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TRABAJO ESPECIAL DE GRADO
MEJORAMIENTO DE LA ESTABILIDAD DEL SABOR DE LA
CERVEZA MEDIANTE EL CONTROL DE MIGRACIÓN DE
METALES (Cu, Cr, Fe y Mn) EN LA FILTRACIÓN POR
TIERRAS DIATOMEAS
Presentado ante la Ilustre
Universidad Central de Venezuela
Por el Br. Bolívar G., Luis E.,
Para optar al Título
de Ingeniero Químico
Caracas, Noviembre de 2013
TRABAJO ESPECIAL DE GRADO
MEJORAMIENTO DE LA ESTABILIDAD DEL SABOR DE LA
CERVEZA MEDIANTE EL CONTROL DE MIGRACIÓN DE
METALES (Cu, Cr, Fe y Mn) EN LA FILTRACIÓN POR
TIERRAS DIATOMEAS
TUTOR ACADÉMICO: Prof. Trino Romero
TUTORES INDUSTRIALES: Maestro Cervecero Florian Kleber
Licenciado Juan Romero
Presentado ante la Ilustre
Universidad Central de Venezuela
Por el Br. Bolívar G., Luis E.,
Para optar al Título
de Ingeniero Químico
Caracas, Noviembre de 2013
Caracas, Noviembre, 2013
Los abajo firmantes, miembros del Jurado designado por el Consejo de Escuela de
Ingeniería Química, para evaluar el Trabajo Especial de Grado presentado por el
Bachiller Luis Eduardo Bolívar, titulado:
“MEJORAMIENTO DE LA ESTABILIDAD DEL SABOR DE LA CERVEZA
MEDIANTE EL CONTROL DE MIGRACIÓN DE METALES (Cu, Cr, Fe y
Mn) EN LA FILTRACIÓN POR TIERRAS DIATOMEAS”
Consideran que el mismo cumple con los requisitos exigidos por el plan de estudio
conducente al título de Ingeniero Químico, y sin que esto signifique que se hacen
solidarios con las ideas expuestas por el autor, lo declaran APROBADO
Prof. José A. Sorrentino R.
Jurado
Profa. Olgioly Domínguez Q.
Jurado
Prof. Trino Romero
Tutor Académico
Maestro Cervecero Florian Kleber
Tutor Industrial
Lic. Juan Romero
Tutor Industrial
DEDICATORIA
Este trabajo de grado va dedicado a mis padres Hilda
Esperanza García y Luis Jesús Bolívar por su
paciencia, amor y apoyo incondicional durante toda mi
vida. Sin ellos nada de lo que he logrado hubiese sido
posible. ¡Gracias mamá y papá!
A mi hermano Carlos Enrique Bolívar por apoyarme
cuando se presentaban situaciones difíciles de resolver.
¡Gracias!
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar agradezco a Dios todopoderoso por hacer que sea una mejor
persona cada día y por ayudar a superarme cuando se presenta una situación adversa.
A mis padres que me han apoyado e incentivado a dar lo mejor de mí. Por
crearme ese sentido de la responsabilidad, honestidad y humildad. Por todo lo que
han sacrificado para que yo consiga todas las metas que me he propuesto.
Un eterno agradecimiento al Lic. Juan Romero que con su apoyo como tutor
industrial me ayudó a llevar a cabo este gran proyecto con su experiencia, dedicación
y profesionalismo.
Al Maestro Cervecero Florian Kleber que depositó su confianza en mí y
permitió que realizara este proyecto de tecnología cervecera.
Al Profesor Trino Romero por sus consejos, recomendaciones y ser un gran
guía en su papel de tutor académico en la realización de este proyecto.
A la Dra. Adriana Bravo por brindarme la oportunidad de realizar este
proyecto en Empresas Polar y enmarcar lo que fue mi primera experiencia laboral.
A los ingenieros Leonardo Martínez y Lisbeth Gil, a la Dra. Graciela
Troncone y a la Dra. Blanca Jaimes, así como a los licenciados Marcia Hernández y
Luis Canelón por dedicar parte de su tiempo en aclarar dudas que surgían y apoyarme
en experimentos que se requerían apoyo técnico. A la Ing. Henmar Parada y al Lic.
Gabriel Mujica por el apoyo brindado en las evaluaciones sensoriales.
A todo el personal de las otras gerencias que conforman el Centro
Tecnológico Polar: Lusmary Márquez, Patricia Blasco, Alix Reyes, Laura De
Oliveira y Patricia Gómez que de una forma u otra hicieron que mi estadía fuera más
agradable y permitir que me integrara con más facilidad.
A la Ing. Josnay Quinche y a todo el personal del área de filtración por el
apoyo brindado en la experiencia industrial del proyecto.
vi
Bolívar G., Luis E.
MEJORAMIENTO DE LA ESTABILIDAD DEL SABOR DE LA CERVEZA
MEDIANTE EL CONTROL DE MIGRACIÓN DE METALES (Cu, Cr, Fe y
Mn) EN LA FILTRACIÓN POR TIERRAS DIATOMEAS
Tutor académico: Prof. Trino Romero Tutores industriales: Licenciado Juan
Romero, Maestro Cervecero Florian Kleber
Tesis. Caracas, U.C.V. Facultad de Ingeniería. Escuela de Ingeniería Química.
2013, 98 pp.
