PRACTICA Nº 6

UREA DETERMINACION ENZIMATICA DE UREA EN SUERO, PLASMA Y FLUIDOS

BIOLOGICOS (VALTEK)

1. INTRODUCCIÓN

La urea es uno de los constituyentes nitrogenados no proteicos (NNP) más abundantes en el cuerpo. Los demás son la creatinina, el ácido úrico, el amonio y los aminoácidos. En otros tiempos todos eran medidos juntos (prueba del NNP), pero debido a que el análisis de cada componente por separado es bastante sencillo y proporciona datos más precisos, las pruebas individuales han sustituido al global casi por completo. La urea es el principal producto nitrogenado de desecho del metabolismo de las proteínas y sólo se sintetiza en el hígado. Su concentración es igual en todos los líquidos corporales, con excepción de la sangre entera debido a la diferencia de valores que existe entre el suero y los eritrocitos.

Por lo tanto, se prefiere el suero o plasma a la sangre entera para analizar el nitrógeno de urea. Las determinaciones de urea y creatinina en suero son dos de los estudios más solicitados para detecta la capacidad del riñón para excretar desechos metabólicos. La elevación de estos valores s e emplea, junto con otros, como indicador de la necesidad de diálisis en pacientes con insuficiencia renal crónica.

La interpretación de los valores del nitrógeno de urea exige el conocimiento de la ingestión de proteína exógena y de líquidos, y las condiciones que pueden incrementar la producción endógena (por ejemplo: la actividad muscular, un traumatismo, la infección de una dieta muy restringida, el ayuno o la inanición). Cualquiera de estas variables pueden aumentar la concentración sanguínea o urinaria que en si mismo no es un reflejo real de la depuración renal de urea. Pueden usarse dos pruebas, con las debidas precauciones e la interpretación, como indicadores aproximados de mejoría o deterioro de la función renal del individuo. Aunque las determinaciones de urea es mucho menos específica que de la creatinina sérica, es de uso común, particularmente en pediatría, como una prueba de rutina para la función renal y para conocer algo sobre el estado de hidratación del individuo. Grados menores de disfunción renal requieren análisis más sostificados como las pruebas de depuración.

UREA COMO PRODUCTO FINAL EN EL SER HUMANO

Un ser humano moderadamente activo que consume cerca de 300 g de carbohidratos, 100 g de grasa y 100 g de proteínas diariamente, debe excretar aproximadamente 16.5 g de nitrógeno al día, 95% en al orina y 5% en las heces. Para las personas que consumen dietas occidentales, la urea sintetizada ene l hígado, liberada hacia la sangre y depurada por los riñones, constituye de 80-90% del nitrógeno excretado.

FORMACIÓN DE LA UREA

La síntesis de un mol de urea requiere de tres moles de ATP, un mol de amoniaco y el nitrógeno de alfaamino del aspartato. Enzimas que catalizan las reacciones:1. Carbamoil fostafo sintasa I2. Orinitin transcabamoilasa3. Arginasa4. Argininosuccinasa5. Acido argininosuccínico sintasa De los seis aminoácidos participantes el N-acetilglutamato funciona únicamente como un activador enzimático. Los demás sirven como portadores de átomos que en última instancia se convierten en urea. En los mamíferos, la función principal de la ornitina, la citrulina y al argininosucinato está en la síntesis de urea. La biosíntesis de urea es un proceso cíclico. La

ornitina consumida en la reacción es degenerada en la reacción5 y no hay pérdida ni ganancia total de ornitina, citrulina, argininosuccinato o arginina. Sin embargo el ion amonio, CO2 y ATP y aspartato sí se consumen, algunas reacciones de la síntesis de urea tiene lugar en la matriz mitocondrial en tanto que otras se realizan en el citosol

FISIOLOGÍA

La urea se forma a través de un proceso de degradación proteínica, la proteína se transforma a partir de aminoácidos en amoniaco (desaminación oxidatixa), como un producto final y de ahí en urea (ciclo de la ornitina) dentro del hígado.

