prácticas 5 y 6 electroforesis y ampliacion de adn por pcr (3)

7/21/2019 Prácticas 5 y 6 Electroforesis y Ampliacion de ADN Por PCR (3)

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Prácticas de Biología Molecular – Semestre 2015-II

PRÁCTICAAMPLIFICACIÓN DEL DNA MEDIANTE PCR

1. MARCO TEÓRICO

La Reacción en Cadena de la Polimerasa es una técnica mediante la cual se pueden

producir múltiples copias de un segmento corto específico de ADN, delimitado por los

primers o cebadores, a través de “n” ciclos de temperatura, a fin de obtener un

número exponencial (2n) de copias del producto amplificado de doble hebra.

La selección de una región en particular a amplificar depende de los Primers o

cebadores. Estos constituyen una secuencia corta de oligonucleótidos de ADN, de

aproximadamente 25 – 30 pb, que son utilizados para iniciar la síntesis de ADN.

Existen diversos primers universales para regiones como mtDNA rRNA 16S descritospor Palumbi (1991), región parcial del gen mitocondrial COI de Folmer et al. (1994),

otros denominados Degenerados entre otros.

Marcador Primer Secuencia (5’ - 3’) Referencia

16S 16Sar-L CGCCTGTTTATCAAAAACAT Palumbi, 1991

16Sbr-H CCGGTCTGAACTCAGATCACGT

COI-5P LCO1490 GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG Folmer et al., 1994

HCO2198 TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA

COI DR1 GGTCWACAAAYCATAAAGAYATTGG Steinke (2007)

DF1 TAAACYTCAGGRTGACCRAARAAYCA

La PCR consiste en ciclos de temperaturas asociados a los procesos de:

desanturalización, annealing o hibridación y extensión. La temperatura de annealing

está relacionada con la temperatura de fusión o de melting (Tm) de los primers a

utilizar, y representa la temperatura a la cual el 50% de oligonucleótidos se encuentra

en dsDNA o hibridizado y el otro 50% en ssDNA o desnaturalizado.

2. PROCEDIMIENTO

Preparación del master mix

-

Limpiar el área a trabajar con etanol 95°- Realizar todo el trabajo en frío (sumergir los tubos en hielo)




- Seleccionar las muestras de ADN molde a amplificar y rotular los tubos de PCR

según las muestras seleccionadas.

- De acuerdo a los volúmenes reacción y al kit de PCR a utilizar, realizar los cálculos

necesarios para determinar volumen del master mix a preparar para el número de

muestras + 1 (sin considerar el volumen del ADN), y la concentración final de

reacción.

- Preparar el master mix en un microtubo de 0.6 mL rotulado

- Rotular y alicuotear la cantidad necesaria por reacción en cada tubo de PCR de

0.2mL

- Agregar la cantidad de ADN molde dependiendo de su concentración (0.5 – 1μL).

- Mezclar en un vortex y centrifugar por segundos, en modo touch

3. Amplificación de ADN

- Colocar los tubos de PCR en el termociclador y seleccionar el file con las siguientes

condiciones de temperatura

- Ajustar la temperatura de hibridación de acuerdo a la secuencia de primers

seleccionados y al ADN molde a utilizar

- Una vez terminado el PCR (aproximadamente luego de 2 horas) evaluar los

resultados inmediatamente, de lo contrario se pueden almacenar las muestras a –

20 °C hasta su análisis.

4. Análisis de datos

- Evaluar los resultados del amplificado mediante una electroforesis, determinar el

tamaño del amplificado y la efectividad de la PCR.

- Discutir los resultados observados.

PREPARACIÓN DEL MASTER MIX

Componentes CCI CCF Vol x 1 rx Vol x __ rx

Buffer PCR

DTPsPrimer F

Primer R

MgCl2

Taq Pol

DNA

H20

Volumen de reacción 25 uL




Tm F = _____________ Tm R = ______________

Completar el ciclo de PCR:

5. CUESTIONARIO

Quiere realizar un protocolo para diagnóstico por PCR de un virus y

determinar el tamaño del amplificado esperado. La secuencia del virus de

referencia es U50923. Considerar los primers y el kit de PCR que el

profesor le indique? Explique todo el procedimiento (incluyendo los

análisis bioinformáticos).

Nombre Secuencia 5’- 3’

146F1 ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG

146R1 TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGA

146F2 GTAACTGCCCCTTCCATCTCCA

146R2 TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT

¿Cuál es la utilidad de considerar un control positivo y negativo en la

reacción de PCR?

¿Qué función tiene el MgCl2?

¿Qué otros compuestos se incluyen en los kits de buffers de PCR? ¿Cuál es

su utilidad?

¿Qué factores influyen en la corrección del cálculo de la temperatura de

meltign y la temperatura de Annealing de la PCR?

¿Qué características deben de tener los primers?

Mencionar las variantes de PCR.




