predicción del crecimiento del hongo botrytis spp en
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Universidad de La Salle Universidad de La Salle
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Ingeniería de Alimentos Facultad de Ingeniería
2020
Predicción del crecimiento del hongo Botrytis spp en fresa Predicción del crecimiento del hongo Botrytis spp en fresa
Fragaria ananassa por medio de termografía infrarroja Fragaria ananassa por medio de termografía infrarroja
Carolayn Moreno Quintanilla Universidad de La Salle, Bogotá
Angie Katherin Sotelo Aldana Universidad de La Salle, Bogotá
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Citación recomendada Citación recomendada Moreno Quintanilla, C., & Sotelo Aldana, A. K. (2020). Predicción del crecimiento del hongo Botrytis spp en fresa Fragaria ananassa por medio de termografía infrarroja. Retrieved from https://ciencia.lasalle.edu.co/ing_alimentos/720
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PREDICCIÓN DEL CRECIMIENTO DEL HONGO Botrytis spp EN
FRESA (Fragaria ananassa) POR MEDIO DE TERMOGRAFÍA
INFRARROJA
CAROLAYN MORENO QUINTANILLA
ANGIE KATHERIN SOTELO ALDANA
TRABAJO DE GRADO PRESENTADO COMO REQUISITO PARA
OPTAR AL TITULO DE INGENIERA DE ALIMENTOS
Directora:
ING. MARIA PATRICIA CHAPARRO GONZALEZ. MS.c
Co - Director:
ING. ORLANDO RINCON ARANGO. Ph.D.
Universidad de La Salle
Facultad de Ingeniería
Programa de Ingeniería de Alimentos
Bogotá, DC. 2020
NOTA DE
ACEPTACIÓN
_______________________________
Directora: María Patricia Chaparro
González
_______________________________
Co-director: Orlando Rincón Arango
_______________________________
Jurado: Alfredo López Molinello
Bogotá,
2020.
DEDICATORIA
¨Que nadie te menosprecie por ser joven. Al contrario, que los creyentes vean en ti un
ejemplo a seguir en la manera de hablar, en la conducta, y en el amor, fe y pureza”.
1 Timoteo 4:12
Dedicado a Dios, ya que cada paso que he dado es por él. Nunca me desampara,
siempre estado presente tal como un padre que es.
A mi madre, la mujer a quien más admiro por su tenacidad y resiliencia, gracias a ella
soy quien soy, es mi mayor inspiración, una mujer quien ha sido mi mayor guía tanto
en lo espiritual, psicológica, ética y personalmente.
Te dedico este trabajo mami, no es perfecto, pero cada logro que he conseguido es
gracias a ti, eres mi motor de vida.
CAROLAYN MORENO QUINTANILLA
Dedico esta tesis en primer lugar a Dios quien me ha permitido llegar hasta aquí, quién me
ha forjado día a día para lograr superar distintos obstáculos y permitirme superarme,
brindándome la sabiduría necesaria para alcanzar mis objetivos.
A mi madre, quien me brindó su apoyo dentro de todo mi proceso de formación profesional y
ha dedicado todo su esfuerzo y tiempo por formar la persona que soy hoy en día, por su
apoyo y amor incondicional en cada situación de mi vida.
A mis hermanos por acompañarme y aconsejarme cada día de dificultad y por jamás
permitir que me rindiera ante las adversidades, por último, quiero agradecer a mi padre
quien aunque no se encuentre presente físicamente siempre ha estado y estará en mi corazón
apoyándome y brindándome su amor con sus recuerdos.
ANGIE KATHERIN SOTELO ALDANA
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a Dios por que gracias a él he llegado hasta aquí, es quien me ha brindado el
conocimiento, fortaleza y sabiduría para continuar en este proceso de aprendizaje en la
Universidad de La Salle. A mi hermosa familia, por su apoyo durante mis viajes de casa a
Universidad y viceversa, sin ellos no hubiera podido continuar mi proceso, siempre han estado
allí para levantarme, gracias por ser mi mayor y primordial pilar.
A la profesora María Patricia Chaparro por su orientación, correcciones y por brindarnos
todo su conocimiento incondicional durante estos cinco años. Al igual que el docente Orlando
Rincón, quien nos animó y dio forma a este trabajo a pesar de nuestras fallas. Agradezco al
profesor Alfredo López, nuestro jurado, el cual siempre estuvo al pendiente y nos brindó sus
correcciones para así lograr realizar lo mejor posible este trabajo, además de ser un gran guía
durante nuestra carrera universitaria.
Mientras otras parejas pasan tiempo juntas en recreación, nosotros hablamos de
esta tesis. Juan David Ayala gracias por tu apoyo, por tu compañía, por levantarte temprano
para escucharme leer este documento muchas veces, mi querido, gracias por siempre estar.
Agradezco a mi compañera de tesis Angie Sotelo, ya que fue un maravilloso apoyo
durante el desarrollo experimental mientras yo cumplía mis demás sueños y metas. Juntas
logramos aprender una de la otra, a trabajar en equipo y a seguir firmes para sacar adelante este
proyecto de grado.
CAROLAYN MORENO QUINTANILLA
Le agradezco a Dios por brindarme todas las herramientas para superar diferentes
adversidades y guiarme durante todo este proceso de formación tanto profesional como
personal.
Agradezco a mi madre Sandra Aldana por acompañarme y permitirme la fortuna de
forjarme como profesional en esta institución a través de sus esfuerzos, por dedicarme su tiempo
para aconsejarme y no dejarme vencer ante mis debilidades, a mis hermanos por estar siempre
presentes en cada situación de tristeza, alegría o dificultad, por apoyarme y brindarme siempre
una voz de aliento cuando las cosas parecían más difíciles.
Le agradezco a la profesora Patricia Chaparro quién como directora de este proyecto
siempre nos brindó sus conocimientos y apoyo para lograr sacar adelante este proyecto de la
mejor forma, al profesor Orlando Rincón por apoyarnos y ayudarnos con las correcciones
necesarias para presentar un adecuado documento final; asimismo agradezco a todos los
docentes del programa de Ingeniería de Alimentos de la Universidad de La Salle que durante
todo el proceso de la carrera nos brindaron las herramientas y conocimiento necesario para
poder desarrollar este trabajo, así como nos guiaron y aconsejaron en el mismo.
Por último, quiero agradecer a mi compañera Carolayn Moreno por su comprensión,
compromiso y dedicación en este proyecto y por su apoyo y consejos durante diferentes
adversidades presentadas a lo largo de nuestra formación.
ANGIE KATHERIN SOTELO ALDANA
RESUMEN
El objetivo general de esta experimentación consistió en predecir el crecimiento del hongo más
común en fresa Fragaria anannasa, Botrytis spp, mediante imágenes termográficas in vivo e in
vitro. Se trabajaron 136 fresas repartidas en dos grupos: M1: (control) y M2 (inoculación de
Botrytis spp). Estas fueron almacenadas en condiciones ambientales durante una semana, la cual
se realizó seguimiento de: Tomas digitales y termográficas, análisis fisiológico y análisis
microbiológico. El procedimiento in vivo consistió en apartar tres fresas de cada grupo (por
triplicado) en cajas de Petri, con el fin de mantenerlas fijas para realizar las tomas fotográficas
y cambios fisiológicos observados cada tres horas, desde las 9am a 4pm, durante la semana de
almacenamiento y el restante de las fresas de ambos grupos fueron trabajados para el
seguimiento fisicoquímico y análisis microbiológico, el cual consta del procedimiento in vitro,
realizando seguimiento fotográfico digital y termográfico diariamente.
Las imágenes termográficas demostraron que se puede predecir el crecimiento del hongo,
siempre y cuando las condiciones de: luminosidad, humedad y temperatura, se encuentren
constantes durante todo el seguimiento de la experimentación. Contrario a los resultados
fisiológicos y fisicoquímicos los cuales demostraron que no influyen en la presencia del hongo,
sin embargo, la variación de temperatura en las muestras se evidenció que si existe un patrón
de cambio de temperatura respecto a los parámetros fisiológicos y fisicoquímicos. Asimismo,
la presencia de hongo acelero la degradación del fruto llegando al punto de senescencia en
menor tiempo, dicha degradación se confirmó con el aumento de temperatura a los 2 días de
inicio de seguimiento en M2.
Tabla de Contenido
DEDICATORIA………………………………………………………………………………. 3
AGRADECIMIENTOS………………………………………………………………………...5
RESUMEN……………………………………………………………………………………..7
GLOSARIO...……………………………………………………………….………………...16
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA……………………………..………………………17
OBJETIVOS…………………………………………………………………………………..18
1.MARCO DE REFERENCIA……………………………………………………………….19
1.1 Marco Teórico….………………….………………………………………….......19
1.1.1 Fresa y taxonomía....………………………………………..…………...19
1.1.2 Producción de fresa……………………………………………………..21
1.1.3 Hongo Botrytis cinérea.......…………………………….……….……....23
1.1.4 Degradación enzimática de paredes celulares del fruto…………………27
1.1.5 Termografía Infrarroja....……………….………………………………..28
1.2 Antecedentes……………………………………..……………………………......29
1.3 Marco Legal.............................................................................................................32
2. MATERIALES Y METODOS..............................................................................................34
2.1 Materia Prima..........................................................................................................34
2.2 Limpieza y Desinfección………………...............……………………………......34
2.3 Preparación de los grupos…………………….……………..………………….....35
2.3.1 M1 Control................................................................................................35
2.3.2 M2 Inoculación de Botrytis spp................................................................35
2.4 Tomas digitales y termográficas..............................................................................36
2.4.1 Tomas digitales……………………………………………………….....36
2.4.2 Tomas termográficas y análisis mediante el software FLIR
Tools..................................................................................................................37
2.5 Estandarización del Sistema de Calificación de la Fresa (Fragaria Anannasa).....38
2.6 Procedimiento In Vivo de los grupos M1 y M2………………………………..…..38
2.6.1 Seguimiento visual, acompañado de imágenes digitales y
termograficas.....................................................................................................38
2.6.2 Análisis fisiológico y fisicoquímicos……………………………….......39
2.6.2.1 Tasa de respiración……………………………………………39
2.6.2.2 Determinación de color…………………………………….…40
2.6.2.3 Determinación de pH…………………………………………40
2.6.2.4 Determinación de acidez……………………………………..40
2.6.2.5 Determinación de °Brix………………………………………41
2.7 Procedimiento in vitro de los grupos M1 y M2.......................................................41
2.7.1 Análisis microbiológico. Preparación de diluciones y siembra en medio
de cultivo………………………………………………………………….….41
2.7.2 Seguimiento fotográfico de tomas digitales y termográficas…….…….42
2.7.3 Identificación del hongo……………………………………………......42
2.7.3.1 Análisis cualitativo macro y microscópicamente…………….42
2.7.3.2 Análisis cuantitativo………………………………………….43
2.8 Métodos experimentales ……………………….…………………………...…….43
2.8.1 Diseño de experimentos……………………………………...………....43
2.8.2 Análisis estadístico……………………………………………………...44
3. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS............................................................45
3.1 Imágenes Digitales y Termográficas y Sistema de Calificación del Fruto………..45
3.1.1 Estandarización del sistema de calificación de la fresa (Fragaria
anannasa)………………………………………..............................................45
3.2 Resultados de seguimiento de imágenes digitales y termográficas y sistema de
calificación del fruto de las muestras M1 y M2 (In Vivo e In Vitro)…………………..48
3.2.1 seguimiento de imágenes digitales, termográficas y calificación del
grupo del grupo m1 (in vivo e in vitro)…………………………..……………49
3.2.2 Seguimiento de imágenes digitales, termográficas y calificación del grupo
del grupo M2 (in vivo e in vitro)……………………………………………....57
3.3 Análisis de resultados del procedimiento In Vivo de los grupos M1 y M2……...…….64
3.4 Análisis de resultados del procedimiento in vitro de los grupos M1 y M2……...….…73
3.5 Resultados y análisis fisiológico y fisicoquímicos……………………………………77
3.5.1 Tasa de respiración………………………………………………………...….77
3.5.2 Determinación de color CieLa*b*…………………………………………….80
3.5.3 Determinación de pH…………………………………………………….……84
3.5.4 Determinación de acidez…………………………………………………..….85
3.5.5 Determinación de sólidos solubles (°Brix)……………………………...…….87
3.5.6 Efecto de la temperatura en parámetros fisicoquímicos……………………....89
3.6 Identificación del hongo………………………………………………………………90
3.6.1 Imágenes digitales de los tratamientos en medio de cultivo PDA………..…..90
3.6.2 Análisis cualitativo…………………………………………………………....91
3.6.2.1 Morfología de colonias en medio de cultivo PDA…………………….….91
3.6.2.2 Comparación colonias macro y microscópicamente………………….…..93
3.6.3 Análisis cuantitativo…………………………………………………………..98
3.7 Análisis estadístico…………………………………………………………..………..98
CONCLUSIONES…………………………………………………………………..……….100
REFERENCIAS………………………………………………………………………..……102
ANEXOS………………………………………………………………………….…………103
Lista de tablas
Tabla 1. Taxonomía de la fresa................................................................................................19
Tabla 2. Área, producción y rendimiento nacional...................................................................22
Tabla 3. Área, producción y rendimiento departamental de fresa…………………………....22
Tabla 4. Taxonomía del hongo B. cinerea................................................................................24
Tabla 5. Temperaturas optimas de crecimiento de B. cinerea..................................................26
Tabla 6. Pautas para la descrcipcion Macroscópica de un hongo.............................................42
Tabla 7. Diseño experimental……………………………………………………………...…44
Tabla 8. Escala visual para evaluar el pocentaje de daño en frutos de fresa............................45
Tabla 9. Descripcion visual y sistema de calificacion del fruto...............................................47
Tabla 10. Imágenes digitales, termográficas y calificación del fruto del grupo M1 (in vivo e in
vitro)…………………………………………………………………………………………..49
Tabla 11. Imágenes digitales, termográficas y calificación del fruto del grupo M2 (in vivo e in
vitro)………………………………………………………………………………………..56
Tabla 12. Resultados colorímetros obtenidos a partir de calculadora CieLa*b* y modelo de
color Word para los grupos evaluados......................................................................................81
Tabla 13. Descripción morfológica de las colonias encontradas en los grupos evaluados…..93
Lista de figuras
Figura 1. Descripción de la planta de fresa..............................................................................20
Figura 2. Etapa tempera del moho gris.....................................................................................24
Figura 3. Etapa avanzada del moho gris...................................................................................24
Figura 4. Conióforos de Botrytis cinérea a 40X…………………………………………......27
Figura 5. Conióforos de Botrytis spp a 100X...........................................................................27
Figura 6. Crecimiento de cepas del hongo B. cinérea..............................................................31
Figura 7. Escala de color de la fresa utilizada en Colombia....................................................34
Figura 8. Macrotubo.................................................................................................................36
Figura 9. Cámara termográfica.................................................................................................37
Figura 10. Análisis de imagen termográfica en fresa mediante Software FLIR Tools............37
Figura 11. Modelo de calificación del fruto.............................................................................46
Figura 12. Gráficas de temperatura respecto al tiempo del procedimiento in vivo del grupo M1
y M2 ..........................................................................................................................................69
Figura 23. Gráficas de temperatura respecto al tiempo del procedimiento in vitro del grupo M1
y M2 ....................................................................................................................................75
Figura 3. Cambios de la fruta en diferentes etapas................................................................77
Figura 15. Intensidad respiratoria de las muestras durante 5 días de seguimiento…………..79
Figura 16. Resultados colorímetros obtenidos a partir de calculadora CieLa*b* y modelo de
color...........................................................................................................................................82
Figura 17. Seguimiento de pH de los tratamientos..................................................................84
Figura 18. Seguimiento de %acidez de los tratamientos..........................................................86
Figura 19. Seguimiento de ºBrix de los grupos evaluados.......................................................88
Figura 20. Visualización del grupo M1 en agar al 5 día del tratamiento..................................90
Figura 21. Visualización del grupo M2 en agar al 5 día del tratamiento..................................90
Figura 22. Cepa control de Botrytis spp……………………………………………………...91
Figura 23. Visualización in vivo e in vitro y en microscopio del grupo M1………………….93
Figura 24. Visualización in vivo e in vitro y en microscopio del grupo M2………………….96
Figura 25. Visualización in vitro y microscópica de Botrytis spp……………………………97
Lista de anexos
Anexo 1. Metodología de seguimiento realizada durante la semana de experimentación…..113
Anexo 2. Tabla correspondiente a las horas de realización del seguimiento del registro
fotográfico in vivo e in vitro, mostrado en
minutos……………………………………………………………………..………………..114
Anexo 3. ANOVA temperatura Sp1 y Sp2 in vivo………………………………………….115
Anexo 4. ANOVA temperatura Sp1 y Sp2 in vitro el primer día de inoculación…………...116
Anexo 5. ANOVA temperatura Sp1 y Sp2 in vitro el quinto día de inoculación……………117
GLOSARIO
Conidios: Esporas, que son generadas mediante la mitosis, asexuales e inmóviles
formadas por medio de una hifa (Biasoli, 2013).