Palabras claves: Cerveza, Filtración, Tierras de diatomeas, Radicales Libres,
Antioxidantes, Estabilidad Organoléptica
Resumen. La estabilidad del sabor es una de las características más importantes que
definen la calidad de la cerveza y que se ve afectada por el almacenamiento a
temperaturas no controladas originando su envejecimiento. Esto ocurre por la
presencia de radicales libres que son los responsables del proceso de deterioro
oxidativo con el apoyo catalítico de ciertos metales, por lo que el propósito de toda
industria cervecera es preservar y mejorar la estabilidad del sabor por un periodo de
tiempo prolongado. Las reacciones oxidativas en cerveza son catalizadas por el
contenido de metales con poder oxidante presentes en la bebida tales como cobre,
cromo, hierro y manganeso. La etapa de la elaboración de la cerveza en donde se
focalizó esta investigación es en el proceso de filtración con tierra de diatomeas, en
la cual se encuentran los metales antes mencionados y tienen la posibilidad de migrar
a la bebida por efecto de solubilización. Se implementó la extracción de los metales
mediante un proceso de lavado ácido al medio filtrante. Los resultados analíticos de
potencial antioxidante por quimioluminiscencia y los resultados sensoriales
demostraron que la cerveza elaborada aplicando la filtración con el tratamiento ácido
de tierra de diatomeas, condujo a una mayor estabilidad del sabor en comparación
con la referencia, lo cual demuestra que pequeñas concentraciones de metales con
poder oxidante son capaces de catalizar reacciones oxidativas en la bebida.
vii
ÍNDICE DE CONTENIDO
ÍNDICE DE FIGURAS xi
ÍNDICE DE TABLAS xiii
INTRODUCCIÓN
xiii
CAPÍTULO I 3
FUNDAMENTOS DE LA INVESTIGACIÓN 3
I.1 Planteamiento del problema..................................................................................... 3
I.2 Antecedentes ............................................................................................................ 5
I.3 Uso de la tierra de diatomea en la filtración de cerveza .......................................... 9
I.4 Objetivos ................................................................................................................ 12
I.4.1 General ......................................................................................................... 12
I.4.2 Específicos ................................................................................................... 12
CAPÍTULO II 13
MARCO TEÓRICO 13
II.1 Cerveza ................................................................................................................. 13
II.2 Materia Prima ....................................................................................................... 13
II.2.1 Cebada Malteada ........................................................................................ 13
II.2.2 Lúpulo ......................................................................................................... 15
II.2.3 Levadura ..................................................................................................... 16
II.2.4 Adjuntos Cerveceros y Aditivos auxiliares ................................................ 17
II.2.5 Agua Cervecera........................................................................................... 17
II.3 Proceso de Elaboración ........................................................................................ 18
II.3.1 Producción de Mosto .................................................................................. 18
II.3.2 Fermentación .............................................................................................. 20
II.3.3 Filtración ..................................................................................................... 21
II.3.4 Envasado ..................................................................................................... 22
II.4 Filtración de cerveza por tierra de diatomeas ....................................................... 24
II.4.1 Medios Filtrantes ........................................................................................ 25
viii
II.4.1.1 Diatomita ....................................................................................... 25
II.4.1.2 Perlita ............................................................................................. 27
II.4.2 Técnicas de filtración .................................................................................. 28
II.5 Estabilidad del sabor de la cerveza durante su almacenamiento .......................... 32
II.6 Técnicas analíticas y descriptoras ........................................................................ 34
II.6.1 Espectrofotometría ...................................................................................... 34
II.6.2 Colorimetría ................................................................................................ 36
II.6.3 Espectroscopia de emisión atómica con plasma de acoplamiento inductivo
.............................................................................................................................. 37
II.6.4 Quimioluminiscencia .................................................................................. 38
II.6.5 Resonancia Spin Electrónico ...................................................................... 39
II.6.6 Evaluación sensorial ................................................................................... 40
CAPITULO III 43
MARCO METODOLÓGICO 43
Universo ...................................................................................................................... 43
Muestra ........................................................................................................................ 43
Muestras de tierra de diatomeas y perlita ............................................................. 44
Muestras del proceso de filtración ........................................................................ 44
Muestras requeridas provenientes de Cervecería Polar, Planta Los Cortijos ....... 45
Variables ..................................................................................................................... 46
Métodos e instrumentos de recolección de datos ........................................................ 47
Técnicas de procesamiento y análisis de datos ........................................................... 49
Muestreo ............................................................................................................... 49
