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Detección, Identificación e Interpretación de Imágenes por IFI

de Patrones de Anticuerpos Onconeuronales

Ángela Carrasco Sayalero

F.E.A. en Inmunología

Sección de Autoinmunidad ( Servicio de Inmunología)

X Congreso Nacional del Laboratorio Clínico

ZARAGOZA 2016

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

SÍNDROMES NEUROLÓGICOS PARANEOPLASICOS

“Los síndromes neurológicos

paraneoplasicos son complicaciones

importantes del cáncer generalmente

mediadadas por un mecanismo

inmunopatogenitico “


CONCEPTOS GENERALES

Asociados a una neoplasia, por efecto remoto.

Signos y síntomas que resultan del daño

de tejido neurológico remoto a la

localización de una neoplasia

En ausencia de

• Invasión directa

• Metástasis

• Complicación vascular/metabólica/

infecciosa/isquémica

• Terapia antineoplásica

Senties-Madrid H et al. Paraneoplastic Syndromes Associated with Anti-Hu Antibodies. IMAJ. 2001


PATOGENIA

Expresión ectópica de proteínas neuronales.

Desarrollo de tejido neuronal maduro o

inmaduro en el tumor.

Se considera un “efecto secundario” del

sistema inmunológico que pretende reducir

el crecimiento del tumor.

Debido a una disfunción de las células T

reguladoras.

Células T oligoclonales citotóxicas cruzan la

barrera hemato-encefálica y atacan a las

neuronas que expresa el Ag que comparte

con el tumor


FISIOPATOLOGÍA

¿Origen autoinmune?

Inmunidad

celular

Inmunidad

humoral

Ac contra

Ag intracelulares

Ac contra

Ag superficie

Tumor Tumor / Idiopático

Paraneoplásico o

autoinmune

Viaccoz A, Honnorat J. Paraneoplastic Neurological Syndromes: General Treatment Overview. Curr Opin Neurol. 2013.

Senties-Madrid H et al. Paraneoplastic Syndromes Associated with Anti-Hu Antibodies. IMAJ. 2001.

Wilson JF. The irony of paraneoplastic disorders. The Scientist. 2002.


CARACTERÍSTICAS CLÍNICO-INMUNOLÓGICAS SNP

• “Mediados por mecanismos de inmunidad humoral “

Ac frente antígenos de superficie: Síndrome de unión neuromuscular,

Encefalitis Límbica. Los tumores subyacentes suelen ser teratomas y

cáncer de timo Pronóstico favorable y una buena respuesta

(antitumoral , inmunoterapia: corticoides +Ig iv/ Plasmaferesis,

Ciclofoxfamida y Rituximab)

• “Mediados por mecansimos de inmunidad celular”

Ac frente antígenos intracelulares: Los SNP clásicos asociados

anticuerpos de tipo Hu, Ri. Anfifisina … que afectan a SNC. Tumores

asociados cancer de pulmon, seminoma, cancer de mama.

Pronostico malo y respuesta pobre ((inmunoterapia, corticoides)


METODOLOGIA DE TRABAJO

DESCARTAR :

• Enfermedad autoinmune sistémica con afectación neurológica;

• Neuropatía infecciosa post-vacunales o toxica

• IFI Triple tejido /+ Hep-2 1/80

DOBLE SCREENING: IFI e Inmunoblot

• IFI : sustrato de cerebelo de primate (1/10,1/40,1/100)

• Tipo de muestra : Suero o LCR

Inmunoblot : antígenos purificados o recombinantes

IFI +/ Blot + : Patrón identificable / especificidad encontrada

IFI + / Blot - : Patrón identificable / Blot negativo

NO significa SP


ESTUDIO DE ANTICUERPOS ANTI-NEURONALES

• Inmunofluorescencia indirecta (IFI)

• Inmunohistoquímica (IHQ) Screening

• Inmunoblot (Ac intracelulares)

• Células transfectadas (Ac superficie)

Confirmación

Carrasco A, Alarcón I, González C, Graus F. Identificación y utilidad clínica de los anticuerpos antineuronales. Inmunología. 2014.

