PRACTICA Nº 6

FACTORES FISICOS Y QUIMICOS QUE INFLUYEN EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO

OBJETIVOS

Determinar cómo influyen algunos factores físicos y químicos del medio ambiente en la velocidad de crecimiento de los microorganismos.

FUNDAMENTO

Las razones principales para controlar los microorganismos son: prevenir la transmisión de enfermedades, evitar el deterioro de los alimentos y evitar la contaminación tanto en procesos industriales que requieran cultivos puros, como en laboratorios de diagnóstico o investigación.

DETERMINACIÓN DEL HALOFILISMO

La mayoría de organismos comunes crecen en medios de cultivo con baja concentración de cloruro de sodio, pero existen algunos microorganismos que necesitan altas concentraciones de esta sal. La determinación de las necesidades de cloruro de sodio de una especie particular recibe el nombre de prueba de halofilismo. La prueba se puede hacer en placas con medios de cultivo a concentraciones variables de sal, en donde se siembra el microorganismo y se deja crecer en condiciones favorables. La concentración máxima a la que crece el microorganismo determina su grado de halofilismo.

El procedimiento a seguir es el siguiente:

Preparar placas con medio de cultivo favorable a diferentes concentraciones de cloruro de sodio. Por ejemplo a 0 %, 5 %, 10 %,..., 25 %

Sembrar por- estrías una cepa microbiana a partir de un cultivo joven (en una placa se puede sembrar 4 ó más cepas diferentes).

Incubar a temperatura óptima por un tiempo suficientemente largo. Por ejemplo, a 35 °C durante 5 a 8 días.

Leer el crecimiento microbiano en la huella de las estrías.

Considerar como microorganismo haiófobo al que sólo crece a concentraciones de cloruro de sodio inferiores al 1 %, como ligeramente halófilo si crece hasta 5 % de cloruro de sodio, como moderadamente halófilo si crece hasta concentraciones del 12 %; y como extremadamente halófilo o simplemente halófilo si crece a concentraciones mayores de cloruro de sodio. Los microorganismos halófilos estrictos necesitan obligatoriamente el cloruro de sodio en el medio de cultivo y sólo crecen bien cuando las concentraciones son superiores al 10 %. También se reconoce el grupo de halotolerantes que se caracteriza por crecer en un amplio rango de concentraciones salinas, que va desde 0 % al 20 % de cloruro de sodio.

DETERMINACION DE LA OSMOFILIA

La osmofilia es una prueba para determinar la tolerancia de solutos de un microorganismo, especialmente las concentraciones máximas. Generalmente se asocia a las necesidades

máximas de azúcares, pero también puede realizarse con sales. El procedimiento que se sigue con la glucosa es el siguiente.

Sembrar una estría de una cepa microbiana en la superficie de placas con medio de cultivo favorable, preparado con diferentes concentraciones de glucosa. Por ejemplo, con 0 %, 10 %,..., 50 % y 60 % (en una placa se puede sembrar 4 ó más cepas diferentes).

Incubar a temperatura óptima por un tiempo suficientemente-largo, para permitir su crecimiento. Por ejemplo, a 35 °C durante 5 a 8 días.

Leer la abundancia relativa de crecimiento en la superficie del agar; y

Considerar como microorganismos osmófilos si solamente crecen en altas concentraciones de glucosa. La concentración sugerida como mínima para lograr esta denominación es de 30 % de glucosa, aunque no existe un consenso en la delimitación. La mayoría de microorganismos comunes no necesitan altas concentraciones de glucosa o de ningún otro azúcar. Los osmotolerantes crecen en un amplio rango de solutos.

Las tolerancias a las concentraciones de solutos en el crecimiento microbiano, independientemente de qué tipo sean, se estudian mejor como necesidades de agua y se

expresa en términos de aw, cuyos valores óptimos y máximos se acercan a 1,00 y la diferencia radica en su valor mínimo. En forma general, las bacterias tienen necesidades más altas de humedad, le siguen las levaduras y luego los mohos. Por otro lado, las bacterias toleran mejor el cloruro de sodio, las levaduras prefieren las altas concentraciones de azúcares y los mohos los ambientes secos.

DETERMINACION DE LA ACCIÓN GERMICIDA DE ALGUNOS AGENTES QUÍMICOS

La acción germicida de un compuesto químico se determina poniendo en contacto al microorganismo con el agente químico preparado en una solución de concentración conocida y, después de un período de tiempo variable, se controla su viabilidad, sembrándolo en un medio de cultivo adecuado.

Los factores que influyen en esta prueba son: la concentración del compuesto químico, la temperatura y el tiempo de contacto. Cada compuesto químico tiene una acción diferente frente a los microorganismos o, dicho de otro modo, cada microorganismo responde de forma diferente frente a diversos compuestos químicos. Las sustancias químicas que tienen efectos germicidas reciben el nombre de desinfectantes. Algunos desinfectantes comunes que se usan para matar microorganismos son: el fenol, el yodo, el alcohol, el formol, el hipoclorito de sodio-, etc.

Para determinar la acción desinfectante del fenol diluido, en tiempos variables, con un método simple, se puede hacer de la siguiente manera:

Colocar en un tubo de prueba 5 cm3 de solución de fenol al 0,5 %. Agregar 0,5 cm3 de inoculo de un cultivo joven de una cepa en caldo. Agitar y dejar actuar durante 1 minuto.