Tierra de diatomeas y perlita. ............................................................................ 49
Mezcla de Precapas y Agua de recirculación .................................................... 49
Cerveza madurada y cerveza filtrada ................................................................ 50
Cerveza elaborada. ............................................................................................ 50
Medición de extracto y porcentaje de alcohol en cerveza .................................... 51
Determinación de dióxido de azufre en cerveza................................................... 51
Determinación de oxígeno en cerveza. ................................................................. 52
Determinación de color azul en cerveza. .............................................................. 53
Determinación de hierro por espectrofotometría .................................................. 53
ix
Determinación de metales por espectroscopía de emisión atómica ..................... 55
Potencial antioxidante en la cerveza por quimioluminiscencia ............................ 56
Potencial antioxidante en la cerveza por resonancia spin electrónica .................. 57
Análisis sensorial .................................................................................................. 58
Lavado de Tierra con H2SO4 ................................................................................ 59
Afinidad del reactivo DPPH ................................................................................. 61
Lavado de tierra en la planta ................................................................................ 62
CAPITULO IV 64
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 64
IV.1 Efecto de la adición del 1,1-difenil-2-picrylhydrazyl (DPPH) en el ensayo de
deterioro oxidativo de la cerveza por Quimioluminiscencia....................................... 64
IV.1.1 Reactividad del DPPH en cerveza ............................................................. 64
IV.1.2 Influencia del radical DPPH en el análisis del potencial antioxidante de la
cerveza por quimioluminiscencia ......................................................................... 66
IV.2 Implementación de variables de proceso para la innovación del tratamiento
químico del lecho filtrante. ......................................................................................... 69
IV.2.1 Determinación de metales solubles en tierra de diatomeas y perlita......... 69
IV.2.2 Determinación de pH y tiempo de lavado a escala de laboratorio ............ 70
IV.3 Comparación de concentraciones de cromo, cobre, hierro y manganeso en la
cerveza clarificada tanto en la filtración actual y la propuesta del lavado de tierra. ... 74
IV.4 Análisis del grado de envejecimiento en la cerveza embotellada en ambos
procesos de filtración .................................................................................................. 78
IV.4.1 Homogeneidad del lote de muestras ......................................................... 78
IV.4.2 Estabilidad Fisicoquímica ......................................................................... 80
IV.4.3 Color azul como indicador de envejecimiento .......................................... 82
IV.4.4 Potencial antioxidante por quimioluminiscencia ...................................... 84
IV.4.5 Potencial antioxidante por resonancia spin electrónico. ........................... 86
IV.5 Correlación del grado de envejecimiento de la cerveza obtenido analíticamente
con la evaluación sensorial en producto terminado de ambas filtraciones a las 0, 4, 8,
12 y 16 semanas de almacenamiento .......................................................................... 88
CAPITULO V 95
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 95
V.1 CONCLUSIONES ............................................................................................... 95
x
V.2 RECOMENDACIONES ...................................................................................... 97
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 98
APENDICES 103
xi
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura N° 1. Deterioro Oxidativo en la Cerveza…………………………..…………………4
Figura N° 2. Esquema del proceso de filtración por Tierra Infusoria………………….10
Figura N° 3. (a) Cebada dos hileras, (b) Cebada Seis hileras…………………………….13
Figura N° 4. Conos del lúpulo (glándulas amarillas)..…………………………..…………15
Figura N° 5. Diagrama del Proceso de fabricación de cerveza…………………………..18
Figura N° 6. Diagrama del Proceso de filtración…………………………..………………..21
Figura N° 7. Micrografía electrónica de barrido de la tierra infusoria Celite estándar
Super-Cel® NF (aumento: 500x)…………………………..………………..………………….25
Figura N° 8. Diatomita calcinada (a); Diatomita fundida (b) …………………………….27
Figura N° 9. Micrografía electrónica de barrido de la Perlita (aumento: 500x)…….28
Figura N° 10. Filtro de vela – Corte transversal (a); Vela del filtro (b)……………..30
Figura N° 11. Diagrama de Filtración de velas…………………………..………………….31
Figura N° 12. Representación de los cambios sensoriales en el aroma de la cerveza
durante su almacenamiento…………………………..…………………………..………………41
Figura N° 13. Equipo de destilación…………………………..……………………………….52
Figura N° 14. Curva emitida por el equipo Tohoku® CLA 2100……………………….57
Figura N° 15. Evaluación del valor de potencial antioxidante de la cerveza………..58
Figura N° 16. Degradación del 1,1-difenil-2-picrylhydrazyl con alícuotas
diferentes……………..…………………………..…………………………..…………...…………66
Figura N° 17. Cantidad máxima de metales que pueden ser extraídos de los medios
filtrantes…………………………..…………………………..……………………………………...69
Figura N° 18. Extracción de hierro en función del tiempo de lavado a diferentes
pH…………………………..…………………………..…………………………..…………………71
Figura N° 19. Concentración de hierro en solución luego de 30 minutos de extracción
a distintos pH en tierra de diatomeas calcinada…………………………..…………………72
Figura N° 20. Concentración de cobre durante la filtración de cerveza……………….76
Figura N° 21. Concentración de hierro durante la filtración de cerveza……………76
Figura N° 22. Concentración de manganeso durante la filtración de cerveza………77
xii
Figura N° 23. Prueba de Tukey validación de la Hipótesis Nula: Concentración de
SO2 en cervezas prueba y comparación son estadísticamente iguales……………….79
Figura N° 24. Prueba de Tukey validación de la Hipótesis Nula: Extracto real en
