Universidad Autónoma de QuerétaroLicenciatura en microbiología, Campus Aeropuerto

Reporte de Practica #1:

Preparación de Medios de Cultivo

Laboratorio de Biodiversidad de los Microorganismos

Profesora:

Erika Beatriz Álvarez Hidalgo

Equipo #9:

Alma Marina Peralta RuizRebeca Alejandra Oloarte Pulido

Juana María López Martínez

4 de septiembre del 2013

INTRODUCCIÓN

Microorganismos de todo tipo abundan en la naturaleza, pero para efecto de este reporte solo vamos a referirnos a las bacterias las cuales se encuentran en todas partes e incluso algunas habitan en las superficies interior y exterior del cuerpo humano, éstos pueden ser microorganismos patógenos o bacterias que habitan en nosotros sin causar ninguna enfermedad, como parte de nuestra flora.

Hasta 1882, los organismos microbianos se aislaron mediante la preparación de diluciones seriadas de las muestras en un medio líquido. En 1882, Walther Hesse y Angelina Fannie quienes trabajaban en el laboratorio del médico alemán Robert Koch desarrollaron agar para su uso como un agente solidificante en los medios de cultivo; así, los medios de cultivo que contienen agar proporcionan una superficie sólida para crecer y aislar una amplia variedad de microorganismos.

Las bacterias crecen en prácticamente cualquier fuente de alimentación ecológica que proporcione carbono. En la naturaleza, las bacterias pueden descomponer sustancias sólidas e insolubles por la liberación de las enzimas en el sustrato en el que están creciendo. Así, estas sustancias se descomponen o se transforman en sustancias más simples en un proceso llamado digestión extracelular, ya que se lleva a cabo fuera de las células bacterianas.

El agar es una cadena de polímero que comprende unidades de hidratos de carbono de la galactosa azúcar. El agar se disuelve en agua hirviendo y luego se deja enfriar para de esta forma ser gelificado a una temperatura de entre 34° C y 36° C, formando una masa gelatinosa que se mantiene firme incluso a temperaturas como los 65° C; Dicho agar también mantiene una resistencia considerable capaz de soportar las fuerzas de cizallamiento, por lo que los geles producidos conservan su firmeza en condiciones normales de laboratorio, alguien podría pensar que la gelatina tiene propiedades similares al agar en cuanto a gelificación se refiere, sin embargo la gelatina no es resistente al ataque de las enzimas bacterianas cuando por el contrario, el agar no se ve afectado por dichas enzimas y esto permite que se pueda preparar un medio de cultivo sin necesidad del uso de inhibidores de bacterias que en un momento dado podrían interferir con el crecimiento del organismo que queremos reproducir en el medio.

Desde el desarrollo de la placa de agar en el laboratorio de Robert Koch, varios métodos se han utilizado para lograr una distribución uniforme del crecimiento bacteriano sobre o dentro del agar.

OBJETIVO

Aprender a elaborar medios de cultivo simples, enriquecidos y selectivos/diferenciales para el cultivo de microorganismos, destacando la importancia del calentamiento, pH, distribución, esterilización y almacenamiento adecuado y de esa manera, obtener las condiciones óptimas para el crecimiento microbiano en dicho medio de cultivo.

MATERIALES

Caldo Soya Tripticaseína (CST): Activar cepas

2 Huevos 1 probeta de 500 ml.

Agar Soya Tripticaseína (AST): Estriar, extender y VP

Telurito de potasio al 1% 6 matraces de 1000 ml.

Agar Eosina Azul de Metileno (EMB): Estriar

50 ml. de Sangre desfibrilada

2 vasos precipitado de 250 ml.

Agar Baird Parker (ABP): Extender

250 Cajas Petri desechables

5 frascos schott de 500 ml.

Agar Sangre (AS): estriar 100 Tubos de 13x100 mm 8 charolas p/pesar o papel aluminio

Agar Pseudomonas: estriar

1 Micropipeta de 10 mL 8 Espátulas

Medio SIM: picadura (movilidad)

1 Micropipeta de 1 mL 6 Agitadores magnéticos

Solución salina al .85% 1 caja de puntas p/micropipeta de 10 y de 1 ml.