Emisividad: Equilibrio de la radiación termina que es procedente por el objeto en
estudio por medio una diferencia de temperatura determinada (Collieu y Powney, 2006).
Enzimas: Moléculas que aceleran la velocidad de reacción con el fin de alcanzar un
equilibrio (Cremosi, 2002).
Epidermis: Tejido vegetal que protege el cuerpo primario del alimento. Consta de una
sola capa de células (Herrera, 2012).
Espora: Célula reproductiva de hongos, tienen la capacidad de dividirse con el fin de
instaurar un nuevo sujeto (Acosta, 2019).
Hifa: Hace parte del micelio del hongo y es característico por ser largo y filamentoso
(Kuhar, 2013).
Micelio: Cuerpo del hongo, compuesto por filamentos, hifas (Kuhar, 2013).
Necrotrofo: Organismo que se nutre con células muertas producidas por el mismo
organismo (Ojeda, Casse, Gómez, Garay, Coronel y Avalos, 2011).
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Actualmente las pérdidas en las producciones de cultivos de fresa en Colombia se deben
principalmente a fitopatógenos principalmente el moho gris, Botrytis cinerea, ocasionando que
dichas pérdidas lleguen hasta un 60%. Este problema tiene como consecuencia el deterioro de
la fresa y disminución de productividad en los cultivos. El moho gris se detecta gracias a que se
adhiere en la superficie del fruto y se prolifera hasta parecer un aspecto algodonoso, lo que
causa contaminación en la fresa y baja calidad haciendo que el consumidor la rechace, tanto por
su aspecto como por su alteración nutricional.
Uno de los principales inconvenientes del cultivo comercial de fresa, e incluso en la postcosecha
de la fruta, es el manejo de las enfermedades que en su gran mayoría son de carácter fungoso;
seguido por algunos problemas bacterianos, de nematodos y muy pocos ocasionados por virus.
La fresa es una especie altamente susceptible a patógenos que ocasionan enfermedades como el
moho gris cuyo agente causal es el hongo Botrytis cinerea (Martínez, Castillo, Carmona y
Avilés, 2010). Dichas enfermedades son de vital importancia puesto que pueden ocasionar
grandes pérdidas de la fruta afectando su calidad y por ende rentabilidad en el mercado. El
moho gris B. cinerea es el patógeno que más causa daños destructivos durante el cultivo
postcosecha de la fresa, ocasionando graves pérdidas económicas estimadas alrededor del 30%
del total de la producción. Es importante destacar que en postcosecha este patógeno es aún más
agresivo, afectando al 95% de los frutos 48 horas después de cosechados (Matamoros, 2004).
Conforme a lo mencionado previamente, es importante implementar nuevas tecnologías que
permitan identificar este tipo de patógenos a tiempo para que el control sea oportuno y de tal
manera se minimicen las pérdidas postcosecha, errores humanos y por ende reducción de costos.
Una de estas tecnologías es la termografía de infrarrojo que consiste en la detección de radiación
por medio de las distintas temperaturas detectadas. Este método es una de las técnicas no
destructivas de análisis con uso en la industria alimentaria utilizada para monitorear la
temperatura en productos perecederos en procesos de producción, transporte, almacenamiento
y venta; además de la ventaja de no parar las operaciones durante el proceso lo cual resulta
costoso para la empresa (Flir, 2011).
Formulación del problema
¿Es la termografía infrarroja una prueba rápida para la identificación, con un buen nivel de
confiabilidad, del crecimiento del hongo Botrytis spp en fresa (Fragaria ananassa)
relacionando los deltas de temperatura respecto a los cambios fisiológicos y fisicoquímicos?
OBJETIVOS
General
Predecir el crecimiento del hongo Botrytis spp en fresa (Fragaria ananassa) con estudios in
vivo e in vitro utilizando termografía Infrarroja.
Específicos
1. Comparar el crecimiento del hongo Botrytis spp in vitro e in vivo en la fresa variedad
Fragaria ananassa mediante imágenes termográficas y digitales.
2. Correlacionar las imágenes termográficas y digitales frente a las propiedades
fisiológicas, fisicoquímicas y microbiológicas durante el crecimiento del hongo Botrytis
spp en fresa variedad Fragaria ananassa.
1. MARCO DE REFERENCIA
1.1 MARCO TEÓRICO
1.1.1 Fresa y taxonomía
La fresa hace parte del género Fragaria, este fruto es significativamente conocido en todo el
mundo. Es originaria de Norteamérica, este género es el resultado de la hibridación de dos
especies americanas. Está fruta es considerada una planta perenne, es decir que vive más de 2
años, de pequeño porte que tiene la capacidad de desarrollarse en climas fríos, aunque no puede
soportar heladas que causen su deterioro; las fresas son alimentos no climatéricos, lo que
significa que no seguirá un proceso de maduración una vez se haya recolectado. Adicionalmente
tiene la capacidad de reproducirse de forma sexual y asexual, este último es posible gracias a la
formación de inflorescencias hermafroditas, que son pequeños pétalos de color blanco, quienes
desarrollan poliaquenios que contienen frutos en su superficie (Calderón, 2015). Su taxonomía
y descripciones botánicas se presentan en la tabla 1.
Tabla 2. Taxonomía de la fresa (Fragaria anannasa)
Reino Plantae
División Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Familia Rosaceae
Género Fragaria
Especie Fragaria ananassa
Fuente: Calderón, 2015.
Hasta el momento no se conoce con exactitud el origen de la fresa. Sin embargo, se indican dos
zonas de procedencia, la primera en Europa, específicamente de los Alpes europeos, y la
segunda en Chile. Existe una gran variedad de especies donde las más utilizadas comercialmente
son Camarosa, Albión, Camino Real, Monterrey, San Andreas, Portola, Ventana y Palomar
(Núcleo Ambiental S.A.S, 2015).
Actualmente, en Colombia la variedad albión (Fragaria Ananassa) presenta mayor crecimiento
del área cultivada y por ende la variedad preferida entre los consumidores. Esta especie tiene
una vida de anaquel muy corta, debido a su epidermis turgente y elevada tasa de respiración que
la hacen susceptible a daños mecánicos y a la invasión de algunos organismos patógenos, los
cuales contribuyen a pérdidas potenciales en postcosecha (Yahia e Higuera, 1992).
El manual de producción de la fresa (2015) presenta en su documento la descripción de la planta
de fresa (ver la figura 1), en donde menciona que la fruta costa de pequeños aquenios por arriba
de la epidermis (receptáculo) también llamados semillas.
FUENTE: Manual de Producción de Fresa (2015)
1.1.2 Producción de fresa
Figura 4. Descripción de la planta de fresa
Las estadísticas mostradas por la FAO (2016) muestran que el mayor productor en el mundo de
fresa es China con 3,793,864 toneladas seguido por Estados Unidos y México con 1,420,570 y
468,248 toneladas respectivamente; en cuanto a la superficie cosechada durante el 2016 China
fue el país con la mayor superficie cosechada de fresa en el mundo, con el 35.1% del total. Le
siguieron Polonia con 12.6%, Rusia con 7.3%, Estados Unidos con 5.3% y Turquía con 3.8%.
Sin embargo, Estados Unidos lidera la escala en cuanto al rendimiento de toneladas por hectárea
con 66.9, seguido de España con 47.6 y Egipto con 46.6. Entre los principales países
importadores se encuentran, para el año 2013, Reino Unido (470.770 ton), Canadá (123.463
ton), Estados Unidos (110.457 ton), Francia (90.587 ton) y Holanda (28.937 ton) (Núcleo
Ambiental S.A.S, 2015).
En Colombia, el crecimiento de cultivo de fresa ha aumentado rápidamente en los últimos 15
años, ya que en el 2004 existían 700 hectáreas de cultivo en todo el país, para el 2016 supero
las 2.500 hectáreas. El crecimiento en la inversión de este cultivo se debe a su alta rentabilidad
y al Ministerio de Agricultura que está cada vez más involucrado en estos cultivos, invirtiendo
principalmente en asistencia técnica a los agricultores (Vargas, 2016).
Durante el 2012 hasta el 2016 se mantuvieron las áreas cultivadas de fresa incrementando así la
producción nacional y su rendimiento. Sin embargo, al final de este periodo los rendimientos
fueron impactados negativamente debido a los cambios climáticos, como se evidencia en la
tabla 2.
Tabla 3. Área, produccióny rendimiento nacional de fresa
FUENTE: AGRONET – Base Evaluaciones Agrícolas Municipales - secretaria de la Cadena
Para el año 2013 en Colombia se produjeron 42.453 toneladas de fresa, siendo Cundinamarca
el departamento de mayor producción con 22.562 ton, seguido por Antioquia con 12.545 ton,
Norte de Santander con 3.360 ton, Cauca 2.808 ton y Boyacá con 542,2 ton. En la tabla 3 se
observa el área, producción y rendimiento departamental de la fresa durante el periodo 2014 -
2017, en donde se evidencia el comportamiento desde el 2013 al 2017 que se ha mantenido
liderando en producción el departamento de Cundinamarca con un 71% de la producción total
del país seguido por Antioquia y Cauca (Agronet, 2017).
Tabla 3. Área, producción y rendimiento departamental de fresa
FUENTE: AGRONET – Base Evaluaciones Agrícolas Municipales - secretaria de la Cadena
1.1.3 Hongo Botrytis cinérea
En la actualidad, la fresa con daños físicos presenta un problema, aunque los daños que más se
producen son gracias a los patógenos con un 85%, ya que las enfermedades provocan gran
cantidad de pérdidas en las fresas, seguido por los daños físicos con un 40% y finalmente los
fisiológicos con 2% (Parisi, 2012). Es así como una de las causas de descomposición de la fresa
y mayor pérdida pos-recolección es producido por la Botrytis cinerea, la cual el fruto es cubierto
por su micelio algodonoso. Aunque tiene la capacidad de continuar su crecimiento a los 0°C,
suele ser lento su desarrollo (Interempresas Media, 2018).
El cultivo de fresa se realiza en campo abierto en Colombia, y esto trae como consecuencias el
ataque de enfermedades como la B. cinerea y plagas, lo que genera pérdidas en su producción,
además de otras como las condiciones climáticas. Este hongo genera aproximadamente 25% de
pérdidas durante la cosecha y un 37% durante el segundo pico productivo, muchas veces hasta
el 70% de pérdidas durante toda la cadena productiva (Rubio, Alfonso, Grijalba y Pérez. 2015).
Muchos mercados de fresa se encuentran lejos de su lugar de origen de producción, por ende,
es necesario un manejo adecuado para evitar su deterioro. Por este motivo es muy importante
tener en cuenta las propiedades físicas, químicas y mecánicas del fruto para realizar un diseño
apropiado para toda su cadena de producción desde la cosecha, pasando por limpieza y
clasificación hasta el empacado y procesamiento en sus diferentes presentaciones. Por otro lado,
la presencia y contenido de antocianinas en la fresa, es indicativo de la calidad y estado de
madurez, también es relevante la firmeza, volumen y densidad del fruto, ya que son parámetros
de calidad y son de vital importancia para evaluar la calidad y realizar procesos tecnológicos
(Martínez, Mercado, López & Prieto, 2009).
Figura 6. Etapa avanzada del moho gris Figura 5. Etapa temprana del moho gris
La fresa hace parte de los alimentos altamente perecederos por su alta tasa de respiración, así
como también de los alimentos no climatéricos. Su vida luego de su recolección es muy corta y
vulnerable a daños físicos durante toda su cadena de producción (manejo, almacenamiento y
comercialización) y al ataque por microorganismos. En el cultivo existen múltiples hongos
patógenos que atacan a la planta de modo que disminuyen la longevidad, el rendimiento y la
calidad de la fruta, entre los patógenos que se puede encontrar en post-cosecha se citan los
siguientes: Botrytis, Penicillium, Rhizopus, Aspergillus, Alternaria (Undurruga y Vargas,
2013).
El patógeno Botrytis en su etapa temprana se presenta en forma de lesiones hundidas y el
crecimiento inicial del micelio gris y de las esporas, como se visualiza en la figura 2; cuando la
etapa es avanzada el fruto se cubre completamente de moho gris como muestra la figura 3 y se
extiende a la fruta adyacente por contacto directo (Koike y Bolda, 2016). AGRIOS (1995)
presenta la taxonomía del hongo B. Cinerea como se observa en la tabla 4.