Tomar una asada de la mezcla y sembrar en caldo nutritivo, marcado convenientemente.

A los 2,5 minutos, repicar nuevamente a otro tubo con caldo nutritivo, marcado convenientemente.

A los 5 minutos, proceder igual que el paso anterior; y a los 10 minutos, volver a sembrar de modo semejante una última vez.

Incubar todos los tubos a la temperatura óptima de crecimiento, por ejemplo, 37 °C / 24h - 48 h.

Leer la turbidez de los tubos e interpretar como crecimiento microbiano.

Considerar como resistentes al desinfectante (fenol al 0,5 %) si presenta crecimiento en los tubos y como sensibles si no presenta crecimiento.

Se pueden hacer pruebas similares con otros desinfectantes como: alcohol etílico de 70 %, yodo del lugol, formol al 5 % u otros productos que se encuentran en el mercado. La comparación del efecto antimicrobiano conlleva a opinar que es buen desinfectante el compuesto químico que a bajas, concentraciones produce la muerte microbiana en el menor tiempo de contacto.

DETERMINACIÓN DE LA ACCION DE LOS ANTIBIÓTICOS

La prueba de sensibilidad de un microorganismo frente a los antibióticos recibe el nombre de antibiograma. Esta prueba se puede llevar a cabo por el método de Kirby - Bauer, que consiste en realizar una siembra microbiana en la superficie de un medio de cultivo en placa, colocarle varios discos de papel impregnados con antibióticos de concentración conocida e incubar a temperatura favorable para el crecimiento. La ausencia de crecimiento en una zona alrededor del disco significa que el antibiótico tiene efecto letal o inhibidor contra el microorganismo.

Para llevar a cabo un antibiograma, como el esbozado en el párrafo anterior, es necesario controlar varios factores, como: el tipo de medio de cultivo, la profundidad de la película en la placa, la uniformidad de la extensión del inóculo, la aplicación de los discos de antibióticos y el período de incubación.

El procedimiento que puede ser seguido como rutina es el siguiente:

Distribuir el agar de Muller Hinton en placas petri y secarlo convenientemente.

Sembrar, por extensión en superficie, una alícuota de 0,1 ml de un cultivo joven en caldo y distribuirlo uniformemente con espátula sin dejar marcas en el agar.

Poner los discos con antibióticos a una distancia entre uno y otro.

Incubar a la temperatura óptima del microorganismo, por ejemplo, a 37 °C / 24horas - 48 horas.

Leer la ausencia de crecimiento en la zona que rodea al disco, midiendo el diámetro del halo de inhibición y expresando su valor en milímetros.

Comparar las lecturas en una tabla de interpretación en donde se califican los resultados según el efecto.

SE TRABAJÓ :

1. E.COLI

2. B.SUBTILIS

Resultados

Tabla - Acción de los antibióticosMedio de cultivo: MUELLER-HINTON (MH) ANTIBIOTICO: CEFOPEZONA

PRUEBA ACCIÓN

INCUBAR A 37 °C / 24 HORAS A 48 HORAS

RESULTADO

1 E.COLI -

2. B.SUBTILIS +

Acción germicida con agentes químicos

Tabla - agentes desinfectantesTiempo 1 min 2.5 min 5 min 10 min

Incubar los 4 tubos a una temperatura de 37 °C / 24horas a 48 horas

Lectura

Resultado - - - -

Concentración de solutos

Tabla - DETERMINACIÓN DEL OSMOFILO

Tipo cepa Osmófilos (Sacarosa)

Porcentaje Agar Virgen 10% 20% 30%

Incubar a 37 °C por 5 días a 8 días

Lectura del resultado

Resultado 1 1 E.COLI ++ + -

Resultado 2 2. B.SUBTILIS +++ ++ +

Concentración de solutos

Tabla - DETERMINACIÓN DEL HALOFILISMO

Tipo Cepa Halófilos (ClNa)

Porcentaje Agar Virgen 5% 10% 15%

Incubar a 37 °C por 5 días a 8 días

Lectura

Resultado 1 E.COLI + - -

Resultado 2. B.SUBTILIS + - -

CONCLUSIONES

Con el resultado en la acción de los antibióticos podemos concluir que el antibiótico actuó de manera efectiva para inhibir a la bacteria B.SUBTILIS

Con el resultado en la acción germicida fue sensible en el desarrollo donde podemos concluir que el desinfectante actuó negativamente a medida que pasaron los minutos y luego de la incubación

Como resultado de la prueba del halófilo el microorganismo se dio el crecimiento al 5 % en la E.COLI Y B.SUBTILIS ya que requería del ion sodio para su desarrollo. Es un halófilo discreto (1-6%)

BIBLIOGRAFIA

- http://bc.inter.edu/facultad/yserrano/factoresfisicosqui.htm- Geneser, F. 1986. Histología. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires.

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREALFACULTAD DE OCEONOGRAFÍA, PESQUERÍA Y CIENCIAS

ALIMENTARIAS

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA ALIMENTARIA

CURSO: MICROIOLOGIA GENERAL Y EN ALIMENTOS

TEMA: FACTORES FISICOS Y QUIMICOS QUE INFLUYEN EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO

DOCENTE: DRA. MARIA TERESA FLORES

ALUMNO: CALDERON ESPINOZA WALTER

TURNO: 14:40PM – 16:20PM

AÑO Y SECCIÓN: 3 “A”