plaquetas
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Composicion y maduracion de las plaquetasTRANSCRIPT
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Las plaquetas
Las plaquetas son partículas celulares esenciales para el normal desarrollo de la
hemostasia y cumplen un rol protagónico en los desórdenes tanto trombóticos como
hemorrágicos. Las plaquetas tienen su origen en la fragmentación citoplasmática del
megacariocito. Su estructura, sistema metabólico y mecanismos de señalización regulan
su fisiología. La participación de las plaquetas en numerosas funciones fisiológicas y la
sencilla manera de obtención para su estudio, han fundamentado su uso como modelo
experimental de gran utilidad en Biología Celular.
1.1.2. Descubrimiento de las plaquetas
De los tres elementos formes de la sangre, la plaqueta fue el último en ser
descubierto. Varias circunstancias retrasaron su hallazgo, entre ellas, su tamaño,
notablemente más pequeño que el de los eritrocitos y leucocitos, así como las limitaciones
ópticas de los primitivos microscopios empleados durante los siglos pasados,
particularmente el problema de la aberración cromática. (Izaguirre-Ávila, 1997). Tal vez, el
primer reporte se deba a Antonio van Leewenhoeck (1632-1723), quien al examinar gotas
de sangre, describió los glóbulos rojos y mencionó otras partículas más pequeñas, de un
tamaño aproximado de 1/6 del tamaño de los eritrocitos, que se adherían una a la otra,
aunque no les prestó mayor atención ni les asignó algún nombre.
George Gulliver, médico inglés, publicó en 1841 su observación de la presencia en
la sangre de "esférulas diminutas de aproximadamente 1/10,000 de pulgada", que
consideró precursores de la fibrina. En este sentido, mencionó en su trabajo que en la
sangre, además de los glóbulos rojos y blancos, existen los gérmenes de la fibrina, y en
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una ilustración representó a las plaquetas.
En 1842, William Addison también mencionó a las plaquetas como “corpúsculos
pálidos, algo más grandes que los corpúsculos rojos, que miden de 1/2,800 a 1/3,200 de
pulgada de diámetro” (seguramente referido a los leucocitos), y agregó: “también observé
que el líquido hemático contiene un gran número de moléculas o gránulos
extremadamente diminutos, que varían en tamaño; las más grandes miden de 8 a 10
veces menos que los corpúsculos pálidos y existen en gran abundancia. Al examinarlas,
observé que se inicia la coagulación de la fibrina; varios filamentos o fibras
extremadamente delicadas y perfectamente cilíndricas cruzan el campo del microscopio;
gradualmente se incrementan en número, hacen intersección una con otra en varios
puntos y forman una malla en la que quedan atrapadas tanto las moléculas como los
corpúsculos pálidos. Numerosas moléculas se encuentran situadas, a intervalos, a lo largo
del curso de los filamentos, formando nódulos sobre ellos”. Indudablemente, lo que
Addison describe es la formación del conglomerado de fibrina y plaquetas, a las que llama
“moléculas”, y tal vez fue uno de los primeros investigadores en haber observado
directamente al microscopio el proceso de formación de un coágulo (Figura 1).
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Figura 1. Dibujo de William Addison hecho en 1842.
Las figuras 1, 2b, 3 y 4e muestran las plaquetas, a las que llama“moléculas”, y los leucocitos, a los que llama “corpúsculos
pálidos”, atrapados en la fibrina. La figura 4a ilustra los eritrocitos,
la 4b los “corpúsculos pálidos” y la 4d las “moléculas diminutas” o“gránulos” (plaquetas).
1
2a
2b
3
4c 4d
4e
Varios de los trabajos pioneros sobre las plaquetas mencionan al francés Alfred
Donné, como el primer autor que reportó su presencia en la sangre. Durante una sesión
de la Academia de Ciencias de París en 1842, Donné reportó que en la sangre existen tres
tipos de glóbulos: los rojos, los blancos y los “pequeños glóbulos” (globulinas); más tarde
amplió la descripción en su libro “Curso de Microscopía”, publicado en 1844, y mencionó a
las “globulinas” como un elemento morfológicamente diferente; pensó que eran
precursores de los glóbulos blancos y comparó su apariencia integral a la de la leche. En
su descripción dice: “estos glóbulos (globulinas) muestran una gran diversidad en la
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sangre”. “Se unen en grupos de 3 ó 4, envueltas por una cubierta albuminosa mientras
circulan y así constituyen las células blancas”.
En Alemania, Friederich Arnold, en su libro "Handbuch der Anatomie des
Menschen", de 1845, ilustró plaquetas, a las que llamó gránulos elementales. Gustav
Zimmermann, en 1846, las llamó cuerpos elementales y Max Schultze en 1862, las
describió con el nombre de pequeños elementos.