Debido a que el organismo no utiliza urea, es trasportada en la sangre hasta que es excretada por vía urinaria. Sus concentraciones varían fisiológicamente, dependiendo de una manera directa del consumo de proteínas en la dieta (exógeno) y del estado de hidratación (proporción de soluto a solvente ene l cuerpo), o de modo indirecto por al tasa del catabolismo tisular (rápida degradación corporal, que incrementa el desperdicio de nitrógeno), o por la tasa de anabolismo tisular (disminución de las concentraciones por un mayor índice de construcción tisular, como sucede durante al gestación o convalecencia. La urea se excreta en el filtrado glomerular y se reabsorbe (probablemente por difusión) en el túbulo de la neurona. Sólo se excreta una fracción de todo el material de desperdicio contenido en el filtrado glomerular, pero a causa de que la urea se reabsorbe en los túbulos de manera deficiente, se reabsorbe poca urea, esto es un efecto benéfico.

EN ANÁLISIS CLÍNICOSLa urea Es el principal metabolito de las proteínas. Los valores oscilan entre 16 y 45 mg/dl. Se suele expresar como BUN o nitrógeno ureico sanguíneo (urea = BUN x 2,146). Se cuantifica mediante una prueba espectrofotométrica cinética.

Su aumento puede ser debido a un incremento importante del aporte proteico, a aumento del catabolismo proteico, a disminución de la perfusión renal (shock, deshidratación, insuficiencia cardiaca, síndrome hepatorrenal), a insuficiencia renal parenquimatosa aguda o crónica o a insuficiencia renal postrenal por obstrucción.Aunque la urea sanguínea es un parámetro muy utilizado en la valoración de la función renal, es poco sensible, ya que sólo se eleva cuando se ha perdido más de la mitad de la función renal, y no demasiado específica. La urea sanguínea disminuye en situaciones de hemodilución y en la insuficiencia hepática, ya que se sintetiza en el hígado.La uremia es mejor evaluada en conjunto con la creatinina. Tanto en la azotemia prerenal y postrenal el BUN está más elevado que la creatinina. Sin embargo en el 88% de los niños deshidratados por gastroenteritis quienes presentan una acidósis metabólica presentan concentraciones de BUN < de 18 mg/dl. En la enfermedad renal progresiva crónica, cerca del 75% del parémquima renal es destruido antes de que se desarrolle la azotemia.El nitrógeno ureico refleja el radio entre la producción de urea y su depuración. El BUN aumentado puede ser debido al aumento o disminución de la producción de excreción. A pesar de que la creatinina es considerada la prueba más específica para evaluar la función renal, se utilizan la mayoría de las veces juntos.

Valores normales: 16-45 mg /dl Preparación del paciente: ayuno de 8 hrs Muestra: Suero o plasma. Metodología: Espectrofotometría

NTERFERENCIAS: Se puede reducir el nivel del BUN si se combina con una dieta con pocas proteínas y

abundantes carbohidratos. El BUN normalmente es bajo en niños y mujeres debido a que en su masa muscular es

menor que la del varón adulto. Al final del embarazo y durante al lactancia el BUN se eleva ya que aumentan el uso de

proteínas. Los ancianos pueden padecer BUN elevado cuando su riñón no concentra al orina de

manera adecuada. Al principio del embarazo el BUN puede disminuir también por hidremia fisiológica.

2. PREPARACION DEL REACTIVO DE TRABAJO

MEZCLAR 1 ml DE REACTIVO SALICILATO + 1 GOTA DE SUSPENSION DE UREASA PREPARAE EL VOLUMEN DE REACTIVO NECESARIO MENTENIENDO LA PROPORCION.

MUESTRA:

SUERO

EQUIPO REQUERIDO

Espectrofotómetro o fotocolorímetro de filtros capaz de leer absorbancias a 600 nm ( rango 580 – 620 nm)

TÉCNICA:

Blanco Estándar MuestraEstándar(ml) ------------------ ------------ --------------Muestra(ml) ------------------ 0,10 --------------

Reactivo de trabajo ( ml)

1,00 1,00 1,00

INCUBAR 10 MINUTOS A TEMPERATURA AMBIENTE A 3 MINUTOS A 37ºC AGREGAR A CADA TUBO

REACTIVOHIPOCLORITO

1.00 1.00 1.00

Mezclar e incubar 10 minutos a temperatura ambiente a 5 minutos a 37ºC leer las observaciones dentro del plazo de una hora.

