o Acs• +atropina•

+propranotot

IgG3

409

Fig . 11 . Efectos cronotrópicos (izquierda) y sobre la producciónde PI en células cotransfectadas con los genes del receptor M 2colinérgico y de la proteína Gi/q (derecha) de las fracciones IgGde 2 pacientes con disfunción sinusal y anticuerpos antirrecep-tor M 2 colinérgico (IgG I e IgG2 ) y de un paciente con arritmiaventricular y anticuerpos antirreceptores (3-adrenérgicos (IgG 3) .La IgG I y la IgG 2 redujeron en forma muy acentuada la frecuen-cia de latidos de los cardiomiocitos, efecto que fue antagonizadopor la atropina; la IgG3 tuvo un efecto cronotrópico positivo, quefue neutralizado por el propranolol . Las fracciones IgG I e IgG2 ,al igual que el agonista colinérgico carbachol (Carb), indujeronun aumento importante en la producción de PI ; la fracción IgG 3,en cambio, careció de efectos sobre la producción del segundomensajero . C : Fracción IgG de un control sano .

cho que se debería traducir en una disminución enla producción de AMPc .

DISCUSIONNuestros resultados muestran una correlación

estrecha entre la presencia de anticuerpos circulan-tes antirreceptores (3-adrenérgicos y las arritmiasventriculares que ocurren en el contexto de las mio-cardiopatías dilatada idiopática y crónica chagásicao en corazones sin anormalidades estructurales, asícomo entre la presencia de anticuerpos circulantesantirreceptor M2 colinérgico y la disfunción sinusal

410

primaria o de etiología chagásica. También es evi-dente que los anticuerpos antirreceptores (3-adrenér-gicos son poco frecuentes en los pacientes sin arrit-mias ventriculares y que otro tanto ocurre con losanticuerpos antirreceptor M 2 colinérgico en los pa-cientes con función sinusal normal . Por otra parte,los anticuerpos circulantes antirreceptor M2 colinér-gico son raros en los pacientes con arritmias ventri-culares "puras" (sin compromiso simultáneo de lafunción sinusal), mientras que los anticuerpos anti-rreceptores (3-adrenérgicos están presentes sólo porexcepción en los pacientes con disfunción sinusal"pura" (sin arritmias ventriculares concomitantes) .

Como se describió, las fracciones IgG de algunospacientes contienen tanto anticuerpos antirrecepto-res (3-adrenérgicos como antirreceptor M2 colinérgi-co, que estimulan los receptores correspondientes ycuyos efectos funcionales sobre las células miocár-dicas pueden neutralizarse mutuamente en propor-ciones variables . Cuando el efecto cronotrópico dela fracción IgG es neutro, se podría anticipar que losanticuerpos no deberían desarrollar ninguna acciónarritmogénica potencial, lo que invalidaría la rela-ción entre anticuerpos y arritmias, al menos en al-gunos pacientes. Sin embargo, es razonable postu-lar que el efecto funcional neto de las fracciones IgGcirculantes sobre el tejido miocárdico puede depen-der no sólo de la concentración relativa de cada tipode anticuerpo antirreceptor autonómico, sino tam-bién de la densidad relativa de receptores (3-adre-nérgicos y M 2 colinérgico presentes en diferentessectores del corazón. Así, las acciones funcionalesde los anticuerpos antirreceptor M2 colinérgico de-berían prevalecer en los nódulos sinusal y AV, queposeen una rica inervación colinérgica y una eleva-da densidad de receptores colinérgicos . De hecho,se ha establecido que la acción inhibitoria de la esti-mulación vagal sobre el nódulo sinusal predominasobre la estimulación simpática cuando ambos sis-temas son activados en forma simultánea. (21-23) Porel contrario, los efectos funcionales de los anticuer-pos antirreceptores (3-adrenérgicos deberían predo-minar en el ventrículo, donde prevalecen la inerva-ción y los receptores (3-adrenérgicos . (24) De acuer-do con este criterio, la presencia simultánea de am-bos tipos de anticuerpos antirreceptores autonómi-cos que ha sido demostrada en pacientes con mio-cardiopatía crónica chagásica (14) puede explicar lacoexistencia tan frecuente de disfunción sinusal yarritmias ventriculares complejas (dos de los hallaz-gos clínicos más comunes y llamativos de esta en-fermedad), al igual que el hecho de que la frecuen-cia cardíaca suele ser relativamente baja en los pa-cientes chagásicos con insuficiencia cardíaca . Es dedestacar que en un artículo reciente, Matsui y cola-boradores (25) mostraron que conejos inmunizados