Tabla 4. Taxonomía del hongo B. cinerea
Nombre Común Moho gris
Nombre Científico Botrytis cinérea
Clase Deuteromycetes
Orden Moniliales
Género Botrytis
Familia cinerea
FUENTE: Koike y Bolda (2016)
Este hongo produce la muerte celular en la planta contaminada. Botrytis cinerea se presenta en
fase reproductiva asexual y tiene como característica gran cantidad de esporas. Tiene la
capacidad de presentarse aun en temperaturas muy bajas, incluso causando daños y pérdidas en
cosechas las cuales han estado almacenadas durante un largo periodo de tiempo. Las esporas
que germinan en la planta no atacan directamente en los tejidos de las plantas sanas, actúan
sobre la cual presenta ya una herida causada por insectos u otros. La Botrytis se puede
desarrollar en dos formas, la primera es endógena la cual es la germinación de forma interna y
produce la descomposición interna, lo cual tiene como desventaja que no se pueda ver a simple
vista, la segunda es exógena la cual consiste en que el hongo se arroja desde el exterior al
interior. Los cultivos más propensos a tener esta enfermedad son los cultivos maduros, ya que
cuando están verdes presentan una concentración de acidez más alta, la cual obstaculiza la
penetración y proliferación de los microorganismos. Este hongo presenta actividad en bajas
temperaturas entre 0 a 10ºC, en donde las esporas ya han germinado, aunque muy pocas
penetran directamente en los tejidos los cuales se han producido ya por heridas. El patógeno
sobrevive gracias a que es un saprofito en gran cantidad de plantas contando sus malezas, o
aquella materia en descomposición, aunque después el 14avo mes disminuye su viabilidad
(García, 2017).
Según el documento de Benito, Arranz, y Eslava (2000) la Metodología de infección del hongo
B. cinerea consta de cuatro ciclos:
1. Espora de Botrytis cinerea se produce sobre cualquier material vegetal
2. Se transporta mediante corrientes de aire, en grandes distancias.
Tabla 5. Temperturas óptimas de crecimiento de B. cinerea
3. La espora alcanza la superficie del huésped.
4. Iniciación del ciclo de infección.
• Adhesión y germinación en la cara del huésped.
• Penetración al tejido vegetal (por medio de heridas o aberturas naturales, tanto por
procesos enzimáticos o mecánicos)
• El patógeno provoca la muerte de las células al punto de penetración, para así lograr
una lesión primaria, como consecuencia de los mecanismos de defensa de la planta.
• Fase de latencia en donde los M.O de defensa tratan de controlar el patógeno.
• Luego de un tiempo, el patógeno vence las barreras y comienza la proliferación en
el tejido vegetal. En el tejido ya contaminado, produce una generación de esporas,
las cuales comienzan el nuevo ciclo de infección.
Las fases de desarrollo del patógeno dependen de la temperatura del medio para desarrollarse,
así como muestra la tabla 5.
FUENTE: Latorre y Rioja (2002)
La morfología de Botrytis spp se caracteriza por la producción de una gran cantidad de micelios
de color gris y numerosos conidióforos largos ramificados, en donde las células redondas
producen racimos de conidios incoloros de color gris. La figura 4 muestra los conidióforos de
Botrytis cinerea microscópicamente a 40X y la figura 5 muestra los conidióforos de Botrytis
spp a 100X (Rojas, 2016).
FUENTE: Rojas (2016)
1.1.4 Degradación enzimática de paredes celulares del fruto
La primera fase de infección del hongo, como ya se ha mencionado previamente, consiste en la
penetración de la cutícula, posteriormente se produce la degradación de las paredes celulares de
la planta por enzimas hidrolíticas que facilitan la penetración y colonización de tejidos
hospederos y que favorecen el crecimiento de hifas (Elad, 1997). En este momento actúan las
enzimas que hidrolizan la pared celular generando liberación de nutrientes de las células del
hospedero, se crea estrés osmótico y causa muerte celular. Existen enzimas especificas las
cuales favorecen la degradación de la pared celular de Botrytis sp, las cuales se encuentran en
variedades de plantas y su producción puede ser inducida en cultivos que suministren sustratos
apropiados, entre las enzimas reportadas por estar involucradas en el proceso de patogenicidad
Figura 8. Conidióforos de Botrytis
cinerea a 40X Figura 7. Conidióforos de
Botrytis sp a 100X
de Botrytis sp se encuentran la cutinasa, poligalacuronasas, pectinliasas y pectin metil esterasas,
las cuales degradan la pectina (Reis, 2005).
1.1.5 Termografía Infrarroja
En la industria alimentaria es importante el control de la temperatura desde su producción, hasta
el transporte, almacenamiento y venta al consumidor, por ello y gracias a los desarrollos en
cuanto a métodos de investigación y nuevas tecnologías como la termografía infrarroja, la cual
es una técnica que consiste en medir la temperatura de un objeto de estudio a una distancia la
cual permite no tener contacto físico con este, consiste en el uso de una cámara termográfica la
cual detectara un patrón térmico al objeto al cual se apunta, ese arroja una imagen radiométrica
la cual contiene la información del cálculo de las medidas de temperatura en diferentes puntos
del objetivo de estudio (Melgosa, 2011).
Según la definición de termografía de Samanian y Mohebbi (2016) el proceso de termografía
es básicamente una impresión en donde interviene la transferencia de calor, consistiendo en
detectar la variación de calor emitido por diferentes partes del objetivo por medio de radiación
infrarroja arrojando resultados en tiempo real de esta distribución de calor en forma de imágenes
a color. Su aplicación es para determinar las diferencias de temperatura tanto en la superficie
del objeto como también el calor interno de este.
El uso de termografía infrarroja es característico por ser un proceso no invasivo y es adecuado
para el uso en la industria alimentaria, debido al rápido análisis cualitativo por brindar un
resultado “negativo” al descubrir factores extraños por interferencia de objetos. Inicialmente su
invención fue para aplicaciones militares, aunque hace poco esta técnica pasó a ser una
medición en otras industrias para diversos avances como el monitoreo de la temperatura para
seguridad y calidad de los alimentos (Gowen, Tiwaria, Cullenb, McDonnella y O’Donnella,
2010).
1.2 ANTECEDENTES
Según el trabajo de grado realizada por Moreno (2018) consistió en la evaluación de la relación
de las propiedades térmicas, enzimática, pH y color mediante termografía infrarroja en la
oxidación de un mínimamente procesado de lechuga. Las muestras fueron T0 (lechuga sin
procesar), T1 (lechuga mínimamente procesada) y T2 (lechuga mínimamente procesada con
ácido ascórbico como inhibidor) almacenadas durante tres días a temperatura de 17.8±0.68°C y
humedad relativa 70.86±3.55. Como resultados se obtuvieron que la muestras T0 la temperatura
varia en toda la hoja, las muestras T1 mostraron incremento de temperatura la cual coincidió
con al área de la oxidación y T2 tuvo incremento de la temperatura, pero manteniendo su vida
útil con buena apariencia general. Se concluye que la termografía infrarroja es una herramienta
para el control y monitoreo de la temperatura durante el procesamiento y almacenamiento de
alimentos mínimamente procesados, ya que permitió identificar las áreas de oxidación debido
a la transferencia de calor en los tejidos dañados.
Se realizó un proceso del comportamiento del pepino en presencia de ácido fumárico (AF). Para
eso se utilizó termografía infrarroja para poder ver la temperatura de la hoja en diferentes
condiciones de luz y oscuridad. Se encontró que las plantas con AF presentaron mayor
temperatura en la hoja en condiciones de luz, lo contrario sucedió con las hojas en oscuridad,
estas presentaron menor temperatura. Finalmente se concluye que el estudio permitió
efectivamente el seguimiento del avance del marchitamiento (Wang, Xiong, Ling,Feng, Zhong,
Shen y Guo, 2013).
Jiao, Wu, Zheng y Dong (2015) utilizaron la termografía infrarroja con el objetivo de monitorear
e identificar los tejidos de frutas (durazno) en proceso de descomposición, esto bajo
características de temperaturas no controladas y por convección natural, tomando registro
fotográfico dos veces al día. Los resultados mostraron que las diferencias de temperaturas
fueron significativas respecto a la descomposición en cada hora. Finalmente se concluyó que
esta información arrojada por la cámara termográfica es apta para identificar el grado del
deterioro del alimento.
Kheiralipor, Ahmadi, Rajabipour, Rafiee y Javan-Nikkhah (2015), en su investigación sobre el
uso de termografía infrarroja, realizaron detecciones de imágenes térmicas en hongos causados
por KK11 y R5 aislados por Aspergillus flavus. Las características de los núcleos de pistacho
infectados y sanos fueron extraídos y posteriormente seleccionados y clasificados. Los
resultados de las imágenes térmicas mostraron con efectividad los granos de pistacho infectados
y sanos, la cámara no tuvo en cuenta el tipo de aislamiento, con lo cual se le adhiere una
precisión del 99%.
Según los investigadores Cortés, Zapata y Uribe, (2013) para combatir el hongo Botrytis cinerea
de emplea principalmente el uso de fungicidas químicos. Aun así, el patógeno ha creado
resistencia hacia la mayoría de los fungicidas gracias a su variabilidad genética, por ende, su
manejo es cada vez más ineficiente para su control. Por tal motivo, los autores han evaluado
siete fungicidas (Benomil, Carbendazim, Difenoconazole, Procloraz, Mancozeb, Captán e
Iprodión) comunes para controlar al patógeno en cultivos de mora. La metodología consistió en
determinar el porcentaje de inhibición del crecimiento de forma in vitro. Los resultados
mostraron que el 12,5% de los conidios fueron susceptibles al Benomil, 83% al Carbendazim,
mientras que con Difenoconazole, Procloraz, Mancozeb, Captán e Iprodión la sensibilidad fue
de un 100% al evidenciarse la inhibición total del crecimiento del hongo.
Se realizó un estudio para determinar la relación de la temperatura sobre la germinación de las
esporas del hongo, la cual se encontró que esto se presenta en temperaturas de 0 a 30ºC estando
como óptima a 20ºC. Por otro lado, la humedad relativa es el efecto más importante para el
crecimiento de los conidios, ya que esta es necesario para su germinación y penetración.
Teniendo en cuenta lo que menciona Latorre y Rioja (2002) en donde muestran que la humedad
relativa óptima se encuentra por encima del 90% ya que ocurre un proceso de evaporación
gracias a la evapotranspiración, y tiene como consecuencia, el inicio de la germinación y
contaminación.
Donde a) presenta al micelio compacto, b) apariencia polvorienta, c) apariencia algodonosa y
d) esclerocios del hongo.
FUENTE: García (2017)
Figura 9. Crecimiento de cepas del hongo B. cinerea
El hongo fue cultivado en medio PDA en el cual crecieron colonias con apariencia algodonosa
y polvorienta de color café, también presentó formación de anillos concéntricos, micelios
compactos en donde presenta ramificaciones, el tamaño promedio de 15 cepas de los conidios
fue de 13.4 x 8.1µm; 13.0 x 7.7µm y 13.2 x 7.9µm. Estas cepas crecieron en la superficie del
medio de cultivo, su crecimiento fue disperso por la caja de Petri, el inicio de su crecimiento
tuvo un aspecto de color pardo-verdoso, y a medida de su desarrollo cambiaron de forma,
tamaño y pasaron a tornarse color negro como muestra la figura 6 (García, 2017).
1.3 MARCO LEGAL
NTC 4103. Frutas Frescas. Fresa variedad Chandler. Especificaciones. Establece los requisitos
que debe cumplir la fresa de esta variedad ya sea para consumo en fresco o como materia prima
para procesamiento.
NTC 5778. Buenas prácticas agrícolas para frutas, hierbas aromáticas culinarias y hortalizas,
frescas. Cosecha y Postcosecha. Se describen las principales prácticas recomendadas para
disminuir riesgo de contaminación en los procesos de cosecha y postcosecha, es decir, que
establece los requisitos básicos que garanticen la inocuidad de los alimentos.
NTC 6284. Requisitos que deben cumplir las fresas de género Fragaria para consumo en fresco.
NTC 4092. Microbiología de alimentos y productos para alimentación animal. Requisitos
generales y directrices para análisis microbiológicos. Esta norma comprende el análisis para
determinar bacterias, levaduras y mohos; esta norma aplica a microbiología de alimentos, a
productos para alimentación animal, al ambiente de la producción de alimentos y al ambiente
de producción primaria.
ISO 18434-1:2008. Preámbulo sobre el uso de la termografía infrarroja durante su supervisión
y estado de la máquina, indicando los usos, métodos y requisitos para realizar la termografía.
Menciona recomendaciones sobre la seguridad para los criterios de evaluación con respecto a
las anomalías que se puedan identificar. También muestra los procedimientos para determinar
la temperatura aparente y emisividad.
ISO 18436-1:2004. Norma referente a los requisitos a tener en cuenta para la supervisión de la
máquina termográfica e identificar sus daños y cómo corregirlos.
2. MATERIALES Y METODOS
2.1 Materia prima
Se trabajaron fresas variedad (Fragaria ananassa) las cuales se obtuvieron de un cultivo
ubicado en la vereda Rio Frio Occidental en el municipio de Tabio. Se seleccionaron teniendo
en cuenta las especificaciones de la Norma Técnica Colombiana 6284/2018, donde se permiten
defectos leves, manchas, marcas de presión y cicatrices solo en la superficie en donde todos
estos defectos en conjunto no deben sobrepasar el 10% del área del fruto sin que afecte el
aspecto, calidad y presentación del alimento. Por medio de la figura 7 la cual presenta las escalas
de color usadas en Colombia (Flórez y Mora, 2010), se tomaron las fresas en un grado 4, en
donde el área del color rojo va aumentando hasta la zona del cáliz.
2.2 Limpieza y desinfección
Con el fin de retirar impurezas, se realizó una primera limpieza con agua potable para
seguidamente desinfectar por inmersión con hipoclorito de sodio a concentración de 100 ppm
en un tiempo de 2 a 3 minutos con el fin de reducir 100 veces la carga microbiana del producto
y se lavará nuevamente para así retirar los residuos de desinfectante. Posteriormente se dejaron
Figura 10. Escala de color de la fresa utilizada en Colombia
las muestras escurriendo para eliminar los residuos de agua que ayudan a aumentar la humedad
del producto (García y Vásquez, 2015).
2.3 Preparación de los grupos
Se trabajaron dos grupos distintos las cuales estuvieron en almacenamiento en condiciones
ambientales. Las 136 fresas fueron divididas en 2 grupos para su respectiva experimentación,
in vivo e in vitro. Codificadas de la siguiente manera:
2.3.1 M1 Control
Muestras que solo cuentan con limpieza y desinfección como se describe en el ítem 2.2.
2.3.2 M2 Inoculación de Botrytis spp
Muestras primeramente pasadas por limpieza y desinfección como lo describe el ítem 2.2.
Seguidamente al tener la esporulación de la cepa, se agregaron a las cajas de Petri agua
peptonada raspando suavemente con ayuda de una espátula, con el fin de remover la cepa y
tomar de allí 10μL de la solución donde se colocó en la cámara Neubauer para ajustar a una
concentración de 1x104 esporas/mL rociando en cada una de las muestras (Modificado Herrera,
2011), siguiendo y modificando la metodología
2.4 Tomas digitales y termográficas
Las tomas se realizaron con ayuda de un macrotubo, con material de acrílico en el interior, y
negro en el exterior con el fin de mantener en las tomas las imágenes la misma altura y evitar
variaciones en cuanto a parámetros de luz y aparición de sombras.