PRACTICAANÁLISIS ELECTROFORÉTICO DE DNA

La electroforesis en gel es una técnica de separación de moléculas (proteínas o ácidosnucleicos) por tamaño utilizando un campo eléctrico aplicado en una matriz de gel,

donde las partículas migrarán en dirección a la carga opuesta del electrodo. La

movilidad electroforética de una partícula o molécula cargada es influenciada por el

tipo de moléculas, pH del buffer, temperatura, fuerza del campo de corrida y

naturaleza de la matriz.

Uno de los métodos más comunes para evaluar la calidad,

separar, identificar y purificar el DNA es la electroforesis

horizontal en gel de agarosa. La agarosa es un polímero lineal

(D-galactosa (beta 1-4) L-galactosa) extraído de algas marinas

que se disuelve en calor y forma filamentos gruesos. La

elección de los parámetros adecuados depende, entre otros,

del tamaño de los fragmentos a separar. La agarosa

convencional permite separar fragmentos de 200 – 50,000pb,

adecuado para propósitos analíticos como la identificación de

tamaños de fragmentos luego de una digestión por enzimas

de restricción para el análisis de RFLPs o PCR.

La separación de los fragmentos depende de una serie de factores como: el tamaño

del fragmento, concentración de la agarosa, conformación del DNA, buffer utilizado,

voltaje de corrida, influyen en la tasa de migración. Además, la distancia migrada por

fragmentos de DNA lineal es inversamente proporcional al logaritmo en base 10

(log10) de sus tamaños moleculares en kb. Aquellos DNA no lineales, como circulares,

la migración depende del peso molecular asi como del grado de super-enrollamiento

que presente (influenciado por el pH, salinidad, etc).

Tabla 1. Relación entre concentración de

agarosa y la eficiencia en el rango de

separación en tamaño molecular del DNA Concentraciónde agarosa engel (%)

Rango de separación demoléculas lineales deDNA (kb)

0.3 5.0 – 60.0

0.6 1.0 – 20.0

0.7 0.8 – 1.0

0.9 0.5 – 7.0

1.2 0.4 – 6.0

1.5 0.2 – 3.0

2.0 0.1 – 2.0




OBJETIVOS

- Comprender el fundamento de la técnica de electroforesis de DNA en geles de

agarosa

- Conocer las aplicaciones del uso de geles de agarosa

MATERIALES

Del laboratorio

- Cámara electroforética - Fuente poder

- Transiluminador - Micropipetas y tips 0.5 – 10 ul

- Soluciones buffers: TBE 1X, buffer de carga - Agarosa

- Marcador de tamaño molecular (pb) - Bromuro de etidio

De los alumnos:

- Papel milimetrado

- Cámara fotográfica

- Papel toalla

- Muestra: ácidos nucléicos en clases anteriores

PROCEDIMIENTO

Preparación de geles:1. Pesar la agarosa para preparar ____ml al 1% diluida en buffer TBE 0.5X.

2. Mezclar y calentar en el microondas (sin dejar que forme burbujas), hasta que se

disuelva la agarosa

3. Una vez que alcance aprox 60°C, agregar el compuesto para tinción de ácidos

nucleicos, verterlo en la bandeja de corrida. Colocar los peines y esperar hasta que

se solidifique.

4. Preparar la cámara electroforética colocando buffer TBE 0.5X para la corrida.

5. Remover cuidadosamente los peines y colocar el gel en la cámara electroforética

conteniendo el buffer. Verificar que el gel quede sumergido en el buffer.

Preparación de la muestra:

6. Separar las muestras de DNA a evaluar

7. Mezclar con la micropipeta1ul del buffer de carga + 3-4ul de DNA y colocarlo en un

pocillo del gel. Reservar el pocillo intermedio o lateral para colocar 1 uL del

Marcador de tamaño molecular

Corrida electroforética:

8. Conectar los electrodos a la fuente poder y la cámara electroforética, y realizar la

corrida a 90V por 30 min.

9.

Apagar la fuente poder, retirar el gel y colocar el gel en el transiluminador para laobservación de las bandas. Fotografiar para su análisis.




CUESTIONARIO

1. En forma grupal, interpretar los patrones de bandas observados en todo el gel,

relacionándolos además con los resultados obtenidos en la práctica anterior (decuantificación de DNA)

2. A partir del patrón de bandas obtenido de LambdaDNA/HindIII Plus marker,

calcular la cantidad y porcentaje de DNA en cada banda, si se colocó 0.5ug de

muestra inicial.

3. A partir de la imagen del gel entregado, realizar una recta patrón (ploteando el

número de pb vs. la distancia de migración para general una curva estándar

utilizando los DNA size markers), e interpolar los fragmentos de DNA de la muestra

problema para calcular su tamaño e interpretar los resultados del gel.

4. Explicar la función de los diferentes compuestos utilizados en la electroforesis de

DNA. Aplicaciones de geles de agarosa para la caracterización de muestras.

5. Si necesito correr RNA en un gel de agarosa, ¿qué consideraciones o variaciones

cree ud que debo tener en cuenta?

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS- Weiner M. Genetic Variation: A Laboratory Manual. CSHL Press, 2007, 472

- Puerta C. & Urueña C. Prácticas de biología molecular. Colección Biblioteca del

Profesional. Editorial Pontificia Universidad Javeriana, 100 p.

G.S.C.

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