UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE GUERRERO

PRESENTA: MARÍA GUADALUPE RODRÍGUEZ GARCÍA

MÉXICO, D.F., AGOSTO 2013.

UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICASUNIDAD ACADÉMICA DE MEDICINA/UIEM

MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOMÉDICAS

POLIMORFISMO C/T rs5400 DEL GEN SLC2A2 EN POBLACIÓN INFANTIL CON NIVELES DE GLUCOSA ALTERADA EN

AYUNO

SECRECIÓN DE INSULINA

Imagen modificada de Tarasov et al., 2004

Canal de Ca2` abierto

+

-

GLUT2

METABOLISMO MITOCONDRIAL

INSULINA

CANAL DE Ca2+ ABIERTO

CIERRE DE CANAL KATP

DESPOLARIZACIÓN

ATP MgADP

ATP MgADP

Ca2+

GLUCOSA GLUCÓLISIS

>5.5 mmol/l glucosa

GEN SLC2A2 (GLUT2)

1 2 3 4 5 11

Exónes

5´ 3´

rs54

00

638 C/T

Kilpeläinen et al., 2007

promotor

3q26.1-26.2

Treonina Isoleucina

C / T (T110I)

Estudio realizado Población Resultado Referencia

rs5400 (C/T)) asociado a DM2

Caucásica rs5400 (TT) (OR 1.49, p=0.0059)

Barroso et al., 2003

Actividad física con:rs5393 (A/C) rs5394 (C/T) rs5400 (C/T) rs5404 (G/A)

Finlandesa Haplotipo CTTA de los alelos mutados de rs5393, rs5394, rs5400 y rs5404, con el cambio de actividad física moderada a actividad física vigoroza (p=0.021)

Kilpeläinen et al., 2007

Asociación de rs5400 (C/T) con diabetes tipo 2

Finlandesa rs5400 (TT) ( OR= 2.98, IC95%, 1.31-6.79, p= 0.014).

Willer et al., 2007

Asociación de rs5400 (C/T) con diabetes tipo 2

Finlandesa y Estadounidense

rs5400 (TT) (OR 1.28, IC95% 1.11-1.49, p=0.0023)

Gaulton et al., 2008

rs5400 (C/T) asociadas con alta ingesta de carbohidratos en 2 poblaciones.

Canadiense rs5400 (CC vs T) visit 1: (112g vs. 86g/día, p =0.01) visita 2: (111g vs. 82g/día p= 0.003)(131g vs. 115g/día, p = 0.007)

Eny et al., 2008

ANTECEDENTES

Niveles de glucosa en ayuno

Parámetros (edad, sexo, niveles de insulina, IMC, antecedentes obesidad y diabetes)

Muestra de ADN

Glucosa alterada en ayuno (≥100-125 mg/dl) Niveles de glucosa normal (<100 mg/dl)

Grupo de Casos Grupo Control

Genotipificación PCR-RFLPs

Análisis de Resultados (software STATA v.11)

Base de datos de la población de estudio

Dia

gram

a de

fluj

o

Discusión y conclusiones

Etapa de PCR Temperatura y tiempo  

Desnaturalización inicial 94°C 5 min  

Desnaturalización del ADN 94°C 30 seg 30 ciclos

Alineamiento de iniciadores 60°C 30 seg

Extensión del ADN 72°C 30 seg

Extensión final 72°C 3 min

Reactivo Concentración

inicial

Concentración

final

Volumen

H2O ------ ------ 5.5 μl

Buffer 10X 1X 1.0 μl

MgCl2 50 mM 6.0 mM 1.2 μl

dNTP’s 10 mM 0.8 mM 0.8 μl

Iniciador sentido 10 μM 0.2 Μm 0.2 μl

Iniciador antisentido 10 μM 0.2 μM 0.2 μl

Taq polimerasa 50 U/μl 0.5 U/μl 0.1 μl

gDNA 100 ng/μl 100 ng/μl 1.0 μl

GENOTIPIFICACIÓN rs5400

Figura 2. Identificación del polimorfismo rs5400 C/T en el gen SLC2A2 en geles de poliacrilamida al 6%. Carril 1: Marcador de peso molecular de 50 pb, carriles 2-11: productos de PCR de 156 pb, carril 12: control negativo.

PCR rs5400

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

200

150

100

50

156

Figura 3. Identificación de los genotipos después de la digestión con la enzima SsiI. Carril 1: Marcador de peso molecular de 50 pb, carril 2: genotipo CT, carriles 3-7: genotipo CC y carril 8: producto PCR sin digerir.