En 1873, el investigador francés Edme Vulpian describió que estos cuerpos
incoloros de la sangre se adhieren al vidrio formando agregados y Louis A. Ranvier,
observó que durante la coagulación aparece una materia fibrosa con granulaciones de
características morfológicas y tintoriales diferentes a las de los eritrocitos y leucocitos.
En 1886, Karl Eberth y su asistente Curt Schimmelbusch observaron que la
alteración y estasis del flujo sanguíneo en los vasos van seguidas por el depósito de las
plaquetas en la pared formando un trombo rojo, fenómeno al que Ebert denominó
metamorfosis viscosa de las plaquetas. Sin embargo, quien logró entender mejor la
función de las plaquetas y reconocerlas como un elemento distinto en la sangre fue el
italiano Giulio Bizzozero, quien publicó en 1882 su monografía sobre las plaquetas.
Bizzozzero hizo sus observaciones en la circulación mesentérica de animales vivos y
rebatió las teorías de Schultze y Ranvier, al afirmar que “las masas granulares” no eran
residuos de la desintegración de los leucocitos ni granulaciones de fibrina, sino que se
originaban de los elementos morfológicos preexistentes en la sangre, a los que llamó
“petites plaques” (pequeñas placas o plaquitas) (Figura 2). Bizzozzero describió como se
agrupan en los vasos dañados y forman el tapón hemostático en forma diferente de la
coagulación del plasma y sugirió que se trata de dos eventos independientes y paralelos.
Como otros investigadores de su tiempo, suponía que las “plaquitas” liberaban una
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sustancia no visible al microscopio que podía acelerar la coagulación. Aisló plaquetas de
los trombos e identificó a la hemostasia y a la trombosis como procesos análogos.
También notó la naturaleza friable de los coágulos tempranos y la progresiva tensión que
se produce en los depósitos más avanzados (Quick 1966; Bizzozero, 1882).
Figura 2. Ilustración de Bizzozero hecha en 1882, donde muestra los glóbulos rojos, blancos y las “pequeñas placas pálidas” (plaquetas).
En los años siguientes, las plaquetas fueron reconocidas como un elemento
independiente en la sangre y recibieron diferentes nombres, aludiendo a sus
peculiaridades, como su tamaño pequeño, el orden en que habían sido descubiertas, sus
características tintóreas o lo difícil que era observarlas en forma aislada. Así se
conocieron como “globulitos (globulinas)”, “granulaciones”, “placas de la sangre”,
“pequeñas placas (plaquitas)”, “pequeños discos”, “tercer corpúsculo”, “corpúsculo
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fugitivo”, “discos fugitivos”,“discos invisibles” y “discos incoloros” (Tocantis, 1948).
Recién en 1906, el patólogo norteamericano James H. Wright fue quien perfeccionó
la tinción que lleva su nombre y la aplicó al estudio de la sangre y de la médula ósea.
Wright descubrió, mediante preparaciones histológicas, que los megacariocitos de este
tejido daban lugar a las plaquetas después de la fragmentación de su citoplasma (Figura
3).
Figura3. Ilustración de Wrigth hecha en 1906.Muestraun Megacariocito con prolongaciones quedesprenden plaquetas en el interior de un sinusoide.
Hace más de un siglo que las plaquetas fueron reconocidas como un elemento
independiente en la sangre y es innumerable la lista de investigadores que fueron dejando
las bases para los grandes descubrimientos que se han hecho y se continúan haciendo
acerca de su estructura y función.
1.1.3. Formación de plaquetas
Aunque se ha aceptado universalmente que las plaquetas derivan de los
megacariocitos, los mecanismos por los cuales se forman y se liberan siguen siendo
controvertidos.
La megacariocitopoyesis comienza con las células madre pluripotenciales o stem
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cells, que son las células hematopoyéticas más indiferenciadas, con capacidad de auto-
replicarse y diferenciarse hacia líneas celulares mixtas, como la línea megacariocítica. Los
progenitores megacariocíticos de línea mixta son células hematopoyéticas con capacidad
de originar elementos de varias líneas celulares, entre ellos, los megacariocitos.
El proceso comienza con la fase mitótica, en la que las células progenitoras
megacariocíticas se multiplican, y prosigue con una fase endomitótica en la que se
producen mitosis nuclear y separación de cromatinas, pero sin división celular. Las
sucesivas duplicaciones del ADN originan unas células poliploides de gran tamaño, los
megacariocitos. Una vez alcanzada la ploidía definitiva, en la fase final de la
megacariocitopoyesis, se produce la maduración del citoplasma megacariocítico, que dará
lugar, mediante el proceso de la trombocitopoyesis, a la formación y liberación de
plaquetas (Italiano y col., 2007).
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Figura 4. Microscopia electrónica (Cramer y col., 2006),
muestra la formación de proplaquetas (pr) y de plaquetas (P).