Fuente: Imagen tomada de la tesis de Moreno (2018).
Alvear, Quiroga, y Rincón (2018) describen el macrotubo como un equipo el cual permite
realizar un estudio fotográfico de forma conveniente para posteriormente realizar análisis
detallados, puesto que cuenta con iluminación interna (6 luces artificiales LEDS), la cual es
posible manipular dependiendo el fin.
2.4.1 Tomas digitales
Por medio de una cámara digital NIKON D5300 de 24.2 Megapíxeles, mediante la asistencia
del macrotubo.
Figura 11. Macrotubo
2.4.2 Tomas termográficas y análisis mediante el software FLIR Tools
Las imágenes termográficas se obtuvieron por medio de la cámara térmica con referencia FLIR
E-40 con ayuda del macrotubo. Teniendo en cuenta parámetros de humedad relativa,
temperatura del medio ambiente y emisividad de las muestras.
Tomada de la tesis de Moreno (2018)
Para ver detalladamente los cambios en los diferentes puntos de la fresa y determinar los puntos
más bajos y altos de temperaturas en regiones de interés.
Figura 12. Cámara termográfica
Figura 13. Análisis de imagen termográfica en fresa mediante Software FLIR Tools
Herramientas generales de selección,
rotación, escala de colores, recortes, etc.
Escala de temperatura de forma vertical, de
la temperatura más alta a la más baja
durante la semana de almacenamiento.
Temperatura más alta y baja en la fresa de
interés.
Parámetros que se ajustaron al momento de
registrar la toma.
Información que brinda la cámara
termográfica.
El parámetro de emisividad (0,95) fue encontrado el libro escrito por Pan y Atungulu (2010), la
cual lo establecieron mediante un tratamiento con infrarrojo en fresa.
2.5 Estandarización del sistema de calificación de la fresa (Fragaria anannasa)
Para estandarizar los cambios presentados, se realizó una pre-experimentación con una fresa
dejada al medio ambiente, las cuales se tomaron registros fotográficos digitales para observar
los cambios que se presentan físicamente en el espacio de trabajo, durante una semana.
Determinando estados visuales que van desde fruto comestible a fruto no comestible,
dependiendo el daño presentado en la fresa.
2.6 Procedimiento in vivo de los grupos M1 y M2.
2.6.1 Seguimiento visual, acompañado de imágenes digitales y termográficas.
Luego de que los grupos M1 y M2 estuvieran listos, fueron escogidas de cada muestra, 3 fresas
(seguimiento por triplicado) de las 68 para cada experimento, para posteriormente ser cortadas
por la mitad y puestas en cajas de Petri con agar papa dextrosa con el fin de mantenerlas fijas
en un medio y evitar manipularlas durante la experimentación y realizar el seguimiento visual
teniendo en cuenta cambios sensoriales de color, olor y aspecto, para con ello establecer en qué
estado presentaba de acuerdo a la metodología del punto 2.5.
El seguimiento digital y termográfico, por triplicado de las fresas, se realizó durante una
semana, ejecutando tomas aproximadamente cada 3 horas desde las 9:00am hasta las 4:00pm
de L-V. Con la metodología mostrada en el ítem 2.4. Como se muestra en el anexo 1.
2.6.2 Análisis fisiológico y fisicoquímicos
2.6.2.1 Tasa de respiración
Basándose en la metodología de Moreno (2010), se introdujo la muestra de fresa en una cámara
de respiración sellada herméticamente, posteriormente en el tubo Pettenkofer se agregó 20 ml
de Ba(OH)2. En otra de las trampas se agregaron 125 ml de KOH, después se conectó el montaje
previamente preparado y cada 20 minutos se tomaron las muestras por duplicado de 8 ml del
tubo Pettenkofer. Por último, se realizó la titulación con ácido oxálico y se determinó la
intensidad respiratoria a partir de la siguiente ecuación.
𝐼𝑅 =(𝑉𝑏−𝑉𝑚)×𝑁×22×60
𝑊×𝑡 (1)
Donde:
Vm = Volumen de ácido oxálico para titular la muestra (mL)
Vb = Volumen de ácido oxálico para titular el blanco (mL)
N = Normalidad del ácido oxálico (meq/L)
W = Peso de la muestra
t = Tiempo de barrido
60 = Factor de conversión para el tiempo (min/Hr)
22 = Peso miliequivalente del CO2 (g/meq)
R. = Intensidad respiratoria (mg CO2/Kg.Hr)
2.6.2.2 Determinación de color
A partir del colorímetro CIEL*a*b* de marca Konica Minolta, se inició realizando la
calibración del equipo por medio de una placa blanca, seguidamente se colocó la muestra directo
en el observador y se tomaron tres tomas por muestra. Utilizando la ecuación 2 se calculó la
diferencia de color y la ecuación 3 corresponde al índice de color (IC).
𝛥𝐸 = √(𝐿1 − 𝐿2)2 + (𝑎1 − 𝑎2)2 + (𝑏1 − 𝑏2)2 (2)
𝐼𝐶 =𝑎∗×1000
𝑏∗×𝐿 (3)
2.6.2.3 Determinación de pH
De acuerdo con la metodología AOAC 981.12 (2002), se maceró la muestra de fresa en un
mortero y se tomó 10 g de muestra que fueron diluidos en 10 mL de agua destilada, realizando
la lectura directamente del potenciómetro.
2.6.2.4 Determinación de acidez
Se tomaron 10 gramos de muestra con 20 ml de agua destilada para poder diluir, seguidamente
se agregaron 2 gotas de fenolftaleína y se tituló con hidróxido de sodio al 0.1%, hasta lograr
una coloración rosa. El porcentaje de acidez fue reportado como ácido cítrico mediante la
ecuación (4).
% Á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑐í𝑡𝑟𝑖𝑐𝑜 = 𝑉 ∗ 𝑁 ∗ 𝐸
𝑀 ∗ 100 (4)
Donde
V: Volumen gastado
N: Normalidad del hidróxido de sodio (0.1 eq/L)
E: Peso equivalente del ácido cítrico (0.64g)
M: Peso de la muestra en gramos
2.6.2.5 Determinación de °Brix
La muestra fue macerada para poder colocar una porción pequeña en el refractómetro y
posteriormente se leyó la cantidad de sólidos solubles mostrada por una franja azul.
2.7 Procedimiento in vitro de los grupos M1 y M2.
2.7.1 Análisis microbiológico. Preparación de diluciones y siembra en medio de
cultivo.
Se pesaron 10 gramos cada una de las fresas de los tratamientos, para así realizar las diluciones,
en una caja de petri estéril y pasándolas a un Erlenmeyer con 90 ml de agua peptonada al 0.1%.
Seguidamente se homogeneizó en licuadora durante 10 segundos a una velocidad mínima,
siendo esta la primera dilución (10-1). De la dilución anterior se tomó 1 ml y se trasladado a un
tubo de ensayo con 9 ml de agua peptonada y se agito, se repitió una vez más para obtener la
siguiente dilución hasta 10-3 (Camacho, Giles, Ortegón, Palao, Serrano y Velázquez, 2009).
Se tuvo por duplicado cajas de Petri estériles con 1 ml de cada dilución (10-2 y 10-3) y 20 ml del
medio de cultivo a una temperatura de 45°C. Las cajas se mezclaron suavemente sobre una
superficie lisa. Luego de que los medios de cultivo se solidificaron, se incubaron las cajas a
25°C y se realizaron recuentos diarios hasta el día 5. (Metodología modificada de Camacho,
Giles, Ortegón, Palao, Serrano y Velázquez, 2009).
2.7.2 Seguimiento fotográfico de tomas digitales y termográficas
Como en la metodología del ítem 2.4, exceptuando que no se manejó el macrotubo, ya que para
mantener la inocuidad de las cajas de Petri se colocaron dos mecheros, uno a cada lado de la
caja, y se realizaban las tomas.
2.7.3 Identificación del hongo
2.7.3.1 Análisis cualitativo macro y microscópicamente
Para identificar el hongo de forma macroscópica se observaron características morfológicas del
crecimiento del hongo teniendo en cuenta loa parámetros de la tabla 6.
Tabla 6. Pautas para la descripción Macroscópica de un hongo.
FUENTE: Modificada de Cepero, Restrepo, Franco, Cárdenas y Vargas, 2012
Parámetro Características
Color
Reverso
Colonia
Pigmento del medio
Tamaño de Colonia Diámetro
Apariencia
Correosa
Aterciopelada
Algodonosa
Granulosa
Polvorienta
Cremosa
El análisis microscópico se realizó mediante un microscopio óptimo, que costa de lentes y
elementos manipulables con el fin de generar imágenes aumentadas, por medio de la tinción de
azul de lactofenol y se observaron las características microscópicas del hongo Botrytis spp tales
como: micelios, conidios, hifas y conidióforos, viéndose esto en aumentos de 40 x.
2.7.3.2 Análisis cuantitativo
Se realizó conteo de las colonias de cada placa después de 3, 4 y 5 días de incubación, se
seleccionaron las cajas que contenían entre 10 y 150 colonias y se multiplico por el inverso de
la dilución correspondiente para informar las unidades formadoras de colonias en UFC/g a 26°C
en el tiempo de incubación, modificando la metodología de Camacho, Giles, Ortegón, Palao,
Serrano y Velázquez (2009).
2.8 Métodos experimentales
2.8.1 Diseño de experimentos
La unidad experimental se formó mediante 136 fresas, donde fueron distribuidas para
los grupos M1 y M2. El diseño experimental, mostrado en la tabla 7, fueron la cantidad de datos
recolectados por día.
Tabla 7. Diseño experimental
Día Número de tomas Análisis fisicoquímico
Digitales Termográficas IR Color pH Acidez °Brix
M1 M2 M1/M2 M1/M2 M1/M2 M1/M2 M1/M2
1 9 9 9 30 9 9 9
2 9 9 9 30 9 9 9
3 9 9 9 30 9 9 9
4 9 9 9 30 9 9 9
5 9 9 9 30 9 9 9
Total
por
grupo
45 45 45 150 45 45 45
Total 90 90 300 90 90 90
2.8.2 Análisis estadístico
Con el fin de observar diferencias significativas en los grupos M1 y M2 con respecto a las
temperaturas encontradas, se realizó un análisis de varianza ANOVA, trabajando un nivel de
significancia del 5%, con planteamiento de hipótesis nula (Ho): No hay diferencias
significativas entre los tratamientos y una hipótesis alterna (Hi): Si hay diferencias significativas
en los tratamientos.
3. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS
3.1 IMÁGENES DIGITALES Y TERMOGRÁFICAS Y SISTEMA DE CALIFICACIÓN
DEL FRUTO.
3.1.1 Estandarización del sistema de calificación de la fresa (Fragaria anannasa)
Se establecieron rangos porcentuales de incidencia y severidad del patógeno en el fruto de
acuerdo con la afectación visual perceptible del mismo como se observa en la tabla 8. Esta tabla
se basó en el estudio realizado por Merchán, Ferrucho y Álvarez (2014) y modificado según los
resultados obtenidos.
Tabla 8. Escala visual para evaluar el porcentaje de daño en frutos de fresa
Estado Descripción
0 Fruto sano (Sin infección visible)
1 Hasta 1 % de daño (Indicios de la enfermedad)
2 1 al 5 % del área del fruto dañado
3 6 al 25 % del área del fruto dañado
4 26 al 50 % del área del fruto dañado
5 Más del 50 % del área del fruto dañado
Adaptado de Merchán, Ferrucho y Álvarez, 2014.
De acuerdo con la figura 11 se observa el cambio de las características del fruto, mostrando así
mismo la codificación de la metodología visual de calificación del fruto, se establecieron los
estados de cada muestra de acuerdo con la tabla 7, previamente mencionada.
Se observa el cambio de las características fisiológicas de la fresa desde el día 1 al 8 de: color
y apariencia. En los días 1 y 2 la muestra siguió intacta, alimento comestible y visualmente
agradable. Al tercer día la fresa ya presentaba daños físicos como el cambio de color rojo
brillante a oscuro y ablandamiento en el centro, al día siguiente comenzó con su deterioro
dándose a evidenciar presencia de hongo, color blanco y apariencia esponjosa, como muestra la
imagen del día 4, y evidenciando un aumentando rápidamente su proliferación el mismo día 5,
este aumento en ese mismo día fue visualmente significativo, por aparición de hongos color
blanco y verde algodonoso dando como resultado un alimento deteriorado y no comestible
gracias a sus características organolépticas percibidas de: color, apariencia y olor. Finalmente,
el día 8 en donde la fresa se encuentra completamente llena de hongo calificándose como
Figura 11. Modelo de calificación del fruto
extremadamente deteriorada y no comestible. En la siguiente tabla 9 se plasma la descripción
visual otorgando calificación del fruto de acuerdo con las características presentadas en el
alimento, cada estado corresponde a un porcentaje de daño del fruto establecido en la tabla.
Tabla 9. Descripción visual y sistema de calificación del fruto
DESCRIPCIÓN VISUAL
CALIFICACIÓN
DEL FRUTO
Fruto firme, olor agradable, color del fruto rojo brillante con aquenios oscuros.
No se observan alteraciones ni daños físicos.
Estado 0
Fruto seco y blando con olor acorde al fruto. Aquenios amarillos, oscurecimiento del fruto,
características que dan indicios de alteraciones en el alimento.
Estado 1
Fruto blando con olor a rancio (hongo), oscurecimiento general. Comenzando a dañarse,
un 5% de la fresa, gracias a la formación del hongo color gris y algodonoso en lado inferior
y hongo color verde algodonoso por el borde del fruto.
Estado 2
Fruto blando, oscuro y olor a rancio (hongo). Mayor crecimiento de hongo verde y gris en
todo el borde de la fresa, afectando aproximadamente un 20% de esta.
Estado 3
Fruto blando, color oscuro y olor a rancio (hongo). Crecimiento de hongo color gris en el
centro de la fresa, y aumento de este mismo en el borde, afectando aproximadamente 30%
del fruto.
Estado 4
Fruto con demasiado goteo de líquido rojo, blando con olor extremamente fuerte a rancio
(hongo). Sépalo reseco y hongo gris y algodonoso en todo el fruto atacando toda la fresa,
afectándola 99% de su área.
Estado 5
3.2 RESULTADOS DE SEGUIMIENTO DE IMÁGENES DIGITALES Y
TERMOGRÁFICAS Y SISTEMA DE CALIFICACIÓN DEL FRUTO DE LOS
GRUPOS M1 Y M2 (in vivo e in vitro)
Durante la metodología in vivo las fotográficas tanto digitales como termográficas fueron
tomadas cada tres horas, durante una semana, con el fin de observar cambios físicos en
intervalos de tiempo cortos. Por otro lado, el método in vitro se realizó el seguimiento
fotográfico diariamente, como se observa en el anexo 1.
