PRÁCTICA No. 6MICROCULTIVO

Objetivo general:

Que el alumno aprenda a realizar microcultivos, y los sepa emplear en la diferenciación de los hongos.

Fundamento.

El microcultivo permite la observación de las estructuras microscópicas de los hongos filamentosos, en particular las esporas asexuales, sin alteración de las mismas.

Esta técnica resulta sumamente útil para aquellos hongos en los que es difícil observar la formación de los conidios sobre los conidióforos y la forma y estructura de éstos; porque, al efectuar el preparado correspondiente, se desprenden y/o se rompen. Mediante este método se puede observar bajo el microscopio, su crecimiento y esporulación en todos sus detalles y así tener elementos morfológicos de estructuras somáticas y reproductivas completas para así poder hacer la identificación con mayor confiabilidad y conocer a los hongos como agentes causales de enfermedades.

Generalidades.

Las micosis son las enfermedades causadas por distintas especies de hongos. Estas afecciones pueden ser superficiales y profundas.

Las micosis o dermatomicosis son procesos infectocontagiosos producidos por distintos agentes micóticos que fundamentalmente invaden piel y/o sus anexos. No tienen carácter maligno y, en la mayoría de los casos, solo afecta la estética.

Por lo general no hay repercusión sistémica y las lesiones aparecen como procesos inflamatorios superficiales ante los cuales el organismo puede responder, entre otras maneras, con la formación de anticuerpos reagínicos o células específicamente sensibilizadas, revelables mediante reacciones de hipersensibilidad cutánea. Generalmente no se evidencian anticuerpos fijadores de complemento ni precipitinas o aglutininas. El grado de inflamación va desde una reacción nula, como en el caso de la pitiriasis versicolor, hasta reacciones graves como el querion.

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Las micosis profundas pueden localizarse en dermis, músculos, huesos, pulmones, hígado, cerebro, mucosas, etc. Se observan lesiones inflamatorias y destructivas con la consiguiente difusión de los parásito a través del sistema hemático o linfático o por continuidad. En este caso el organismo infectado responde a la agresión originando anticuerpos específicos, fijadores del complemento, precipitinas, aglutininas, etc.

La mayoría de las micosis profundas revisten de tal gravedad que en muchos casos llevan al paciente a la muerte.

CLASIFICACIÓN DE LOS EUMYCETES

Diferentes autores han trabajado arduamente tratando de ordenar sistemáticamente las distintas especies de hongos. A continuación se transcribirá una clasificación tentativa del ordenamiento lógico de los hongos.

CLASES SUBCLASES ÓRDENES GÉNEROS

Phycomicetes Archimycetes Chytridiales ChytridiumMicelio continuo.

Los unicelulares no se reproducen por

brotación.Esporos asexuados en

esporangios.

OomycetesPeronosporale

sPeronospora

Zigomycetes Mucorales Mucor

Ascomycetes HemiascomycetesEndomycetale

sSaccharomyce

sMicelio tabicado.

Los unicelulares se reproducen por

brotación o esquizogonia.

Esporos sexuados internos en ascos.

Euascomycetes Eurotiales Aspergillus

BasidiomycetesHeterobasidiomycete

sUstilanginales

Ustilago (carbón)

Micelio tabicado.Esporos sexuados

externos sobre ábsides.

Homobasidiomycetes

Agaricales Agaricus

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DEUTEROMYCETES

Mycelia fructignea Moniliales Fusarium

Micelio tabicado.Los unicelulares se

reproducen por brotación o

esquizogonia.No se conoce reproducción

sexuada.

Mycelia steriliaMycelia sterilia

Sclerotium

TERMINOLOGÍA DE LAS MICOSIS

La denominación de las micosis varía según el criterio adoptado para clasificarlas: localización del proceso, hongo que se aísla de la lesión y la designación que utiliza la literatura médica.

De acuerdo con la localización del proceso, la enfermedad micótica puede denominarse: dermatomicosis, micosis pulmonares o neumomicosis, onicomicosis, otomicosis, etc.

De acuerdo al nombre del hongo responsable de la lesión se denomina: aspergilosis, tricofitosis, coccidioidomicosis, candidiasis, etc., cuando los agentes son Aspergillus, Trichophyton, Coccidioides y Candidas, respetivamente.

En el caso de la terminología médica se emplean las siguientes denominaciones: tiñas, pie de atleta, querion, piedras, etc.

MICROCULTIVOS

Se realizan para estudiar los detalles de la estructura de los hongos que debido a las observaciones comunes se destrozan y desaparecen por acción de los ganchos y de las agujas.

Material y reactivos.

Colonia de hongos Asa de platino Mechero bunsen Porta y cubreobjetos Caja Petri de vidrio Tubo de vidrio o capilares

Gasa Pinzas Agua esterilizada Microscopio Bisturí estéril

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T écnica .