Dalmau J, Graus F, Saiz A. Protocolo de detección de anticuerpos anti-neuronales y proteína 14-3-3. http://www.sen.es/profesional/p-diagnosticas/inmunologia2.


INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)

Sustrato:

• Cerebelo de rata (síndromes centrales) y

nervio de primate (síndromes periféricos).

• Hipocampo de rata (Ac superficie).

Muestra

• Suero Ac intracelulares

• Suero y LCR Ac superficie

S (28.9-100%) y E (95%)


Carrasco A, Graus F. Atlas de anticuerpos anti-neuronales. 2012.

https://www.euroimmun.de/fileadmin/template/images/pdf/qr/info_autoimmune_encephalitis_en.pdf

Tampoia et al. Diagnostic accuracy of different immunological methods for the detection of antineuronal antibodies. Immunol Invest 2010


INMUNOHISTOQUÍMICA

Sustrato:

• Cerebelo de rata (síndromes centrales) y

nervio de primate (síndromes periféricos).

• Hipocampo de rata (Ac superficie).

Muestra

• Suero Ac intracelulares

• Suero y LCR Ac superficie




INMUNOBLOT

Indicación: Ac intracelulares.

Sustrato: Blog con antígenos purificados o recombinantes.

Muestra: Suero (o LCR).

Dilución: 1/10, 1/40, 1/100.

S (83-100%), E (96-100%).





CÉLULAS TRANSFECTADAS

Sustrato:

• Células HEK293 (human embrionic cells of kidney).

• Transfección con un vector de expresión eucariótica (plásmido) con ADN que codifique el Ag específico (NMDAR, AMPAR, etc.).

• Cultivo para crecimiento.

Muestra: suero y LCR.

Inmunofluorescencia indirecta.

Sensibilidad: suero (85%), LCR (82-100%).

Especificidad: ~100%.



https://www.euroimmun.de/fileadmin/template/images/pdf/qr/info_autoimmune_encephalitis_en.pdf



CLASIFICACIÓN DE LOS ANTICUERPOS

Grupos Anticuerpos Características

Grupo I

(Ag intracelulares)

Grupo Ia

-Hu (ANNA-1) -PCA-2

-Ri (ANNA-2) -Anfifisina*

-ANNA-3 -Recoverina

-Yo (PCA-1)

-CV2 / CRMP-5

-Ma1 (PNMA1)

-Ma2 (Ta, PNMA2)

• Paraneoplásicos (asociación bien

caracterizada)

• Posible presencia con tumor sin clínica

(0-16%)

• ¿Rol patogénico?

• Marcadores

• Mala respuesta a inmunoterapia (10-30%

leve)

Grupo Ib -Familia ZIC

-Familia SOX

• Paraneoplásicos (CPCP)

• NO rol patogénico (marcadores)

Grupo Ic -GAD*

-AK5

• No paraneoplásicos (raro tumor)

• Autoinmune

Grupo II

(Ag superficie)

Grupo IIa

-NMDA -GABA-A

-LGI1 -GlyR

-Caspr2 -DPPX

-AMPA -Homer-3

-GABA-B

• Tendencia en más jóvenes

• No implican paraneoplasia (tumor <70%)

• Rol patogénico

• Buena respuesta inmunoterapia (75-80%)

Grupo IIb

-mGLuR1 -DNER (Tr)

-mGLuR5

-VGCC

• Paraneoplásicos

• Rol patogénico

• Buena respuesta inmunoterapia (75-80%)

Graus, Dalmau, Saiz. Antibodies and neuronal autoinmune disorders of the CNS. J Neurol. 2010.