Para las siguientes tablas (10 y 11) se muestran los registros fotográficos los cuales evidenciaron
cambios físicos en las muestras y cambios en el crecimiento de microorganismos, en las fresas
y las cajas de Petri, respectivamente. Los cambios mostrados en las tablas se encuentran
expresados en minutos para así mostrar, mediante gráficas, la tendencia de los cambios de
temperatura. En el anexo 2 se muestran los minutos correspondientes a los días.
Las imágenes termográficas corresponden a cada imagen digital mostrada, arrojando
temperaturas representadas como Sp1 y Sp2, temperatura más alta y baja, respectivamente, y
mostrando también estas temperaturas durante toda la experimentación, mostradas
verticalmente en la parte derecha de cada imagen.
Durante la semana de almacenamiento las fresas se mantuvieron em condiciones ambientales
de temperatura atmosférica (19 ± 3°C) y humedad relativa (41 – 54%) en donde se observaron
cambios físicos y organolépticos, de los frutos, los cuales demuestran el proceso de un fruto
comestible a no comestible.
3.2.1 Seguimiento de imágenes digitales, termográficas y calificación del fruto del
grupo M1 (in vivo e in vitro)
Tabla 10. Imágenes digitales, termográficas y calificación del fruto del grupo M1 (in vivo e in vitro).
IN VIVO IN VITRO
Imagen digital Imagen termográfica Imagen digital Imagen termográfica
00:00 min 0:00 min de incubación
a b c d
Estado 0: Fruto firme, sano, color rojo brillante, olor agradable con
aquenios de color verde, con 0% de daños.
Sin crecimiento.
5.760 min de incubación
Sin cambios
e f
No existe crecimiento.
1.440 min 0:00 min de incubación
a b c d
Estado 1: Fruto firme, color rojo brillante y olor agradable, presentando
ablandamiento y oscurecimiento, dando indicios de alguna enfermedad, en
la parte central. Los aquenios se encuentran de coloración oscura.
Sin crecimiento.
5.760 min de incubación
Sin cambios
e f
No existe crecimiento.
3.300 min 0:00 min de incubación
a b c d
Estado 2: Fruto con mayor ablandamiento en centro, olor fuerte
(fermentado). Presencia del hongo color verde algodonoso en lado
derecho, afectando aproximadamente 1% del alimento. La punta de la fresa
y su centro se tornan color rosa blando.
Sin crecimiento.
5.760 min de incubación
c d
Crecimiento de 6 colonias color amarillo con apariencia cuosa.
4.320 min 0:00 min de incubación
a b c d
Estado 3: Fruto blando, olor un poco a rancio (hongo). Hongo color gris
y algodonoso por todo el borde de la fresa, y hongo verde algodonoso en
el lateral derecho superior hacia el inferior, atacando aproximadamente 6%
del área del fruto aproximadamente. Sépalo con presencia de hongo de
apariencia polvorienta color negro. En su centro hay una decoloración,
colocándose de un color rosa más pálido.
Sin crecimiento.
5.760 min de incubación
e f
Presencia de colonias color blanco y amarillo, ambas de apariencia
acuosa. En el borde se encuentran colonias color blancas y de
aparaciencia algodonosa.
6.180 min 0:00 min de incubación
a b c d
Estado 4: Fruto blando y olor extremadamente fuerte a rancio (hongo).
Formación de hongo color gris y algodonoso en todo su alrededor, así
como también hongo verde en forma de colonias, afectando
aproximadamente 40% del fruto.
Sin crecimiento.
4.320 min de incubación
e f
Crecimiento de 7 colonias color amarillo con apariencia cuosa.
5.760 min de incubación
g h
Crecimiento de colonias pequeñas, color verde oscuro y blancas, con
apariencia algodonosa.
La tabla 10 muestra el registro de imágenes digitales y termográficas, in vivo e in vitro, del
grupo M1 durante una semana de almacenamiento a temperatura ambiente, con seguimiento
desde los 0:00 a 6.180 min. Los resultados in vivo arrojan cambios visuales destacados
mostrando crecimiento de hongo a los 3.300 min. De acuerdo de la escala de calificación,
se da como resultado un fruto no comestible, con estado 4, al finalizar la semana. Referente
a las imágenes termográficas se obtuvieron temperaturas de Sp1 entre 18.4 y 20.5°C y Sp2
entre 18.1 y 19.9°C, aumentando 2.1 y 1.8°C, respectivamente durante la semana, teniendo
como temperatura más baja de 18.1°C y temperatura más alta de 22.6°C durante la
experimentación.
Por otro lado, los resultados in vitro mostraron distintos comportamientos del crecimiento
microbiano en las cajas de Petri. Tal como se mencionó anteriormente, a los 3.300 min comenzó
la aparición de hongo visual, correspondiente al miércoles al medio día, aunque no se evidencio
microbiológicamente, ya que se presentó crecimiento de colonias acuosas no pertenecientes a
un hongo, se presume que en el proceso de la dilución se tuvieron inconvenientes y por ende
afectado la supervivencia de este. Si embargo, la muestra del minuto 6.180, correspondiente al
estado 4, con desarrollo de hongo gris algodonoso, se evidencio crecimiento de colonias negras,
blancas y verdes algodonosas microbiológicamente.
Las imágenes termográficas mostraron temperaturas de Sp1 entre 22.6 y 23.2°C y Sp2 entre 22
y 20.2°C, aumentando 0.6°C y disminuyendo 1.8°C, respectivamente, durante la semana,
teniendo como temperatura más baja de 20°C y temperatura más alta de 31.1°C en la muestra
durante el experimento.
3.2.2 Seguimiento de imágenes digitales, termográficas y calificación del fruto del grupo M2 (in vivo e in vitro).
Tabla 11. Imágenes digitales, termográficas y calificación del fruto del grupo M2 (in vivo e in vitro).
IN VIVO IN VITRO
Imagen digital Imagen termográfica Imagen digital Imagen termográfica
00:00 min 0:00 min de incubación
a b c d
Estado 0: Fruto firme, color rojo brillante, olor agradable, sano, sin
infecciones visibles.
Sin crecimiento.
1.440 min de incubación
e f
Crecimiento de aproximadamente 10 colonias color amarillo con
apariencia cuosa.
1.620 min 0:00 min de incubación
a b c d
Estado 2: Fruto blando y oscuro en la parte del centro y crecimiento de
hongo blanco algodonoso en la parte del borde inferior del alimento,
afectándola aproximadamente 1% de su área.
Sin crecimiento.
1.440 min de incubación
e f
2.880 min 0:00 min de incubación
a b c d
Estado 4: Fruto color rojo pálido, olor rancio (hongo, ablandamiento y
oscurecimiento general el centro. Aparición de hongo blanco aterciopelado
en forma de “gotas” en toda la fresa, afectando así acerca del 50% de su
área.
Sin crecimiento.
5.760 min de incubación
e f
Crecimiento de aproximadamente 12-15 colonias amarillas de
apariencia acuosa y 9 colonias color verde algodonoso.
4.320 min 0:00 min de incubación
a b c d
Estado 4: Fruto, afectado aproximadamente 50%, con excesivo
ablandamiento y libración de líquido color rojo con olor desagradable a
rancio, hongo blanco aterciopelado en forma de “gotas” y algodonoso en su
parte derecha e inferior abarcando acerca del 20% del área.
Sin crecimiento.
5.760 min de incubación
e f
Crecimiento de hongo en toda la caja de petri, de color verde y
aparaciencia algodonosa.
Área del hongo: 0,067 m2
Porcentaje de Cobertura de Hongo: 10%
5.760 min 0:00 min de incubación
a b c d
Estado 5: Fruto extremadamente húmedo, crecimiento de hongo blanco
aterciopelado en forma de “gotas” blanco en el 100% del fruto y hongo
algodonoso y verde grisáceo en borde.
Sin crecimiento.
4.320 min de incubación
e f
Crecimiento parcial en caja de petri de hongo verde con apariencia
polvorienta y algodonosa.
Área del hongo: 0,204 m2
Porcentaje de Cobertura de Hongo: 30,45%
5.760 min de incubación
g h
Crecimiento de hongo verde oscuro con apariencia polvorienta y
algodonosa en toda la caja de petri.
Área del hongo: 0,66 m2
Porcentaje de Cobertura de Hongo: 98,51%
La tabla 11 muestra el registro de imágenes digitales y termográficas, in vivo e in vitro, del
grupo M2 durante una semana de almacenamiento a temperatura ambiente, con seguimiento
desde 0:00 a 5.760 min. Los resultados in vivo arrojan los cambios visualmente destacados
mostrando crecimiento de hongo a los 1.620 min. Los resultados de la escala de calificación
desde el estado 0 hasta el 5, resultado un fruto no comestible, con estado 5, al finalizar la
semana.
Las imágenes termográficas mostraron temperaturas de Sp1 entre 18.9 y 19.7°C y Sp2 entre
17.8 y 18.3°C, aumentando 0.8 y 0.5°C, respectivamente durante la semana, teniendo como
temperatura más baja de 17.8°C y temperatura más alta de 22°C en la muestra durante el
experimento.
Por otro lado, los resultados in vitro mostraron distintos comportamientos del crecimiento
microbiano en las cajas de Petri. Mostrando desarrollo de colonias amarillas acuosas
pertenecientes a las muestras del min 0:00 y 1.260, y percibiendo el hongo físicamente. Se podía
observar microbiológicamente poca cantidad de pequeñas colonias color verde de la muestra de
2.880 min, en donde en está ya se observó hongo con aspecto ramificado, filamentoso y en
forma de gotas. El crecimiento y proliferación de hongo en toda la caja de Petri corresponde a
la fresa del min 5.760, la cual presentaba visualmente mayor cantidad de hongo con aspecto
ramificado, filamentoso y en forma de gotas.
Las imágenes termográficas mostraron temperaturas de Sp1 entre 23.3 y 25.3°C y Sp2 entre
23.2 y 21.4°C, aumentando 2°C y disminuyendo 1.8°C, respectivamente durante la semana,
teniendo como temperatura más baja de 20°C y temperatura más alta de 31.1°C en la muestra
durante el experimento.
3.3 ANÁLISIS DE RESULTADOS DEL PROCEDIMIENTO in vivo DE LOS GRUPOS
M1 y M2
En el proceso in vivo de acuerdo con lo mostrado en las tablas 10 y 11, se observa que los grupos
tuvieron un comportamiento distinto en cuanto al tiempo de aparición de hongo. El grupo M1
paso de estado 0 a 4 de manera consecutiva, viéndose crecimiento de hongo a los 3.300 min
(día 3), con temperatura Sp1 de 19°C, mientras que el grupo M2 presento estados de 0 a 5,
saltándose el estado 1, es decir, no presento presentó indicios de alteración, paso al desarrollo
de hongo a los 1.620 min (día 2), con temperatura Sp1 de 19.8°C.
La vida útil de las muestras del grupo M1 fueron de 3 días, relacionado con lo reportado por
Moshari, Alirezaly y Almasi (2020) quienes en su investigación los resultados en la
determinación de la vida útil de la fresa, informa que en el tratamiento control comenzó su
disposición al cuarto día, en un almacenamiento de 4°C, de igual manera Chen, Cao, Li, Tao
Feng y Han (2020), en su investigación, mencionan que el tratamiento control comenzó el
crecimiento del patógeno igualmente al día 4, en almacenamiento de 20°C. Estos soportes
trabajaron la misma variedad de fresa, variedad Fragaria ananassa, y este último en las mismas
condiciones de almacenamiento. Se presume que la causa de que el grupo del control en la
experimentación haya presentado desarrollo del patógeno, es gracias a que compartió el mismo
ambiente con el grupo de la inoculación M2, a pesar de que se encontraban con distanciamiento
las esporas de este grupo afectaron el grupo M1, transportándose por el medio ambiente,
teniendo como porte lo explicado por Koike y Bolda (2016), mencionando que B. cinérea
produce esporas que tienen la capacidad de volar hacia otras frutas de fresa originando así la
enfermedad, causando lesiones, malformación o muerte del fruto. También cabe tener en cuenta
el proceso de limpieza y desinfección, puesto que se realizó con hipoclorito de sodio,
desinfectante con amplio aspecto contra bacterias, virus, esporas y hongos, entre otros. La
concentración manejada no fue la adecuada, ya que como lo explica Meza (2006), el uso
adecuado de este desinfectante contra hongos y esporas bacterianas es 1.000, y la concentración
trabajada en el experimento fue de 100 ppm, dosis extremadamente baja para inhibir el
crecimiento de hongos presentes en las fresas, provenientes desde su postcosecha o retardarlo
durante el almacenamiento.
Estos cambios físicos en las fresas, descritos en los estados de las tablas 10 y 11, como el
proceso de ablandamiento, cambios de color de los aquenios, explica Martínez, Balois. R,
Tejacal, Cortes, Palomino y López (2017), que el factor del proceso de ablandamiento hace
parte de la maduración del fruto que tiene como consecuencia cambios de características como:
humedad (jugosidad), firmeza y textura, gracias a la hidrolisis de los componentes de la pared
celular en donde se encuentra celulosa, hemicelulosa, pectina y proteínas. El proceso de
senescencia da lugar a la producción de enzimas, que son las responsables de la modificación
de la pared celular causando cambios de textura en el alimento, teniendo como consecuencia
que sea más apetecible para patógenos y animales. Y los cambios de color de los aquenios lo
explica Puche (2015), quien menciona que en el desarrollo y maduración del fruto de fresa
(Fragaria x anannasa), el fruto cuando se encuentra verde (inmaduro) sus aquenios se
encuentran muy juntos y del mismo color. Ya cuando el fruto se encuentra de color blanco (ya
ha llegado a su tamaño definido) los aquenios cambian de color verde a marrón gracias al efecto
de la lignificación.
Es importante destacar que este patógeno actúa como necrótrofo y saprófito que se establece
inicialmente la parte afectada del fruto y se extiende hasta atacar los tejidos sanos del mismo,
una de las condiciones que más favorece el crecimiento de éste es la alta humedad del ambiente,
puesto que esta humedece los tejidos generando un medio apropiado para el rápido crecimiento,
mantener humedades altas durante el proceso de almacenamiento por tiempos prolongados
puede provocar esporulación del hongo formando masas grises en la superficie del tejido
afectado (Gómez, 2013). Durante la experimentación, la humedad estuvo dentro de los 41 y
54%, datos no considerados altos para el desarrollo del patógeno, ya que menciona Latorre y
Rioja (2002) que la humedad optima es 90% y temperatura de 20°C, por ende, a pensar que la
humedad no era la apropiada, la temperatura si, la trabajada durante la semana estuvo en 19 ±
3°C. Asimismo, se presume que las condiciones iniciales de las muestras no fueron las más
inocuas, viniendo contaminada desde el lugar de producción, tal como lo sugiere Elad,
Williamson, Tundzyinsky y Denle (2007), indicando que Botrytis spp es un patógeno
caracterizado por tener un crecimiento silencioso, es decir, frecuentemente su infección es
imperceptible durante cosecha y pos cosecha dificultando un contra ataque a tiempo para evitar
daño en el fruto, debido a que este patógeno inicia su proceso de infección internamente con la
formación de conidios, a partir de esclerocios o micelios obtenidos durante residuos de cosecha
o frutos infectados cercanos al mismo, seguido a esto y con condiciones favorables penetra la
epidermis de hospedero invadiendo tejido sub epidérmico, inter e intracelularmente para
establecer la infección, B. cinerea secreta enzimas de degradación de la pared celular durante
las etapas tempranas de la infección, se conoce que las poligalacturonasas son necesarias para
la plena virulencia de B. cinerea codificadas por el gen endopoligalacturonasa .
