Para qu romper clulas?

Para obtener productos que se encuentran en el interior de las clulas.

La tcnica de RC seleccionada determina el tamao de los desechos y la influencia que tendrn en las operaciones que se utilicen para su separacin.

Ejemplos de productos intracelulares

cidos nucleicos Enzimas

Tanasa Invertasa Proteasas DNA polimerasa

Pigmentos B-coeritrina (BPE), colorante rosa

Polmeros intracelulares AnBbiBcos

Caldo de fermentacin

Separacin de clulas

Rompimiento celular

Separacin, tratamiento de

cuerpos de inclusin

sobr

enad

ante

Con clulas

protenas intracelulares

Concentracin

Purificacin alta resolucin

refinamiento

Refinamiento

Sin clulas

C

lulas inmovilizadas o

Clulas retenidas

La recuperacin ptima de productos intracelulares requiere del conocimiento de la estructura de las capas externas que protegen a las clulas.

Paredes microbianas:

La tcnica uBlizada determinar el tamao de los desechos que se

producirn

MECANISMOS DE RUPTURA CELULAR

La seleccin de una tcnica depende de las caractersBcas del producto:

u Resistencia a: Medios alcalinos

Solventes

Detergentes

Enzimas

Temperatura Esfuerzo de corte

Los mtodos de ruptura celular en la industria pueden ser divididos en:

Mtodos qumicos Mtodos Qsicos Mtodos biolgicos

ROMPIMIENTO CELULAR RUPTURA DE CLULAS DE MICROORGANISMOS

Mtodos Fsicos Mtodos Qumicos Mtodos Biolgicos

Mtodo Slido

Mtodo Lquido

Liolizacin

Detergentes

Enzimas que digieren la pared

celular

Congelacin, descongelacin

Ultrasonido

Molinos Molino Dyno

Molino coloidal

Prensas Gaulin/Manton

Prensa de French

Prensas Prensa X

Prensa Hughes

Molino de bolas

Cambio en la presin osmRca

Tratamiento con cidos

Extraccin con acetona/tolueno

Fagos

Agentes que inhiben la pared

celular

Mtodos qumicos:

Choque osmBco Permeabilizacin Disolucin lipdica (tolueno 10% de la biomasa) DigesBn enzimBca (enzimas que atacan la

pared celular) Tratamiento alcalino Detergentes Liolizacin

Los mtodos no-mecnicos son fciles de escalar, si uno necesita tratar 10 veces ms materia orgnica basta con adicionar 10 veces ms reacBvo qumico o enzimBco

TCNICAS PRINCIPIO ESTRS EN EL PRODUCTO COSTO EJEMPLO

Solubilizacin Detergentes solubilizan la membrana Suave Moderado/

Caro

Choque osmtico Ruptura osmtica de la membrana Suave Barato Ruptura

de glbulos rojos

Disolucin lipdica

Solventes orgnicos actan sobre

la pared celular desestabilizndola

Moderado Barato Rompimiento de levaduras con

tolueno

Digestin enzimtica

Rompimiento por la digestin de

la pared celular Suave Caro

Micrococcus lysodeikticus tratado con

lisozima

Tratamiento alcalino

La saponificacin de los lpidos solubiliza la

membrana Fuerte Barato

Permeabilizacin enzimatica

Permeabilizan la membrana ocasionando

la ruptura de la clula Suave Caro

Tratamiento de M. lysodeikticus con lisozima

Rompimiento celular por mtodos qumicos.

Mtodos mecnicos:

Mtodos a pequea escala: Ultrasonicacin Molido con abrasivos Homogeneizadores

Mtodos a gran escala: Homogeneizadores a alta presin Molinos de perlas

TCNICAS PRINCIPIO ESTRS

SOBRE EL PRODUCTO

COSTO EJEMPLO

Homogeneizador de cuchillos

Las clulas son rotas en un mezclador

Moderado Moderado Rompimiento de tejidos y clulas animales.

Homogeneizador alta

presin

Las clulas son forzadas a pasar a travs de un

pequeo orificio, produciendo su ruptura

por el esfuerzo de corte

Fuerte Moderado

Tratamiento a gran escala

de suspensin de clulas.

