prÁctico 7 ejercicio globalizador

PRÁCTICO DE BIOQUÍMICA INFORME TALLER DE EJERCICIOS

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PRÁCTICO 7 – EJERCICIO GLOBALIZADOR En los efluentes de un frigorífico se descubrió una cepa bacteriana que produce y secreta una enzima con actividad proteasa. La actividad de esta enzima puede determinarse utilizando el medio del cultivo donde creció la bacteria como si fuera un extracto de enzima. Si al medio de cultivo se le agrega BAPNA (N-benzoil-arginina-p-nitroanilida), se desarrolla una coloración amarilla, típica de la p-nitroanilina (producto de la hidrólisis del BAPNA) que puede medirse a 405 nm. Dado que esta cepa bacteriana puede crecer a altas densidades en medios de cultivos de muy bajo costo, se pensó que la bacteria podría utilizarse para la producción de esta proteasa (una enzima de potencial interés industrial). Para evaluar su potencial y caracterizar sus propiedades es primero necesario purificar la enzima. Para la purificación de esta proteasa, se recurrió a un proceso que constó de tres etapas: (1) Precipitación de proteínas del medio de cultivo con sulfato de amonio. (2) Cromatografía de filtración en gel. (3) Cromatografía de intercambio iónico. Etapa 0 - Obtención del sobrenadante del cultivo La cepa bacteriana se creció en 2 litros de medio de cultivo durante 48 h. Luego, el cultivo se centrifugó, se desechó el sedimento (células bacterianas) y se conservó el sobrenadante límpido donde se encontraría la proteasa secretada (este sobrenadante se rotuló como F0). Se analizó a F0: 1) realizando una electroforesis desnaturalizante, como se muestra en la Figura 1 (gel de la izquierda) y 2) midiendo su actividad enzimática utilizando el sustrato BAPNA (Figura 2).

Etapa 1 - Precipitación con sulfato de amonio - (NH4)2SO4 A los 2 L del sobrenadante límpido del cultivo se le agregaron 780 g de (NH4)2SO4 en cristales (cantidad suficiente para lograr un 60 % de saturación), observándose la formación de un precipitado blanco. Se centrifugó, desechándose el sobrenadante y conservando el precipitado (donde estarían presentes las proteínas capaces de precipitar a un 60% de saturación de sulfato de amonio). El precipitado de proteínas se disolvió en un volumen total de 5,0 mL de agua. A esta fracción se la rotuló como F1. La misma se analizó por electroforesis desnaturalizante (ver Figura 1, gel de la derecha) y se evaluó la actividad enzimática utilizando el sustrato BAPNA (Figura 3). Etapa 2 - Cromatografía de filtración en gel F1 se sometió a una cromatografía de filtración en gel. Se usó una columna de Sephadex G-50 (rango de fraccionamiento 1.500 - 30.000 Da), de 96 cm de largo y 2 cm de diámetro (volumen total: 300 mL). La matriz cromatográfica se equilibró con una solución de NaCl 0,1 M en buffer Tris-HCl 10 mM y pH 8,0 (buffer A). Se inyectaron los 5 mL de la fracción F1, y el proceso cromatográfico se inició por el agregado de la fase móvil a una velocidad de flujo de 1 mL/min. Se colectaron fracciones de 1,0 mL (se usó un colector de fracciones automático), y se midió la A280nm de cada fracción (o eluído) recolectado. Con los valores obtenidos se construyó el cromatograma o perfil de elución (ver la Figura 4). Por otra parte, se hicieron ensayos de actividad proteasa de las fracciones correspondientes al máximo de cada pico (fracciones #60, #79, #95, #162, #196, #250


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y #300) (No se muestran estos resultados). Según los resultados obtenidos, la fracción #60 (correspondiente al máximo del pico I) presentó alta actividad enzimática, en tanto que en las otras fracciones ensayadas la actividad fue casi indetectable. Se conservaron todas las fracciones del pico I para continuar con el proceso de purificación (está indicado en el cromatograma, Figura 4). El conjunto de estas fracciones se rotuló como F2. En la Figura 5 se muestra una SDS-PAGE de F2, y en la Figura 6 se muestra el resultado de los experimentos de actividad enzimática de F2. Etapa 3 - Cromatografía de intercambio iónico

- (a) Ensayos exploratorios (cromatografía a escala analítica) Como no se conocía el punto isoeléctrico (PI) de esta enzima, se hicieron ensayos preliminares de intercambio iónico con una pequeña cantidad de F2. En un caso, se usó CM-Sephadex (intercambiadora de cationes) y en el otro, DEAE-Sephadex (intercambiadora de aniones). En ambos casos, las mini-columnas se equilibraron con la misma solución usada en la cromatografía de filtración en gel (buffer A). En cada columna se cargó una pequeña cantidad de F2 y se permitió la adsorción de las proteínas a la matriz cromatográfica. Luego se recolectó el percolado y se hicieron varios lavados con buffer A. Por último, mediante el aumento de la fuerza iónica (buffer A + NaCl 0,5 M = buffer B), se eluyó el material retenido en las columnas. Para determinar la presencia de la enzima, se hicieron ensayos de actividad tanto para el percolado como para la elución en buffer B de ambos experimentos (No se muestran

estos datos). Se pudo constatar que:

Cuando se realizó la cromatografía con CM-Sephadex: el percolado presentó actividad enzimática muy intensa, pero ésta fue casi indetectable en la fracción obtenida luego de la elución con buffer B. Cuando se realizó la cromatografía con DEAE-Sephadex: el percolado tuvo muy baja actividad, en tanto que en la elución con buffer B, la actividad enzimática fue muy alta.

Se optó por procesar el total de F2 con una columna a escala preparativa de DEAE-Sephadex.

- (b) Cromatografía de intercambio iónico a escala preparativa La columna preparativa se equilibró con buffer A. Se cargó el volumen total de F2 (considere despreciable el volumen de F2 que utilizó en los ensayos previos). Se lavó la columna con buffer A hasta que la A280 nm de los lavados fue menor a 0,010. Luego, se procedió a eluir las proteínas retenidas con buffer B. Se colectó un total de 2 mL. Se rotuló como F3. En la Figura 7 se muestra una SDS-PAGE de F3, y en la Figura 8, los resultados del ensayo de actividad enzimática de F3.

En la Figura 9 encontrará la información necesaria para el cálculo de la concentración de proteínas de las diferentes fracciones. Con los datos que se dan a continuación, haga los cálculos necesarios para completar la siguiente tabla que resumiría los datos del proceso de purificación.


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Datos:

- El coeficiente de extinción molar de la p-nitroanilina a λ 405 nm es ε = 10500 M-1 cm-1. Para simplificar los cálculos, se sugiere usar un coeficiente de extinción en unidades de concentración µM, es decir ε = 0,0105 µM-1 cm-1. - Una unidad de enzima (1 U) se define como la cantidad de enzima que permite la formación de 1 µmol de producto en 1 minuto.

Proteínas

Actividad enzimática

Vo

lum

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Co

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ETAPA

0 - Sobrenadante del

cultivo

1 - Precipitación (NH4)2SO4

2 - Filtración molecular

3 - Intercambio iónico


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Dibuje un esquema de cada una de las etapas de purificación descritas más arriba.

ETAPA 0 ETAPA1

ETAPA 2 ETAPA 3


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