3. CALCULOS

factor= 66absorbancia estandar

UREA (mgdl )=factor ×absorbanciade lamuestraPARA EXPRESAR LOS VALORES OBTENIDOS COMO NITROGENO UREICO (mg/dl) MULTIPLICAR EL VALOR OBTENIDO POR 0,455

4. RESULTADOS:

ABSORBANCIA ESTÁNDAR: 0,198

NOMBRE SEXO EDAD TALLA IMC ABSORBANCIA UREA SANGRE

Agustín Masculino 25 70 1,62 0.048

Mauro masculino 32 75 1,70 0.043

factor= 660,198

=333,33

Para AGUSTIN

=0,048 X 333 ,33 = 16 = 16 X 0,455 = 7, 28 mg/dl

Para MAURO :

=0,043 X 333 ,33 = 14, 33= 14, 33 X 0,455 = 6, 52 mg/dl

O

RANGOS DE REFERENCIA:

SANGREUrea 10 A 50 mg/dlNitrogeno ureico 4,5 A 22,7 mg/dl

ORINAUrea 15 A 30 mg/dlNitrogeno ureico 7 A 14 mg/dl

INFERENCIA ESTADISTICA

NOMBRE UREA EN SANGRE (mg/dl)

Agustín 16

Mauro 14,33

NOMBRE NITROGENO UREICO (mg/dl)

Agustín 7, 28

Mauro 6, 52

1 20

1

2

3

4

5

6

7

8

UREA EN SANGRE mg/dl

1 26

6.2

6.4

6.6

6.8

7

7.2

7.4

NITROGENO UREICO

5. CONCLUSIONES:

En esta práctica se logró hacer la determinación de urea (la cual es el resultado final del metabolismo de las proteínas) en suero (debido a que si se utiliza la sangre entera, es decir plasma + suero, en estos hay una gran diferencia de valores que existe entre el suero y los eritrocitos, por lo que se prefiere el suero o en su defecto el plasma para esta determinación) mediante una reacción colorimétrica.También con la práctica se logró observar como para cada análisis se deben realizar los procedimientos adecuadamente y de la forma determinada para cada análisis para que no tengamos discrepancias en nuestros resultados como ocurrió con las muestras de orina.

Ya que ninguno de los sujetos a prueba presentó datos de urea elevada se pueden descartar entonces casos de uremia y por lo tanto de enfermedades renales, insuficiencia cardíaca, hemorragias gástricas hipovolemia y obstrucciones renales. En el caso del dato que fue eliminado por su baja concentración de urea, no es de gran importancia clínica ya que la urea no es una sustancia necesaria para el funcionamiento del organismo y según la literatura se ha sugerido que una concentración disminuida de nitrógeno de urea puede ser signo de un pronóstico favorable, debido a que indica una función renal normal con excreción adecuada.

6. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Ballcells, G.A. La clínica y el laboratorio 18ª Edición, Editorial Masson, México, 2001.

Fisbach, T.F. Manual de pruebas diagnosticas, 5ª Edición, Editorial McGrawhill interamericana, México, 1997.

Govantes, B.J. Dr, Lorenzo, V.P Dr, Manual Normon, 8ª Edición, Editorial laboratorios Normon S.A, Departamento de publicaciones científicas, España, 2007.

Koolman, Color Atlas of Biochemistry, 2nd edition © 2005 Thieme Murray, R.K, Bioquímica de Harper, 14ª Edición, 2ª reimpresión, Editorial el manual moderno, México, 1997.

CUESTIONARIO:

1. DEFINIR TRANSAMINACIONES, AMINACION Y DESAMINACION

TRANSAMINACIONES

La reacción química de transaminación puede referirse a dos tipos de reacción. La primera es la reacción entre un aminoácido y un alfa-cetoácido, en la que el grupo amino es transferido de aquel a éste, con la consiguiente conversión del aminoácido en su correspondiente alfa-cetoácido. Después de la formación de glutamato, éste transfiere su grupo amino directamente a una variedad de alfa-cetoácidos por varias reacciones reversibles de transaminación: donación libremente reversible de un grupo amino alfa de un aminoácido al grupo ceto alfa de un alfa-cetoácido, acompañado de la formación de un nuevo aminoácido y un nuevo alfa-cetoácido.