1. Se esteriliza el material a ocupar, (caja Petri de vidrio, portaobjetos, cubreobjetos, capilares o tubo de vidrio, agua destilada y el medio de cultivo).

2. Se prepara la caja Petri con gasa un poco humedecida con agua esterilizada y se coloca en el interior de la caja.

3. Se colocan dos tubos capilares o un tubo de vidrio doblado encima de la gasa para que sirva de sostén al portaobjetos.

4. Se corta una sección de un medio de cultivo agar Sabouraud ya coagulado, ya sea un círculo o un rectángulo con el bisturí y se coloca sobre el portaobjetos dentro de la caja, con pinzas previamente flameadas.

5. Se flamea el asa bacteriológica y se toma una muestra del hongo o cultivo del hongo en estudio y se siembra sobre el trozo de agar Sabouraud y también en los costados del mismo.

6. Se coloca el cubreobjetos con una pinza previamente flameada, sobre la superficie del agar.

7. Cerrar la caja Petri y sellar la circunferencia con papel parafil o masking.

8. Se incuba de 25- 28°C por 7 días.9. Una vez desarrollado el hongo, se saca el cubreobjetos que lleva

adherido el crecimiento fúngico y se coloca sobre un portaobjeto limpio con una gota de colorante Gueguen o Lactofenol y se deja unos segundos a que actúe el colorante.

10. Se saca el trozo de agar Sabouraud con una pinza colocando luego una gota de colorante y un cubreobjetos nuevo, obteniendo así dos preparaciones listas para estudiar.

11. Observar a 40x.

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db

cc

a

a) Portaobjetos.b) Cubreobjetos.c) Zonas de siembra.d) Medio de cultivo.

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Lámina anterior:

Técnica de microcultivo.

A. Uso de tubo de prueba estéril para obtener bloques de agar para la técnica de microcultivo.

B. Preparación de una cámara húmeda estéril usando una placa de Petri que contiene agar simple al 2% sobre un portaobjetos estéril.

C. Método alternativo de preparar un microcultivo. Se colocan discos de papel filtro en el fondo de la caja Petri y el portaobjetos se apoya en varillas de vidrio. Los discos de papel filtro se mantienen húmedos con agua estéril durante el periodo de incubación.

D.Colocación del bloque de agar en la preparación de un microcultivo. Obsérvese que se han inoculado pequeñas porciones del cultivo con un gancho en cuatro cuadrantes del bloque de agar.

E. Inoculación de la superficie de un bloque de agar en la preparación de un microcultivo. Obsérvese que se han inoculado pequeñas porciones del cultivo con un gancho en cuatro cuadrantes del bloque de agar.

F. Colocación de un portaobjetos estéril sobre la superficie del bloque de agar inoculando antes de la incubación.

G.Aspecto de un microcultivo típico luego del periodo de incubación apropiado. Obsérvese el crecimiento micelial por debajo de la superficie de los cubreobjetos.

H.Colocación del cubreobjetos recogido del bloque de agar microcultivado en un agota de lactofenol-azul de anilina en un portaobjetos para examen microscópico.

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Observaciones.

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La imagen muestra el microcultivo realizado, observando de manera macroscópica el crecimiento de una colonia de hongos, donde se aprecia que dicha colonia creció tanto en las orillas como en el centro, siendo esta de color amarillo claro con naranja.

Observación microscópica:

Medio de cultivo: Agar SabouraudColor: marilloAspecto: gelatinosoConsistencia: blandaEstructura: micelios con un conidióforo y fiálides. Aspergillus flavus. Visto a: 40x

Observación microscópica:

Medio de cultivo: Agar SabouraudColor: amarillo claroAspecto:gelatinosoConsistencia: blandaEstructura: micelios y un conidio con fíálides puede tratarse de Aspergillus flavus , Teñido: con azul de metilenoVisto a: 40x

Conclusión.

Con esta práctica se aprendió a realizar el microcultivo, ésta es una de las mejores técnicas a elegir en el aislamiento e identificación de hongos patógenos para el hombre, ya que nos permite una mejor visualización del crecimiento macroscópico y microscópico, puesto que el método con la preparación elaborada para ello se observa al microscopio ya estando montada en el cubreobjetos y con esto se evita que se dañen las estructuras como sucede cuando se prepara la muestra a partir de una colonia asilada en caja.

Bibliografía.

Micología Prácticas de Laboratorio, Koneman Roberts; Edit. Médica Panamericana.

Diagnóstico Micológico, Amadeo D’ Alessandro; Edit. Panamericana. Microbiología Clínica. Prats, Guillem; Edit. Médica Panamericana. (2005).

España.

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