Molienda Las clulas son rotas

por medio de una molienda con abrasivos

Moderado Barato

Molino de perlas Las clulas son

trituradas con perlas de acero o vidrio

Fuerte Barato Rompimiento a gran escala

para suspensiones de clulas y clulas de plantas

Ultrasonificacin Las clulas son

quebradas en una cavidad ultrasnica

Fuerte Caro Rompimiento de suspensiones

de clulas a lo menos en pequea escala

Rompimiento celular por mtodos mecnicos

Mtodos biolgicos:

Enzimas Fagos Agentes inhibidores de pared celular

Estos mtodos no son muy empleados debido a que son muy costosos.

Animales Micelio Bacterias Gram + Bacterias Gram Levaduras Esporas

7 = Fcil de romper 1 = Difcil de romper

Dicultad para rompimiento de diferentes Bpos de clulas.

Que hay que tomar en cuenta para la seleccin de un mtodo de ruptura celular

Naturaleza del producto intracelular Escala de la operacin Velocidad Estabilidad del producto Pureza del producto Costo del mtodo

CHOQUE OSMTICO

Las clulas se colocan en un volumen de agua frecuentemente 2 veces mayor que el volumen de clulas.

Las clulas se expanden, por un simple ujo osmBco que se produce debido a que las clulas conBenen solutos, ocasionando que el agua entre al interior.

Debido a esta expansin puede conducir a su lisis o rompimiento.

El uso de este mtodo depende de la resistencia de las

clulas.

Ley de van`t Hoff

Toluenizacin:

Ruptura a altas concentraciones, , se trabaja a bajas temperaturas, clulas inacBvas metablicamente.

Permeabilizacin a bajas concentraciones, clulas metablicamente acBvas comienzan a destruirse.

DigesRn enzimRca

Consiste en el empleo de enzimas que atacan a la pared celular hidrolizndola.

Permeabilizando la membrana para liberar compuestos intracelulares al medio o rompiendo completamente la clula.

DigesRn enzimRca

A pH< 5 las clulas no se rompen an cuando la pared haya sido destruida por digesBn.

Los costos son muy altos No hay recuperacin de las enzimas empleadas Mayor suscepBbilidad a Gram +

Ejemplos Gram(+): lisozima Gram(-): lisozima + AEDT Levaduras: 1,3-glucanasa, 1,6-glucanasa manasa, quiBnasa

Permeabilizacin con detergentes

Los detergentes Benen una zona hidroQlica y otra hidrofbica, por esta razn pueden interactuar tanto con el agua como con los lpidos. Su habilidad se basa en la solubilizacin de los lpidos de la pared celular

Los detergentes ms uBlizados son de tres Bpos:

Detergente aninico Detergente caBnico Detergente no-inico

Ejemplos Detergentes aninicos :

Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) Sulfonato de Sodio Tauroclorato de Sodio Colato de sodio

Ejemplos Detergentes caBnicos: Bromuro de CaBltrimeBl Amonio (CTAB)

Ejemplos Detergente no-inicos Triton X-100 Tween Spam

Permeabilizacin con detergentes

A bajas concentraciones no se produce degradacin de lpidos.

A alta concentracin se produce una degradacin que resulta lineal a la concentracin de detergente, junto a esta variable tambin se altera la tensin

supercial de la solucin.

Permeabilizacin con detergentes

Procedimiento: 1. Se coloca un determinado volumen de detergente concentrado por un volumen de clulas. Generalmente la mitad de volumen de detergente que de volumen de clulas.

2. El detergente rompe la membrana celular.

3. La suspensin resultante se centrifuga para remover los fragmentos de clulas y se pasa por etapas de extraccin para aislar el producto.

Permeabilizacin con detergentes

Tratamiento de las clulas con soluciones alcalinas (KOH, NaOH, pH 11.5-12.5; 20-30 min)

Ventajas: Simple y barato Aplicacin a gran escala

Desventajas: Tratamiento fuerte, los lpidos son converBdos en detergentes

No selecBvo Aplica nicamente si las enzimas a aislar son estables a pH alcalino

Ultrasonicacin

Frecuencias >20 KHz produciendo vibraciones que provocan el fenmeno de cavitacin.