cervezas prueba y comparación son estadísticamente iguales……………………….79
Figura N° 25. Concentración de metales solubilizados en cervezas embotelladas de
ambas filtraciones……………………………………………………………………81
Figura N° 26. Degradación del dióxido de azufre en cervezas embotelladas de ambos
proceso de filtración…………………………..…………………………..……………………….82
Figura N° 27. Variación del color azul en cervezas embotelladas………………………83
Figura N° 28. Potencial antioxidante ó tiempo de aparición del segundo pico (a),
sumatoria de las intensidades reportadas en los dos picos (b).…………………………..84
Figura N° 29. Resistencia de las cervezas ante la oxidación a lo largo de las semanas
en base a las concentraciones de SO2 determinadas.……………………………………….85
Figura N° 30. Corrección del Lag-time con las concentraciones de SO2
determinadas…………………………..…………………………..…………………………..……87
Figura N° 31. Grado de oxidación determinado por el panel sensorial…………….89
Figura N° 32. Calidad de amargor determinada por el panel sensorial……………..89
Figura N° 33. Estabilidad organoléptica determinada por el panel sensorial……….89
Figura N° 34. Factor de correlación a lo largo de las semanas de almacenamiento...93
Figura N° 35. Comparación entre las calificaciones sensoriales calculadas y las
experimentales………..…………………..…………………………..………………………….......94
xiii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla N° 1. Propiedades químicas de la cebada malteada (fracción másica en
%)…………………………..…………………………..…………………………14
Tabla N° 2. Composición química del lúpulo. (Fracción másica en %)……….16
Tabla N° 3. Composición de una cerveza de fermentación baja pale-lager (12%
extracto original de mosto) …………………………..………………………….24
Tabla N° 4. Análisis químico de las tierras con los diferentes tratamientos27
Tabla N° 5. Análisis químico de la perlita. ……………………………………..28
Tabla N° 6. Términos y símbolos importantes utilizados en la medición de la
absorción…………………………..…………………………..………………….35
Tabla N° 7. Espectro visible y colores complementarios……………………….36
Tabla N° 8. Límites de detección de análisis en el equipo de espectroscopia de
emisión atómica con fuente de plasma (ICP-AES).............................................38
Tabla N° 9. Intervalos de análisis y descripción de condiciones………………..48
Tabla N° 10. Patrones para la curva de calibración……………………………...55
Tabla N° 11. Muestras para la descripción del efecto del DPPH en cerveza…...65
Tabla N° 12. Indicadores de envejecimiento en las cervezas utilizadas para los
ensayos…………………………..…………………………..…………………….67
Tabla N° 13. Determinación de quimioluminiscencia en muestras de cerveza con
el radical libre DPPH…………………………..………………………………….67
Tabla N° 14. Concentración de hierro en función del pH y del tiempo de
contacto…..……………..…………………………..…………………………..…70
Tabla N° 15. Volumen necesario para la extracción de hierro en 1 litro de
suspensión de tierra de diatomeas calcinada……………………………………..73
Tabla N° 16. Cantidad de H2SO4 al 98% se debe dosificar por cada Kg de Tierra
……………………………………………………………………………………..74
Tabla N° 17. Concentraciones de cromo, cobre, hierro y manganeso en las
suspensiones de precapa…………………………………………………………..75
Tabla N° 18. Concentración de oxígeno en llenadoras…………………………..80
xiv
Tabla N° 19. Resultados obtenidos del análisis de resonancia spin electrónico...87
Tabla N° 20. Calificación de las cervezas degustadas en la evaluación sensorial91
1
INTRODUCCIÓN
La cerveza ha sido una de las bebidas más consumidas a lo largo de la historia
y en determinadas culturas forma parte de la dieta, por lo que en los últimos años uno
de los mayores desafíos que enfrentan los fabricantes de cerveza es el de retrasar lo
máximo posible el grado de envejecimiento de la cerveza. Con frecuencia dicho
producto es almacenado por un tiempo prolongado sin control de temperatura, lo cual
afecta la degradación oxidativa de los compuestos constituyentes, que se traducen en
sabores no deseados, surgiendo descriptores como papel-cartón, caramelo, madera
que son característicos de este tipo de degradación en la bebida. La estabilidad del
sabor de la cerveza es uno de los factores más importante de su calidad, donde los
consumidores responden a este parámetro tanto consciente como inconscientemente.
El propósito de toda industria cervecera es mejorar la calidad de sus productos con el
fin de satisfacer las necesidades y exigencias del público consumidor, lo cual está
relacionado con el margen de demanda y ventas de los distintos tipos de cervezas que
se elaboran.
Existe un criterio de que los radicales libres derivados del oxígeno como
hidroxilos y etoxilos, disminuyen la estabilidad del sabor, alterando las principales
fuentes de compuestos de sabor debido al envejecimiento, es decir, los sabores
indeseados en la cerveza surgen, entre otros factores, a partir de los radicales libres.
Estos radicales se forman por la oxidación de la cerveza durante el almacenamiento,
una de estas especies reactivas es el radical hidroxilo, que oxida rápidamente los
componentes de la cerveza desencadenando la formación de compuestos que
deterioran la calidad organoléptica del producto. Muchos de estos compuestos de
envejecimiento se pueden producir durante las etapas del proceso.
Hoy en día, se afirma que el oxígeno molecular es relativamente estable y
tiene que ser activado antes de desarrollar su impacto perjudicial en la cerveza. La
degradación del peróxido de hidrógeno puede ser considerado el último paso de esta
2
activación, mientras que los metales pesados catalizan esta degradación. Los metales
catalizan la formación de otros radicales en la cerveza sin la influencia del oxígeno
por ejemplo, en la formación de radicales de ácidos grasos. Por lo tanto, los iones de
metales son un factor de suma importancia en el envejecimiento de cerveza. Los
iones de hierro, cobre, manganeso y cromo tienen una influencia negativa sobre la
estabilidad del sabor de la cerveza. El origen de estos metales en la cerveza se da
entre otros factores a partir de las tierras diatomeas utilizadas como lecho filtrante.
Aunque la oxidación es inevitable, puede minimizarse mediante la
optimización de las operaciones de la fabricación de cerveza y las condiciones de
almacenamiento, para preservar el contenido de antioxidante en la cerveza envasada
por un mayor periodo de tiempo. Por lo cual el principio de esta investigación se
centra en mejorar el proceso de filtración de cerveza madurada a cerveza antes de
embotellar a través de un tratamiento químico al medio filtrante, que en este caso es
la tierra de diatomeas.