M: megacariocito; N:núcleo. Magnificación 35650 Å
1.2. ESTRUCTURA DE LA PLAQUETA EN REPOSO
Las plaquetas circulan en forma de lente biconvexa (lenticular), se encuentran en
una concentración que oscila entre 150 a 400 x 109/L y tienen un tamaño de 0,5 a 2,5 m.
El histograma de volumen plaquetario (7 a 9 fL) es representado por una distribución
normal logarítmica aún en poblaciones con un número incrementado de plaquetas recién
formadas. Esta observación ha sido considerada una evidencia de que la heterogeneidad
plaquetaria es determinada por su formación y no es consecuencia del envejecimiento. El
estudio de la ultraestructura de las zonas centrales y de constricción a lo largo de las
proplaquetas confirma la dispersión de tamaños; serán pequeñas cuanto más dístales del
cuerpo celular y más grandes las que provengan del centro citoplasmático.
La ultraestructura plaquetaria está subdividida en tres partes topográficas
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relacionadas con su función (Figuras 5 y 6): A- Membrana plaquetaria / intra y extra
celular; B- Gránulos y organelas intracitoplasmáticas/ secreción plaquetaria y C-
Citoesqueleto / proteínas motoras.
Figura 5.Esquema representativo de un corte transversal de una plaqueta. DTS: sistema
tubular denso, GP: glicoproteínas de membrana, : gránulo alfa, : gránulo denso, L:gránulos lisosomales, SCCS: sistema canalicular conectado a la superficie.
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Figura 6. Microscopía electrónica de una sección plaquetaria mostrando los compartimientos
intracelulares (Cramer y col, 2006). mt: anillo de microtúbulos, pm: membrana plasmática,
SCCS: sistema canalicular conectado a superficie, dts: sistema tubular denso, A: gránulos ,
db: cuerpos densos (gránulos ), m: mitocondria y glucógeno. Magnificación, 40.000 Å
GRÁNULO
GRÁNULO SISTEMA CANALICULAR
CONECTADO A SUPERFICIE
GRÁNULO
LISOSOMAL
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1.2.1. Membrana plaquetaria / intra y extra celular
La principal función plaquetaria es mantener la integridad vascular y frenar el
sangrado. Para el desarrollo de esta función, la superficie plaquetaria juega un rol crucial
de contacto, primero asegurando la adhesión a los componentes del subendotelio
expuesto y luego favoreciendo la agregación y formación del trombo plaquetario. La
plaqueta está rodeada por una membrana plasmática que se extiende a través de
múltiples ramificaciones del sistema canalicular conectado a la superficie (SCCS) (Figura
7).
Figura 7. Replica de una microscopía de fractura por congelamiento.
( White y col., 2006) Muesta la conección entre el SCCS y la
membrana plaquetaria. Magnificación 26.000x
A nivel de microscopía electrónica, la membrana plaquetaria tiene un espesor de 20
nm y aparece como una unidad trilaminar de membrana formada por dos hojas densas
separadas por un espacio constante. Al igual que otras membranas biológicas está
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compuesta por proteínas y lípidos, principalmente fosfolípidos y colesterol (Cramer y col.,
2006).
El glicocálix o cubierta plaquetaria está formado por cadenas de oligosacáridos
provenientes de glicolípidos, glicoproteínas de membrana (GPs) y cadenas de
polisacáridos provenientes de proteoglicanos de membrana. Además, proteoglicanos
plasmáticos y proteínas tales como la albúmina y el fibrinógeno forman parte del glicocálix
y son incorporados por adsorción (Handagama y col.,1993).
La asociación entre la membrana plaquetaria y los depósitos de proteínas
plasmáticas constituye la primera línea de interacción de la plaqueta con su entorno y
participa activamente en el proceso de endocitosis y almacenamiento de proteínas
plasmáticas en los gránulos de secreción. El glicocálix es responsable de la carga
negativa en la superficie plaquetaria, que provoca la repulsión de interacciones “no
deseadas” con otros elementos de la pared vascular o de la circulación sanguínea.
Las invaginaciones de la membrana plaquetaria dan origen a un sistema de canales
y canalículos que forma una extensa malla dentro del volumen citoplasmático. En esa
superficie invaginada, el glicocálix está menos desarrollado; un ejemplo de ello es la
mínima presencia de la glicoproteína Ib (GP Ib) comparada con la existente sobre la
superficie celular. Además, las cadenas glicosiladas de las moléculas descriptas
constituyen un bloqueo del SCCS, formando un filtro que controla la entrada de proteínas
plasmáticas (White y col., 2006).