Lancaster E. Paraneoplastic disorders. Continuum. 2015. *Ag sinápticos intracelulares (mejor respuesta a inmunoterapia)


SÍNDROMES PARANEOPLÁSICOS ANTICUERPO

ESPECIFICO

CARACTERIZACIÓN ASOCIACIÓN CLÍNCA

1. Anti-Hu (ANNA-1)

Antígeno:

Proteína Hu ligada al RNA

Fluorescencia en núcleos neuronales en sistema nervioso central y periférico

Detección por IFI e Inmunoblot

Neuropatías sensitivas, encefalitis límbica, degeneración cerebelosa, encefalomielitis subaguda

Tumor asociado: carcinoma de célula pequeña de pulmón

2. Anti-Yo Antígeno: CDR62/CDR34

Fluorescencia en Citoplasma células de Purkinje. Patrón granular


Degeneración cerebelosa

Tumor asociado: ovárico; mama

3. Anti-CV2 (CRMP5)

Antígeno: CRMP- 5 Fluorescencia en Citoplasma oligodendrocitos

capa granular y sustancia blanca del cerebelo


Encefalomielitis, neuropatía motora y sensitiva, ataxia cerebelosa

Tumor asociado: carcinoma de célula pequeña de pulmón, timoma

4. Anti-Anfifisina

Endocitosis de las vesículas sinápticas

Fluorescencia en la zona granular un botón sináptico y la zona molecular positiva


Síndrome de Stiff-person Tumor Asociado: carcinoma de pulmón célula

pequeña; cáncer de mama

5. Anti-Tr (PCA-Tr)

Antígeno: DIVER

altamente específico en C. Purkinje

Fluorescencia punteado en la zona molecular y citoplasma de las células de Purkinje

Detección por IFI

Degeneración cerebelosa Tumor asociado linfoma de Hodgkin.

6. Anti-Ri (ANNA-2)

Antígeno: NOVA Proteína ligada al RNA

Idéntico a Hu en SNC, Negativo núcleos neuronales plexo mientérico intestino


Encefalitis de tronco y opsoclono

Tumor asociado :carcinoma de pulmón célula pequeña, cáncer mama

7. Anti -Ma2 (PMNA2)

Antígeno:

Fosfoproteína citoplasmática

implicada en la síntesis de RNA

Fluorescencia núcleo dentado, puntos en el nucleolo o citoplasma


Encefalitis límbica. encefalitis meso-di encefálica

Tumor asociado: testículo

A Carrasco F Graus; Atlas de Ac Anti-neuronales 2012


ENCEFALITIS AUTOINMUNE

ANTICUERPO ESPECÍFICO

CARACTERIZACIÓN ASOCIACIÓN CLÍNCA

1. Anti-receptor de NMDA

Receptor NMDA de Glutamato

Fluorescencia en zona molecular de hipocampo y estrato granuloso del

cerebelo IFI y Células transfectadas

Encefalitis

Tumor asociado: teratoma ovárico (58%)

2. Anti–LGI1

Proteína asociada a VGKC

Fluorescencia en zona molecular hipocampo y cerebelo

IFI y Células transfectadas

Encefalitis límbica

Tumor asociado: ninguno

3. Anti-receptor de GABAB

Receptor de GABAB


Células transfectadas


Tumor asociado: SCLC (70%)

4. Anti–CASPR2

Proteína asociada a VGKC



Síndrome de Morvan, neuromiotonia, encefalitis límbica

Tumor asociado: Timoma (73%)

5. Anti-receptor de AMPA

Receptor AMPA de Glutamato




Tumor asociado: SCLC, mama, timoma (60%)

