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RESUMEN

El objeto del presente trabajo es analizar una formulación liofilizada de antígeno entero de T. gondii. La formulación se evaluó en diferentes condiciones de conservación posterior al proceso de liofilización frente a sueros de referencia, y se le realizó una segunda evaluación en la que se empleó una presentación de antígeno entero no liofilizado de T. gondii, utilizando también sueros de referencia y muestras problema. El proceso de liofilización no afectó la capacidad de los trofozoitos de T. gondii de expresar antigenos de membrana. La nueva presentación

otoleró 24 horas a 25 C, sin que se afecte la expresión de antigenos. Al evaluar en condiciones de conservación para la formulación liofilizada no se encontraron

o odiferencias en las variables de 4 C y – 20 C con la utilización de suero de referencia. No se encontraron diferencias al evaluar las variables

o ode conservación 4 C y – 20 C, frente a antígeno entero no liofilizado, conservado a

o– 20 C. Se demostró que no existe diferencia entre las variables de conservación para el antígeno liofilizado respecto al antígeno entero no liofilizado uso regular.

Palabras clave: Toxoplasma, Liofilización, Inmunofluorescencia Indirecta.

P. R. Casanova, R. Cox, M. Rodríguez, A. Díaz*

Instituto Pedro Kourí LABIOFAM*

Instituto Pedro Kourí, PO Box 601 Marianao 13. Ciudad de La Habana, Cuba. Email: rcapedro@ipk.sld.cu

ABSTRACT

Toxoplasmosis is considered a reemerging foodborne parasitic disease that can cause severe damages to the fetus if a woman gets infected for the first time during pregnancy. As t h i s d i s e a s e s e r i o u s l y a f f e c t s immunodepressed persons, it has greatly drawn the researchers' attention due to its relationship with HIV/AIDS patients. To diagnose toxoplasmosis, a varied group of different serological techniques as well as the search for parasitic DNA by molecular biology procedures are used. All these techniques and procedures imply an appropriate conservation of the biological components, which have a short period of bioavailability. The liofilization coursed inside the measures fixed at the beginning; ampullas were covered and re-covered, solidity of the pill was observed and 2% humidity was considered. We worked on conservation variables for the liofilized antigen taking care on when carrying out an IFI test, the capacity of detection of IgG inmunoglobulins present in the reference materials was not affected. It implied 9 measures in different periods of time: 5 measures at 24, 48, 72, 96 and 120 hours later to the liofilization process and 4 measures continuing at the 15, 30, 60 and 90 days. As part of the analysis the liofilized formulation of T. gondii was evaluated versus fresh antigen of the same parasite, using reference material and problem samples. Results show that there are no significant differences for two of the variable studied for the lyophilized antigen with regards to the regularly used fresh antigen.

Key words: Toxoplasmosis, liofilization, T gondii.

ISSN-1606-0563Bioingeniería y Física Médica Cubana

Presentación liofilizada de antígenode TOXOPLASMA GONDII para estudios serológicos

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1. INTRODUCCIÓN

La toxoplasmosis es considerada una parasitosis reemergente [1], de transmisión digestiva, que puede provocar serios daños al feto si la madre se infecta por primera vez durante el embarazo. El hecho de afectar seriamente a los inmunodeprimidos, y particularmente a pacientes VIH/SIDA ha hecho que la atención sobre la misma aumente [1] , [2]. Para el diagnóstico de la toxoplasmosis se emplea un grupo importante de diferentes técnicas serológicas y la búsqueda de ADN parasitario por procedimientos de biología molecular [3]. La principal problemática de las técnicas y procedimientos antes mencionados radica en la conservación de los componentes de origen biológico, así como el corto periodo de biodisponibilidad de los mismos [4].Los problemas fundamentales que con frecuencia se observan en los Laboratorios de Diagnóstico son las irregularidades que se presentan en los reactivos de origen biológico conservado en soluciones acuosas y que forman parte de diagnosticadores comerciales [4], fundamentalmente por incumplimiento en el mantenimiento de la cadena de frío indicada por los fabricantes y los cortos periodos de viabilidad o vencimiento de los mismos [5]. Estos eventos adversos traen como consecuencia la inhabilitación de los juegos diagnósticos, así como una considerable pérdida económica y la incapacidad de ofrecer ese servicio. La liofilización es un proceso práctico que fue introducido en tiempos de la segunda guerra mundial [6]. Su primer uso fue en la conservación del plasma sanguíneo, seguido de la producción de la penicilina y de otros antibióticos [7]. La aplicación de la liofilización ha continuado desarrollándose, y en la actualidad incluye vacunas, esteroides, vitaminas y una amplia gama de producciones destinadas a diagnosticadores. Muchos de estos nuevos productos son proteínas, química y físicamente inestables en soluciones acuosas u otras presentaciones, dependiendo su actividad biológica de la conservación de sus estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria [8]. La formulación y manufactura de estos elementos representa un desafío para el área biotecnológica, y la liofilización constituye una herramienta necesaria para el desarrollo de estos productos [9].