en forma simultánea con los péptidos correspondien-tes al segundo bucle extracelular de los receptores31-adrenérgico y M 2 colinérgico desarrollan una mio-cardiopatía con hipertrofia ventricular izquierda,infiltrados inflamatorios de intensidad moderada yfibrosis intersticial leve a moderada .

Efectos bioquímicos, arritmogénicos ymiocardiopáticos de los anticuerposantirreceptores autonómicos

Las pruebas funcionales que se realizaron con lasfracciones IgG y los anticuerpos inmunopurificadosde nuestros pacientes indican que los anticuerposantirreceptores (3-adrenérgicos y M2 colinérgico esti-mulan los receptores correspondientes de la membra-na de las células miocárdicas . Nuestras determinacio-nes bioquímicas en células COS7 transfectadas conlos genes de los receptores 01 y (32adrenérgicos mos-traron que los anticuerpos que reconocen a esos re-ceptores inducen incrementos significativos de la con-centración de AMP cíclico, hallazgos que coincidencon los de una publicación reciente que empleó célu-las CHW. (26) Por otra parte, hemos mostrado que losanticuerpos que reconocen al receptor M 2 colinérgicoinducen un aumento en la producción de PI, lo queindica de manera indirecta su efecto sobre la proteínaGi. Ello concuerda con la disminución del AMP cícli-co en membranas del ventrículo de rata que observa-ron Fu y colaboradores. (27) Es importante enfatizarque la estimulación de los receptores autonómicospor los anticuerpos es menos intensa que la que pro-ducen los agonistas pero mucho más persistente,como quedó demostrado mediante el estudio de susefectos cronotrópicos que realizaron Magnusson y co-laboradores (28) y por la hiperproducción prolongadade segundos mensajeros descripta en nuestros resul-tados. Las acciones "adrenérgica" y "colinérgica" delos anticuerpos podrían desempeñar un papel de pri-mera magnitud en la fisiopatogenia de las arritmiasventriculares y de la disfunción sinusal, respectiva-mente, tal como lo hace la estimulación por los neuro-mediadores adrenérgicos y colinérgicos . Aun cuandono se han proporcionado pruebas directas de las pro-piedades arritmogénicas de los anticuerpos antirre-ceptores autonómicos, un artículo reciente de Faríasde Oliveira y colaboradores (5) mostró que la fracciónIgG de pacientes con miocardiopatía crónica chagási-ca induce bradicardia y bloqueo AV en un preparadode Langendorf de corazón de conejo. Además,Müeller y colaboradores (29) describieron que lasarritmias ventriculares más severas que ocurren enpacientes con miocardiopatía dilatada idiopática yanticuerpos circulantes antirreceptor (3 1-adrenérgicose pueden prevenir por inmunoadsorción, un proce-dimiento que elimina los anticuerpos de la circulaciónpor períodos prolongados .