Mediante microscopía electrónica se ha analizado la distribución y la funcionalidad
de las GPs en la superficie y a nivel intracelular, de las cuales las más relevantes son:
a- El receptor de adhesión formado por un complejo de tres GPs (GP Ib, GP IX y GP V) es
el receptor de unión de la superficie plaquetaria al subendotelio, mediante el factor von
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Willebrand (VWF) y la trombina (TR) (Hourdille y col., 1990). El complejo GP Ib/IX/V es
considerado el más importante de los receptores implicados en la adhesión. (Ruggeri y
col., 1997; Lopez y col., 1997). La inmunomarcación de los tres componentes de este
complejo indica su presencia sobre toda la superficie de las plaquetas en reposo,
ocasionalmente en el sistema canalicular y existe entre un 5 a 10% del total de marcación
inmunocolocalizado con el VWF en las membranas granulares (Berger, 1996). La
conexión del complejo con la malla de actina se produce a través de una proteína de unión
a actina (ABP) (Fox y col., 1993) y es particularmente importante en la modulación del
mecanismo de adhesión (Figura 8).
TR TR
A B C D
Figura 8. Estructura cristalográfica del complejo GP Ib IX V y sus ligandos (Munday y col., 2003)Panel A: GP Ib IX V; Panel B: Sitio de unión al VWF; Panel C y D: Sitios de unión a TR.
b- La GP VI, es el receptor para colágeno más importante (Col), está comprometido
en los eventos tempranos de la función plaquetaria y participa en la activación y la
agregación inducida por Col (Clemetson y col., 1999) (Figura 9).
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Figura 9. Esquema representativo de GP VI.: unión no covalente de FcR- a 3.
CRP: Peptido Relacionados
c- El complejo GP IIbIIIa (IIb 3) es el principal receptor en la agregación
plaquetaria, su principal función es la de unir fibrinógeno y, en condiciones de alto shear
rate, al VWF. Este complejo se encuentra homogéneamente distribuido sobre la superficie
y en la membrana del SCCS. Estudios realizados por inmunomarcación han demostrado la
presencia de depósitos internos ubicados en la membrana externa de los gránulos α
(Cramer y col.,1997) que representan una cantidad mayor al 30% de GP IIbIIIa. La función
más importante de este pool interno es la incorporación y almacenamiento del fibrinógeno
plasmático en los gránulos α (Cramer y col.,1994; Handagama y col.,1993; Plow y col.,
2006). (Figura 10)
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Figure 10. Esquema representativo que muestra los distintosdominios de las sub unidades αIIb (verde) y β3 (azul) en su formaextendida. (Plow y col., 2006)
d- La GPIV (CD36) está involucrada en las propiedades de adhesión y agregación
plaquetaria. Funciona como receptor de Col II y de trombospondina y participa en la
transducción de señales (Greenwalt y col., 1992). Por microscopía electrónica se ha
detectado GPIV sobre la superficie plaquetaria, en el sistema canalicular y en la
membrana de los gránulos α (Berger y col., 1993).
e- El complejo GP Ia/IIa (21) une Col (Figura 13), mientras que GP Ic/IIa y GP Ic *
/IIa (51, 61) unen laminina y fibronectina, respectivamente. Otra forma del complejo
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53, está presente sobre la superficie en muy baja concentración (aproximadamente 100
copias por plaqueta) y une proteínas adhesivas tales como fibrinógeno, fibronectina y VWF
(Coller y col., 1991). (Figura 11)
Figura 11. Esquema representativo de la GP Ia IIa. : Unión no covalente entre las subunidades 21
f- La molécula de adhesión endotelio-plaqueta (PECAM-1) y el CD9 son
componentes del plasma, de las membranas del sistema canalicular y en menor
proporción de la superficie de los gránulos α. El CD9 está formado por una proteína
relacionada con el complejo GP IIbIIIa en los procesos de activación, actúa como receptor
para fibronectina y podría estar comprometida en la funcionalidad del receptor para
factores de crecimiento (Lagaudrière-Gesbert y col.,1997). El PECAM-1 es una molécula
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de adhesión asociada con el citoesqueleto de las plaquetas activadas y también se
expresa en las células endoteliales (Newman y col., 1992).
1.2.2. Gránulos y organelas intra citoplasmáticas /secreción
1.2.2.1. Sistema tubular denso
Este sistema se origina a partir del retículo endoplasmático del megacariocito y está
compuesto por canales ubicados cerca de las cisternas del SCCS (Figura 12). Contiene
varias enzimas activas, tales como Ca2+ -ATPasas y ciclooxigena 2 (COX2).
Figura 12. Microscopía electrónica (Cramer y col., 2006). Las flechasseñalan el sistema tubular denso, detectado por marcación cito-química(peroxidasa). Magnificación: 26730.Å.
1.2.2.2. Gránulos de Secreción
Las plaquetas contienen cuatro tipos de gránulos citoplasmáticos clasificados de
acuerdo a su ultraestructura, densidad y contenido: los gránulos α, los gránulos densos,
los lisosomas y los peroxisomas.