6. Anti-receptor mGluR5

Fluorescencia en zona molecular hipocampo

Encefalitis límbica Hodgkin

A. Carrasco; F. Grau; Atlas de Ac Anti-Neuronales 2012


OTROS SÍNDROMES

SOX1 (AGNA) Antígeno: Proteína

SOX1

Relacionado con células madre neuronales

Fluorescencia en núcleos de las células de

la glia de Bergmann alrededor de las células de Purkinje

SOX1: Mediante Inmunoblot

LEMS paraneoplásico, en menor medida mismos síndromes asociados a anti-Hu

Tumor asociado: SCLC

Anti-GAD

Proteína Sináptica * Solo detecta títulos

elevados de GAD (>2000 por RIA)

Fluorescencia; Patrón granular en capa molecular *

RIA, ELISA, Inmunoblot

SPS, ataxia cerebelo, encefalitis límbica

Cáncer No

ANTICUERPO ESPECÍFICO CARACTERIZACIÓN ASOCIACIÓN CLÍNCA

NMO-IgG

Antígeno: AQP4

Fluorescencia en córtex y cerebelo: zona Pia y subPia

ELISA; IFI sobre células transfectadas

Neuromielitis Optica (Síndrome de Devic’s)

A Carrasco; F Graus; Atlas de Ac Anti-Neuronales 2012


ESTRUCTURA DEL CEREBELO Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Estrato Molecular Estrato Granuloso

C. Purkinje

ANA: FALSO POSITIVO

ANA 1/40. Falso Positivo.

Estrato Granular

(E.G.)

Estrato Molecular

(E.M.)

Células de Purkinje

Núcleo neuronas E.M.

Vasos

Células Glía de Bergmann

Sustancia Blanca

Fibras

Núcleo neuronas E.G.


ANA INESPECÍFICO Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Estrato Molecular

Estrato Granuloso

C. Purkinje

NEGATIVO

NEGATIVO Estrato Granular

(E.G.)

Estrato Molecular

(E.M.)



Vasos


Sustancia Blanca

Fibras



Estrato Molecular

Estrato Granuloso

C. Purkinje

Sustancia Blanca

ANTI HU/RI

Anti Hu/Ri. Núcleos Neuronales

del SNC y Periférico

Estrato Granular

(E.G.)

Estrato Molecular

(E.M.)



Vasos


Sustancia Blanca

Fibras



ANTI HU (ANNA-1)

AG: PROTEÍNA HU LIGADA AL RNA


Estrato Molecular

Estrato Granuloso

C. Purkinje

Sustancia

Blanca

ANTI-YO

Anti-Yo, citoplasma de las C.P. “patrón

granular”

Estrato Granular

(E.G.)

Estrato Molecular

(E.M.)



Vasos


Sustancia Blanca

Fibras



ANTI YO (PCA-1)

AG: CDR62/CDR34


Estrato Molecular

Estrato Granuloso

C. Purkinje

Sustancia Blanca

ANT-YO

Anti-Yo. Puede haber un segundo

anticuerpo hay IFI en E.G. y S.B.

Estrato Granular

(E.G.)

Estrato Molecular

(E.M.)



Vasos


Sustancia Blanca

Fibras



EG

ANTI CV2

AG: CRMP-5

•

Fluorescencia en citoplasma de oligodendrocitos, capa granular y sustancia blanca del cerebelo


Estrato Molecular

Estrato Granuloso

C. Purkinje

FALSO CV2

Falso CV2, Astrocitos Estrato Granular

(E.G.)

Estrato Molecular

(E.M.)



Vasos


Sustancia Blanca

Fibras



Estrato Molecular

Estrato Granuloso

C. Purkinje Sustancia

Blanca

ANFIFISINA

Patrón Sináptico E.M.+,

E.G. Botón Sináptico: Anfifisina

Estrato Granular

(E.G.)

Estrato Molecular

(E.M.)



Vasos


Sustancia Blanca

Fibras



ANFIFISINA

ENDOCITOSIS DE LAS VESIUCLAS SINAPTICAS


Estrato Molecular

Estrato Granuloso

C. Purkinje

Sustancia

Blanca

MITOCONDRIA+ FALSO PATRÓN DE ANFIFISINA

Mitocondria +,

falso positivo de Anfifisina

(botón sináptico E.G.)