1 potenciómetro

4 platos calientes 6 L de agua destilada 100 ml. de agua de llave estéril

Cloro

METODOLOGÍA

Pasos para preparar un medio de cultivo sólido Baird – Parker (ABP)

1. Suspender 60g. de polvo para preparar agar Baird – Parker en un litro de agua purificada.

2. Mezclar perfectamente, checar que el pH de la mezcla este en el rango permitido

3. Calentar con agitación frecuente

4. Hervir durante un minuto hasta disolución completa

5. Distribuir y esterilizar a 121° C durante 15 minutos.

6. Enfriar a 45° C – 50° C

7. Adicionar 10 ml. (por litro) De solución estéril al 1 % de Telurito

8. Agregar 50 ml. (por litro) De emulsión de yema de huevo estéril.

9. Mezclar bien

10.Vaciar en placas Petri.

Diagrama de flujo para la elaboración de un medio de cultivo sólido de Agar Baird – Parker (ABP)

No

No

No

Si

Si

Si

Material estéril y/o

desinfectado

Encender la campana de flujo laminar

Pasar a un frasco schott, etiquetar, cerrar (sin que sea a

presión), poner cinta testigo

Desinfectar el huevo y un cuchillo

Esterilizar con olla de presión o

autoclave a 121° C

Retirar del fuego hasta que baje la

espuma

La espuma del líquido

sube

Llevar a ebullición por un total de un minuto

Calentar tapado en plato caliente con

agitación constante

Introducir un agitador magnético

al matraz

Adicionar ácido clorhídrico o

hidróxido de sodio

El pH está dentro del

rango

Pesar agar en balanza analítica

Adicionar la cantidad proporcional de agua destilada y agitar hasta deshacer grumos

Adicionar medio a un matraz Erlenmeyer

Establecer proporción de Agar Baird – Parker y agua

destilada a preparar

Inicio

No

No

Si

Si

Si

Tapar y almacenar para uso futuro

Fin

Está sólido

Verter el agar Baird – Parker ya completamente preparado

en cajas Petri

Esperar dentro de la campana de flujo laminar

a que solidifique

Agregar 10ml de solución estéril a 1% de

Telurito y 50ml de emulsión de yema de

huevo (por litro) al agar ya esterilizado

Esperar a que tenga una temperatura

templada

Temperatura aproximada 45° – 50°C

Checar la temperatura del frasco schott con el agar Baird – Parker

ya esterilizado

Emulsionar

Agregar solución salina al 85%

Con ayuda del cuchillo abrir el huevo y separar la yema, ponerla en una probeta previamente esterilizada

Llevar el material a la campana de flujo laminar para preparar la

emulsión de yema de huevo

RESULTADOS

MEDIO DE CULTIVO COMPOSICIÓN MODO DE ACCIÓN DEL

INGREDIENTE EMPLEO MORFOLOGÍA COLONIAL

Agar Baird–Parker

10g Peptona de caseína

5g Extracto de carne

1g Extracto de levadura

5g Cloruro de litio17g Agar

12g Glicina10g Piruvato de

sodiopH final 6.8±0.2

Peptona de caseína: Se recomienda para enriquecer medios para el cultivo de un gran número de bacterias de difícil crecimiento.

Peptona de gelatina: Bajo contenido de cistina y triptófano; ausencia de carbohidratos; Promueve una respuesta típica y consistente de organismos no exigentes en sus requerimientos nutricionales.

Peptona de carne: Usada para cultivos de organismos difíciles y aerobios, así como en formulaciones en la diferenciación de reacciones hemolíticas.

Peptona de soya: Alto contenido de carbohidratos y vitaminas; adecuada para el cultivo de una gran variedad de microorganismos, incluyendo hongos y bacterias exigentes como Clostridium y especies de Neisseria.