CC= 134, 22 pb.CT= 156, 134, 22 pb.TT= 156 pb.

Enzima de restricción

SsiI

Secuencia de restricción

5'... C* C G C ... 3'3'... G G C *G ... 5'

Producto PCR Buffer Enzima H2O Incubación

Temperatura Tiempo

0.5 μl 1.5 μl 0.2 μl 7.8 μl 37° C 3 horas

RFLP rs5400

1 2 3 4 5 6 7 8

50

100

150

CCCT

Niveles de glucosa en ayuno

Parámetros (edad, sexo, niveles de insulina, IMC, antecedentes obesidad y diabetes)

Muestra de ADN

Glucosa alterada en ayuno (≥100-125 mg/dl) Niveles de glucosa normal (<100 mg/dl)

Grupo de Casos Grupo Control

Genotipificación PCR-RFLPs

Análisis de Resultados (software STATA v.11)

Base de datos de la población de estudio

Dia

gram

a de

fluj

o

Discusión y conclusiones

RESULTADOSCuadro 1. Características de la población

Datos proporcionados en n (%), mediana y percentil 25-75, media±DE, valor p <0.05 (*X2, °Mann Whitney)

Variables Totaln=150

Glucosa alterada en ayuno n= 50

Glucosa normal en ayuno n=100

Valor p

Edad (años) 9 (7-10) 9 (8-10) 9 (7-10) 0.15 °

Género Masculino Femenino

74 (49)76 (51)

29 (42)21 (58)

45 (45)55 (55)

0.13 *

Antecedentes obesidad No Si

66 (44)84 (56)

22 (44)28 (56)

44 (44)56 (56)

1.0 *

IMC (kg/m2) <24.9 24.9-28.29 ≥ 28.3

19 (16-23)127 (85)16 (10)

7 (5)

21 (17-24)39 (78)7 (14)4 (8)

18 (16-23)88 (88)

9 (9)3 (3)

0.05 °0.22*

Antecedentes diabetes No Si

86 (57)64 (43)

33 (66)17 (34)

53 (53)47 (47)

0.13 *

Insulina μU/ml <4.51 4.52-9.547 >9.548

7(4-12)51 (34)

49 (32.7)50 (33.3)

7(5-12)11 (22)20 (40)19 (38)

6 (2-11)40 (40)29 (29)31 (31)

0.10 °

0.08 *

Triglicéridos (mg/dL) <150 >150

92 (64-150)112 (75)38 (25)

97 (63-150)36 (72)14 (28)

92 (64-144)76 (76)24 (24)

0.83 °0.59*

HOMA (mg/dL) 1.50 (0.76-2.80) 1.85 (1.20-3.12) 1.37 (0.58-2.55) <0.05°

Cuadro 2. Frecuencias genotípicas y alélicas de rs5400 C/T en el gen SLC2A2 en los grupos de estudio.

Total (n= 150) Glucosa alterada en ayuno (n=50)

Glucosa normal en ayuno (n=100)

Valor p

rs5400 C/T

Genotipos 0.017 *CC 142 (95) 44 (88) 98 (98)CT 8 (5) 6 (12) 2 (2)TT 0 (0) 0 (0) 0 (0)

AlelosC 292 (97) 94 (94) 198 (99) 0.018 *T 8 (3) 6 (6) 2 (1)

*X2 con prueba exacta de Fisher, rs5400 x=0.010 p=0.92.

Cuadro 3. Características somatométricas por genotipo CC y CT de rs5400 del gen SLC2A2, en población infantil de Chilpancingo, Gro.

Variable C/C (n=142) C/T (n=8) Valor p

Edad (años) 9 (7-10) 11 (10-11) <0.05°

Género Masculino Femenino

69 (49)73 (51)

5 (62.5)3 (37.5)

0.49 *

Antecedentes obesidad No Si

63 (44)79 (56)

3 (37.5)5 (62.5)

1.0 *

IMC (kg/m2) <24.9

18.75 (16-23.1)122 (86)

24.05 (20.1-24.95)5 (62.5)

<0.05 °

24.9-28.2 ≥ 28.3

13 (9)7 (5)

3 (37.5)0 (0)

0.08 *

Antecedentes diabetes No Si

83 (58)59 (42)

3 (37.5)5 (62.5)

