SEMINARIO PRÁCTICAS

Colinesterasa del suero un ejemplo de determinación de actividad

enzimática y cálculos cinéticos

Javier Sáez Valero

1. Colinesterasas: acetilcolinesterasa y butirilcolinesterasa 1.1. El Sistema colinérgico y el papel de acetilcolinesterasa (AChE) 1.2. Butirilcolinesterasa (BuChE), potencial papel fisiológico 2. Determinación de la actividad colinesterasa por el método de Ellman 2.1 El uso de inhibidores y sustratos específicos 3. La práctica 3.1. Los Objetivos 3.2. El Protocolo 3.3. Los cálculos enzimáticos 4. La seguridad en el laboratorio de investigación

Colinesterasas

Enzimas que hidrolizan preferentemente los ésteres de colina. Serin-esterasas (y por ser inhibidos pro fisostigmina, eserina, 10-5M) Inh irreversible por organosfosforados Acetilcolinesterasa: AChE Butirilcolinesterasa: BuChE EC 3.1.1.7 EC 3.1.1.8 (gen cromosoma 7) (gen cromosoma 3)

Según la (IUBMB) Unión internacional de Bioquímica y Biología Molecular, los estractos enzimáticos pueden nombrarse por un número de identificación consistente en las letras EC seguidas de 4 digitos (separados por puntos), que corresponderían por orden: el primero a la clase (de las 6 existentes), el segundo a la subclase, el tercero a la sub-subclase y el cuarto número identificaría al enzima concreto.

1. Óxido-reductasas Reacciones de oxido-reducción

2. Transferasas Transferencia de grupos

funcionales

3. Hidrolasas Reacciones de hidrólisis (rotura de enlaces por

adición de H2O)

4. Liasas Adición de grupos a los dobles

enlaces o eliminación grupos para formar dobles enlaces

5. Isomerasas Reacciones de isomerización

(reordenamientos moleculares) 6. Ligasas

Formación de enlaces entre 2 sustratos, con aporte de ATP

grupos aldehidos gupos acilos grupos glucosilos grupos fosfatos (kinasas)

Transforman polímeros en monómeros. Actuan sobre: enlace éster enlace glucosídico enlace peptídico enlace C-N

Entre C y C Entre C y O Entre C y N

Entre C y O Entre C y S Entre C y N Entre C y C

-Deshidrogenasas. -Oxidasas. -Reductasas. -Peroxidasas -Catalasas. -Oxigenasas. -Hidroxilasas.

Transaldolasas, Transcetolasa. Acil-, metil-, glucosil-, fosforiltransferasas. Quinasas. Fosfomutasas. Esterasas. Glucosidasas. Peptidasas. Fosfatasas. Tiolasas. Fosfolipasas. Amidasas. Desaminasas. Ribonucleasas Descarboxilasas. Aldolasas. Hidratasas. Deshidratasas. Sintasas. Liasas. Racemasas. Epimerasas. Isomerasas. Mutasas (no todas).

Sintetasas. Carboxilasas

Si una molécula se reduce, tiene que haber otra que se oxide

Cada una de las 6 clases se subdivide en varias subclases y cada subclase en sub-subclase:

Ej: Acetilcolinesterasa (AChE) EC 3 - Hidrolasa EC 3.1 – Actúa sobre enlace ester EC 3.1.1 – Hidrolasa de ester carboxílico EC 3.1.1.7 – Acetilcholinesterasa (Esterasa de acetilcolina)

Reacción: acetilcolina + H2O = colina + acetato

Sistema colinérgico

La función de la acetilcolinesterasa (AChE) es la inactivación rápida del neurotransmisor acetilcolina después de su liberación en las sinápsis colinérgicas Además se localiza en tejidos desprovistos de colina, por lo que se le atribuyen otras funciones

EC 3.1.1.7

AChE

La enzima colinacetiltransferasa (ChAT) acetila la colina (Ch) utilizando acetil-coenzimaA (Acetil-CoA) para formar el neurotransmisor acetilcolina (ACh). La ACh, que se libera mediante vesículas sinápticas y la participación del transportador vesicular de ACh (VAChT). La ACh liberada al espacio sináptico puede interactuar con receptores colinérgicos muscarínicos o nicotínicos. Finalmente, ACh es hidrolizada por acetilcolinesterasa (AChE) para producir acetato (A) y Ch. La Ch es recaptada por la neurona presináptica por un transportador de Ch de alta afinidad (ChT).

