• Describir y discutir los méritos de los métodos directos e indirectos utilizados para el diagnóstico de infecciones animales

• Evaluar sus características para las condiciones del control de la infección

Objetivos

Razones diagnóstico

• Salud, producción y comercio mundial demanda plataformas rápidas de alerta, capacidad global y armonización diagnóstica

• Prevenir, detectar y controlar enfermedades animales

• Tecnologías de detección como base para la salud global “una salud”

Aspectos de importancia para el control

• Conocimiento de la enfermedad• Diagnóstico correcto• Acción sobre animales positivos?• Vacunación ?

CONCEPTOS FUNDAMENTALES

• Conocer las características de infección, virulencia, patogenicidad y capacidad de transmisión del agente

• Mecanismo de infección y respuesta inmune protectora

• Interpretar resultados diagnósticos de la enfermedad

La tecnología diagnóstica pretende…..

• Detectar la presencia o ausencia de un patógeno y su subsecuente identificación y caracterización

• Detectar el efecto patológico, o la respuesta inmune a la infección por un patógeno en particular

• Fácil?? Sensible, seguro, reproducible…..

Métodos diagnóstico aceptados*

• Validado

• Sensible

• Especifico

• Rápido

• Simple

• Barato y

eventualmente automatizado para evaluar gran número de muestras

*

Diagnóstico Directo: Identificación Agente

a. Cultivo, Aislamiento y caracterización

b. Identificación de componentes (proteína)• Inmunohistoquímica

• Inmunodetección de proteínas, Captura Elisa

• Inmunoensayos (radioinmunoensayo. IFA y Elisa cuantitativo)

• Inmunocromatografía (flujo lateral)

• Proteómica

c. Identificación de ácido nucleico específico• PCR y rt-PCR

• Polimorfismos RLFP y otros basados en DNA (huella digital)

• Sondas DNA y tecnología de microarreglo, DNA

• Extracción de ácido nucleico (muestras específicas)

Detección de ácido nucleicos

PCR

Paso 1. DenaturaciónDNA

Paso 2. DNA templado

Las sondas se unen solo si complementarias a la muestra de DNA

Paso 3. Elongado

Elongación en presencia de polimerasa

Cantidad de DNA específicose duplica en cada ciclohasta que eventualmente se hace detectable

Pasos esenciales

PCR variantes

Ventajas

• Obtención de copias múltiples de un gen específico

• Muy poca cantidad de muestra

• DNA parcialmente degradado (parafina)

Limitantes

• Limitación del tamaño de fragmento a amplificar

• No es cuantitativo

• Posibilidad de contaminación Especificidad

Anidado; competitiva; RT-PCR a partir de mRNA: cDNA; cuantitativa; RFLP polimorfismo genético……

RT-PCR

• El RT-PCR se ha convertido en la herramienta central del diagnóstico de enfermedades de animales productivos

• En función de su comportamiento será la base del diagnóstico molecular para la erradicación y control de la epizootias futuras

• Aftosa, NDV, Peste porcina clásica, Lengua azul, Influenza aviar, IBR, DVB,…….

Microarreglo

• Detección simultanea de secuencias múltiples (20.000 o mas) de RNA o DNA (organismos) en una muestra en el mismo sitio (10µm) eje: 70 nucleótidos.

• Sensibilidad baja para algunos agentes

• Validación debe utilizar muestras clínicas para evaluar sensibilidad comparativa a PCR.

• Early, rapid and sensitive veterinary molecular diagnostics -Real Time PCR applications

• Pestana, E., Belak, S., Diallo, A., Crowther, J.R., Viljoen, G.J. 1st Edition., 2010, XIV, 310 p. Hardcover, ISBN 978-90-481-3131-0

Visión futura del diagnóstico veterinario

• Punto de inflexión en el balance entre cliente, costo y mejorar su desempeño

• Nuevo estándar de oro? beneficio para el cliente

• Utilidad, fortalezas y debilidades, aplicación exitosa de los resultados generados

• Secuenciación, la utilización de microfluidos y la metagenómica

WAVLD. 2013, 2015

Visión futura del diagnóstico veterinario

• PCR, migrará del laboratorio a la clínica

• Valor de la información generada

• Laboratorios relaciones con rango de expertos en materias como epidemiología, medicina, salud de hato, y manejo

• Meta proveer resultados no solamente individuales sino ser parte de formular soluciones

Implicaciones de las nuevas tecnologías

• Detección y caracterización de patógenos a las 24 horas de un brote, 25 años atrás???