3
CAPÍTULO I
FUNDAMENTOS DE LA INVESTIGACIÓN
I
I.1 Planteamiento del problema
En toda industria de alimentos y bebidas, es necesario llevar un régimen de
control de calidad, el cual es una de las bases para los sistemas de producción. En el
caso de la cerveza la calidad del producto está relacionada íntimamente al sabor de la
misma, por lo que se traduce en la garantía de la preferencia del producto en el
mercado consumidor de bebidas alcohólicas. Desde el punto de vista del consumidor,
la cerveza contiene sustancias beneficiosas como vitaminas, carbohidratos, minerales,
aminoácidos, ácidos orgánicos, además 200 ml de cerveza posee menor carga calórica
que su equivalente en jugo de manzana (76 Kcal y 96 Kcal respectivamente) debido a
que es una bebida de fermentación natural; por lo tanto, si se mejora la calidad del
producto significa un aporte tangible a la dieta del público, por supuesto si es
moderado su consumo, ya que el abuso de alcohol ocasiona enfermedades crónicas.
Para lograr un buen desempeño en el control de calidad del producto es necesario
contar con la instrumentación y el personal capacitado para su realización, así como
también una metodología rigurosa para lograr que el análisis del producto se lleve a
cabo eficientemente.
Cervecería Polar C.A. de manera de consolidar la preferencia de sus productos
en el mercado nacional, toma en consideración la aplicación de los sistemas de
control antes mencionados en cada una de las etapas del proceso de elaboración de
sus productos. Para ello en el Centro Tecnológico Polar ubicado en Planta Los
Cortijos se dispone de varias gerencias encargadas de evaluar los distintos productos
fabricados, en donde destaca el Laboratorio de Gerencia de Innovación y Soporte
Analítico para la evaluación de los diferentes productos de la cervecería.
4
La realización de este proyecto sobre la mejora de estabilidad del sabor de la
cerveza, se basa en la hipótesis de que la estabilidad del sabor se encuentra
estrechamente relacionada con la Actividad Antioxidante Endógena de la Cerveza, la
cual está determinada por las condiciones de cada proceso de preparación de materia
prima hasta el embotellado. Todas las cervezas tienen una cierta cantidad de
antioxidantes naturales como polifenoles, sulfitos y otros reductores que protegen su
sabor ante la oxidación por reacciones de radicales libres evitando el envejecimiento
de la bebida. Aquellas cervezas con una mayor actividad antioxidante pueden resistir
a la oxidación durante períodos más largos de tiempo y, por lo tanto, tener una mayor
estabilidad de su vida útil. Por lo tanto, la tarea consiste en primer lugar, determinar
la actividad antioxidante endógena de cerveza. Es posible detectar oxígeno activo en
forma de radical libre (radical ·OH) durante el proceso de oxidación de cerveza
usando el método de Quimioluminiscencia; esto se lleva a cabo a través de un
monitoreo detallado de la generación de radicales ·OH durante la oxidación cerveza
con una prueba de oxidación forzosa.
Figura N° 1. Deterioro Oxidativo en la Cerveza
(Fuente: Elaboración Propia)
La cerveza madurada se filtra mecánicamente haciéndola fluir a través de
capas de material filtrante, con el objetivo de remover gran parte de la levadura y
cualquier otro sólido (lúpulo, partículas de grano, entre otros) que se encuentra en la
bebida y así proporcionar el cuerpo y el color requerido. Normalmente en la filtración
por tierras diatomeas se obtiene una cerveza que es cristalina, en donde casi todos los
|microorganismos en la cerveza se remueven durante el proceso. La cerveza que ha
5
sido filtrada se mantiene generalmente en los tanques de gobierno antes de ser
embotellada o aplicarle un tratamiento adicional.
Entre otros factores, el deterioro oxidativo se debe a la presencia de iones
metálicos tales como Fe, Cu, Mn y Cr, debido a esto es prioritario estudiar la
influencia de dichos iones contenidos en tierras diatomeas utilizada como medios
filtrantes en la bebida.
Se plantea realizar una extracción de los metales de la tierra de diatomeas
aplicando ácido sulfúrico, éste material de origen sedimentario fosilizado es utilizado
como medio filtrante en proceso de filtración de cerveza madurada, posteriormente se
procederá a desechar el ácido junto con los metales extraídos de la tierra mediante el
enjuague con agua grado plato (°P) para llevar el proceso a la normalidad e iniciar el
proceso de filtración de cerveza; por ultimo todas aquellas cervezas producidas con la
filtración propuesta serán comparadas química y sensorialmente con respecto a las
cervezas producidas con el proceso actual de filtración, se tiene previsto que esta
innovación impacte positivamente a nivel de calidad del producto, mediante el
aumento de la estabilidad del sabor y la prolongación del tiempo de consumo
preferencial.
I.2 Antecedentes
El mejorar la estabilidad del sabor de la cerveza ha sido objeto de interés a lo
largo de los años en Cervecería Polar C.A. ya que es de suma importancia para
consolidar la preferencia de sus productos por parte del público consumidor. Se han
desarrollado varias investigaciones acerca de esta propiedad característica en la
bebida, por lo que, la información y reportes de datos contenidos en dichos trabajos
realizados por diferentes autores, sirven de base para el presente Trabajo Especial de
Grado. Entre las investigaciones más importantes hechas en la empresa así como
también en diferentes instituciones alrededor del mundo, tenemos:
6
“INFLUENCIA DE IONES METÁLICOS PESADOS EN LA
ESTABILIDAD DEL SABOR DE LA CERVEZA.”