Se producen zonas de baja presin en el lquido El lquido se transforma en gas formndose pequeas burbujas Las burbujas colapsan debido a los cambios de presin. Se producen fuertes esfuerzos de corte en el lquido que rompen las clulas.

Ultrasonicacin

Desventajas:

Produccin de radicales libres Destruccin del producto por las ondas Destruccin del producto por la temperatura

Elevados requerimientos de energa Altos costos

Homogeneizacin

Homogeneizadores: el material biolgico se somete a una fuerte presin

hidrostBca (500 atm) y la presin se libera bruscamente que el lquido salga

por una vlvula.

La idea es generar altos esfuerzos de corte que produzcan la rupturas. Estos se pueden

obtener por:

1. mbolos 2. Cuchillas 3. Pistones

Congelacin-descongelacin

Formar y deshacer los cristales de hielo

Ventajas: Muy simple de realizar Se realiza a bajas temperaturas

Desventajas: Tiempos largos Algunos microorganismos son resistentes Sensibilidad de las enzimas a congelacin/descongelacin

Molino de perlas

Operacin intermitente: El rompimiento celular con perlas agitadas a altas velocidades sigue una cinBca de primer orden. El balance de masa liberada puede ser expresado mediante la ecuacin:

Ejemplo 1:

Obtencin y puricacin de la enzima monxido de carbono deshidrogenasa, a parBr de extractos celulares de la bacteria Oligotropha carboxidovorans, cepa OM5.

Las bacterias con lisozima se colocaron en un bao mara durante 12 horas a 40C. Posteriormente, se complet el rompimiento celular por sonicacin en un equipo Branson Sonifer (VWR Company), con la siguientes indicaciones:

Output control: 7, Duty cycle: 60, Time: 10 minutos

Posteriormente se solubiliz con el detergente Tritn X-100 debido a que la enzima que se desea obtener estaba ligada a la membrana.

La metodologa uBlizada consisB en agregar a cada 600mL de extracto celular despus de la sonicacion, 200mL de Tritn X-100; se dej homogenizar la solucin. Se dej actuar por una hora y se centrifug a 10000 rpm durante 45 min en una centrifuga refrigerada.

Se tom el sobrenadante y el detergente remanente fue reBrado mediante dilisis.

Ejemplo 2: Ruptura celular de Saccharomyces cerevisiae por medio de mtodos qumicos.

Se basan en el uso de solventes orgnicos y detergentes para acelerar los procesos de autlisis de S. cerevisiae. El sistema se basa en la autlisis celular por medio de una plasmlisis originada por tratamiento de las clulas con solventes orgnicos.

Para seguir la liberacin del contenido intracelular miden la canBdad de la proteasa vacuolar carboxipepBdasa. Y liberada por la clula, requiriendo el proceso un no control del pH alrededor de 8. Entre los solventes orgnicos destacan los alcoholes de cadena

entre 6 y 9 carbonos de longitud.

Los detergentes con mejores resultados son el Tritn X-100 y N-laurilsarcosina.

Ventajas a nivel industrial: No requiere aparatos especiales Restos celulares fciles de separar por centrifuga Costo de los productos inductores bajo. Desventajas: Dicultad para eliminar compuestos qumicos Riesgo de desnaturalizacin Largos Bempos para lograr la autlisis 20-30h. Aumentan el riesgo de las protenas de inters por

la proteasas presentes.

Ejemplo 3: Ruptura celular de S. cerevisiae por medio de enzimas lBcos combinado con el uso de estabilizadores osmBcos.

Con estos tratamientos se ha logrado la liberacin selecBva de enzimas y protenas localizados en diferentes comparBmientos celulares. El complejo empleado procede de Oerskowia xanthinoly;ca. Se trata de una mezcla de enzimas lBcos con acBvidades en beta-1,3-gluconasa, proteasa, beta-1,6-glucanasa, mananasa y quiBnasa.

Todas actan en forma sinrgica en la degradacin de la pared celular, la acBvidad mananasa que degrada la capa externa de

manano de la pared y la beta-1,3-glucanasa para la degradacin de la capa interna de glucano.

La produccion de estas enzimas obtenida en un fermentados de 2000 litros es suciente para lisar un fermentador de 100,000 litros de S.

cerevisiae.