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1.2.2.3. Gránulos α
Los gránulos α son los más prominentes y los que se encuentran en mayor número,
entre 50 a 80 por plaqueta, aproximadamente. Se forman durante la maduración temprana
de los megacariocitos y aparecen en la malla trans-Golgi en forma de pequeñas vesículas
y de gránulos inmaduros que transitan a través de cuerpos multivesiculares hasta alcanzar
su tamaño y densidad definitiva (Heijnen y col., 1998).
Morfología: Los gránulos maduros son generalmente redondos u ovoides, su
diámetro es de 200 a 500 nm y están rodeados por una unidad de membrana. La
ultraestructura es muy característica, la matriz puede dividirse en tres zonas con diferentes
densidades (Harrison y col.,1993). En la zona nucleoide oscura, se observa co-localización
de proteoglicanos con proteínas plaquetarias específicas tales como la β-trombomodulina
y el factor plaquetario cuatro (PF4). En la zona clara, localizada en la periferia y en forma
opuesta a la anterior, contiene una a cinco estructuras tubulares de 20 a 25 nm,
regularmente espaciadas y alineadas (Cramer,1985). En estas estructuras se observa
colocalizado el VWF (Cramer y col.,1986) en su forma multimérica de alto peso molecular
(Wilbourn y col.,1993). Finalmente, una tercera zona intermedia está asociada con la
marcación para fibrinógeno, trombospondina, albúmina y factores de crecimiento. (Figura
13)
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I
N
L
Figura 13. En la foto se observan tres zonas características, N: nucleoide oscura,I: intermedia y L: zona clara. Las flechas indican la presencia del GP IIb IIIa en lamembrana del gránulo (marcación por inmuno-gold). (Cramer y col., 2006)
Contenido: Los gránulos α contienen proteínas adhesivas, factores de crecimiento,
inhibidores de proteasas, proteoglicanos e inmunoglobulinas. Las proteínas pueden
agruparse según su función en: 1-proteínas adhesivas: VWF, Fibrinógeno (Fg),
Fibronectina (Fn), Vitronectina (Vn), trombospondina-1 (TSP-1), laminina-8; 2-proteínas de
coagulación: FV/ FVa, Factor XI, PS: proteína S, kalicreínas de alto peso molecular
(HMWK), antitrombina; 3-otras proteínas: plasminógeno, PAI-I, 2-antiplasmina, TAFI y
proteínas relacionadas con la angiogénesis.
La membrana de los gránulos α contiene diferentes receptores moleculares, cuyos
sitios de reconocimiento a ligandos están orientados hacía su lado interno. Algunos como
la P-selectina (Stenberg y col.,1985), la osteonectina y el GMP33 son receptores
específicos y están ausentes en la membrana plasmática de la plaqueta en reposo. En
particular, la P-selectina es indicadora de activación plaquetaria cuando se la encuentra
expresada en la superficie celular. (Furier y col., 2001)
Varios receptores están presente en ambas membranas; el ejemplo más relevante
corresponde al complejo GPIIbIIIa (Cramer y col.,1990), otros (CD9, PECAM-1, y GPIV)
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están presentes en porcentajes menores (Cramer,1994; Berger,1993) y el complejo GP
Ib/IX/V sólo en trazas.
El estudio de una enfermedad congénita poco frecuente, el síndrome de plaqueta
gris (Smith y col., 1997; Nurden y col., 2008;), ha contribuido a la comprensión del rol de
los gránulos α en la fisiología plaquetaria. En estos pacientes, las plaquetas contienen
gránulos α anormalmente vacíos, constituidos por membranas, pero sin contenido soluble
(Rosa y col., 1987). El origen de esta anomalía se observa en los megacariocitos en los
que las proteínas de la matriz granular de origen endógeno se liberan en grandes
cantidades hacia el espacio extracelular contenido en el lumen del sistema de
demarcación de membrana. Las plaquetas de estos pacientes adquieren un aspecto
grisáceo luego de la tinción de Romanowsky y tienen una agregación disminuida en
presencia de Col y TR in vitro. Por ello, estas plaquetas constituyen un modelo útil para el
estudio de la participación de los gránulos α en la hemostasia. (Figura 14)
A: En zona lumínica las
flechas marcan grupos
de estructuras tubulares
(corte transversal), de
multímeros de alto peso
molecular del FVW.
B
B: En zona nucleoide
las flechas señalan
inmunomarcación de
-trombomodulina
C DA
C: En zona
intermedia, las
flechas señalan
inmunomarción
para fibrinógeno.
D: En membrana
las flechas indican
inmunomarcación
de gliproteínas
(GPIIbIIIa).
Fotos de microscopía electrónica. Detalles del contenido del gránulo alfa
(Magnificación 120.000Å )
A: En zona lumínica las
flechas marcan grupos
de estructuras tubulares
(corte transversal), de
multímeros de alto peso
molecular del FVW.