En desarrollo de hongo en los grupos trabajados, corresponde a Botrytis cinérea, ya que coincide
con la descripción realizada por Plascencia, y colaboradores (2012), exponiendo que los
síntomas de un fruto atacado por este patógeno se caracterizan por un micelio gris o café,
ablandamiento (no acuosa) cubierto por crecimiento con apariencia polvorosa, producción de
esclerocios de color oscuro. En frutos en su etapa de maduración, los síntomas comienzan con
la perdida de firmeza con apariciones de manchas descoloridas y opacas. Por otro lado, las
características del hongo proliferado en la fresa del grupo M2 desde el 2.880 min, según la
descripción presentada por estos mismos autores, pertenece al hongo Rhizopus stolonifer. Este
puede desarrollarse desde 10 a 36°C y en gran rango de humedades relativas, los mayores
síntomas causados por este género es que las partes carnosas del fruto se encuentre demasiado
blandas y con goteo de agua, este ataque va hasta que pierde humedad dando como consecuencia
que se arrugue y finalmente se momifique, este ablandamiento llamado también “pudrición
blanda” es producida por las hifas secretadas por enzimas pectinoliticas, encargadas de degradar
y diluir las sustancias que mantienen adheridas las células a los tejidos del fruto, dando así
pérdida de unión entre células. En lo que concierne, el aroma, que desprende este tipo de
enfermedad en el alimento es a rancio, gracias a la acción de las levaduras y bacterias que se
encuentran en los tejidos afectados. Teniendo en cuenta las condiciones de crecimiento de este
hongo, durante la experimentación se mantuvieron los parámetros muy aptos para su
proliferación en cuanto a sus condiciones ambientales, tales como una temperatura de 19 ± 3°C
y 41 – 54% de humedad relativa.
Otra variable evaluada consistió en el seguimiento del comportamiento diario de la temperatura,
durante los cinco días de almacenamiento, vista termográficamente, los cuales con el fin de
conocer la variación porcentual (incremento o disminución) mediante la diferencia entre un
valor pasado y uno presente en términos de un porcentaje, realizando esto por medio de las
siguientes ecuaciones de primer orden:
𝑇𝑛 − 𝑇𝑛−1 = 𝑇𝑛𝑢𝑒𝑣𝑜 (5)
𝑇𝑛𝑢𝑒𝑣𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙
𝑇𝑛𝑢𝑒𝑣𝑜 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙∗ 100 = % (6)
Figura 12. Gráficas de temperatura respecto al tiempo del procedimiento in vivo del grupo M1 y M2
Gráficas in vivo
Temperatura respecto al tiempo Porcentaje (%) de crecimiento de temperatura respecto al tiempo
Grupo M1
a
b
Grupo M2
c
d
Las gráficas in vivo, situadas en la figura 12, muestran los resultados del comportamiento de la
temperatura respeto al tiempo de almacenamiento, de los grupos M1 y M2. En la figura 12a,
grupo M1, se observa que la temperatura de las primeras tomas presenta un rango de 18.4 a
19.5°, aumentando estos valores en cada toma hasta llegar a su máximo de temperatura de
22.6°C el minuto 3.300, teniendo un aumento de Sp1 y Sp2 del 200 y 167% de temperatura,
respectivamente, mostrado en la figura 12b, mientras que en la 12c, del grupo de muestras
inoculadas, las primeras tomas residieron en rangos de 18.9 a 20.3°C, llegando a su temperatura
máxima de 21.9°C igualmente al minuto 3.300, con aumento de Sp1 y Sp2 del 187.5 y 300%,
observándose en la figura 12d, de su temperatura, respectivamente.
De acuerdo con lo anterior, el punto máximo de la temperatura del grupo M1 coindice con el
crecimiento de hongo visualmente, mostrado en la tabla 10, evidenciando aumentos de
temperatura en el día 1 y 2, según la figura 12a, hasta llegar a verse visualmente al día 3 (minuto
3.300). Por otro lado, a pesar de que la temperatura máxima del grupo M2 no coincide con la
visualización del hongo, este se desarrolló al día 2 con temperatura de Sp1 de 19.8°C, en la
fresa, presentando mayores valores y variaciones de temperatura durante el almacenamiento,
para ello cabe tener en cuenta que las plantas desarrollan mecanismos de acción, para defenderse
de agentes patógenos, mediante barreras físicas y químicas tratando de impedir la infección,
esto lo explica Stange, Briceño, Latorre y Arce (2007), mencionando también que este suceso
es una interacción incompatible en donde la planta reconoce al microorganismo, comenzando a
impedir su penetración y multiplicación, conllevando a un mecanismo de resistencia.
Las temperaturas de las figuras 12a y 12d, son posibles de relacionar con la curva de crecimiento
de una población microbiana, presentando inicialmente la fase de latencia, como lo menciona
Pedrique (2001) en donde esta etapa no existe un crecimiento inmediato de esta población,
puesto que es un proceso de adaptación y el desarrollo del microorganismo, depende de las
condiciones del medio, puede ser largo o corto, sin embargo existe una gran actividad
metabólica a razón de que se estos están produciendo las enzimas necesarias para crecer en este
nuevo medio, este comportamiento de fase de latencia se puede observar en los primeros dos
días del grupo M1, ya que fue aumentando su temperatura diariamente y por ende se puede decir
que es gracias a la actividad metabólica y adecuación al medio del patógeno B. cinérea. Por otro
lado el grupo M2 se comportó de manera similar, en sus temperaturas los primeros dos días,
posiblemente presentando su fase de latencia en los primeros minutos de la inoculación, y como
menciona este mismo autor, que cuando un cultivo que ya se encuentra creciendo, en fase
exponencial, es inoculado al mimo medio en las mismas condiciones, no se podrá evidenciar la
fase de latencia y su crecimiento exponencial continuara, por ende es posible que este suceso se
viera reflejado en la figura 12d, en donde la temperatura va aumentando más rápidamente en
las primeras tomas de este grupo inoculado que en el grupo M1. Seguidamente el desarrollo de
microorganismos va creciendo hasta llegando a su fase exponencial, como mostro el grupo M1
al minuto 3.300, en donde hubo aumento de la temperatura y crecimiento de hongo visualmente,
dando como explicación que la población se duplico mediante las condiciones apropiadas de
temperatura, medio de cultivo, cantidad de alimento y demás parámetros, el grupo M2 comenzó
esta fase a partir del día 2, en donde si presento aumento de la temperatura a pesar que no fue
la más alta, posiblemente, como se mencionó anteriormente, por el mecanismo de resistencia
realizaba el fruto. Durante los últimos días de las tomas termográficas (día 4 y 5), las
temperaturas de los grupos fueron disminuyendo, principalmente en el grupo M2, esto
posiblemente por la limitación del crecimiento del hongo en la fresa, como muestran las
imágenes digitales, de la tabla 11 del grupo M2, al minuto 5.760 se encontraba hongo en el
100% del fruto, proceso por el cual la curva de crecimiento del patógeno ya se encontraba en
su fase estacionaria y de muerte, por causa del agotamiento de nutrientes, teniendo en cuenta
que el patógeno puede continuar con vida y metabolizando, pero aun así se disminuye la
reproducción y crecimiento microbiano.
En las gráficas también se muestran que existen temperaturas bajas antes y después de las tomas
diarias, exponen Piotr Baranowski y colaboradores (2015), que las bajas temperaturas están
reflejadas por la superficie del alimento la cual es causada por el crecimiento de micelios, en
donde no hay una resistencia a la evaporación y se ve reflejado en el aumento de la transpiración.
Sin embargo, también es necesario tener en cuenta las condiciones del medio ambiente para el
crecimiento del hongo, como por ejemplo lo explicado por Forges. M y sus colaboradores
(2018), que ya se han realizado estudios y demostrado que la luz es un importante regulador
entre las interacciones entre el patógeno y la planta, puesto que una planta expuesta a alta
intensidad de luz, esta inicia con la producción de especies reactivas de oxígeno que tienen
como función se runa defensa y actuar contra plagas y enfermedades. En su estudio resulto que
los síntomas de enfermedad de B. cinerea se encontraron más altos en las hojas incubadas a
oscuras. Además de esto, menciona también Meng. L, et al, (2020) que los hongos tienen la
capacidad para detectar la luz y dar respuestas para determinar su crecimiento y desarrollo. Por
ello, las variaciones de temperatura también fueron posiblemente por la falta de control de los
factores en el ambiente, donde se encontraban almacenadas las fresas, puesto que se ingresaba
varias veces el día al lugar de trabajo constantemente y con ello se encendía y se apagaban las
instalaciones, afectando las condiciones del medio.
3.4 ANÁLISIS DE RESULTADOS DEL PROCEDIMIENTO in vitro DE LOS
GRUPOS M1 y M2
Las imágenes digitales del procedimiento in vitro de las tablas 10 y 11 mostraron crecimiento
de colonias amarillas, en las cajas Petri, con aspecto acuoso en las muestras de los dos grupos
trabajados, esto se presentó posiblemente a un manejo incorrecto de estas muestras, ya que
mencionan Los editores de la Encyclopaedia Britannica (2017) que estas colonias son bacterias
correspondientes al género Micrococcus lateus, las cuales se presentan mediante colores rosa o
amarillo y habitan en el cuerpo humano, además de esto, otra suceso posible es que ya estuvieran
contaminadas con esta bacteria desde la cosecha, tal como lo mencionan Geenblatt, Baum,
Klein, Nachshon y Koltunov (2004), que a pesar de que Micrococcus lateus no crea esporas,
tiene la capacidad de sobrevivir a largos periodos de tiempo en cultivos no manejados
adecuadamente, a pesar de mantener las muestras almacenadas en un refrigerador.
El crecimiento de hongo negro y verde con aspecto algodonoso de los grupos M1 y M2
comenzaron a los 5.760 min (el día 5) y a los 1.620min (día 2), respectivamente, aunque M1 no
presento cobertura del hongo completa en las cajas Petri, M2 presento este suceso a los
5.760min, tiempo igual que en el estudio presentado por Plascencia. R, et al, (2012) quienes
obtuvieron resultados del crecimiento de hongo Botrytis cinérea en sus cajas de Petri a las 96
horas (5.760 min) de incubación, en forma de micelio color gris y negro. También presentaron
resultados de análisis microbiológico de Rhizopus stolonifer, en donde sus características se
destacaban por ser un hongo de color blanco, aéreo y aspecto ramificado, y por su crecimiento
más rápido que Botrytis, ya que cubrió la caja en 48 horas (2.880 min). Teniendo en cuenta lo
anterior, el hongo Rhizopus stolonifer nunca creció en las cajas de Petri, probablemente por la
competencia de nutrientes del medio con Botrytis.
El desarrollo del hongo B. cinérea creció en los dos grupos trabajados, en M1 y M2 a partir de
los 3.060 y 1.620min, respectivamente, lo que significa que las muestras inoculadas avanzaron
24h más rápidas, en cuanto a la aparición del patógeno, que las muestras control. Se esperaba
que la muestra M1 no presentara ningún tipo de alteración microbiológica, y si lo poseyera fuera
más tardía su aparición, ya que se realizó desinfección con hipoclorito de sodio, desinfectante
el cual posee amplio aspecto contra bacterias, virus, esporas y hongos, entre otros, trabajando
este desinfectante a 100ppm para la desinfección de las muestras, dosis extremadamente baja
para inhibir el crecimiento de hongos provenientes desde la cosecha, ya que menciona Meza. F
(200) que el uso adecuado de este desinfectante contra hongos y esporas bacterianas es 1.000
ppm, por ende, no se pudo inhibir ni tampoco retardar el desarrollo del patógeno.
De igual forma, siguiendo los mismos cálculos presentados en las ecuaciones (5) y (6), se
realizan graficas en términos de porcentaje, como se muestras a continuación.
Figura 13. Gráficas de temperatura respecto al tiempo del procedimiento in vitro del grupo M1 y M2
Gráficas in vitro
Temperatura respecto al tiempo Porcentaje (%) de crecimiento de temperatura respecto al tiempo
Grupo M1
a
b
Grupo M2
c
d
De acuerdo con la figura 13, se observan las gráficas de las variaciones de temperaturas de los
grupos, en el procedimiento in vitro. En la figura 13a se puede ver que las temperaturas Sp1 de
las cajas de Petri correspondientes al día 3 y 5, al iniciar las tomas, mientras que este dato
coincide con la aparición del hongo in vivo visualizado en la tabla 10 al día 3 (min 3.300), y
poca proliferación de este al día 5, la toma digital de la caja Petri solo muestra crecimiento de
colonias amarillas ya mencionadas anteriormente. Las temperaturas Sp1 y Sp2 del día 1, llego
a la misma que el día 3, al segundo día de incubación, con un aumento del 1220% y disminución
del 771%, respectivamente, mostrado en la figura 13b, teniendo en cuenta que estos porcentajes
hacen referencia al crecimiento total durante la semana evaluada, sin evidenciar crecimiento del
patógeno in vivo ni in vitro. Durante los siguientes días de incubación, la temperatura de la
muestra del día 3 continuo más alta, y la del día 5, la más baja, durante la semana de
almacenamiento. La figura 13c muestra que las temperaturas Sp1 y Sp2 del día 3, presentaron
las temperaturas más altas y esto al inicio de la experimentación, con aumento del 123 y 82%
mostrado en la figura 13d, dato la cual concuerda con la proliferación del hongo in vivo y
crecimiento de hongo y bacterias en la caja Petri de este mismo tiempo, a pesar de que fue la
temperatura más alta, los datos in vitro no muestran que esta caja Petri haya sido la de mayor
porcentaje de cobertura del hongo, como paso con la muestra del día 5 in vivo, proliferándose
el 98.51% en la caja Petri, y se observa que las temperaturas Sp1 y Sp2 fueron constantes
durante todo el almacenamiento, presentando solo variación del 100% al finalizar y comenzar,
respectivamente, el experimento.