La Sinápsis Colinérgica

ChAT

AChE en PATOLOGÍA

La miastenia gravis (debilidad muscular) Enfermedad neuromuscular autoinmune (se generan anticuerpos contra receptores de ACh) y Crónica: debilidad de los músculos esqueléticos causada por un defecto en la transmisión de los impulsos nerviosos a los músculos (tratamiento con Inhib AChE) No confundir con miastenia congénita sináptica, EAD (Endplate acetylcholinesterase deficiency) o síndrome miasténico congénito de Engel: déficit de Col Q (NUNCA administrar Inhib AChE!!!)

La Enfermedad de Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa: deterioro cognitivo y trastornos conductuales. El sistema colinérgico es el más afectado por la patología (papel de ACh en memoria)

AChE en PATOLOGÍA

La miastenia gravis (debilidad muscular) Enfermedad neuromuscular autoinmune (se generan anticuerpos contra receptores de ACh) y Crónica: debilidad de los músculos esqueléticos causada por un defecto en la transmisión de los impulsos nerviosos a los músculos (tratamiento con Inhib AChE) No confundir con miastenia congénita sináptica, EAD (Endplate acetylcholinesterase deficiency) o síndrome miasténico congénito de Engel: déficit de Col Q (NUNCA administrar Inhib AChE!!!)

La Enfermedad de Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa: deterioro cognitivo y trastornos conductuales. El sistema colinérgico es el más afectado por la patología (papel de ACh en memoria)

BuChE o colinesterasa del suero

La función fisiológica de la Butirilcolinesterasa (BuChE) se desconoce Puede hidrolizar acetilcolina, aunque sin potencial papel en la sinápsis colinérgica (condiciones normales) Presente en casi todos los tejidos Especialmente abundante en suero

EC 3.1.1.8

BuChE en PATOLOGÍA BuChE puede hidrolizar algunos ésteres de colina, los cuales pueden ser drogas como Procaína*, tetracaína*, aspirina, heroína y cocaína También se ha propuesto que puede servir de “barrera” ante el envenenamiento por organosfosforados La actividad BuChE puede estar completamente ausente en individuos con mutaciones genéticas: fenotipo silente Individuos SIN patología pero NO pueden hidrolizar algunos compuestos de uso en medicina (*): anestésico suxametonium

BuChE es especialmente abundante en el suero siendo sintetizada en el hígado por lo que la disfunción hepática cursa con niveles bajos de actividad BuChE

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD COLINESTERASA POR EL MÉTODO DE ELLMAN

+

( C H 3 ) 3 N - C H 2 - C H 2 - S - C O - C H 3 +

acetiltiocolina

AChE

+

tiocolina ( C H 3 ) 3 N - C H 2 - C H 2 - S -

+

acetato + 2H + 3 C H - C O O -

butiriltiocolina

BuChE ( C H 3 ) 3 N - C H 2 - C H 2 - S - C O - C H 3

+ - C H 2 - C H 2

tiocolina

+ ( C H 3 ) 3 N - C H 2 - C H 2 - S -

+

butirato 2H +

3 C H - C O O - C H 2 - C H 2 -

BW

Iso-OMPA

Basado en la oxidación de grupos tioles libres por un compuesto cromogénico un tioanálogo del sustrato preferente (ATCh/BuTCh)

BuChE

AChE X

X

5-tio-2-nitrobenzoato

C O O

N O 2 S

-

-

conjugado

C O O

( C H 3 ) 3 N - C H 2 - C H 2 - S - S N O 2 +

-

+

Cromóforo 412 nm

C O O

N O 2 S

-

-

DTNB

-

S

C O O

N O 2

S

C O O

N O 2

-

+ tiocolina

( C H 3 ) 3 N - C H 2 - C H 2 - S - +

La tiocolina reacciona rápidamente con el DTNB (5-tio-2-nitrobenzoato) muestra un color amarillo intenso y un máximo de absorbancia a 412 nm

Análisis de actividad enzimática: espectrofotómetros

Un espectrofotómetro tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática a través de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Permite al operador realizar dos funciones: 1. Da información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra (ej AN Abs 260 nm) 2. Indica indirectamente que cantidad de la sustancia que nos interesa está presente en la muestra

Lector de placa permite adaptar los métodos y evaluar simultáneamente gran número de muestras (placas de 96 pocillos)

Objetivos (El alumno habrá de ser capaz de): Medir actividades enzimáticas por técnicas colorimétricas. Representar gráficamente el curso temporal de la reacción y valorar la linealidad del proceso. Calcular actividades enzimáticas, expresando el resultado en unidades de actividad enzimática. Observar una cinética michaeliana y representar la curva de velocidad frente a concentración de sustrato. Determinar las constantes cinéticas por la representación de Lineweaver-Burk.