Estrato Granular

(E.G.)

Estrato Molecular

(E.M.)



Vasos


Sustancia Blanca

Fibras



Estrato Molecular

Estrato Granuloso

C. Purkinje

ANTI-TR

Anti-PCA2-Tr, dendritas en E.M.,

punteado en C.P. y E.M.

Estrato Granular

(E.G.)

Estrato Molecular

(E.M.)



Vasos


Sustancia Blanca

Fibras



ANTI –TR

AG: DIVER, ESPECIFICO DE LAS C. PURKINJE


Estrato Molecular Estrato Granuloso

C. Purkinje

Sustancia

Blanca

ANTI-HU/RI (ANNA-2)

AG: NOVA PROTEINA LIGADA AL RNA

Anti Hu/Ri, discretamente positivo C.P.

Estrato Granular

(E.G.)

Estrato Molecular

(E.M.)



Vasos


Sustancia Blanca

Fibras



ANTI-MA2 (PMNA2)

AG: FOSFOPROTEINA CITOPLASMATICA IMPLICADA EN LA SINTEISS DE RNA

Estrato Molecular

Estrato Granuloso

C. Purkinje

Núcleos y fibras alrededor de las C. P.

Ma2, núcleo dentado, puntos en el

nucleolo o citoplasma

Estrato Granular

(E.G.)

Estrato Molecular

(E.M.)



Vasos


Sustancia Blanca

Fibras



Estrato Molecular

Estrato Granuloso

C. Purkinje

Sustancia

Blanca

ANTI-GAD

Patrón granular E.M.

”punteado sináptico”

anti-GAD

Estrato Granular

(E.G.)

Estrato Molecular

(E.M.)



Vasos


Sustancia Blanca

Fibras



ANTI-GAD

PROTEINA SINAPTICA

IMUNOHISTOQUIMICA IFI : Patrón granular en capa molecular


Estrato Molecular

Estrato Granuloso

C. Purkinje

ANTI-SOX

anti-SOX. Núcleos de las celulas de la Glia

de Bergmann alrededor de las C.P.

Estrato Granular

(E.G.)

Estrato Molecular

(E.M.)



Vasos


Sustancia Blanca

Fibras



• 2004: Aquaporin-4

2008: NMDA-receptors

2009: AMPA-receptors

2010: GABAB-receptors

2010: LGI1; CASPR2

2012: DNER (Tr)

•

•

•

•

•

ANTICUERPOS CONTRA ANTÍGENOS DE SUPERFICIE Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

HIPOCAMPO Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

CORTE DE HIPOCAMPO

Hipocampo Positivo


Anti-NMDA : receptor NMDA de Glutamato

Hipocampo: Zona molecular Cerebelo: Estrato Granuloso

Encefalitis Límbica


Estrato Molecular

Estrato Granuloso C. Purkinje

Sustancia Blanca

ANTI-NMDA

anti-NMDAR, botones sinápticos en E.G.

Estrato Granular

(E.G.)

Estrato Molecular

(E.M.)



Vasos


Sustancia Blanca

Fibras



ANTI-NMDA

+ HIPOCAMPO -

C T - NO CT CT +

CEREBELO+


Anti-AMPA: Receptor AMPA del Glutamato

HIPOCAMPO Zona Molecular CEREBELO Baton Sinaptico EG , Fibras nerviosas Difuso y granulado EM

Encefalitis Límbica Clásica // Síntomas Psiquiátricos asociados


Anti-GABA: Receptor de GABA

Hipocampo Cerebelo

Encefalitis Límbica Clásica ( coexistencia con GAD65 )

Estatus epilépticos refractarios


Hipocampo Cerebelo

Epilepsia Autoxomica

Anti-LGI1 (VGKC) : Proteína Presináptica Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2016

Anti-CASPR2 (VGKC) : Proteina Axonal Transmembrana

Hipocampo Cerebelo

Síndrome de Morvan ( neuromiotomia +/- encefalitis ) // Epilepsias Resistentes


INMUNOHISTOQUIMICA VGKC


Anti-DPPX (VGKC): Proteína Transmemebrana (tipo II)

(Dipeptidyl amino peptidase like proteine)

Subunidad reguladora Kv4.2 de VGKC

Hipocampo Cerebelo

Fluorescencia granular del Estrato Molecular Estrato lúcido del Hipocampo.

