UNIVERSIDAD AÚTONOMA DE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS

CIENCIA Y TECNOLOGIA DE LOS ALIMENTOS

Santiago Landín

Réka Maulide Cane

13 Deciembre de 2010

1. PRÁCTICA IV: EXTRACCIÓN DE PIGMENTOS DE MICROALGAS

POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA.

La presente práctica tiene por objetivo el análisis (mediante HPLC) de

carotenoides de una muestra de espirulina. La Spirulina platensis es una microalga

verde-azul conocida por su alto valor nutritivo y considerada como una de las fuentes

naturales más completas de proteínas, vitaminas, minerales y otros nutrientes.

Los carotenoides son provitamina A. Los beta carotenos son pigmentos naturales

que se pueden encontrar en frutas y hortalizas de color rojo, naranja y amarillo, o

también en vegetales verdes oscuros.

1.1. EXPLICACIÓN DE ALGUNOS CONCEPTOS IMPORTANTES.

Al ser sólida la muestra (de microalga), esta no podría entrar en el HPLC, por

eso se ha tenido que hacer un extracto de carotenoides que tenía la muestra.

Los carotenoides son apolares, se han extraído con disolventes orgánicos: etanol,

acetona, acetato de etilo y hexano.

Las técnicas de extracción que fueron utilizadas por los distintos grupos de

prácticas fueron:

* Extracción con disolvente sólido-líquido: se cogió una fracción de la muestra,

se añadió el disolvente y se agitó. Se procedió a la extracción de los compuestos y en

seguida se evaporó el disolvente en un rotavapor (a temperatura ambiente).

* Extracción con ultra sonidos: el ultrasonidos provoca la agitación de las

moléculas.

* Extracción asistida por microondas: el microondas calienta rapidamente

(rompiendo más, se extrae más). Cuanto más polar sea el compuesto más se calienta y

más se extrae. En este método hay que buscar las condiciones para que la muestra no se

caliente demasiado (no más de 100º C) evitando así la degradación de los carotenoides.

Otra técnica que se puede usar, es la A.S.E (extracción acelerada con disolvente)

en la que se usa la temperatura, se calienta muy rápido y con alta presión, en un

recipiente cerrado y presurizado.

El extracto de microalga tiene color verde porque hay mucha clorofila. Sin

embargo, los carotenoides tienen color amarillo –rojo (el color verde enmascara el color

de los carotenoides, al ser más abundante la clorofila). Se hace cromatografia en capa

fina para saber que hay en la muestra.

1.2. RESULTADOS OBTENIDOS (EXTRACCIÓN).

a) Condiciones seleccionadas para la extracción en microondas.

Muestra: Spirulina plantesis.

Disolventes utilizados: Etanol y Acetato de etilo.

Presión: 650 Watt

Tiempo: 3 min

Limite de temperatura: 120º C

Temperatura: 80º C

Datos obtenidos (Microondas): 10 seg ---- 43º C

31 seg ---- 58º C

41 seg ---- 61º C

50 seg ---- 98º C

55 seg ---- 110º C

1 min ---- 120º C

1:12 min – 124º C

Las condiciones elegidas por el grupo no son las más adecuadas para la

extracción. Habría que optimizar el proceso de extracción, elegir nuevas condiciones de

trabajo (temperatura, presión y tiempo).

b) Cálculo del Rendimiento de la Extracción (%).

- Datos: * Matraz vacío (etanol) = 79,5419g

* Matraz vacío (acetato de etilo) = 76,6612g

* Matraz + Extracto (etanol) = 79,5588g

* Matraz + Extracto (acetato de etilo) = 76,6733g

Rendimiento extracción (%) = extraído/g extracto. 100

- Resolución:

Extracto seco (etanol) = 79,5588 – 79,5419 = 0,0169g = 16,9 mg

Extracto seco (acetato de etilo) = 76,6733 – 76,6612 = 0,0121g

= 12,1 mg

Redisolución en etanol en los 10 mg/ml (etanol) = 16,9/10 = 1,69 ml

Redisolución en etanol en los 10 mg/ml (acetato) = 12,1/10 = 1,21 ml

Rendimiento (etanol) = (0,0169 /2,5). 100 = 0,68 % debido a pérdidas

de parte la muestra

en el proceso de

apertura del cilindro

teflón este

rendimiento no

corresponde al total

de la muestra. Por lo

que usaremos los

datos de otro grupo

(en la tabla de

rendimiento).

Rendimiento (acetato de etilo) = (0,0121/2,5)/100 = 0,48 %

b) Tabla con los rendimientos de los métodos de extracción (todos grupos).

MÉTODO DE

EXTRACCIÓN

DISOLVENTE PESO

EXTRACTO

RENDIMIENTO

EXTRACCIÓN(%)

Microondas Etanol 95,5mg 3,62% Microondas Acetona 34,6mg Microondas Acetato de Etilo 12,1mg 0,48% Microondas Hexano 4,7mg Sólido -Líquido Etanol Sólido -Líquido Acetona Sólido -Líquido Acetato de Etilo Sólido -Líquido Hexano

Ultrasonidos Etanol 2,4mg 0,96%

Ultrasonidos Acetona 0,0030g 0,12%

Ultrasonidos Acetato de Etilo 5,4mg 0,216%

Ultrasonidos Hexano 0,0003mg 0,012%

1.3. RESULTADOS OBTENIDOS (CROMATOGRAFIA EN CAPA

FINA).

a) Cromatograma obtenido.