BB
B: En zona nucleoide
las flechas señalan
inmunomarcación de
-trombomodulina
C DA
C: En zona
intermedia, las
flechas señalan
inmunomarción
para fibrinógeno.
D: En membrana
las flechas indican
inmunomarcación
de gliproteínas
(GPIIbIIIa).
Fotos de microscopía electrónica. Detalles del contenido del gránulo alfa
(Magnificación 120.000Å )
Figura 14. Fotos de microscopía electrónica (Cramer y col., 2006). Detalles del contenido del gránulo α. Magnificación 120000Å.
21
1.2.2.4. Gránulos densos (cuerpos densos)
Morfología: Los gránulos densos reciben este nombre por su natural opacidad en
las tinciones con tetróxido de osmio y por su capacidad de ser visibles al microscopio
electrónico en preparaciones no teñidas. Se visualizan entre dos y siete gránulos densos
por plaqueta, con un diámetro aproximado de 200 a 300 nm y presentan un cuerpo central
denso rodeada por un halo claro. Se han desarrollado dos técnicas citométricas de
observación al microscopio electrónico, una basada en la opacidad producida por el
contenido de serotonina (White y col.,1969) y la otra usando acetato de uranilo para
marcar el contenido de ADP y ATP y visualizar las membranas de los gránulos (Richards y
col., 1977). Los gránulos densos también pueden observarse por microscopía óptica de
fluorescencia o por citometría de flujo utilizando la incorporación de cristales fluorescentes
derivados de la quinidina, como la mepacrina (Wall y col., 1995).
Contenido: Son organelas de almacenaje de serotonina, (un potente
vasoconstrictor, que en un 90% de su concentración circulante se encuentra unido a
plaquetas), de cationes divalentes como Ca2+ y Mg+2 y de un pool no metabólico de ADP y
ATP. La membrana posee varios receptores, algunos como la GP53 (granulofisina-CD63)
y otros comunes al resto de las membranas tales como GPIIbIIIa y P selectina (Berger y
col., 1993; Israels y col., 1992). Después de la activación, el contenido de los gránulos
densos es directamente secretado por fusión con la membrana plasmática y las proteínas
de membrana son translocadas a la superficie. (Figura 15)
22
Figura 15. Muestra gránulos densos en una microscopia electrónicaRealizada con la técnica de White. (Cramer y col., 2006). A: α gránulo,dg: gránulo denso.
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1.2.2.5. Lisosomas
Morfología: Son gránulos pequeños con un diámetro inferior a 300 nm, poseen una
estructura homogénea y se encuentran en número reducido. La función de las enzimas
lisosomales durante la activación plaquetaria está dada por sus interacciones con la pared
vascular y por la digestión de los componentes de la matriz subendotelial. Dentro de la
plaqueta cumplen una función autofágica eliminando fragmentos citoplasmáticos. Distintas
GPs, como las proteínas lisosomales-asociadas a la membrana (LAMP-1, LAMP-2) y
CD63, están presentes en la membrana lisosomal y son redistribuidas a la superficie
después de la activación plaquetaria producida por estímulos fuertes como la TR.
1.2.2.6. Peroxisomas
Además de los tres tipos de gránulos descriptos, mediante técnicas citoquímicas se
han observado actividades de peroxidasa y catalasa, lo que posiblemente indica la
existencia de pequeños gránulos similares a los peroxisomas descriptos en otros tipos
celulares.
1.2.2.7. Citoesqueleto / proteínas motoras
El citoplasma está organizado espacialmente por una malla de proteínas
estructurales llamada en su conjunto citoesqueleto, que está compuesta principalmente
por tubulina y polímeros de actina (Fox y col., 1993). Cumple una función dual, tanto
estática como dinámica. Las plaquetas no estimuladas circulan en forma discoidea y
cambian a esféricas cuando son activadas, lo que permite asegurar una función
hemostática correcta. El citoesqueleto está formado por dos estructuras: un conjunto de
microtúbulos cercano a la membrana y una malla densa de filamentos de actina (White,
1984).
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Microtúbulos: están compuestos por moléculas de tubulina, que son heterodímeros
relacionados a dos polipéptidos globulares; la α y β tubulina y están asociados con
proteínas motoras, tales como quinesina y dineína. La función de los microtúbulos está
comprometida con el mantenimiento de la forma discoidea de las plaquetas en reposo
(White y col., 1998). Durante el cambio de forma, los microtúbulos se contraen y
centralizan las organelas de secreción en la cercanía del sistema canalicular. En paralelo,
fragmentos de microtúbulos aparecen en la periferia celular formando seudópodos (Steiner
y col.,1979; 1980).
La malla de actina puede ser subdividida en dos componentes: el esqueleto
submembranoso y los filamentos citoplasmáticos. Se encuentran debajo de la membrana
plaquetaria o rodeando la banda de microtúbulos. Su función está relacionada con los
cambios de forma de la plaqueta, el reordenamiento de complejos de GPs (Ib IX V) y la
formación de seudópodos.