Las anteriores graficas muestran que las cajas Petri presentan bajas temperaturas durante la
semana, semejante al artículo de Lahir y sus colegas (2012), quienes realizaron el seguimiento
de la temperatura mediante termografía infrarroja en bacterias gran negativas patógenas, en
placas de micro valoración de pocillos de fondos planos durante 2 min, teniendo como
resultados que los pocillos fueron disminuyendo su temperatura respecto al tiempo, explicando
que ese hecho se presenta por la pérdida de energía del objeto en estudio hacia el ambiente,
recalcando que las imágenes termográficas de los tubos con microorganismos patógenos y el
control, en medio líquido, disminuyeron su temperatura proporcionalmente, sin embargo, el
control presentaba temperaturas más bajas ya que la presencia de microorganismos ejercieron
una fuente de calor adicional, se puede distinguir en las figuras 13a y 13c, en donde la figura
12c, de las muestras inoculadas, se observa que en general existen temperaturas más altas que
en la figura 13a, correspondiente al grupo M1, y esto probablemente al desarrollo del hongo en
forma rápida y por alta concentración de este, ya que esto explican los mismos autores. Otro
estudio, la cual se basó en la cuantificación de bacterias en medios líquidos mediante
termográfica, se descubrió que las mediciones de temperatura no eran las adecuadas para
confirmar la concentración de bacterias en estos medios, porque la temperatura no podía
distinguir entre los pocillos con bacterias y el control (Salaimeh, Campion, Gharaibeh, Evans y
Saito, 2011).
De acuerdo con el objetivo dos se reportan los análisis de la caracterización fisiológica y
fisicoquímica.
3.5 RESULTADOS Y ANÁLISIS FISIOLOGICO Y FISICOQUÍMICOS
3.5.1 Tasa de respiración
En la figura 15 se puede observar el comportamiento de los resultados de intensidad respiratoria
de los grupos analizados durante 5 días, en ambos casos se puede observar un comportamiento
decreciente, ya que según Pantastico (1975) la fresa es una fruta no climatérica, lo cual indica
que además de presentar crecimiento tardío en su tasa de respiración durante la maduración no
tiene un ascenso en su tasa de respiración ni producción de etileno durante su desarrollo, como
se observa en la figura 14.
Figura 14. Cambios de la fruta en diferentes etapas. Adaptado de Wills et al., (1982)
De acuerdo con los resultados, se presentaron valores de intensidad respiratoria entre 429.13 y
539.17 mgCO2 / kg h para los grupos M1 y M2 respectivamente, puesto que según Kader (2002)
estos valores se pueden deber a que la fresa se cataloga como un fruto de alta respiración.
Asimismo, López, Sánchez, Acuña y Fischer (2017) estudiaron los cambios fisicoquímicos de
fresa en diferentes estados de madurez encontrando un mayor incremento en IR con respecto al
avance de la maduración del fruto, con mayor similitud en estados 3 y 4; de igual forma reportan
resultados entre 150 a 450 mg CO2 / kg h los cuales no concuerdan con los resultados reportados
por Kader (2002) y Herrrera (2010) que oscilan entre 100 - 200 mg CO2 / kg. Se presume que
las diferencias entre los estudios relacionados y los resultados presentes en este estudio pueden
ser debido a condiciones edafológicas, variedad utilizada, grado de madurez, así como
condiciones ambientales de almacenamiento.
Teniendo en cuenta que M2 presentó una IR más alto en comparación a M1 se puede considerar
que se encontraba en un estado de madurez mayor, de igual forma el patógeno pudo influenciar
las características fisiológicas del fruto acelerando su senescencia, esto debido a que un mayor
grado de maduración indica mayor producción de etileno y Defilippi, Becerra y Robledo (s.f)
mencionan que la presencia de etileno durante el almacenamiento puede estimular el
crecimiento de Botrystis spp, generando así que M2 alcance el punto de senescencia en menor
tiempo, como se puede observar en la figura 15.
Figura 15. Intensidad respiratoria de las muestras durante 5 días de seguimiento.
La velocidad de respiración, medida por la producción de dióxido de carbono o por el consumo
de oxígeno, es una buena medida de la velocidad de metabolismo y sirve para predecir el
almacenamiento de frutas y verduras. Es deseable una baja velocidad de respiración, puesto que
indica un bajo porcentaje de utilización de azúcares, que son los principales sustratos
respiratorios, y de otros materiales de reserva esenciales, lo que alargará su vida (Pacheco y
Vivas, 2006). Como se observa en la figura 16 la velocidad de respiración de M1 y M2 no
presenta gran desviación, sin embargo, se observa que M2 alcanza el punto de senescencia más
rápido, en el día 5, esto debido a que el patógeno inoculado consume en mayor cantidad los
azúcares degradando con mayor rapidez el fruto, habiendo una correlación directa con la
intensidad respiratoria que muestra este mismo comportamiento al llegar más rápido a la
senescencia.
Teniendo en cuenta que las condiciones de almacenamiento, en las que se encuentra el fruto
pueden acelerar o mantener la IR y de esta manera favorecer el crecimiento del patógeno
evaluado. Según un estudio realizado por Wang, Xiong, Ling, Feng, Zhong, Shen y Guo (2013)
sobre el comportamiento de Fusarium con respecto al marchitamiento de hojas en diferentes
cultivos, encontrando que factores como luz y oscuridad influyen significativamente en el efecto
que puede tener dicho patógeno al actuar y atacar los frutos, determinando que una temperatura
más alta en la luz y más baja en la oscuridad, factores que asimismo influyen en la velocidad de
respiración de un fruto no climatérico. De acuerdo con los resultados reportados el primer
cambio de temperatura se dio a las cuatro horas de iniciar el tratamiento sin presentar un cambio
en su tasa de respiración, ni modificaciones visibles en la hoja, esto con respecto a las hojas
tratadas con el patógeno en cuestión; asimismo reportaron un aumento significativo de
temperatura entre las siguientes horas (4 a 9), contrario a la muestra control, que evidencio una
temperatura más baja y cambios visiblemente evidentes. De igual forma estas diferencias no
afectaron la tasa de respiración, demostrando que no hay una correlación directa entre la
temperatura y la tasa de respiración, comportamiento similar obtenido en la fase experimental
de este estudio, donde no se presentaron diferencias significativas entre cada grupo evaluado.
3.5.2 Determinación de color CieLa*b*
La figura 16 muestra los colores obtenidos de acuerdo con 10 puntos de color tomados de los
dos grupos evaluados y comparados con calculadora CieL*a*b* y modelo de word, se puede
evidenciar que no hay diferencias entre los tratamientos para el mismo modelo de cálculo. Sin
embargo, como se observa en la tabla 12 se observan tonalidades diferentes, esto debido
probablemente a que el modelo de word puede modificar los parámetros evaluados generando
un color más oscuro, de igual forma es evidente que la coloración no cambia entre los
tratamientos evaluados. Se realizó análisis estadístico de varianza ANOVA con un nivel de
significancia de 0.05 donde no se encontraron diferencias significativas para ninguno de los
parámetros de color entre M1 y M2.
Tabla 12. Resultados colorímetros obtenidos a partir de calculadora CieLa*b* y modelo de
color Word para los grupos evaluados.
Método Grupo
M1 M2
CieLa*b*
Word
𝛥𝐸 = √35,19 − 35,81)2 + (16,04 − 16,73)2 + (8,51 − 9,29)2
𝛥𝐸 = 1,70
Con los valores promedio de 10 datos tomados por triplicado para cada tratamiento se calculó
el valor 𝛥𝐸, siendo este de 1,70 por lo cual al observar la tabla 12 no se alcanza a evidenciar
diferencias de color, así como en la figura 16 se evidencian comportamientos muy similares,
como lo indica Oteo (2013) el valor 𝛥𝐸se utiliza para saber cuánta desviación hay en un sistema
de tratamiento de color, cuanto menor sea el valor 𝛥𝐸más difícil será su percepción al ojo
humano. Dichos valores de delta considerados admisibles son usualmente muy bajos. Entre 2 y
3,5 son valores ya perceptibles como colores distintos.
Figura 16. Gráficas de variación de color de parámetros CieLab para grupos M1 y M2
PÁRAMETROS CieLab de grupos M1 y M2
L* a*
b*
Se calculó el índice de coloración (IC), con la ecuación usada por Vignoni, Césari, Forte y
Mirábile (2006), teniendo en cuenta que un valor IC negativo (-40 a -20) va del azul violeta al
verde profundo; si este valor va de -20 a -2, se encuentra entre un verde profundo y uno
amarillento; por otra parte, el IC positivo se asocia a colores que van desde el naranja suave
hasta el rojo profundo.
𝐼𝐶𝑇1 =16.04×1000
35.19×8.51= 51.74 𝐼𝐶𝑇2 =
16.73×1000
35.81×9.29= 50.29
De acuerdo con el IC de los tratamientos se puede observar que tampoco presentan mayores
diferencias como se esperaba con respecto a las figuras anteriores, en cuanto a los datos
encontrados son considerablemente altos debido a la madurez del fruto puesto que un IC entre
20 y 40 está asociado con estado de madurez 3 – 4 con un color rojo intenso a rojo profundo,
valores más altos indican mayor acumulación de pigmentos y antocianinas en estado de
madurez 5 (Nunes et al., 2006).
No se presentó diferencia entre el grupo M1 y M2 referente al color, indicando así que el
patógeno inoculado no incide en un cambio marcado. Esto debido a que también se observó
crecimiento de hongo en M1, probablemente por la producción de esporas del patógeno,
contaminación previa a la cosecha y baja concentración de desinfección antes de iniciar el
análisis. Asimismo, relacionando las tomas termografías se presentó que en los deltas de
temperatura entre los dos grupos no presentan diferencias significativas porque la diferencia
entre estos es de 0.6 º C pudiéndose así correlacionar el comportamiento entre las temperaturas
y el color.
3.5.3 Determinación de pH
De acuerdo con los resultados obtenidos dentro del seguimiento realizado a las muestras de
fresa durante 5 días consecutivos, se puede observar una diferencia mínima entre los grupos M1
y M2 lo cual se confirma con el análisis de varianza ANOVA realizado, ya que, como se
evidencia no se observaron diferencias significativas. Monserrat (2016) relaciona un valor
promedio de pH de 3,23 para fresa en su estado de madurez entre 4 y 5, por lo cual se entiende
que los valores encontrados oscilen en este rango. De igual forma se observa que M2 presenta
un valor superior y un leve incremento durante las primeras tomas, esto debido a que los
conidios de Botrytis spp germinan en un rango de pH de 3 - 7 con un óptimo de 4 (Figueroa y
García, 2002).
Figura 17. Seguimiento de pH de los tratamientos
La figura 17 evidencia el comportamiento y cambios presentados con respecto al pH de los
grupos donde se puede observar que M1 incrementa levemente hasta alcanzar el valor óptimo
de pH de Botrytis spp para finalmente descender, en cuanto a M2 tiene un comportamiento
continuo hasta el día 4, ya que, en muchos casos se inicia una fase de latencia del hongo donde
los mecanismos de defensa de la planta parecen controlar al patógeno (Benito, Arranz y Eslava,
2000), para este día se observa un pico de crecimiento debido a que luego de un tiempo el
patógeno es capaz de vencer barreras defensivas del fruto, producir mayor esporulación y por
ende mayor crecimiento del microorganismo (Benito, Arranz y Eslava, 2000), para el último
día se observa un descenso considerable debido a que el hongo se encuentra en su máxima
expresión y se ha consumido casi en su totalidad el fruto.
3.5.4 Determinación de acidez
Se evaluaron las diferencias significativas con un nivel de significancia de 0.05, en donde no se
encontraron diferencias significativas entre los grupos evaluados para este parámetro. Se puede
observar un comportamiento ascendente para M2 hasta volverse constante conforme al tiempo,
este comportamiento es contrario al observado para M1 puesto que se evidencia que el valor
incrementa y disminuye constantemente durante la semana, como se observa en la figura 18.
Figura 18. Seguimiento de %acidez de los tratamientos
Alberte (2006) indica que uno de los daños producidos por Botrytis spp es el incremento de
acidez volátil y fijación de SO2, así como se observa en la figura 18, el tratamiento M2 presenta
dicho comportamiento. Se observa una acidez inferior para M1 debido a que la fresa tiene un
contenido aproximado de 8,9% de carbohidratos generando nutrientes óptimos que son fuente
aprovechable para este patógeno, por lo cual se presenta el incremento de acidez; de igual forma
dichos valores pueden ser contradictorios si se comparan con la figura 18, puesto que estos
resultados tendrían que tener un correlación directa con respecto al pH y como se observa en la
figura 19 este patrón tiene inicialmente un comportamiento básico hasta la última toma donde
desciende considerablemente y se acidifica.
La fresa tiene como ácido orgánico principal el ácido cítrico, siendo mayor su concentración en
estados más verdes del fruto disminuyendo progresivamente de acuerdo con la producción de
solidos solubles que gana debido a la conversión de azúcares que realiza durante el proceso de
maduración (Wills, McGlasson, Graham, & Joyce, 2007), lo cual genera el aumento de acidez
que se puede observar en la figura 18.
De igual forma la figura 18 muestra un aumento progresivo durante el seguimiento en M2 y un
descenso constante en cuanto a M1, esto debido a que B. cinérea es un gran productor de ácido
oxálico, un ácido tan fuerte que puede acidificar el medio donde se encuentra, estimulando la
producción y la actividad de un rango amplio de enzimas secretadas por este hongo, como
pectinasas, proteinasas y lacasas conocidas por degradar la pared celular, las cuales favorecen
la muerte celular del fruto infectado (Manteau, 2003).
3.5.5 Determinación de sólidos solubles (°Brix)
Se determinó la variación de sólidos solubles de las muestras evaluadas, se evidencia un
incremento continuo para la muestra M1, comportamiento contrario al que presentó la muestra
M2 a excepción del día donde tanto M1 como M2 descendieron significativamente, lo cual pudo
ser a causa de un error de laboratorio o reactivos utilizados, de igual forma se observa un
comportamiento similar con respecto a la acidez, puesto que fue mayor en M2 es decir que dicha
muestra contiene menor cantidad de sólidos solubles debido a que el patógeno Botrytis se
consume los nutrientes del fruto para poder sobrevivir. Sin embargo, al realizar análisis
estadístico de las muestras se pudo observar que no existen diferencias significativas para
considerarse como diferentes, es decir, que el hongo no causó ningún efecto dentro de la
muestra.
Figura 19. Seguimiento de º Brix de los grupos evaluados.
Tejada (2014) en un estudio de inductores de defensa en control de Botrytis en cultivo de tomate
reportó que no se encontró diferencia estadística en el orden de mérito reportándose promedios
similares de 4.0 a 3.14 °Brix, es decir, se puede apreciar que no hubo influencia de los productos
en estudio comportándose todos los productos estadísticamente igual que el testigo. A pesar de
que Decco (2018) indica que el sabor cambia debido a la hidrólisis de los almidones que se
transforman en azúcares. Su sabor pasa de ser ácido a ser más dulce, debido a que su pH se
eleva cuando madura. El aroma se desarrolla por la formación de una serie de compuestos
volátiles que les imparten un olor característico a las diferentes frutas. Además, Según Ménager
et al. (2004), Nunes et al. (2006) y Salamat, Ghassemzadeh, Heris y Hajilou (2013), los sólidos
solubles de la fresa tienden a incrementarse durante la maduración del fruto en planta. Sin
embargo, estos resultados se pudieron ver afectados debido a la presencia de agentes patógenos
que alteraban las condiciones y variables del medio.