En 2008, Zufall, C. y Tyrell Th. confirmaron la influencia de los iones de
hierro, cobre, y manganeso; y las formaciones de radicales a través de las reacciones
Fenton y Haber-Weiss. Determinaron el impacto de los iones de manganeso sobre la
estabilidad de la cerveza en concentraciones pertinentes, y observaron que su
concentración permanece constante desde la elaboración del mosto hasta la
producción de cerveza, donde su reactividad y concentración son típicamente más
altas en relación al hierro y cobre. Los resultados de la investigación indican
claramente que hay otros metales con poder oxidante que influyen en las
características de sabor rancio de cerveza, además de los metales conocidos (hierro y
cobre). En contraste con los iones antes mencionados, la presencia de manganeso en
el producto no se debe a la lixiviación en tanques de proceso o por materiales de
tubería, el mismo proviene de los cereales empleados en la elaboración de la cerveza.
Este hallazgo, infiere la importancia de manganeso como un sistema REDOX en el
deterioro oxidativo de la cerveza, esto puede servir como base para un enfoque
diferente en la elección de las materias primas.
“A STUDY OF BEER STALING USING CHEMILUNINESCENCE
ANALYSIS”, (ESTUDIO DEL ENVEJECIMIENTO DE LA CERVEZA
USANDO EL MÉTODO DE LA QUIMIOLUMINISCENCIA).
En 1991 Kaneda, H., Kano, Y., Kamimura, M., de la Cervecería Sapporo
(Shizuoka, Japón) y Kawaskishi, S., Osawa, T. (Universidad de Nagoya, Japón)
fueron los primeros en emplear el análisis de quimioluminiscencia (CL) para estudiar
envejecimiento de cerveza. Analizaron varios tipos de cervezas comerciales
japonesas, las cuales se almacenaron a 37 °C y su desarrollo de quimioluminiscencia
a 60 ºC. El nivel de CL en la cerveza se desarrolló a medida que transcurría el tiempo
de almacenamiento hasta a alcanzar un nivel máximo y luego disminuyó. La suma de
7
las intensidades de CL para la primera hora mostró una buena relación con el grado
de envejecimiento emitido según la evaluación del panel sensorial. Se afirmó que las
tasas de deterioro de la bebida pueden ser evaluadas a partir de los patrones de
quimioluminiscencia en las cervezas frescas antes de su almacenamiento. La
presencia de sulfitos en la cerveza disminuyó la producción CL durante su
almacenamiento, lo que indica que hay alguna contribución del sulfito a la estabilidad
del sabor debido a su efecto inhibidor sobre las reacciones de radicales libres en la
cerveza.
“CHEMICAL EVALUATION OF BEER FLAVOR STABILITY”,
(EVALUACIÓN QUÍMICA DE LA ESTABILIDAD DEL SABOR DE LA
CERVEZA).
Posteriormente en 1995 Kaneda, H., Kobayashi, N., Furusho, S., Sahara, H., y
Koshino S. desarrollaron un nuevo sistema de control de calidad para evaluar la
estabilidad de la cerveza y para chequear el proceso en relación a la estabilidad de
sabor. La actividad productora de quimioluminiscencia (CL) de la cerveza demostró
una buena correlación con el grado de degradación de sabor en evaluaciones
sensoriales. La combinación de los análisis CL con los análisis de actividad reductora
del 2,2-difenil-1-picrylhidrazyl (DPPH) demostró una alta correlación con el sabor de
cerveza evaluadas en pruebas sensoriales. Por lo tanto, se indicó que una
combinación de los análisis de CL y DPPH puede evaluar correctamente la
estabilidad de sabor y verificar el proceso de elaboración de cerveza y diversos
factores que intervienen tales como materia prima, producción de mosto y
fermentación.
8
“ROLE OF OH-RADICAL IN BEER OXIDATION”, (ROL DEL
RADICAL OH EN LA OXIDACIÓN DE LA CERVEZA)
En 1996 Uchida, M. y Ono, M., hicieron el desarrollo de un método para la
determinación de la actividad antioxidante endógena de la cerveza que puede
proporcionar una nueva técnica que teóricamente pudiera mejorar la estabilidad de la
cerveza. Detectaron radicales libres en la cerveza durante una prueba de oxidación
forzada a través de espectroscopia de resonancia de spin electrón. Al analizar las
estructuras hiperfinas de los aductos de spin con α-fenil N-tert-butilnitrona (PBN) y el
N-oxido del 5,5'-dimetil-L-pirrolina (DMPO), los radicales libres detectados se
identificaron como radicales hidroxilo (radicales ·OH). Los investigadores
encontraron que el radical ·OH no siempre fue generado después de haber comenzado
la prueba de oxidación forzada. Sin embargo se generaron luego de un periodo
definido, al cual llamaron el "Lag time" (tiempo de retardo). El "Lag time" se
consideró como la actividad antioxidante endógena de la cerveza. También
discutieron el mecanismo de la generación del radical ·OH.
“PREDICCIÓN DEL GRADO DE DETERIORO ORGANOLEPTICO DE
LA CERVEZA POR MEDIO DEL COLOR”
Leo, F. simuló en el 2010 un periodo de almacenamiento, bajo condiciones
controladas, durante el cual se analizaron los cambios químicos ocurridos en la
cerveza al transcurrir el tiempo mediante la Colorimetría y Quimioluminiscencia.