4 1 1

Los anticuerpos antirreceptores autonómicos po-drían desempeñar un papel en la patogenia de lasarritmias cardíacas no sólo o simplemente por susefectos estimulantes sobre los receptores correspon-dientes y los cambios consiguientes en las propie-dades electrofisiológicas de los tejidos miocárdicos,sino provocando un daño estructural de las célulasmiocárdicas. Matsui y colaboradores (30) describie-ron que la inmunización crónica (durante un año)de conejos con los péptidos sintéticos R1 o M2 (con lamisma secuencia de aminoácidos del segundo bu-cle extracelular de los receptores correspondientes)induce una forma de miocardiopatía con dilataciónventricular (mucho más conspicua en el ventrículoderecho) y las características histológicas de unamiocarditis crónica . En ese mismo estudio, 2 de 8conejos inmunizados con el péptido R1 murieron enforma súbita, hecho que sugiere un mecanismo arrít-mico. Por otra parte, los efectos miocardiopáticos dela inmunización con los péptidos (31 y M2 se puedenprevenir con el tratamiento simultáneo con metro-prolol en el primer caso, o con otenzepad en el se-gundo (Fu M, comunicación personal) . En dos artí-culos recientes, se mostró que la inmunoadsorciónproduce una mejoría notable de la función ventricu-lar y de las dimensiones del ventrículo izquierdo enpacientes con miocardiopatía dilatada idiopática,insuficiencia cardíaca y anticuerpos circulantes an-tirreceptor R 1 -adrenérgico. (31, 32) El efecto benéfi-co de la inmunoadsorción persiste hasta que los an-ticuerpos reaparecen en la circulación .

La naturaleza del trastorno inmunológicoresponsable de la aparición de los anticuerposantirreceptores autonómicos

Evidencias experimentales incuestionables indi-can que, en condiciones apropiadas, los receptores(3-adrenérgicos y M2 colinérgicos pueden ser inmu-nogénicos. (30, 33) Sin embargo, los factores quedesencadenan la anormalidad inmunorregulatoriaque compromete a los receptores autonómicos en lascardiopatías se desconocen. Un estudio reciente deKaplan y colaboradores (34) arrojó luz sobre la na-turaleza de los anticuerpos que reconocen y estimu-lan los receptores autonómicos cardíacos en pacien-tes con miocardiopatía crónica chagásica . Los anti-cuerpos dirigidos contra una proteína ribosómica Pde Tripanosoma cruzi también reaccionan con el re-ceptor P1adrenérgico y lo estimulan. Este hecho seatribuyó a la presencia de una porción de residuosacídicos (EEEDDD) en el péptido R13 del parásito,que es homólogo a un epítope del segundo bucleextracelular del receptor (3 1-adrenérgico (AESDE) .Por lo tanto, los anticuerpos que reconocen y esti-mulan los receptores autonómicos de la membranade las células miocárdicas pueden estar, al menos

en parte, dirigidos contra antígenos de un agenteinfeccioso y ser independientes de una reacción au-toinmune que compromete a los receptores R-adre-nérgicos y M 2 colinérgico .

IMPLICACIONESLos resultados de nuestro estudio permiten en-

trever un nexo patogénico entre los anticuerpos an-tirreceptores autonómicos cardíacos y las arritmiasque ocurren en el contexto de cardiopatías en lascuales existen alteraciones de la inmunorregulación .Este nuevo concepto puede conducir al desarrollode investigaciones que mejoren nuestros conoci-mientos sobre la etiología y la fisiopatología de lasarritmias cardíacas, con eventuales derivaciones parasu tratamiento .

La arritmogenicidad de los anticuerpos aún sedebe demostrar en forma fehaciente a través de nue-vas investigaciones clínicas y experimentales . Laposible presencia de otros anticuerpos con efectosfuncionales sobre las células miocárdicas, sugeridaen este estudio, debería estimular investigacionestendientes a identificar su naturaleza molecular.

SUMMARY

PREVALENCE AND FUNCTIONAL ANDBIOCHEMICAL EFFECTS ON ANTI-AUTONOMIC CARDIAC RECEPTORANTIBODIES IN PATIENTS WITHVENTRICULAR ARRHYTHMIAS AND RENALFAILURE

BackgroundAnti-(3 adrenergic and anti-M2 cholinergic recep-tor antibodies have been demonstrated in variousheart diseases. The relationship between thearrhythmias occurring in those heart diseases andthe antibodies as well as the functional and bio-chemical effects of the antibodies have not beensystematically investigated .