AMINACION

Aminación  es el proceso de introducir el grupo amino (–NH2) dentro de un compuesto orgánico, por ejemplo, la producción de anilina (C6H5NH2) mediante la reducción de nitrobenceno (C6H5NO2) en fase liquida (Fig. 1) o en fase vapor en un reactor de lecho fluidizado . Por muchas décadas, el único método de colocar un grupo amino  en un grupo aril implicando adición de un grupo nitro (–NO2), luego reducción al grupo amino (–NH2).

DESAMINACION

Degradación de un aminoácido, caracterizado por la pérdida del radical amino (NH2), con formación de un ácido cetónico y de amoniaco. Es una de las fases de la digestión de materias albuminoides.

2. DESCRIBIR CICLO DE UREA

1.  El primer grupo amino que ingresa al ciclo proviene del amoníaco libre intramitocondrial. El amoníaco producido en las mitocondrias, se utiliza junto con el bicarbonato (producto de la respiración celular), para producir carbamoil-fosfato. Reacción dependiente de ATP y catalizada por la carbamoil-fosfato-sintetasa I. Enzima alostérica y modulada (+) por el N-acetilglutamato.

2.  El carbamoil-fosfato cede su grupo carbamoilo a la ornitina, para formar citrulina y liberar Pi. Reacción catalizada por la ornitina transcarbamoilasa. La citrulina se libera al citoplasma.

3.  El segundo grupo amino procedente del aspartato (producido en la mitocondria por transaminación y posteriormente exportado al citosol) se condensa con la citrulina para formar argininosuccinato. Reacción catalizada por la argininosuccinato sintetasacitoplasmática. Enzima que necesita ATP y produce como intermediario de la reacción citrulil-AMP.

4.  El argininosuccinato se hidroliza por la arginino succinato liasa, para formar arginina libre y fumarato.

5.  El fumarato ingresa en el ciclo de Krebs y la arginina libre se hidroliza en el citoplasma, por la arginasa citoplasmática para formar urea y ornitina.

6.  La ornitina puede ser transportada a la mitocondria para iniciar otra vuelta del ciclo de la urea.

En resumen, el ciclo de la urea consta de dos reacciones mitocondriales y cuatro citoplasmáticas

3. DETERMINAR LAS CAUSAS DEL INCREMENTO DE LA UREA EN SUERO O PLASMA Y EN LA ORIN

Su aumento puede ser debido a un incremento importante del aporte proteico, a aumento  Del catabolismo proteico, a disminución de la perfusión renal (shock, deshidratación, insuficienc

iacardiaca, síndrome hepatorrenal), a insuficiencia renal parenquimatosa aguda o crónica o ainsuficiencia renal postrenal por obstrucción.

4. CUANDO LA FUNCION RENAL ES

NORMAL, EL ORIGEN DE EL AUMENTO DE UREA EN LA SANGRE A QUE CAUSAS PUEDE DEBERSE

Exceso de glucosa en la sangre Aumentado:

Allopurinol, aminoácidos, anfotericina B, captotril, carbamacepina, cimetidina, aspirina, cisplatino, ciclosporina, furosemida, gentamicina, neomicina, tetraciclina, hidroclorotiazida, interleukina 2, pentamidina, tertratolol, ketoprofeno.

5. DEFINIR UREMIA

Urea alta neuropática y urológica (uremia renal y posrenal).

La hiperazotemia es el signo humoral más simple de la insuficiencia renal orgánica y constituye la uremia geninua en clínica. Pero hay que tener bien clara la idea de que no toda la urea alta significa uremia ni nefropatía, muchas veces la elevación de la urea obedece a causas extrarrenales.

UREMIA AGUDA

Va acompañada de anuria o oliguria con orina densa. Aunque rápidamente se alcanzan cifras muy altas o muy altas de urea, el cuadro es, a veces irreversible.

En la glomerulonefritis aguda en la que, a diferencia de la crónica, la reacción xantroproteica es normal, pues salvo la anuria absoluta no existe retención de sustancias aromáticas.

En la nefropatía anúrica (nefrosis de neurona distal, anuria traumática, etc), el en shock, necrosis muscular isquémica, shocks hemolíticos o transfusionales.