La práctica…

Ensayo de actividad enzimática 1) La formación de producto con el tiempo. 2) El efecto de la concentración de sustrato.

Procedimiento: Preparar la tanda de 6 tubos (más un tubo para al ‘autocero’) según el protocolo

1º Añadir el volumen de sustrato (butiril-tiocolina o BuTCh) y de agua indicado para completar en volumen a 1 ml. 2º Añadir 1 ml de disolución de DTNB (agitar y esperar 2 minutos hasta primera medida). Antes de la primera medida de actividad, preparar una cubeta sólo con 2 ml de agua y 1 ml de DTNB (volumen total 3 ml), y usarla para hacer el ‘autocero’ del colorímetro 3º ‘Disparar’ la reacción con la enzima.

*La adición de inhibidores es necesaria si la muestra puede contener AChE y BuChE; si sólo una de ellas está

presente, como es el caso, se pueden omitir.

3º ‘Disparar’ la reacción con la enzima. (tubo a tubo NO todos de golpe…) Anotar cada 20 sg (durante 3 min) el valor de absorbancia (a 410 nm)

Representar gráficamente la absorbancia frente al tiempo para cada uno de los tubos y obtener la recta que mejor se ajusta a los puntos: calcular el ∆Abs/min

[ ] [ ]dtPd

dtSdvVelocidad =

−==Reacción: S P

Perfil de Velocidad o Curva de Progreso

Curva de progreso: Determina vo experimentalmente (para cada [S]) [S] ajustable por el investigador

Cinética Enzimática: Velocidad de transformación de reactivos en productos Método de estudio del mecanismo de una reacción: estudio de la velocidad de la reacción (y su variación en respuesta a cambios en los parámetros experimentales) Las enzimas modifican las velocidades de las reacciones La velocidad se expresa como cambio en [S] (o aparición de P, cambio en [P]) por unidad de t

vo

vo

Representación de la Ecuación de Michaelis-Menten

*

Para conocer la concentración de sustrato final en cada uno de los tubos, aplicar: Vi × Si = Vf × Sf

Por ejemplo, para el tubo 1: 0.05ml ×6mM = 3ml × S1 (S1 = 0.1 mM) CÁLCULOS DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Unidad Internacional (U): Cantidad de enzima que transforma 1 micromol de sustrato por min.

1 UNIDAD = 1 U = 1 μmol / min

La relación absorbancia - concentración sigue la Ley de Lambert-Beer: Absorbancia = ε C L C = Abs / ε L(espesor) siendo ε= coeficiente de extinción molar del cromóforo (1,36×104 litro/ mol cm). C = concentración molar de producto formado (moles / litro). L = longitud del paso óptico de la cubeta (1 cm). En la práctica (para nuestra reacción colorimétrica): C = Abs /1,36×104 (moles / litro)

Cálculos

Promediar Incremento absorbancia (∆Abs) frente a tiempo (min), ∆Abs /min, comprobando linealidad gráficamente, A continuación, calculad la actividad enzimática, sabiendo el coeficiente de extinción del cromóforo, empleando la expresión: Actividad en U/ml (µmol.min-1.ml-1) = [(∆Abs/min)×103×Vt] / [1.36×104 × Vm] Donde Vt es el volumen total en la cubeta, y Vm el volumen de muestra (enzima). 103 es una factor de conversión. Para simplificar los cálculos, conviene calcular un factor “f” tal que: Actividad en U/ml (µmol.min-1.ml-1) = (∆Abs/min)×f Calcular dicho factor f para nuestros ensayos

Cálculos

Representar gráficamente la absorbancia frente al tiempo para cada uno de los tubos y obtener la recta que mejor se ajusta a los puntos: calcular el ∆Abs/min Calcular la actividad enzimática en U/ml suero (μmol/min /ml suero) - Valores ∆Abs/min, v, 1/v, [S], 1/ [S] - Gráfica de v frente a S y 1/v frente a 1/S. - Valor obtenido de KM y Vmáx .