La actina es el mayor componente del citoesqueleto y representa el 20% del
contenido proteico plaquetario. Se distribuye en dos formas, la primera son monómeros
globulares de actina (G-actina) y la segunda está formada por filamentos de actina (F-
actina). Varias proteínas, GPs y GPs de trans-membranas (filamina A (ABP-280), talina, K-
actina, miosina I y II) están asociadas a la malla citoplasmática de actina (Fox, 1988;
1993). Estas proteínas tienen como función la estabilización del esqueleto cuando las
plaquetas están en reposo y favorecen el entrecruzamiento de las proteínas de membrana
con la malla de actina.
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1.3. ACTIVACIÓN PLAQUETARIA
1.3.1Activaciónde la membrana plaquetaria
Una vez ocurrida la activación de las plaquetas, los constituyentes de la membrana
plasmática comienzan a reorganizarse y a exponerse como superficies catalíticas para las
proteínas plasmáticas: los fosfolípidos aniónicos cambian su posición asimétrica y son
reorientados desde el interior a la capa externa para facilitar la formación del coágulo. El
citoesqueleto se contrae en forma simultánea y la membrana plaquetaria cambia su forma,
contribuyendo a la formación de seudópodos.
1.3.2. Cambio de forma y agregación
Morfología: Luego de la activación ocurrida frente a una injuria de la pared vascular
o por la adhesión a un sustrato, las plaquetas sufren una serie secuencial de cambios
morfológicos: forma esférica, adhesión por filopodios cortos y largos, adhesión por
lamelopodios y finalmente, la consolidación completa de la adhesión (Stenberg y col.,
1988) (Figura 16).
La prolongación de lamelopodios es posible por el reordenamiento del citoesqueleto
y por un ensamble masivo de actina con fragmentación de la malla periférica de actina por
plecstrina. Los fragmentos resultantes de actina están unidos a la membrana por las
conexiones ABP-GP Ib/IX/V. Además de la formación de lamelopodios, las plaquetas
activadas forman filopodios superficiales, que permiten la unión entre plaquetas y la
formación de agregados sólidos. Estas proyecciones están contenidas por ramilletes de
filamentos de actina largos y difieren de los que forman lamelopodios por no depender de
la fragmentación.
Las diferentes estructuras participan en distintas funciones dentro de los procesos
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adhesivos: la formación de lamelopodios detiene el drenaje vascular adhiriéndose a la
superficie injuriada, y la formación de filopodios permite la unión a fibrina y a otras
plaquetas para formar el coágulo plaquetario tridimensional. Finalmente, los cambios de
forma son reconocidos por cuatro etapas claramente identificables:
1- Se despolimerizan los microtúbulos, se incrementa la cantidad de F-actina, se
deforma la membrana plaquetaria, se originan los lamelopodios y finalmente éstos facilitan
la adhesión entre ambos bordes de la injuria vascular.
2- Otras plaquetas son reclutadas, lo que permite consolidar la formación de la
monocapa. Éstas son activadas a través de receptores G-heterotriméricos, lo que resulta
en la activación de la integrina IIb3 (señalización del interior al exterior), permitiendo la
unión al fibrinógeno (señalización del exterior al interior) y la polimerización la red de
filamentos de actina. Finalmente, con la formación de numerosos filopodios, las plaquetas
se agregan y se consolidan entre sí formando un espeso trombo plaquetario.
3- Las plaquetas se contraen a través de cordones de actina también llamados
“fibras de tensión”, ancladas en las zonas de adhesión. Estas cuerdas de actina se
expanden y contraen, dando como resultado la secreción de moléculas pro-coagulantes y
factores de crecimiento que contribuyen a la reparación de la injuria vascular.
4- Luego de la secreción, las plaquetas “exhaustas” incrementan pasivamente los
agregados formados. La proteína P-selectina del gránulo que se expresa durante la
activación es blanco de las células polimorfonucleares y de los monocitos/ macrófagos.
Finalmente, estas células fagocíticas “limpian” la zona de los restos plaquetarios y de
fibrina (de Gaetano y col.,1999).
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Fotos de microscopía electrónica. Detalles de cambio de forma
A:Plaquetas en reposo. Se observa la forma discoide en cortes transversales.
B: Plaquetas activadas. Se observa el cambio de forma y la formación de
pseudópodos.
C: Centralización, fusión de los gránulos con la membrana y liberación de su
contenido al sistema canalicular abierto.
Fotos de microscopía electrónica. Detalles de cambio de forma
A:Plaquetas en reposo. Se observa la forma discoide en cortes transversales.
B: Plaquetas activadas. Se observa el cambio de forma y la formación de
pseudópodos.
C: Centralización, fusión de los gránulos con la membrana y liberación de su
contenido al sistema canalicular abierto.