Asimismo es importante resaltar el efecto que tiene las condiciones ambientales a las que se
expone o como se mantiene el fruto, con respecto a cambios de sólidos solubles, así como
mencionan Franco, Saucedo, Calderón, Cruz, Teliz y Galicia (2018) en un estudio de calidad
de tres variedades de Fresa tratadas en atmosfera modificada reportaron valores constantes
cuando el fruto se mantiene en una atmosfera controlada hasta exponer el fruto 2 días a ambiente
y elevar sus sólidos 2 puntos, como se refleja en la figura 19 al día 5 de seguimiento cuando se
incrementa repentinamente los ºbrix del fruto, de igual forma este comportamiento se explicar
como sucede en el caso de la uva puesto que lo que hace básicamente este hongo es secar el
fruto. Al eliminar el agua, la uva queda mucho más concentrada en azúcares y elementos
sólidos, dando como resultado un fruto con más sabor y más concentrado (Agromática, s.f).
3.5.6 Efecto de la temperatura en parámetros fisicoquímicos
La figura 15 muestra que el comportamiento de la tasa de respiración, en ambos grupos, va en
descenso mientras que la temperatura presenta una tendencia de aumento (ver figuras 12a y
12c), similar a lo presentado por Dura, Almela y Ortolá (2010), en su artículo sobre la
modelización de la tasa de respiración de caqui rojo, en donde trabajaron temperaturas de 1 a
15°C, de manera consecutiva, midiendo la tasa de respiración en cada una de ellas, resultando
que a mayor temperatura menor tasa de respiración, los escritores explican que este es un
producto del aumento de la concentración de CO2 y disminución de O2.
Por otro lado, se observa que el comportamiento de los °Brix, tanto el grupo M1 como el M2,
tienen relación con el comportamiento de las temperaturas, disminuyendo la cantidad de solidos
solubles y temperatura, a partir del día 3, resultados parejos a los reportados por Vinicio (2010),
trabajó la conservación de las fresas mediante tratamientos térmicos, en intervalos de 40, 45 y
50°C, concluyendo en su trabajo que las temperaturas influyen en el incremento de solidos
solubles en la fresa, presentando una relación directamente proporcional, explicando Suarez,
Pérez, Sanabria, Valera y Ulacio (2009), que a temperaturas más altas mayor deshidratación, y
por ende mayor concentración de solidos como finalidad de esta deshidratación.
Durante la experimentación no se presentó un cambio de temperatura considerable que permita
realizar una correlación apropiada entre los parámetros fisiológicos y fisicoquímicos.
3.6 IDENTIFICACIÓN DEL HONGO
3.6.1 Imágenes digitales de los tratamientos en medio de cultivo PDA
Figura 20. Visualización del grupo M1 en agar
al 5 día del tratamiento
Figura 21. Visualización del grupo M2 en agar
al 5 día del tratamiento
En la figura 20 se observa el crecimiento de 3 colonias diferentes, entre ellas se puede presumir
el crecimiento de Botrytis spp, sin embargo, al realizar análisis microscópico no se logró
ratificar dicha hipótesis. Referente al grupo M2, figura 21, se observa de igual forma la
caracterización de crecimiento de Botrytis spp, el cual si se observó en microscopio.
En su estudio Sepúlveda (2015) reporta que en cajas Petri con medio de cultivo PDA crece y se
desarrolla colonias algodonosas, de color blancas a grises o también pardo – grisáceas con un
diámetro de colonia de 6 – 9 cm, como se observa en la cepa control utilizada para las
respectivas inoculaciones, figura 22.
Figura 22. Cepa control de Botrytis spp
3.6.2 Análisis cualitativo
3.6.2.1 Morfología de colonias en medio de cultivo PDA
En la tabla 13 se realiza la descripción morfológica de las colonias evidenciadas en las figuras,
21 y 22, de acuerdo con una adaptación de la tabla realizada por Cepero, Restrepo, Franco,
Cárdenas y Vargas (2012).
Tabla 13. Descripción morfológica de las colonias encontradas en los grupos evaluados
Parámetro Características
M1 M2
Color
Reverso Negro, verde con
blanco y amarillo
Blanco, amarillo con
partes verdes
Colonia 3 colonias diferentes,
negra, verde y amarilla
Blancas con halo un
poco transparente
Pigmento del
medio Incoloro Blanco
Tamaño de Colonia Diámetro N.A - < 1 cm N. A
Apariencia
Aterciopelada Si No
Algodonosa Si Si
Cremosa Si No
Las colonias de moho gris presentan un micelio blanco, denso, piloso que posteriormente se
torna gris (Farrera, Zambrano y Ortiz, 2007), características que corresponden con las
mencionadas en la tabla 13 y las observadas en la cepa control utilizada para inocular M1, véase
figura 22. Aunque macroscópicamente se evidencia crecimiento.
3.6.2.2 Comparación colonias macro y microscópicamente.
Figura 23. Visualización in vivo e in vitro y en microscopio del grupo M1
*Se relacionan resultados desde el tiempo cero del seguimiento y se realiza análisis desde que se evidencian
cambios significativos.
Tiempo (Días)
1
2
3
4
5
No se evidencio en
microscopio
No se evidencio en
microscopio
No se evidencio en
microscopio
Frente Reverso Agar Microscopio
De acuerdo al grupo M1, como se observa en la figura 23, el primer cambio y presencia de
hongo se observó al tercer día, es decir 72 horas, donde se observa hongo color verde
algodonoso por el borde derecho del fruto y el sépalo se encuentra más seco con puntas marrón,
el crecimiento de hongo en este tiempo se debe a las condiciones de almacenamiento a las cuales
se encontraban las muestras así como lo menciona El Semillero (2019) una fruta de fresa
cosechada en plena maduración y mantenida a temperatura ambiente, se deteriora en un 80%
en solo 8 horas por lo que las cajas se llevan inmediatamente a un cuarto frío. Lo anterior
mejorará la vida de anaquel y apariencia de las frutas por las siguientes 72 horas, haciéndolo
más durable y manteniendo sus características de una fruta apetecible. Del mismo modo, para
este tiempo en la muestra in vivo se observó crecimiento de colonias negras aterciopeladas con
un halo color blanco crema alrededor, de acuerdo con parámetros de calidad del medio de
cultivo PDA una de las colonias que pueden crecer con características como algodonosas,
expandidas, negras y muy esporuladas en 3-5 días corresponde a Aspergillus niger, con respecto
a las características macroscópicas A. niger crece rápidamente y se reconoce con facilidad por
su aspecto polvoriento; inicialmente el micelio es color blanco, luego se va tornando oscuro y
finalmente adquieren diversos colores, que van del negro azabache al pardo oscuro. Con
relación al reverso la colonia parece una tela gamuzada de color gris-amarillento, lo que
distingue a A. niger de otros hongos con colonias oscuras llamados hongos dematiáceos (Gil,
2018). Para el último día de seguimiento en las muestras in vivo se observó en el reverso
ablandecimiento del fruto y coloración amarilla por donde se observaba crecimiento de hongo,
en efecto las condiciones para la muestra in vitro no presentan mayor variación con respecto al
hongo mencionado, pues, aunque se evidencia colonias color blanco lisas en su mayoría la
predominancia se encuentra en la negras cremosas. Asimismo, la visualización microscópica
según Gil (2018) corresponde a conidios de aspecto variable entre globosas, subglobosas,
elípticas, lisas, equinuladas, verrugosas o con estrías longitudinales, todas de color negro con
un tamaño máximo de 75 micras, las cuales por lo general no son observables debido a lo denso
de la acumulación de las colonias negras. Aunque según la imagen evidenciada en la tabla no
se logra identificar si el microorganismo encontrado corresponde a las características
microscópicas mencionadas previamente, de acuerdo a la información recolectada in vivo, in
vitro e imagen microscópica se concluye que el hongo encontrado corresponde a A. niger. Cabe
destacar que las condiciones de crecimiento de este hongo son similares a Botrytis spp, de 25 a
37 º C, en medio de cultivo PDA, por ende, al no inocularse el patógeno en estudio se brindan
los nutrientes y condiciones propicias de crecimiento.
Figura 24. Visualización in vivo e in vitro y en microscopio del grupo M2
*Se relacionan resultados desde el tiempo cero del seguimiento y se realiza análisis desde que se evidencian
cambios significativos.
Tiempo (Días)
1
2
3
4
5
No observado
Frente Reverso Agar Microscopio
Por otro lado, el fruto evaluado para el grupo M2, como se observa en la figura 25, el crecimiento
del hongo in vitro se percibió a partir del día 2 con un crecimiento de colonias considerable, de
tal forma que al realizar el conteo desde el primer crecimiento se presentó un resultado
incontable por la cantidad de unidades formadoras de colonias presentadas, por ende el día
quinto tampoco se logró identificar la cantidad de UFC.
Figura 25. Visualización in vitro y microscópica de Botrytis spp según Bolda y Koike, 2012.
En ese contexto se evidencia que las colonias encontradas en M2 corresponden a Botrytis spp
debido a las ramificaciones e hifas observadas microscópicamente, puesto que el micelio de B.
cinerea está constituido por un conjunto de hifas o filamentos tabicados, cilíndricos que se
multiplican mediante división citoplasmática, siendo común que tenga lugar una división
nuclear sin que se haya producido división citoplasmática (Rodríguez, 2013).
Finalmente con respecto a la variación de temperaturas encontradas y el seguimiento visual
realizado se determinó un crecimiento para el grupo M1 al tercer día del ensayo y para M2 al
segundo día, con respecto a temperaturas se determinó la primera variación en M1 a las 51 horas,
es decir 2.1 días, y en M2 a las 27 horas, 1.1 día; de modo de aunque los tiempos no son exactos
se evidencia una relación entre el crecimiento del hongo y el delta de temperatura presentado,
indicando así que a partir de variaciones de temperatura si se puede determinar o predecir
crecimiento de patógenos.
3.6.3 Análisis cuantitativo
Los resultados finales durante todo el seguimiento fueron incontables, desde el día cero hasta el
día 5, por lo cual no se pudo establecer un patrón de crecimiento valido, esto debido a que se
utilizaron diluciones de 10-2 y 10-3 para realizar los respectivos cultivos, las cuales se presume
se encontraba el microorganismo muy concentrado impidiendo realizar una cuantificación
favorable.
3.7 ANÁLISIS ESTADISTICO
Se realizó análisis de varianza ANOVA entre las temperaturas más cálidas (Sp1) y más frías
(Sp2) obtenidas en los análisis in vivo e in vitro, como se observa en el Anexo 3, las muestras
evaluadas de los grupos M1 y M2 in vivo no presentaron diferencias significativas, es decir que,
aunque presentaron desviación, no es suficiente para considerar que el estudio permite la
predicción del hongo. Sin embargo, según estudios realizados los cambios térmicos no suelen
ser altos ni alcanzan a generar una diferencia significativa, pero son suficientes para considerar
que esta variable fue estable. De igual forma al realizar el análisis de la muestra in vitro no se
identificaron diferencias el primer día, contrario al quinto día donde se acepta la hipótesis nula
tanto para Sp1 como Sp2, esto debido a que el hongo se encuentra en su máximo de crecimiento.
CONCLUSIONES
Se realizó la predicción del crecimiento del hongo Botrytis spp en fresa (Fragaria
anannasa) mediante estudios in vivo e in vitro mediante termografía infrarroja, imágenes
digitales y análisis fisiológico y fisicoquímicos.
Se logra concluir que la termografía es una herramienta la cual es posible aplicar en el
manejo postcosecha, ya que se evidencio la correlación del crecimiento del hongo de manera in
vivo con los cambios y variaciones de temperatura, sin embargo, los parámetros establecidos,
para esta variable, en la metodología in vitro no fueron las adecuadas, por lo tanto, esto impidió
llevar un registro detallado del crecimiento del hongo y con ello la comparación in vivo e in
vitro.
Asimismo, se evidencio relación entre los cambios de temperatura y el crecimiento in
vitro del patógeno en los mismos horarios, de este modo se puede establecer que el ensayo
realizado permite determinar o predecir el crecimiento de hongos o agentes extraños que estén
alterando las características del fruto.
Dentro del análisis realizado en cuanto a parámetros fisiológicos se logró determinar
que la inoculación del patógeno evaluado altera la tasa de respiración del fruto deteriorando la
vida útil del mismo de manera más rápida, debido a que Botrytis spp se consume y degrada en
mayor rapidez los nutrientes. Asimismo, en cuanto a los parámetros fisicoquímicos se pudo
determinar que sí se presentan variaciones entre M1 y M2 principalmente en parámetros de pH
y acidez, en cuanto al color se pudo apreciar diferencias entre los valores reportados pero el
mismo comportamiento de las muestras. Sin embargo, es importante mencionar que dichas
variaciones no fueron lo suficientemente amplias como para determinar diferencias
significativas en ninguna de las muestras.
RECOMENDACIONES
Se recomienda mayor dosis de desinfectante para así asegurar la inhibición del hongo y
obtener datos con mayor exactitud. Además de esto, mantener los dos grupos en espacios
distintos para así evitar que el grupo control no se infecte mediante la esporulación del
hongo del otro grupo.
También se sugiere que el sitio donde se realice la experimentación permita mantener
estableces parámetros como luminosidad, humedad y temperatura, y así tener resultados más
exactos y evitar errores por la variación natural de estos parámetros.
Para poder realizar efectivamente la comparación del crecimiento del hongo mediante
el procedimiento in vivo e in vitro mediante imágenes termográficas, es ideal utilizar una cabina
de flujo laminar que permita generar un ambiente estéril dando protección al producto y
garantizando así no afectar las condiciones generales del tratamiento ni contaminación de las
muestras, que puedan alterar los resultados finales.
Se recomienda aplicar un inhibidor, ya sea químico o biológico, que permita obtener un
control eficaz del hongo y de esta manera poder realizar un análisis adicional con una muestra
que garantice el no crecimiento y alteración microbiológica, permitiendo probablemente
obtener resultados con mayor variación.
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ANEXOS
Anexo 1. Metodología de seguimiento realizada durante la semana de experimentación
Anexo 2. Tabla correspondiente a las horas de realización del seguimiento del registro
fotográfico in vivo e in vitro, mostrado en minutos.
Anexo 3. ANOVA temperatura Sp1 y Sp2 in vivo.
Anexo 4. ANOVA temperatura Sp1 y Sp2 in vitro el primer día de inoculación.
Anexo 5. ANOVA temperatura Sp1 y Sp2 in vitro el quinto día de inoculación.