Representación de la Ecuación de Michaelis-Menten

*

Representación de la Ecuación de Michaelis-Menten

Usamos el ordenador en el laboratorio como ayuda para representar… pero contamos con sólo 6 puntos

A partir de 6-8 puntos experimentales, puede considerarse fiable la determinación gráfica de KM y Vmax por este método

En la práctica no suelen calcularse la Vmax ni la KM a partir de la curva de saturación, es poco preciso

Calcular los inversos para la representación de Lineweaber-Burk

1

21

kkkKM

+= −

Si k2<<k-1: a

M KkkK 1

1

1 == −

-Significado de KM : su valor es próximo a la [S] que suelen darse en condiciones fisiológicas. Esto permite la regulación de la actividad del enzima en respuesta a pequeñas variaciones de pH, Tª, fuerza iónica, …. -Sería la [S] a la cual el enzima trabaja a la mitad de su velocidad máxima. Tiene unidades de concentración (M)

La KM puede ser un indicador de la afinidad de unión del enzima por el sustrato

La KM y la Vmax son únicas para cada actividad enzimática en unas condiciones de pH y Tª determinadas

-Es un proceso bifásico: KM: da información sobre la fase de fijación del sustrato E+S⇔ES. Vmax: da información sobre la fase catalítica (cinética de paso de S⇒P).

-Significado de vmax : La vmax revela el número de recambio de la enzima -(La Constante catalítica ó) El Número de recambio (turnover): Número de moléculas de sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo y por cada molécula de enzima, en condiciones de saturación (U/mol de enzima ó µmol de Sustrato X min.-1 X mol de enzima-1) Si hay S >>>> E, todo E está como ES y la kcat ~ k2

1.- ¿Por qué es mejor usar butiriltiocolina que acetiltiocolina para medir la actividad de butirilcolinesterasa? ¿Y por qué butiriltiocolina y no butirilcolina? ¿Por qué prescindimos de inhibidores de colinesterasas? 2.- ¿La enzima ensayada da una respuesta lineal de formación de producto con el tiempo? ¿La enzima ensayada, cumple la ecuación de Michaelis - Menten? 3.- En hojas aparte deberá presentar un informe, que contenga los cálculos ya comentados: - La tabla de Resultados. - Gráfica de absorbancia frente a tiempo. - Tabla con valores de ∆Abs/min, v, 1/v, [S], 1/ [S] - Gráfica de v frente a S y 1/v frente a 1/S. - Valor obtenido de KM y Vmáx .

Cuestionario - Informe

Los cuadernillos de practicas deben entregarse al profesor responsable de la práctica al concluir la misma, con el nombre del alumno, así como del compañero…

pero individualmente

(Y en numero de “puesto” donde se realiza la práctica)

Directrices para laboratorios básicos – niveles de bioseguridad 1 y 2

Protección personal

En el laboratorio SIEMPRE ATENTOS!!

Sin bata no se puede acceder al laboratorio

OBLIGATORIEDAD!!!

Directrices para laboratorios básicos – niveles de bioseguridad 1 y 2 Procedimientos 1. Estará estrictamente prohibido pipetear con la boca. 2. No se colocará ningún material en la boca ni se pasará la lengua por las etiquetas. 3. Todos los procedimientos técnicos se practicarán de manera que se reduzca al mínimo la formación de aerosoles y gotículas. 4. Se limitará el uso de jeringuillas y agujas hipodérmicas, que no se utilizarán en lugar de dispositivos de pipeteo ni con ningún fin distinto de las inyecciones por vía parenteral o la aspiración de líquidos de los animales de laboratorio. 5. Todos los derrames, accidentes y exposiciones reales o potenciales a materiales infecciosos se comunicarán al supervisor del laboratorio. Se mantendrá un registro escrito de esos accidentes e incidentes. 6. Se elaborará y seguirá un procedimiento escrito para la limpieza de todos los derrames. 7. Los líquidos contaminados deberán descontaminarse (por medios químicos o físicos) antes de eliminarlos por el colector de saneamiento. Puede ser necesario un sistema de tratamiento de efluentes, según lo que indique la evaluación de riesgos del agente con el que se esté trabajando. 8. Los documentos escritos que hayan de salir del laboratorio se protegerán de la contaminación mientras se encuentren en éste.

Directrices para laboratorios básicos – niveles de bioseguridad 1 y 2 Procedimientos

Directrices para laboratorios básicos – niveles de bioseguridad 1 y 2

Zonas de trabajo del laboratorio 1. El laboratorio se mantendrá ordenado, limpio y libre de materiales no relacionados con el trabajo. 2. Las superficies de trabajo se descontaminarán después de todo derrame de material potencialmente peligroso y al final de cada jornada de trabajo. 3. Todos los materiales, muestras y cultivos contaminados deberán ser descontaminados antes de eliminarlos o de limpiarlos para volverlos a utilizar. 4. El embalaje y el transporte de material deberán seguir la reglamentación nacional o internacional aplicable. 5. Las ventanas que puedan abrirse estarán equipadas con rejillas que impidan el paso de artrópodos.

Seamos Profesionales!! (=responsables)