Fotos de microscopía electrónica. Detalles de cambio de forma
A:Plaquetas en reposo. Se observa la forma discoide en cortes transversales.
B: Plaquetas activadas. Se observa el cambio de forma y la formación de
pseudópodos.
C: Centralización, fusión de los gránulos con la membrana y liberación de su
contenido al sistema canalicular abierto.
Figura 16. Fotos de microscopía electrónicaDetalles del cambio de forma. (Cramer y col., 2006).
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1.3.3. Receptores plaquetarios
La activación de los sitios de unión a ligandos en la GP IIb3 es producida por
distintos mecanismos de señalización que se inician por la unión de agonistas a las
proteínas G constituidas por siete segmentos transmembrana (STRs).
Muchos de estos agonistas provienen del contenido plaquetario: la serotonina, que
estimula la plaqueta a través de un receptor de tipo 5-HT-2 (Julius y col. 1990); el
tromboxano A2 (TxA2), producto de la metabolización del ácido araquidónico (AA) que se
une a un receptor específico de tromboxano (TP-1,-2) (Hirata y col., 1991) y el ADP
liberado de los gránulos densos que se une principalmente a dos receptores de tipos P2Y1
y P2Y12 (Jin y col., 2002).
Otros agonistas posibles son hormonas liberadas por otros tejidos, incluyendo la
epinefrina, que se une a receptores plaquetarios adrenérgicos de tipo 2 (Regan, 1986), y
la vasopresina proveniente de la hipófisis.
Finalmente, la trombina cliva a su receptor STR (Receptor Activador de Proteasas,
PAR 1,4) formando un nuevo péptido N-terminal que se unirá a la porción C-terminal del
receptor (Coughlin, 2000; Vu y col., 1991).
1.3.4. Mecanismos intracelulares
Una de las respuestas tempranas dependientes de proteínas G es la activación de
la fosfolipasa C-beta (PLC-) (Cockcroft y col., 1992). Esta enzima es responsable de la
hidrólisis del fosfatidil-inositol produciendo diacilglicerol, que activa una proteína quinasa C
(PKC) que cataliza la fosforilación de proteínas, la secreción de gránulos y la expresión del
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receptor para fibrinógeno (Shattil y col.,1987). Otro producto de la hidrólisis catalizada por
la PLC es el inositol-fosfato, que se une al sistema tubular denso y estimula la liberación
de Ca2+ (Brass y col., 1985). Además, la fosforilación del fosfatidil-inositol en la porción D-3
del anillo de inositol producida por otra quinasa, la fosfatidil inositol 3 quinasa (PI3K) es
importante en la regulación de la activación de la integrina IIb 3 (Kucera y col.,1992). El
segundo mecanismo involucra la vía de los eicosanoides. Se inicia por la fosfolipasa A2
(PLA2), que libera AA de los fosfolípidos de la membrana plaquetaria (Leslie, 1997), lo que
constituye el paso limitante para la síntesis de prostanoides y leucotrienos.
El incremento intracelular de los niveles de Ca2+ mediado por IP3, está
directamente relacionado con la activación plaquetaria, dado que muchas de las enzimas
comprometidas en los mecanismos de transducción de señales, tales como PLA2, PLC y
la quinasa de la cadena liviana de la miosina son dependientes de Ca2+.
En resumen, la función plaquetaria involucra un conjunto de etapas, cambio de
forma, secreción y activación de sitios de unión a ligandos en la integrina IIb3, todas
relacionadas al proceso de adhesión. El resultado final será la interacción plaqueta-
plaqueta y la formación del tapón hemostático formado por los agregados plaquetarios. La
consolidación del trombo requiere de la acción conjunta de dos receptores plaquetarios
centrales, el GPIIb/IIIa y el GPIb/IX/V y de sus principales ligandos, el fibrinógeno y el
VWF (Ruggeri y col., 1999; Nurden, 2008). Figura 17.
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FLUJO
LEUCOCITOS
PLAQUETA
CONSOLIDACION
DEL TROMBO
MICRO PARTICULAS
PLAQUETARIA
CELULAS
ENDOTELIALES
CELULAS
ENDOTELIALES
PLAQUETAS
ADHESION
ACTIVACION
AGREGACION
Contracción
Miosina IIA+Rho kinasa
EMPAQUETAMIENTO
NURDEN AT, 2008
FLUJO
LEUCOCITOS
PLAQUETA
CONSOLIDACION
DEL TROMBO
MICRO PARTICULAS
PLAQUETARIA
CELULAS
ENDOTELIALES
CELULAS
ENDOTELIALES
PLAQUETAS
ADHESION
ACTIVACION
AGREGACION
Contracción
Miosina IIA+Rho kinasa
EMPAQUETAMIENTO
NURDEN AT, 2008
Figura 17. Esquema representativo de
la formación del trombo plaquetario