En este trabajo nos propusimos analizar una formulación liofilizada de antígeno entero de T. gondii, evaluar la misma en diferentes condiciones de conservación frente a sueros de referencia, y realizar una segunda evaluación frente a antígeno entero no liofilizado de T. gondii, utilizando suero de referencia y muestras problema.

2. METODOLOGÍA

2.1 Procedimiento de liofilización para la formulación de antígeno entero de T. gondii:El material biológico objeto del estudio fue obtenido del exudado peritoneal de ratones OF1 de 18 gramos de peso y 4 semanas de vida, previamente inoculados con trofozoitos de

4T. gondii en concentración de 1 X 10 por ml. El mismo fue sometido a un proceso de inactivación con formol al 1%, y posteriormente lavado 3 veces con Solución Salina Tamponada (PBS) 1X pH 7,6 con la finalidad de eliminar macrófagos y restos celulares acompañantes en el fluido peritoneal, centrifugando a 1500 rpm

opor 5 minutos a una temperatura de 100 C. Se eliminó el sobrenadante del último lavado y se resuspendió en 1 ml de solución de liofilización, (PBS 1X pH 7.6 y Dextrana 2 mg por ml). Se realizó el primer conteo en cámara de Neubauer para conocer el numero de parásitos por ml, se resuspendió con volumen de ajuste para una

6concentración de 1X10 parásitos por ml de solución de liofilización, se realizo segundo conteo para confirmar concentración de parásitos.En frascos de vidrio de liofilización 2R, se añadió 1 ml de la suspensión y se colocaron tapas de goma de liofilización; los mismos se

oguardaron a temperatura de - 70 C por un periodo de 72 horas. Cumplido este periodo se colocaron los frascos con la tapa en posición de extracción de vapor, en cámara de liofilización del equipo Edwards. Se programó el procedimiento para 16 horas de

oduración, a temperatura de – 60 C, y una fuerza de extracción o vacío de 2 mbar o 200 Pascal. Al final de este proceso se confirmó el cierre de las tapas de goma y se colocaron retapas metálicas.Los frascos procedentes del proceso de liofilización fueron divididos en 4 grupos para su conservación: 10 frascos se colocaron en

o 0incubadora a 37 C, 10 frascos a 25 C o temperatura ambiente,10 f rascos en

orefrigerador de 4 C y finalmente 10 frascos se o

colocaron en refrigerador a – 20 C.

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2.2 Evaluación de la formulación liofilizada de antígeno entero de T. gondii, en diferentes condiciones de conservación posterior al proceso de liofilización, frente a sueros de referencia:Este estudio abarcó un periodo de 90 días, y siguió el siguiente esquema: durante los primeros 5 días posterior a la liofilización se abrió un frasco de cada variable, así como los días 15, 30, 60 y 90, los mismos fueron hidratados con 1 ml de Na CL al 0.9 %, y se sometió a proceso de agitación suave para lograr homogeneidad. Seguidamente, se procedió a fijar 10 láminas portaobjeto para IFI, a razón de 100 ul por lámina, manteniéndolas a temperatura ambiente hasta el secado total. Una vez secas se empaquetaron por separado, con doble envoltura y bolsas plásticas aislantes de la humedad y se conservaron a una temperatura

ode -20 C.Se realizó IFI sobre cada una las 4 variables de conservación de la formulación liofilizada y se utilizó suero de referencia reactivo de alta concentración y no reactivo. 2.3 Evaluar la formulación liofilizada de T. gondii, frente a antígeno estándar fresco de T. gondii, utilizando sueros de referencia y muestras problema.Los sueros de referencia y las muestras problema se estudiaron a la vez tanto sobre antígeno entero no liofilizado como en antígeno liofilizado. Para ello fueron utilizadas las láminas para IFI fijadas de cada una de las dos variables de temperatura que continuaron en estudio. El antígeno entero no liofilizado como norma luego de ser preparado y fijado en

oláminas, es conservado a – 20 C hasta el momento de su uso [10].El antígeno entero de T. gondii, fue también obtenido bajo procedimiento antes mencionado en el proceder de liofilización. Se realizó el primer conteo en cámara de Neubauer para conocer el numero de parásitos por ml, se resuspendió con volumen de ajuste

6para una concentración de 1X10 parásitos por ml en PBS, se realizó segundo conteo para confirmar concentración de parásitos.Seguidamente se procedió a fijar 10 láminas portaobjeto para IFI, a razón de 100 ul por lámina, manteniéndolas a temperatura ambiente hasta el secado. El antigeno de T. gondii, es estable por 1 año conservado a

o-20 C.

El protocolo en esta etapa implicó la realización de tres procesos por separado de IFI, en el que las muestras problema y los sueros de referencia fueron presentados a antígeno de T. gondii, en tres presentaciones diferentes. El procedimiento técnico de IFI, se realizó bajo patrones de buenas prácticas, la lectura se realizó con microscopio de la marca Leyca, modelo DMLB, se utilizaron 20 sueros entre muestras problemas (MP) y muestras de referencia (MR). Se trabajaron en una dilución de 1/32 y fue descartada la presencia de anticuerpos contra T. gondii utilizando un conjugado fluorescente anti IgG humana de SIGMA.