ObjectivesTo assess the prevalence as well as the functionaland biochemical effects of the circulating antiau-tonomic membrane receptor antibodies (AARAb)in patients with cardiac arrhythmias .

MethodsFour groups of individuals were studied . Group I:28 patients with ventricular arrhythmias . Group II:13 patients with sinus node dysfunction . Group III:5 patients with both ventricular arrhythmias andsinus node dysfunction. Group IM 10 healthy con-trols. The chronotropic effects of the IgG fractionswere assessed on cultured neonatal rat cardiomyo-cytes before and after exposure to atropine and

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propranolol to detect of anti-M 2 cholinergic and/or anti-(3-adrenergic receptor antibodies . In 10 se-lected cases, immunopurified anti-(3i adrenergicreceptor or anti-M2-cholinergic receptor antibod-ies were obtained and their chronotropic effectswere explored in the same experimental set-up . Thebiochemical effects of the IgG from 17 patients(group I : 9 patients; group II : 6 patients; group III:2 patients) and 3 healthy controls were assessed onCOST cells transfected with genes encoding for (3 1and R2 adrenergic receptors (by the increment incAMP) and M 2 cholinergic receptors (by the incre-ment in phosphatidylinositol : PI) .ResultsIgG from healthy controls had no chronotropic ef-fects and, accordingly, AARAb were not detected .The IgG from the group I patients exerted a posi-tive chronotropic action, with a high prevalence ofanti-(3-adrenergic receptor antibodies (75%) and alow prevalence of anti-M2- cholinergic receptorantibodies (10.7%) . In contrast, the IgG from groupII patients had a depressing chronotropic effect,with a high prevalence of anti-M 2 cholinergicreceptor antibodies (76.9%) and a low prevalenceof anti- (3-adrenergic receptor antibodies (15.4%) .No significant chronotropic effects were elicitedby the IgG from group III patients, but a highprevalence of anti-M 2 cholinergic receptor antibod-ies (80%) and an intermediate prevalence of anti-3-adrenergic receptor antibodies (40%) could bedemonstrated. The study of the chronotropic effectof the immunopurified antibodies was confirmedthe results obtained with the corresponding IgGfractions . In agreement with the results of the func-tional tests, the IgG from group I patients induceda clear-cut and long-lasting increment of cAMP butno of PI, whereas the IgG from group II patientsevoked a marked augmentation of PI without af-fecting cAMP production .ConclusionsOur results demonstrate a strong correlation be-tween anti-p-adrenergic receptor antibodies andventricular arrhythmias (primary or due to Chagas'heart disease or idiopathic dilated cardiomyopa-thy) as well as between anti-M,cholinergicreceptor antibodies and sinus node dysfunction(primary or due to Chagas' heart disease) . Anti-M2-cholinergic receptor antibodies are uncommon inpatients with ventricular arrhythmias (unless thereis a concomitant involvement of sinus node) andanti-p-adrenergic receptor antibodies are uncom-mon in patients with "pure" sinus node dysfunc-tion. It was also demonstrated that the AARAbexert a stimulating action on the correspondingreceptors. Anti- (3-adrenegic receptor antibodies


increase and anti-M 2 adrenergic receptor antibod-ies inhibit cAMP production. These findings mayopen new ways towards the knowledge of theetiology and pathophysiology of ventricular ar-rhythmias and sinus node dysfunction and maypossess important therapeutic implications .

Key words Chagas' heart disease - Idiophatic dilatedcardiomyopathy - Primary ventricular arrhythmias-(3-adrenergic receptors - MZcholinergic receptor -

Propranolol - Atropine

AgradecimientosExpresamos nuestro reconocimiento a los Dres . Ulises Questa,

por el análisis estadístico, a Silvio Gutkind y Omar Coso por sucolaboración y asesoramiento en los estudios bioquímicos y a laSra . Cecilia Mc Keon por su ayuda en la confección del manuscrito .

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