• Diferenciación entre cepas de un mismo virus • Secuencia de ácido nucleico permite conocer capacidad

de causar enfermedad• Alta sensibilidad, los resultados positivos deben ser

cuidadosamente considerados con respecto a su validez • Desarrollo y uso ha sobrepasado la validación,

estandarización y estándares • Hace este resultado sentido biológico ?

• Aglutinación

• Inhibición de hemaglutinación

• Inmunodifusión en gel de agar

• Fijación de complemento

• Elisa indirecta (iELISA)

• Elisa competitiva (cELISA)

• Elisa de bloqueo (bELISA)

• Inmunoadsorción (Inmunoblot)

• Inmuno-Fluorescencia

Diagnóstico indirecto detección de anticuerpos

Metodologías recientes para medición de anticuerpos

• Pruebas rápidas e in situ

• Biosensores

• Bioluminometría

• Fluorescencia polarizada

• Quemoluminiscencia

• Cromatográfia de flujo lateral

VALOR DE LAS PRUEBAS SEROLOGICAS

Indicativo de infección

Óptimo

. Suero pareado (2-3 semanas)

. Conversión Negativo-Positivo

. Aumento título (4X)

Considerar

. Inmunidad pasiva-aborto

. Historia de vacunación

CARACTERÍSTICAS DESEABLES

Economía en reactivos (Ag/Ac)

Sensibilidad y Especificidad óptimas

Prueba estandarizada y valorada en la especie de trabajo

Reproducible, sencilla, libre de inespecificidades

Equipo y reactivos necesarios de fácil consecución

Antígenos libres de riesgo biológico.

Prueba validada con respecto a la referencia

La validez de las pruebas serológicas depende…

Calidad del manejo y almacenamiento de la muestra

Especificidad y Sensibilidad de la prueba

Calidad de las pruebas estadísticas empleadas en evaluación

GUÍAS PARA SELECCIONAR UNA PRUEBA DIAGNÓSTICA

Comparación con la prueba de Referencia

Controles positivos y negativos representativos

Evaluación bajo condiciones similares a la prueba

Existen valores normales?

Se emplea sola o como parte de una batería

Existe evidencia de que mejorará el resultado.

Factores a evaluar en Interpretación • Frecuencia de ocurrencia de la infección en la

población, momento de infección no detectada posteriormente todos positivos IBR, DVB…

• Duración de la reacción serológica causada por la infección, variación agente, inmunización o infección, anamnesis

• Inmunotolerancia, negativo no representativo de infección, DVB, Brucella

• Variación prueba serológica, títulos, isotipos…

• Estatus vacunal, antígeno, adyuvante, especie, individuo, anterior exposición, resistencia….

Prueba serológica ideal

* Detectar infección en período deincubación. Alta sensibilidad.

* No influencia de anticuerpos inespecíficos.Alta especificidad.

* Capacidad para detectar portadorescrónicos. Alta sensibilidad.

* Diferenciar vacunados de infectados. Altaespecificidad.

CRITERIOS PARA INTERPRETACIÓN DE PRUEBAS SEROLÓGICAS

• SENSIBILIDAD

• ESPECIFICIDAD

• VALOR PREDECIBLE

• SEGURIDAD

• PRECISIÓN

• COEFICIENTE DE VARIACIÓN

Una buena prueba?