Además de analizar los indicadores del deterioro del producto y realizar pruebas
sensoriales como parámetro descriptivo para así dar consistencia al estudio. Indicó
que valores como el índice EBC (European Brewing Convention) de color no
representa un indicador en cuanto al envejecimiento o deterioro de la cerveza,
mientras que el índice de quimioluminiscencia y el índice RVA (Rojo-Verde-Azul),
específicamente el color azul son buenos indicadores ya que representan el
comportamiento de la cerveza deteriorada. Obtuvo respuestas confiables y objetivas
9
mediante la relación entre los resultados analíticos y descriptores, para después
plantear una ecuación de correlación entre ambos factores medidos.
“COMPUESTOS α-DICARBONÍLICOS COMO INDICADORES Y
PRECURSORES DEL DETERIORO DEL SABOR DURANTE EL
ENVEJECIMIENTO DE LA CERVEZA”
Durante el año 2002, Bravo, A., Sánchez, B., Scherer, E., Herrera, J. y Aldao
R., detectaron por primera vez mediante HPLC la acumulación de los compuestos α-
dicarbonílicos durante el almacenamiento de cerveza a 28°C con respecto a cervezas
mantenidas a 0 °C. La estructura química de los α-dicarbonilos detectados en la
cerveza revela los posibles mecanismos involucrados en su formación: la degradación
de compuestos de Amadori, la degradación de Strecker de aminoácidos y reacciones
de rompimiento retroaldólicas. La adición de aminoguadinina a la cerveza al
embotellar inhibió la formación de productos finales de la reacción de Maillard, tal
como 5-hidroximetil-furfural; y protegió del deterioro del sabor durante el
almacenamiento a 28 °C, por un mecanismo que aún no ha sido completamente
elucidado. Este trabajo subraya la relevancia de los intermediarios α-dicarbonílicos
como posibles precursores de compuestos que deterioran el sabor de la cerveza, y
abre una vía para el desarrollo de nuevas estrategias para atenuar el deterioro de la
estabilidad del sabor por la vía térmica.
I.3 Uso de la tierra de diatomea en la filtración de cerveza
La tierra de diatomeas es un material de origen sedimentario compuesto por
los restos de los esqueletos de plantas acuáticas microscópicas llamadas diatomeas.
Estas plantas fueron parte de la ecología de la tierra desde tiempos prehistóricos, y
siguen formando parte del ciclo de vida de los océanos. La diatomea es una célula
viva, envuelta por una especie de caja porosa de sílice, que es su esqueleto y que está
fabricada por la misma célula, con sílice extraída del agua de mar.
10
En Cervecería Polar, se mantienen las soluciones de tierra infusoria al 20 %
p/v en tanques con agitación continua para que no se sedimente. Para poder filtrar
cerveza con diatomea, se requiere un filtro de velas, que son sistemas que pueden
estar soportados verticalmente desde arriba (colgantes) o desde abajo. Están
conformados por unos cilindros donde se adhiere la tierra de diatomeas aplicando un
flujo constante de agua, para que luego la cerveza madurada fluya a través de este
filtro, obteniendo la bebida clarificada.
Figura N° 2. Esquema del proceso de filtración por Tierra Infusoria
(Fuente: Elaboración Propia)
El filtro de velas trabaja con precapas, el cual es un sistema de filtración que
opera bajo presión y en forma discontinua. Los elementos filtrantes de forma tubular,
se distribuyen uniformemente en la superficie de una carcasa cilíndrica vertical con
fondo cónico y tapa toriesférica de apertura rápida.
Inicialmente se prepara en el tanque de precapa (Dosimat), una solución del
material filtrante en agua. Se la hace recircular por el filtro para formar la precapa
sobre los tubos filtrantes, hasta que el líquido se observa limpio a la salida del filtro.
La precapa funciona como un revestimiento con más poros de menor diámetro que
los del soporte del tubo filtrante. Con la precapa ya formada se comienza a circular el
11
producto a filtrar. La adición del material filtrante en el producto a filtrar tiene por
finalidad el evitar la compactación de la torta que se va formando durante el ciclo.
El final de la filtración ocurre cuando la torta llega el espesor máximo admisible,
o cuando el caudal del líquido filtrado está por debajo del nivel económicamente
aceptable. La eliminación de la torta se realiza mediante la presurización del filtro
con agua limpia, y una rápida despresurización que hace que se desprenda la torta y
se descargue por el fondo del filtro.
El objetivo es que el lecho de diatomea debido a su porosidad promedio de apenas
3 a 10 micrones, permite retener partículas microscópicas, y obtener una bebida
clarificada para que posteriormente sea envasada y pasteurizada. Como se explicó en
el planteamiento del problema, la tierra diatomea posee un contenido metálico
(cromo, cobre, hierro y manganeso), los cuales actúan como catalizadores en las
reacciones oxidativas que ocurren en la cerveza, por lo que, si hay mayor cantidad de
estos iones metálicos, el envejecimiento de la bebida puede ser más acelerado.
12
I.4 Objetivos
I.4.1 General
Mejorar la estabilidad del sabor de la cerveza mediante la disminución del
impacto a la actividad antioxidante endógena a través del control de la transferencia
de metales (Fe, Mn, Cu y Cr) en el proceso de filtración de la cerveza madurada por
tierras de diatomeas, con la aplicación de un tratamiento químico al lecho filtrante.
I.4.2 Específicos
1. Verificar el efecto de la adición del 1,1-difenil-2-picrylhydrazyl (DPPH) en el
ensayo de deterioro oxidativo de la cerveza por quimioluminiscencia.
2. Optimizar el pH y tiempo del lavado ácido para la máxima extracción de metales
con poder oxidante de la tierra de diatomeas usada en la preparación de las dos
precapas en filtración.