Extracto de carne: se obtiene a partir de carne libre de grasa, predigerida enzimáticamente. Libre de carbohidratos fermentables, lo que resulta adecuado para la preparación de medios de cultivo destinados a la realización de ensayos de fermentación.

Extracto de levadura: Se obtiene por extracción acuosa de células de levadura autolizadas; presenta un alto contenido de vitamina B, lo que ofrece excelentes condiciones de crecimiento en medios de cultivo diseñados para el aislamiento de microorganismos exigentes como Haemophilus y Neisseria.

Cloruro de litio: inhibe el crecimiento de bacilos Gram negativos fermentadores de lactosa,

Es selectivo para el aislamiento y diferenciación de Estafilococos a partir de diversas muestras.

El medio base contiene peptona, extracto de carne y extracto de levadura, que son la fuente de carbono, azufre, nitrógeno, vitaminas y minerales. El piruvato de sodio y la glicina estimulan selectivamente el crecimiento de Estafilococos. El cloruro de litio y telurito actúan como inhibidores de microorgansimos contaminantes.

Debido a la reducción del telurito a teluro; el Staphylococcus aureus desarrolla colonias negras.

Las colonias de Estafilococos presentan dos características:

Lipólisis y proteolisis, por lo que se observan halos claros característicos con un anillo opaco dentro del mismo por el contenido de yema de huevo. La reacción con la yema de huevo y la reducción del telurito coinciden prácticamente con la prueba de la coagulasa positiva.

Agar Eosina y Azul de Metileno

10g Peptona de gelatina

5g Lactosa5g Sacarosa2g Fosfato dipotásico13.5g Agar0.4g Eosina

0.065g Azul de metileno

pH final 7.2±0.2

Es un medio ligeramente selectivo y diferencial para el aislamiento de microorganismos entéricos a partir de diversas muestras. Permite una diferenciación muy clara entre las colonias de organismos fermentadores de lactosa y aquellos que no la fermentan; el contenido de eosina y azul de metileno inhiben en cierto grado organismos Gram positivos. La presencia de sacarosa permite para algunos miembros del grupo coliforme fermentarla con más facilidad que la lactosa.

Las colonias lactosa positiva son azules a moradas con brillo metálico o poseen centros oscuros con periferias transparentes incoloras y las que son negativas en lactosa o sacarosa, se observan incoloras o rosa pálido transparentes

Agar Verde Brillante

5g Peptona de carne

3g Extracto de levadura

5g Peptona de caseína

5g Cloruro de sodio

10g Lactosa10g Sacarosa

0.08g Rojo fenol0.0125g Verde

brillante20g Agar

pH final 6.9±0.2

Medio de cultivo selectivo y diferencial para el aislamiento de Salmonella (excepto S. typhi y Shigella) a partir de diversas muestras.

La selectividad de este medio se basa en la concentración del verde brillante, que inhibe microorganismos Gram positivos y parcialmente a Gram negativos. La lactosa y la sacarosa permiten diferenciar la flora acompañante que utiliza estos carbohidratos, del

Las colonias típicas de Salmonella son translúcidas, ligeramente rojas a rosa con halo rojo brillante.

Los organismos fermentadores de lactosa y/o sacarosa que se desarrollan en el medio se diferencian fácilmente por la formación de colonias amarillo verdosas rodeadas de una zona amarilla

1. Durante la práctica primero se pesó la cantidad de agar deshidratado de acuerdo a la cantidad de agua destilada que íbamos a poner, en este caso 500ml por lo tanto utilizamos 30g de agar Baird – Parker

2. Después se depositó en un matraz Erlenmeyer con un poco del agua destinada para la mezcla, y se agitó hasta disolver el polvo, después se agregó toda el agua.