INFECTADO LIBRE

+

-

SENSIBILIDAD

ESPECIFICIDAD

Falso negativo

Falso positivo

Sensibilidad diagnóstica• La sensibilidad de una técnica es la probabilidad

que esta produzca un resultado positivo verdadero cuando se usa en una población infectada (comparada con un estándar de referencia)

• Formula

Sensibilidad D = TP/TP+FN

Especificidad diagnóstica

• La especificidad de una técnica es la probabilidad que esta produzca un resultado negativo verdadero cuando se usa en una población no infectada (comparada con un estándar de referencia)

• FormulaEspecificidad D = TN/FP+TN

• El valor predictivo positivo de una prueba es la probabilidad que un animal este infectado cuando un resultado positivo se obtiene.

• En la practica los valores predictivos solo deben ser calculados de estudios de cohorte o estudios que reflejen legítimamente el numero de animales en esta población que son infectados con la enfermedad de interés en ese momento

• Predictivo pos = TP/ TP+FP

• El valor predictivo negativo de una prueba es la probabilidad que un animal no este infectado cuando un resultado negativo se obtiene.

• Esta medida de seguridad debe usarse solamente si la prevalencia esta disponible de los datos

• Predictivo Neg= TN/TN+FN

• VALIDACION

Animal infectado

Probabilidad de obtener resultado positivoen la prueba. Sensibilidad

Animal libre de la infección

Probabilidad de obtener resultadonegativo en la prueba. Especificidad

• INTERPRETACION

Animal positivo en la prueba

Probabilidad de estar infectado: Valorpredictivo de positivo

Animal negativo en la prueba

Probabilidad de libre: Valor predictivo denegativo

• CONSTANTE

• VARIABLE

SEGÚN

PREVALENCIA

Una Prueba Validada....

Consistentemente provee resultados queidentifican animales como positivos o negativos

Predice el estado de infección del animal dentrode un grado predeterminado de certeza

Variables que afectan el comportamiento de una prueba

De la muestra: Biológicos y externos

Del sistema o prueba

Exactitud analítica

De los resultados

Sen-D

Esp-D

Prevalencia de la población blanco

Repetibilidad y Reproducibilidad

Repetibilidad grado de coincidencia deresultados entre corridas de prueba en unmismo laboratorio

Coeficiente de variabilidad no debeexceder 10%

Reproducibilidad es el grado de coincidenciade resultados entre laboratorios

Coeficiente de variabilidad no debeexceder 15%

Animales de Referencia

Estado de infección conocido, bajo que estándar. Positivo y negativo

Probarlos en la nueva prueba y determinar corte

Cuantos animales de referencia? (Tablas) SnD< 300. EsD <1000

Representativos?

Cinética de Ac, isotipos y cantidad

Definición Punto De Corte

Distribución defrecuencias enanimales de referencia

Seleccionar punto decorte

Visual-percentiles

Calcular Sn-D y Es-D

Definiciones

Seguridad: habilidad de una prueba para dar una respuesta correcta.

Confiable: segura y precisa.

Coeficiente de variabilidad: desviación estándar (DE)/media x 100%.

Eficacia: Porcentaje de animales clasificados correctamente con un método determinado.

Positivo verdadero: Animal enfermo correctamente clasificado por la técnica.

Positivo falso: Animal incorrectamente clasificado por la técnica empleada.

Tamiz Intermedio Confirmativa

Especificidad Baja Media Alta

Sensibilidad Alta Media Baja

Antígeno sLPS sLPS P(A/M), sLPS

Dil. suero 1/50 1/200 1/50

Conjugado IgG(L&P) IgG1 Común

Tipo iELISA iELISA CELISA

Estrategia de condiciones para la selección de Elisa Brucelosis

Tamizado Intermedia Confirmatoria

Especificidad Baja Media Alta

Sensibilidad Alta Media Baja

Prueba ARB 2ME FC

Buferada RIV

Tarjeta

MRT

iELISA, FP iELISA CELISA

Estrategia para la selección de técnicas para Brucelosis

• Herpesvirus bovino Tipo I (BHV-1). • Clínica: (1) vías respiratorias (2) oculares (3) abortos (4)

genitales (5) cerebro (6) generalizada en terneros recién nacidos. Subtipos 1,2,y 3