3. RESULTADOS

El proceso de liofilización transcurrió dentro de los parámetros fijados al inicio, los frascos fueron tapados y retapados. Se observó la formación de la pastilla de solutos y se estimó la humedad inferior al 2%, que es la que establece el proceso en las condiciones de liofilización programadas para el equipo utilizado [11].En la Tabla I se presentan los resultados de las primeras mediciones realizadas por IFI, en las que se utilizó un suero de referencia reactivo con título de IgG 1/1024 y dos sueros de referencia no reactivos (NR1 y NR2), con el numero 1 se marca el valor reactivo del suero de referencia y con 0 es ausencia de reactividad.En esta etapa el estudio se fundamentó en encontrar una variable de conservación para el antígeno liofilizado en que al realizar una prueba de IFI, no se afectara la capacidad de detección de inmunoglobulinas del tipo IgG presentes en los sueros de referencias utilizados. Implicó 9 mediciones en periodos de tiempo diferentes: 5 mediciones a las 24h, 48h, 72h, 96h y 120h horas posteriores al proceso de liofilización y 4 mediciones continuando a los 15 días, 30 días, 60 días y 90días; en estas últimas solo se trabajó con las

o ovariables de conservación de 4 C y – 20 C (Tabla II), por cuanto no se encontró diferencia en la actividad del material de referencia, mientras que en la variable de conservación de

o37 C, por el efecto de la temperatura, se produjo una afectación significativa en la conservación y expresión de antígenos [12]. Se encontró también que en la variable de

oconservación de 25 C o temperatura ambiente

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diferencia del patrón reactivo del material de referencia se afectó al evaluarla a las 48 horas, lo cual indica que este antígeno se mantuvo estable durante 24 horas. Como parte del análisis se evaluó la formulación liofilizada de T. gondii, frente a antígeno entero no liofilizado del mismo parásito, utilizando sueros de referencia y muestras problema. Los resultados se expresan en la Tabla III. En los mismos se puede apreciar que no existe diferencia entre la

oformulación liofilizada conservada a 4 C y

o–20 C y el antígeno entero no liofilizado oconservado a – 20 C.

4. DISCUSIÓN

Se comprobó que durante el proceso de liofilización no se afectó la capacidad del trofozoito de T. gondii para expresar antígenos de superficie, tanto a las 24 horas post liofilización como en mediciones posteriores, que alcanzaron los 90 días, demostrándose que estos antígenos no sufren transformación durante este proceso de extracción de líquidos, lo cual es consistente con la literatura consultada [13,14].Es una práctica común la evaluación de formulac iones l io f i l i zadas con f ines diagnósticos frente a sueros de referencia de concentración conocida [15]. En este caso se utilizaron cuatro variables de conservación para confirmar en cuál o en cuáles se observa un funcionamiento estable de los sueros de referencias utilizados. En otro trabajo consultado referente a esta temática, pero sobre otro tipo de formulaciones se ha podido realizar un monitoreo continuo de la misma, lo cual ha permitido conocer en el tiempo el momento exacto en que comienza a caducar el producto en análisis [16]. En la variable de

o37 C, el efecto temperatura provocó la degradación de los antígenos de membrana, observándose diferencia desde las primeras 2 4 h o r a s p o s t l i o f i l i z a c i ó n [ 1 7 ] ; comportamiento similar se observó en la variable de 25 ºC o temperatura ambiente, pero posterior a las 48 horas. Similar resultado se observó en un estudio publicado sobre estabi l idad acelerada de conjugados fluorescentes para IFI [18]. Las variables de

o oconservación de 4 C y – 20 C son muy utilizadas en estudios de estabilidad por cuanto son condiciones con que se disponen comúnmente en los laboratorios. En estas variables no se observaron diferencias respecto

al material de referencia, resultado similar se encontró en otro estudio de estabilidad

oconsultado [19]. Estas variables de 4 C y

o–20 C fueron somet idas a un reto, enfrentándolas en tres momentos diferentes a un panel de sueros problemas, sueros de referencia y antígeno entero no liofilizado

oconservado a -20 C. En la evaluación no se constataron diferencias, de forma similar a lo reportado por Towsend y Rey [20], [21].

5. CONCLUSIONES

El proceso de liofilización no afectó la capacidad de los trofozoitos de T. gondii de expresar antígenos de membrana. La nueva

oformulación toleró 24 horas a 25 C, sin que se afectara la expresión de antígenos. En evaluación de condiciones de conservación para la formulación liofilizada no se encontró

o odiferencia en las variables de 4 C y – 20 C cuando se utilizó suero de referencia. No se encontraron diferencias al evaluar las variables

o ode conservación 4 C y –20 C, frente a antígeno

oentero no liofilizado conservado a – 20 C.

REFERENCIAS

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ANEXOS

TABLA IAnálisis de las primeras 120 horas post-liofilización, sobre

las 4 variables de conservación+

Tabla II Resultados de la evaluación realizada sobre dos

0 0condiciones de temperatura, 4 C y -20 C

TABLA III Ensayo en tres tiempos para las tres variables,

o o antígeno liofilizado 4 C y – 20 C y antígeno fresco.