En la nefrosis necrotizante por el sublimado y otros tóxicos.UREMIA CRONICA

Con una cantidad normal de orina o con poliuria compensadora. La orina tiene una densidad densa. Corresponde a lesiones renales avanzadas e irreversibles, de ahí la razón pronostica para separar este grupo del anterior.

En la glomérulonefritis crónica, aquí la reacción xantoproteica de cifras altas. En la esclerosis renal primaria o secundaria. En las nefropatías quirúrgicas (hidronefrosis, tuberculosis renal, pielonefritis, riñón

poliquístico, etc.) En la nefropatía calcéra de la osteítis fibrosis quística avanzada, también en el mieloma

múltiple se observa a menudo insuficiencia renal, en un caso neutro, la retención ureica alcanzó 360 mg.

6. CUALES SON LAS CAUSAS DE LA INSUFICIENCIA AGUDA

Es un síndrome clínico caracterizado por la disminución rápida de la TFG, la retención de productos de desecho nitrogenados en sangre (hiperazoemia) y la alteración del equilibrio hidroelectrolítico y ácido-básico, además puede estar acompañado por oliguria o anuria. Por lo general la IRA es asintomática, y se diagnostica cuando un examen de laboratorio revela aumento de urea y creatinina en plasma. La mayoría de las IRA son reversibles, gracias a que el riñón es un órgano que puede recuperarse considerablemente de una perdida casi completa

de su función. Dependiendo de la causa que lleva a la IRA se clasifica en: prerrenal (debido a

una hipoperfusión renal), intrínseca (enfermedad renal parenquimatosa) yposrenal (obstrucción del flujo de orina distal al parénquima renal).

7. MENCIONAR LAS CAUSAS DE LA INSUFICIENCIA RENAL CRONICA

La enfermedad renal crónica (ERC), anteriormente conocida como insuficiencia renal crónica (IRC), es una pérdida progresiva (por 3 meses o más) e irreversible de las funciones renales, cuyo grado de afección se determina con un filtrado glomerular (FG) <60 ml/min/1.73 m2.1 Como consecuencia, los riñones pierden su capacidad para eliminar desechos, concentrar la orina y conservar los electrolitos en la sangre.2 Los síntomas de un deterioro de la función renal son inespecíficos y pueden incluir una sensación de malestar general y una reducción del apetito. A menudo, la enfermedad renal crónica se diagnostica como resultado del estudio en personas en las que se sabe que están en riesgo de problemas renales, tales como aquellos con presión arterial alta o diabetes y aquellos con parientes con enfermedad renal crónica. La insuficiencia renal crónica también puede ser identificada cuando conduce a una de sus reconocidas complicaciones, como las enfermedades cardiovasculares, anemia o pericarditis.

8. DESCRIBIR EL FILTRADO GLOMERULAR Y LA REABSORCION DE LA UREA EN EL GLOMERULO

Capa que reviste al Glomérulo, la cual está constituida por tres capas. Una capa densa media, llamada lámina densa, formada por colágena del tipo IV. A cada lado de la lámina densa están unas capas electróndensas, las láminas raras, las q contiene laminina, fibronectina y proteoglucano. Los cuales ayudan a los pedículos y a las células en doteliales a conservar su inserción contra la lámina densa.

9. PORQUE LA DIABETES ES CAUSA DE LA ELEVACION DE UREA EN LA SANGRE

Debido a las alteraciones que se producen en la estructura renal en los pacientes diabéticos, la función depuradora de la sangre que lleva a cabo este órgano se van deteriorando de forma progresiva, produciendo un aumento constante de las cifras de urea en sangre y una pérdida progresiva de proteínas a través de la orina. Esto da lugar a una hipoalbuminemia, o disminución de proteínas y la consiguiente aparición de edemas (retención de líquidos). Después de un período de años, aparece el cuadro clínico completo, con hipertensión, edemas periféricos importantes y uremia (aumento de la urea en sangre). Algunas complicaciones, como el infarto de miocardio, la insuficiencia cardíaca, los accidentes cerebrales, la neuropatía (lesiones en nervios periféricos) y la enfermedad vascular periférica agravan el problema.