• Distribución secreciones, ocular, nasal, genital• Persistencia, portador, Inmunosupresión• Detectar, monitorar y eliminar• Serología, SN, Elisa pE, pB, DIVA• Vacuna?? Deleción

Rinotraqueitis Infecciosa Bovina (IBR)

Diagnóstico Infección por IBR

• Aislamiento a partir de material infeccioso, en cultivos celulares MDBK, BTC, inclusiones intranucleares e inmunofluorescencia

• Inmunofluorescencia y peroxidasa en cortes histológicos de tejidos

• Serología inmunoenzimáticas (ELISA) o seroneutralización, sueros pareados

• Efecto citopático sobre macrófagos alveolares y otras células epiteliales de las vías respiratorias altas

• Prevención: Aplicación de vacunas inactivadas inmunogénicasconstituyen el mejor método, por la seguridad que ofrecen. Las vacunas de virus modificados pueden remotamente producir enfermedad al difundir el virus

Rinotraqueitis infecciosa bovina

• Vacunas a virus vivo modificado o atenuado y a virus muerto para su inoculación vía parenteral o intranasal

• Dadas las características de los Herpesvirus, su utilización debe ser cuidadosamente evaluada.

• Las muertas o muy atenuadas vía IN podrían ser aplicadas en animales preñados pero otras pueden causar aborto. Las IN pueden inducir anticuerpos locales en poco tiempo, 3 días, pueden ser útiles en protección parcial ante una evidencia de brote.

• Dos dosis de vacuna muerta pueden ser empleadas para inducir inmunidad protectora.

Oferta diagnóstica

• Detectar antígeno

• Detectar Anticuerpos a diferentes antígenos

• gB con monoclonal para Elisa Bloqueo

• Diferenciar cepas RT-PCR

• Diferenciar vacunado de infectado DIVA

• Pestivirus, familia Flavivirus, genotipos 1 y2, CPE • Infección aguda inaparente con signos transitorios de fiebre,

leucopenia, 3-7 días postinfección, diarrea y baja producción • Preñadas resultar en infección fetal o transplacentaria• Fetos abortados, momificados, nacidos muertos o nacer con

anormalidades severas • Terneros inmunotolerantes, con viremia persistente (PI)

fuente de transmisión del virus, enfermedad de las mucosas extensas erosiones en la mucosa oral y gastrointestinal

• Efecto inmunosupresor que predispone a los animales a la infección por otros microorganismos

Diarrea Viral Bovina (BVDV)

Diagnóstico en detección del virus para prevención y control de BVD

1) Identificación y eliminación de animals infectadospersistentemente (PI)

2) Aumento de inmunidad mediante vacunación3) Implementar medidas de bioseguridad

Indispensable apoyo de laboratorioKit de RT-PCR aprobado para BVDV

• Determinar si un animal ha sido infectado algunavez con el virus

• Determinar si un ternero tiene anticuerposcalostrales

• Determinar si el animal está inmunizadoapropiadamnete

• Determinar si el animal tiene infección aguda• Determinar si el ternero se ha infectado in utero

Utilidad de la serología para diagnóstico de BVDV

• Inmunohistoquímica o fluorescencia enmuestras de piel de oreja (muesca)

• Elisa para antígeno en suero, piel o muestra individual de suero

• RT-PCR en sangre, leche o piel de oreja• Dudas?? gp E2 y ERNS o “atipicas” o

pestivirus “HoBi-like” BVDV tipo 3

Tipos de pruebas para detectar animales PI

Pruebas para detección de infección por DVBPrueba Detección

AntígenoSensibilidad Cepa Tiempo Costo

Aislamiento No virus infeccioso

Alta (1UFP/ml)