Distancias recorridas: * Patrón (β caroteno) = 6,3cm

* Acetato de etilo = 2,5 – 3,5 - 6,3cm

* Etanol = 2,5 – 2,9 – 6,2cm

* Hexano (0)

* Acetona = 2,7 – 6,3 cm

- Tanto en las muestras extraídas con acetato de etilo como en las extraídas con

etanol y acetona están presentes carotenoides (beta carotenos). En la muestra extraída

con hexano no se detectó la presencia de ningún carotenoides u otro compuesto.

b) Cálculo del Rf.

2. PRÁCTICA V: ANÁLISIS DE CAROTENOIDES EXTRAÍDOS DE

MICROALGAS POR CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS (HPLC-DAD).

El análisis (mediante HPLC) de pigmentos de microalgas tiene como objetivo

ver carotenoides de la Spirulina.

2.1. EXPLICACIÓN DE ALGUNOS CONCEPTOS IMPORTANTES.

El detector DAD (Diode Array) permite ver espectros.

Cuando tenemos un cromatograma es difícil identificar los compuestos en

HPLC. Para ello nos ayudamos de otras técnicas. El simulador HPLC se usa para

caracterizar Spirulina con Diode Array. Columna utilizada: de fase inversa, apolar.

Se introducen disolventes en una columna con una bomba. El detector puede ser

de longitud de onda fija o variable o de Diode Array. Se detecta lo que sale. Se inyecta

la muestra con un sistema de inyección (llave de varias vías, que permite ir conmutando

la posición e inyectar varias muestras).

Para cambiar la separación se puede cambiar el disolvente. En fase inversa se

usaron: columna apolar y disolventes polares (miscibles con el agua). Se usa disolvente

agua: metanol, agua: ACN, agua: THF.

En la simulación se eligió el % del disolvente y se vio la separación. Los

disolventes orgánicos salen más rápido. Cuanto más metanol haya más arrastra los

compuestos orgánicos afines (se eluyen más rápido en un menor tiempo).

En la vida real es difícil llegar a las condiciones óptimas de separación (% de

disolventes); cada cambio de disolvente implica un tiempo por que hay que purgar el

sistema, por ejemplo. En la simulación, se trataba de elegir la muestra que tiene 9

compuestos e intentar separarla.

2.2. SIMULACIÓN DE UNA SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA POR

HPLC.

► Simulación 1.

- Muestra: AllStair.

- Columna: DuPont C18.

- Disolvente: metanol. % de disolvente: 51% metanol (49% H2O).

- Flujo: 2,0 ml/min. Presión: 4109 psi. Isocrático (Sin gradiente).

- Volumen de la inyección: 20 μl. Tiempo: 20 min.

- Detector:* Longitud de Onda-200nm; *Haz de diodos: sí; *Sensibilidad:0,500.

► Simulación 2.

- Muestra: AllStair.

- Columna: DuPont C18.

- Disolvente: aceto nitrilo. % de disolvente: 40% aceto nitrilo.

- Flujo: 1,3 ml/min. Presión: 1505 psi. Isocrático (Sin gradiente).

- Volumen de la inyección: 20 μl. Tiempo: 20 min.

- Detector:* Longitud de Onda-200nm; *Haz de diodos: sí; *Sensibilidad:0,500.

► Simulación 3.

- Muestra: AllStair.

- Columna: DuPont C18.

- Disolvente: metanol.

- Flujo: 4,1 ml/min. Presión: 2841 psi.

- Gradiente: 40 % (Inicial %B); 100% (Final %B).

- Volumen de la inyección: 10 μl. Tiempo: 5,0 min.

- Detector:* Longitud de Onda-200nm; *Haz de diodos: sí; *Sensibilidad:0,500.

La simulación 3 es el método más válido, tiene mejores condiciones que las

simulaciones 1 y 2.

El mejor disolvente a emplear es el metanol, el peor es el tetrahidrofurano,

puesto que nos da picos sobrepuestos y una peor resolución.

2.2.1. SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA POR HPLC USANDO LAS

CONDICIONES DE LA SIMULACIÓN 3.

- Fenol (5mg/ml): es el primer pico.

- p-nitrophenol (1mg/ml): es el segundo pico.

- β-cresol (1mg/ml): es el tercer pico.

- Metilbenzoato(1mg/ml): es el cuarto pico.

- 2,5 – xylenol (1mg/ml): es el quinto pico.

- Anisol (1mg/ml): es el sexto pico.

- Phenetol (1mg/ml): es el séptimo pico.

- Tolueno (1mg/ml): es el octavo pico.

- Benceno (1mg/ml): es el nono pico.

2.3. RESULTADOS OBTENIDOS.

A) CROMATOGRAMAS OBTENIDOS.

► 1º: Patrón Xantofila; 2º: Patrón Caroteno; 3º: Microondas Etanol.

► Espectro ---- Microondas Etanol.

► Espectro ---- Microondas Acetato de Etilo.

B) COMPARACIÓN.

- El método de microondas es el que mejor extrae comparando con los demás

métodos. Tanto con acetona como con etanol, se extrae mejor.

- Con el hexano casi no hay β-caroteno. Se ve clorofila. Se extrae mucho peor.

Con ultrasonidos se ve mal.

- En sólido líquido se extrae un poco mejor con acetato de etilo que con hexano.

El microondas (acetato de etilo) extrae mejor que el sólido líquido.

- Con la acetona se extrae mejor xantofilas que con hexano (ultrasonidos).

- Con el microondas el hexano es con el que se extrae peor.

- Los carotenos salen más tarde la columna, son más apolares, se retienen más.

- Las xantofilas salen antes, son menos apolares.

Hay xantofila en el alga pero es luteína, no se sabe cual es (si es zeoxantina u

otros).