La eliminación de albúmina en la orina es uno de los signos fundamentales que nos va a permitir predecir el grado de lesión renal. Cuanto mayor es la tasa de excreción de albúmina, mayor valor tiene como factor predictivo de la aparición posterior de nefropatía clínica, siempre que se excluyan otras causas que pueden provocarla (mal control de la diabetes, hipertensión, infecciones, ejercicio La prevalencia de nefropatía en los diabéticos insulino dependientes aumenta con la duración de la enfermedad. Muestra un predominio del sexo masculino. El 45 % de todos los pacientes con DMID desarrollan nefropatía clínica.

La nefropatía diabética es una complicación grave y es la causa de muerte del 25 % de todos los DMID. Durante los primeros años de DMID se puede encontrar microalbuminuria (albúmina en orina solo detectable mediante análisis especifico) si se busca. Después de 15 años aparece la macroalbuminuria (albúmina detectable mediante un análisis normal de orina), que al principio puede ser intermitente y/o provocada por el ejercicio. Posteriormente, la albuminuria es persistente y aumenta de intensidad. Los pacientes con una proteinuria de aparición tardía mostraron una supervivencia inferior a la de los pacientes con proteinuria de aparición precoz, lo que puede reflejar una heterogeneidad de la nefropatía diabética. La función renal puede permanecer normal durante años y, posteriormente, empieza a disminuir. La ausencia de otras complicaciones diabéticas, sobre todo de la retinopatía, sugiere que la diabetes puede no ser la causa de la insuficiencia renal. El control estricto de la DM y de la hipertensión puede enlentecer la progresión inevitable hacia la insuficiencia renal terminal. Los requerimientos de insulina disminuyen, porque también disminuye el catabolismo (eliminación metabólica) renal de la insulina. En los pacientes tratados con antidiabéticos orales, estos medicamentos deben sustituirse por insulina cuando aparece la insuficiencia renal, para evitar los fenómenos de acumulación. Una vez establecida la insuficiencia renal, la elección se sitúa entre la diálisis y el trasplante. Las infecciones urinarias se dan con más frecuencia en los diabéticos que en la población general. Esta disparidad es más aparente que real, debido, en cierto modo, a la frecuencia con que se realizan análisis de orina los diabéticos. Las infecciones son a menudo graves. Debido al riesgo de infecciones graves, sólo se debe realizar un sondaje vesical a diabéticos cuando existen razones que lo justifiquen. El tratamiento es el convencional, aunque es necesario que dure más para lograr la curación completa. Es fundamental realizar exámenes frecuentes para detectar recaídas y recurrencias. Debido a las alteraciones que se producen en la estructura renal en los pacientes diabéticos, la función depuradora de la sangre que lleva a cabo este órgano se van deteriorando de forma progresiva, produciendo un aumento constante de las cifras de urea en sangre y una pérdida progresiva de proteínas a través de la orina. Esto da lugar a una hipoalbuminemia, o disminución de proteínas y la consiguiente aparición de edemas (retención de líquidos). Después de un período de años, aparece el cuadro clínico completo, con hipertensión, edemas periféricos importantes y uremia (aumento de la urea en sangre). Algunas complicaciones, como el infarto de miocardio, la insuficiencia cardíaca, los accidentes cerebrales, la neuropatía (lesiones en nervios periféricos) y la enfermedad vascular periférica (ver arterioesclerosis de las extremidades), agravan el problema. La eliminación de albúmina en la orina es uno de los signos fundamentales que nos va a permitir predecir el grado de lesión renal. Cuanto mayor es la tasa de excreción de albúmina, mayor valor tiene como factor predictivo de la aparición posterior de nefropatía clínica, siempre que se excluyan otras causas que pueden provocarla (mal control de la diabetes, hipertensión, infecciones, ejercicio )La prevalencia de nefropatía en los diabéticos insulino dependientes aumenta con la duración de la enfermedad. Muestra un predominio del sexo masculino.El 45 % de todos los pacientes con DMID desarrollan nefropatía clínica.La nefropatía diabética es una complicación grave y es la causa de muerte del 25 % de todos los DMID.Durante los primeros años de DMID se puede encontrar microalbuminuria (albúmina en orina solo detectable mediante análisis especifico) si se busca. Después de 15 años aparece la macroalbuminuria (albúmina detectable mediante un análisis normal de orina), que al principio puede ser intermitente y/o provocada por el ejercicio. Posteriormente, la albuminuria es

persistente y aumenta de intensidad.