No 2-14 días Alto

Fluorescencia Si Alta Posible 1-2 días Moderado

Histoquímica Si Alta Posible 2-4 días Alto

Elisa Captura Si Baja Posible 2-6 horas Bajo

RT-PCR Si Alta Posible 1-2 días Moderado/Alto

SN-Ac Si Alta Posible 2-4 días Moderado

Elisa-Ac Si Moderada Posible 4-6 horas Bajo

Oferta diagnóstica

• Detectar antígeno

• Detectar Anticuerpos a diferentes antígenos p80 (NS3)

• gB con monoclonal para Elisa Bloqueo

• Diferenciar cepas

• Diferenciar vacunado de infectado DIVA

LEUCOSIS BOVINA ENZOOTICA (BLV)

Retrovirus Oncornaviridae Subgrupo C; Género Delta-Retrovirus subfamiliaOrthoretrovirinae

• Infección subclínica cualquier edad, incluye fase embrionaria

• Linfocitosis 30-70%

• Linfosarcoma 5-10% (Tumores), muerte súbita

• Provirus integrado, infección latente

• Inmunodeficiencia?

Exposición al virus deLeucosis bovina enzoótica

No infección Infecciónseroconversión

InfecciónPersistente Linfocitosis

Persistente

Linfoma

DETECCIÓN DE ANTÍGENO

CULTIVO DE LEUCOCITOS

• Visualización por microscopía electrónica

• Formación de sincitios (PO714)

Detección por reacción inmunológica

• Inmunofluorescencia

• Radioinmunoensayo

• Infectividad por formación de sincitios

• Inmunoperoxidasa para p24

• Inmunodifusión en gel

RESPUESTA HUMORAL A BLV

• Relación niveles de anticuerpos y protección

• Antígenos estructurales solubles gp51 y p24

• Antígenos de membrana

• Infección y replicación en linfocitos B

• Anticuerpos pasivos (6-7 meses)

DETECCIÓN DE ANTICUERPOS• Fijación de complemento

• Inmunodifusión doble, gp51, p24

• Inmuno-blot p24

• Contraelectro-osmoforesis

• Neutralización viral-Inhibición de formación desincitios

• Inmunofluorescencia

• Radio inmunoensayo, p24

• Ensayo inmunoenzimático ELISA p24, gp51

INMUNODIFUSIÓN DOBLE EN GEL (AGID)

• Simple y económica

• Antígenos gp51 y p24

• Sueros controles referencia OIE E1 y E4

• Multi-especie

• Sensibilidad y Especificidad 96.4% y 94.6%

Ensayo inmunoenzimático (ELISA)

• Suero y leche

• Objetiva, automatizada

• Antígeno gp51 o p24 indirecta o captura Anticuerpos monoclonales

• Mayor sensibilidad y especificidad

Diagnóstico por PCR

Máxima sensibilidad, amplificación de DNA provirus (105 a 106 células)

Gag, pol, env

2.1-kb m RNA tax-rex

PCR e hibridación, 10-5 ug DNA sensibilidad

8.26 kb 340bp 5’ homología entre cepas de diferente procedencia

Diagnóstico individual por PCR

• Terneros con anticuerpos calostrales

• Tumor diferenciación entre esporádica y enzootica-linfoma infeccioso

• Tejido tumoral sospechoso colectado en matadero

• Infección reciente, antes de desarrollo de anticuerpos

ELISA débil positivo

• Tamiz sistemático previo a introducción a centros de inseminación/producción vacunas

Transmisión de la Neosporosis bovina

Exogena Endógena

quiste

En tejido

ooquiste

aborto

Ciclo selvático Infección persistente

Comida

agua

Infección primariaCrías infectadas

Vía principal Vía secundaria

Oferta diagnóstica

• Elisa indirecta anticuerpos, leche, suero

• Elisa antígeno?

• qPCR MCA, prueba tamiz para diferentes coccidias, basado en 18s rDNA, colorante fluorescente y Tm para diferenciar

• Detecta, identifica y diferencia DNA de coccidias de varias especies,

ganado, porcinos, caninos y felinos WAVDL

Conclusiones

• Conocimiento del agente infeccioso• Selección diagnóstica con base en técnicas validadas• Amplia oferta diagnóstica• Desarrollo tecnológico en constante avance