3. Se procedió a checar el pH de la mezcla; en nuestro caso el pH estaba en el rango por lo que no tuvimos que agregar ácido clorhídrico ni hidróxido de sodio

4. Se introdujo un agitador magnético al matraz

5. Se procedió a calentar en un plato caliente hasta llevarlo a ebullición durante un minuto, teniendo precaución de retirarlo del fuego cuando la espuma subía

6. Una vez ya bien disuelto el agar, se puso en un frasco schott para su esterilización

7. Ya esterilizado todo el material incluyendo el agar, se procedió a llevar el material necesario a la campana de flujo laminar

8. Con cuidado, se desinfectaron los huevos y un cuchillo este último también se flameo previo a la apertura de huevo y separación de la yema

9. Se agregó solución salina al 85% y se emulsionó

10.Una vez que la temperatura del agar alcanzó los 45–50°C se agregó le agrego el telurito

11.Se mezcló bien y se procedió a añadir la emulsión de yema de huevo

12.Una vez ya preparado se pasó a porcionar en las cajas Petri y se almacenó para su cultivación en un futuro

DISCUSION DE RESULTADOS

En general toda la práctica se llevó a cabo sin ningún inconveniente, tuvimos una ejecución bastante buena tomando en cuenta que es la primera vez que realizamos una práctica de este tipo y utilizamos equipo nuevo que nunca habíamos utilizado con anterioridad.

A nuestro punto de vista, el resultado fue satisfactorio ya que lo preparamos con un cuidado minucioso y siguiendo todas las indicaciones que se nos dieron. Si acaso tuvimos una única observación negativa es que una de nosotras cuando estaba vaciando el medio a las cajas Petri, tomó el frasco demasiado arriba en el pivote de forma que tuvo cierto contacto con la parte externa del pivote, sin embargo no creemos que haya impactado de forma negativa el resultado ya que esto sucedió dentro del área de la campana de flujo laminar por lo que en teoría el ambiente estaba estéril en ese momento. Una forma de comprobar si hubo contaminación es observando que las cajas Petri no hayan desarrollado colonias de bacterias cuando aún no se ha realizado la siembra ya que de ser así, nuestro pequeño error tuvo consecuencias y esas consecuencias son que dicha caja de Petri nos sería inservible para cultivar el tipo de bacterias que deseábamos cultivar.

CONCLUSIÓN

Aprendimos a identificar y a preparar los medios de cultivo más utilizados, los métodos que se utilizan para llevar a cabo dicha preparación, así como los tipos de microorganismos que crecen en estos medios. La preparación de medios de cultivo no solo es muy delicada sino que también es un proceso tardado; se deben de seguir una serie de pasos con exactitud, precisión y siempre teniendo cuidado de utilizar correctamente el equipo de laboratorio.

En éste laboratorio vamos a estar manejando bacterias por lo que debemos minimizar los errores en la ejecución de la metodología para garantizar la inocuidad del material y de los reactivos que estamos manipulando, ya que es muy fácil que nuestros medios de cultivo se infecten con bacterias aerobias que no queremos aislar o estudiar. También aprendimos que las bacterias necesitan un medio óptimo y que este a un pH adecuado por lo que no debemos dar por sentado que el pH de nuestro medio de cultivo será el adecuado, sino que debemos verificarlo y en caso de no ser así, hacer que este medio tenga el pH adecuado agregándole algún ácido o base según sea el caso, también aprendimos a utilizar una olla de presión para la esterilización tanto del medio de cultivo como del material. Hoy sabemos, gracias a esta práctica, que hay diferentes medios de cultivo y que vamos a utilizarlos dependiendo del tipo de cultivo que se desee ya sea para cultivar colonias de bacterias para un estudio general, o para aislar un tipo específico para un estudio más particular, es esta selectividad la que lleva a nuestro equipo a tener cierto favoritismo por los medios de cultivo enriquecidos, ya que nos agrada más la idea de investigar algo particular que algo general.

BIBLIOGRAFÍA

Biología de los microorganismos – Michael T. Madigan, John Martinko, Jack Parker – Editorial Pearson – Pag. 103 a la 110Microbiología – K. Piatkin – Editorial Mir – Traducido por N. Arnaiz Planelles – Pag. 75 a la 91Intro. a la Microbiología – Gerard J. Tortora – Editorial Medica Panamericana – Pag. 168 a la 182