practica nº 10
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Mg. Ana I. F. Gutiérrez Román [email protected] Page 1
Mg. Milagros Quintana Cáceda [email protected]
Práctica N°10: Determinación de urea
Objetivos:
a) Conocimiento de la técnica y sus aplicaciones Teoría.-
Al principio se notó que la glutaminasa del riñón era responsable de convertir el exceso de glutamina del hígado a amonio en la orina. Sin embargo, cerca del 80% del nitrógeno excretado está en forma de urea la cual es sintetizada en el hígado, en una serie de reacciones que están distribuidas entre la matriz mitocondrial y el citosol. Esta serie de reacciones que forma urea es conocida como el Ciclo de la Urea o el Ciclo Krebs-Henseleit. Entonces, la urea es el producto final mayoritario del metabolismo del nitrógeno proteico en los seres humanos y constituye la fracción más abundante del nitrógeno no proteico. Su elevación es producto de transtornos en la función renal o hepática, problemas dietéticos, diabetes y otros.
La enzima responsable de la descomposición de la urea es la Ureasa, la cual contiene en su sitio activo dos átomos de Níquel unidos por un puente carbamato. Su pH óptimo es igual a siete. La descomposición de la urea produce dos moléculas, una de amoniaco y la otra de dióxido de carbono las cuales son utilizados durante el metabolismo de nitrógeno. De hecho, el amoniaco producto de esta hidrólisis puede ser usado para la síntesis de proteínas o en la transaminación para la síntesis de aminoácidos, mientras que el dióxido de carbono formará parte del esqueleto carbonado de los compuestos nitrogenados.
Fundamento del método.- La urea presente en la muestra, es desdoblada a amonio por
acción de la enzima ureasa según la proposición de Faucet y Scott (NH2)2CO + 2H2O Ureasa 2NH3 + CO2 + H2O El amonio producido reacciona con salicilato e hipoclorito en ambiente alcalino
formándose un complejo de color verde. La intensidad del color producido es directamente proporcional a la cantidad de urea presente en la muestra y su absorbancia se lee a 600 nm (580 -620)
Material y Reactivos
1. Solución de hipoclorito de sodio 10 mmol/lt en hidróxido de sodio 200 mmol/lt.. 2. Suspensión de Ureasa 50 U/ml 3. Solución Salicilato: Ac. salicílico 5mM y Nitroprusiato 5mM 4. Estándar de Úrea: 0,66 gr/lt (66mg/dl) 5. Solución de trabajo: 1ml de solución salicilato con 50 ul de suspensión de ureasa. 6. Muestra biológica: suero, plasma u orina diluída 1:100
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Procedimiento
Para la determinación de úrea se usa el método de Berthelot modificado. En este método la Ureasa descompone específicamente la úrea produciendo dióxido de carbono y amoníaco. Este reacciona en medio alcalino con salicilato e hipoclorito para dar indofenol color verde. El procedimiento es el siguiente:
Blanco Estándar Muestra
Estándar __ 10 ul __
Muestra __ __ 10 ul
Sol. Trabajo (Ureasa) 1 ml 1 ml 1 ml
Mezclar e incubar a 37 °C x 3 min. o a T.Amb. (sobre 20°C) x 5 min. y luego agregar:
Solución hipoclorito 1 ml 1 ml 1 ml
Mezclar e incubar a 37 °C por 5 min. o a T.Amb. x 10 min.
Leer la absorbancia a 600 nm, el color es estable por 2 horas.
Cálculos: FACTOR = _______66 mg/dL_________ Absorbancia Estándar Urea (mg/dL )= Factor x Absorbancia muestra.
Rangos de Referencia: Suero o plasma: 10 a 50 mg/dl de urea Orina: 15 a 30g/24 hrs. Cuestionario
a) Anote sus resultados y realice sus cálculos b) ¿Por qué el amoniaco es tóxico? c) ¿Cómo se regula la síntesis de urea?
Bibliografía 1. Bidwell, R.G.S. 1993. Fisiología Vegetal. Primera Edición en español. A.G.T. Editor, S. A.
México Pp. 130-131. 216-218, 456. 2. Geza. D. 1965- Plant Biochemistry. Interscience publishers. Hungary. Pp. 226-230, 294-
297, 336-340, 426-429, 452-463. 3. Manunza B., Deiana S., Pintore M., Salinas V. y Gessa C. A Molecular modeling study of
the Ureasa Active Site. 4. Wiener LAB. 1995. Vademécum. Edición Revisada y Actualizada. Rosario-Argentina.