Encefalomielitis + Síntomas Intestinales


PATRONES ESPECIFICOS DIFICILES DE DIFERENCIAR

Hipocampo

Anti-DPPX (VGKC) Anti-CASPR2 (VGKC) Anti-LGI1 (VGKC)

Anti-GABABR Anti-AMPAR Anti-NMDAR


PATRONES ESPECIFICOS DIFICILES DE DIFERENCIAR

Cerebelo

Anti-DPPX (VGKC) Anti-CASPR2 (VGKC) Anti-LGI1 (VGKC)

Anti-GABABR Anti-AMPAR Anti-NMDAR


OTROS SÍNDROMES

Anti-NMO IgG

Neuromielitis Óptica

(Sindrome de Dévic)

Antigeno AQP4


NEUROMIELITIS ÓPTICA (NMO-IGG)

Cerebro

Anti-AQP 4

Nervio óptico


NEUROMIELITIS ÓPTICA (NMO-IGG)

HEK293 Transfectadas con AQP-4

Anti-AQP 4

HEK293 Control


RELEVANCIA DE LOS AUTOANTICUERPOS

El 31% de los

resultados

positivos lo son

para algo

diferente de lo

solicitado!

Anti-Yo 8,2%

Anti-Ri 9,3%

Anti-Ma 1,9%

Anti-PCA2

Anti-CV2

3,7%

Anti-Amphiphysin 0,9%

0,9

%

Anti-NMDAR 38%

Hu + CV2 2,8%

Anti-Hu 5.6%

Anti-GABAB 2,8%

Anti-AMPAR 0,0%

Anti-LGI1 11,1%

NMDAR + Hu 1,9%

NMDAR + CASPR2 0,9%

Anti-CASPR2

11,1%

NMDAR + GABAB 0,9%


GRACIAS

• [email protected]


http://kerubino.files.wordpress.com/2010/08/70020neurona_primera.jpg

Taller de Imágenes. Foto 1.

Estrato Molecular

Estrato Granuloso

C. Purkinje

Núcleos y fibras alrededor de las C.

P.

Ma2, núcleo dentado, puntos en el

nucleolo o citoplasma

Estrato Granular

(E.G.)

Estrato Molecular

(E.M.)



Vasos


Sustancia Blanca

Fibras



Estrato Molecular

Estrato Granuloso

C. Purkinje

Sustancia Blanca


Anti-Yo. Puede haber un segundo

anticuerpo hay IFI en E.G. y S.B.

Estrato Granular

(E.G.)

Estrato Molecular

(E.M.)



Vasos


Sustancia Blanca

Fibras



Estrato Molecular

Estrato Granuloso

C. Purkinje

Sustancia Blanca


Anti Hu/Ri. Núcleos Neuronales

del SNC y Periférico

Estrato Granular

(E.G.)

Estrato Molecular

(E.M.)



Vasos


Sustancia Blanca

Fibras



Estrato Molecular

Estrato Granuloso C. Purkinje

Sustancia Blanca


Estrato Granular

(E.G.)

Estrato Molecular

(E.M.)



Vasos


Sustancia Blanca

Fibras



Estrato Molecular

Estrato Granuloso

C. Purkinje


Estrato Granular

(E.G.)

Estrato Molecular

(E.M.)



Vasos


Sustancia Blanca

Fibras



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