0.29 *

Datos proporcionados en n y porcentajes. *Prueba de X2, medianas (p25p75). °Prueba de Mann Whitney

Variable C/C (n=142) C/T (n=8) Valor p

Glucosa (mg/dL) 96 (88-100) 103(97.5-112.5) <0.05 °

Insulina μU/ml <4.52 4.52-9.54 >9.54

6.6 (3.2-11.5)50 (35)48 (34)44 (31)

13.2 (8.2-15.3)1 (12.5)1 (12.5)6 (75)

<0.05 °

0.06 *

Triglicéridos (mg/dL) <150 >150

92 (64-144)108 (76)34 (24)

130 (66-188)4 (50)4 (50)

0.37 °0.11 *

HOMA (mg/dL) 1.42 (0.72-2.61) 3.16 (2.24-4.25) <0.05 °

Datos proporcionados en n y porcentajes. *Prueba de X2, medianas (p25p75). °Prueba de Mann Whitney

Cuadro 4. Características bioquímicas por genotipo CC y CT de rs5400 del gen SLC2A2, en población infantil de Chilpancingo, Gro.

Célula β normal Célula β susceptible

Obesidad/resistencia a insulina

Ambiente (ac. Grasos/caloríasActividad física )

Incremento de la función de células β.

Incremento del crecimiento de célula β

Tolerancia normal a la glucosa

Hiperinsulinemia compensatoria

Disfunción de células βApoptosis células β

Glucosa alterada

Diabetes tipo 2

PARTICIPACIÓN DE LAS CÉLULAS β

Kahn et al ., 2006

Páncreas Secreción de insulina

cerebro

hígado

músculo

adipocitos

Ingesta de alimento

Obesidad

Producción de glucosa

Eficiencia de la entrada de glucosa

Lipolísis

NEFAs

Resistencia a insulina

Glucosa en plasma

Glucosa en plasma

Resistencia a insulina

Función de la célula β

ALTERACIÓN EN LA LIBERACIÓN DE INSULINA

Kahn et al ., 2006

Modelo Crudo Modelo Ajustado°

Variables CCn (%)

CTn (%)

OR IC95% p OR IC95% p

Antec. obesidad NO SI

63 (44)79 (56)

3 (38)5 (63)

1*1.33

0.31-5.77 0.70 1.45 0.32-6.55 0.63

Antec. diabetes NO SI

83 (58)59 (42)

3 (37)5 (63)

1*2.34

0.54-10.19 0.26 2.18 0.48-9.87 0.31

IMC (kg/m2)

<24.9 122 (86) 5 (63) 1* 24.9-28.29 13 (9) 3 (38) 5.63 1.20-26.30 0.03 4.98 0.99-25.13 0.05 >o = 28.3 7 (5) 0 (0) 3.48 0.06-37.82 0.31 3.48 0.06-37.82 0.31

Glucosa (mg/dl)

Normal 98 (69) 2 (25) 1* Alterada 44 (31) 6 (75) 6.68 1.30-34.42 0.02 6.36 1.18-34.37 0.03

Insulina μU/ml

4.52-9.547 48 (34) 1 (13) 1* <4.51 50 (35) 1 (13) 0.96 0.05-15.78 0.98 1.26 0.73-21.88 0.87 >9.548 44 (31) 6 (74) 6.54 0.75-56.53 0.09 6.42 0.72-57.14 0.10

Triglicéridos (mg/dl)

<150 108 (76) 4 (50) 1* >150 34 (24) 4 (50) 3.17 0.75-13.38 0.12 2.63 0.59-11.70 0.20

HOMA

1.06-2.29 49 (35) 1 (13) 1* < 1.06 49 (35) 1 (13) 1 0.06-16.44 1.0 1.42 0.82-24.69 0.81 >2.29 44 (30) 6 (74) 6.68 0.77-57.69 0.08 6.76 0.76-60.20 0.09*Categoría de referencia. Reportado el OR (odds ratio) con un IC (intervalo de confianza) del 95% y un valor de p significativo <0.05. °Ajustado por edad y sexo.

Cuadro 5. Asociación de los genotipos de rs5400 con parámetros clínico-bioquímicos

Barroso et al., 2003 modelo dominante (OR 1.49, p=0.0059).

Willer et al., 2007 asociado con DM2, (OR 2.98; IC95% 1.31-6.79, p= 0.014)

Gaulton et al., 2008 asociado con DM2, (OR 1.28, IC95% 1.11-1.49, p= 0.0023)

GRACIAS