3. Comparar concentraciones de metales cromo, cobre, hierro y manganeso en la
cerveza clarificada tanto en la filtración actual como en la propuesta.
4. Determinar analíticamente el grado de envejecimiento en la cerveza embotellada
en ambos procesos de filtración.
5. Correlacionar el grado de envejecimiento de la cerveza obtenido analíticamente
con la evaluación sensorial en producto terminado de ambas filtraciones a las 0, 4,
8, 12 y 16 semanas de almacenamiento
13
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
II.1 Cerveza
La cerveza se describe como una bebida con sabor amargo con contenido de
alcohol, extracto, y dióxido de carbono; que se prepara a partir de malta de cebada
principalmente, lúpulo, agua cervecera y levadura. El alcohol es producido con ayuda
de la levadura, la cual realiza la fermentación de azucares provenientes del almidón
contenido en la cebada malteada. En algunos casos se aplica el uso adjuntos
cerveceros como: trigo, maíz y arroz, que al mezclarlos con la cebada, aportan una
cantidad adicional de almidones y azucares. Por otro lado, la adición del lúpulo
proporciona el aroma y amargor que caracteriza a la bebida. [11]
II.2 Materia Prima
II.2.1 Cebada Malteada
Es la materia prima más importante y preferida por encima de otros cereales
debido a que el grano está revestido por una cáscara que protege el germen durante el
malteado y evita que el grano pierda su contenido de almidón, compuesto necesario
para generar azúcares. Generalmente se utiliza la cebada de dos hileras ya que sus
granos son más desarrollados en comparación a la cebada de seis hileras [8, 11], en
las figuras 3a y 3b se observan las diferencias.
(a) (b)
Figura N° 3. (a) Cebada dos hileras, (b) Cebada Seis hileras
(Fuente: Google Images)
14
El malteado consiste en germinar los granos para provocar las
transformaciones que la cebada logra de forma natural durante su crecimiento y
detener esta transformación rápidamente según las características esperadas, además
de activar enzimas que permitan solubilizar las materias de reserva del grano.
La transformación de la cebada en malta dura aproximadamente ocho días y
se desarrolla en cuatro etapas principales:
a) Remojo
b) Germinación
c) El secado y tostado
d) La desgerminación
A la salida de la maltería, la malta se presenta en forma de un grano amarillo
dorado seco y quebradizo. La malta es transportada a granel en camión, chalana, tren
o barco, en sacos y en contenedores. La duración de conservación puede llegar a más
de un año si se respetan las condiciones estrictas de almacenamiento y limpieza.
La malta para la cerveza clara se tuesta a 85 °C y la malta para la cerveza
oscura a 100 °C. Todos los procesos en la maltería son procesos naturales que
transcurren sin ninguna ayuda de químicos auxiliares. En la Tabla N° 1 se observan
las propiedades químicas que posee la cebada malteada.
Tabla N° 1. Propiedades químicas de la cebada malteada (fracción másica en %)
Contenido Cebada Cebada malteada
Almidón 64 – 66 58 – 60
Otros compuestos no-nitrogenados del extracto 14 – 16 17 – 19
Proteínas 10 – 12 9 – 11
Fibras 4,5 5,2
Minerales 2,8 2,5
Grasa 2,3 2,1
Fuente: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. Editorial Wiley VCH. 2005.
15
II.2.2 Lúpulo
El lúpulo es un ingrediente indispensable debido a que le confieren un sabor
amargo a la cerveza, un aroma específico, y promueve la clarificación. Además, es
usado también por tener propiedades que mejoran la estabilidad de espuma, inclusive
también por su papel como un antiséptico en la cerveza. [11]
Para elaborar la cerveza son necesarios únicamente los conos de lúpulo
descritos en la Figura N°4; estos contienen las resinas importantes que proporciona el
amargo así como también sustancias aromáticas como el linalol (compuesto
predominante que aporta el aroma característico del lúpulo). La composición del
lúpulo depende de la variedad, cosecha, procedencia, tiempo de cosecha, secado y
almacenamiento. [12]
Figura N° 4. Conos del lúpulo (glándulas amarillas)
(Fuente: Google Images)
Las resinas totales representan la suma de todas las resinas amargas, y se
pueden dividir en resinas duras y blandas. Los principales constituyentes en resinas
blandas son los ácidos amargos, que se pueden dividir en α - ácidos (3 - 17%) y β -
ácidos (2 - 7%). Los cinco homólogos de la α - ácidos son las humulonas, co-, ad-,
pre- y posthumulona; no obstante, estos cinco homólogos también se pueden
encontrar en los β - ácidos (lupulonas), que sólo difieren de humulona en el lado de
cadena en el carbono 3 (un grupo alilo de dimetilo en lugar de un grupo OH).
El lúpulo también es una gran fuente de polifenoles, que cumplen el papel de
antioxidantes naturales muy potentes que protegen frente a la acción perjudicial de
16
los radicales libres. La presencia de estos constituyentes otorgan a esta bebida una
capacidad antioxidante equivalente a la del vino. Dependiendo del tipo de cerveza se
agregan de 100 a 400 gramos de lúpulo por cada hectolitro de cerveza.
La Tabla N° 3 muestra los componentes más importantes que se encuentran en
el lúpulo. Los ácidos amargos (α y β-ácidos) y las sustancias aromáticas (aceites
esenciales) los cuales son de gran importancia tanto desde el punto de vista de la
tecnología de elaboración de la cerveza como para su sabor. [12]
Tabla N° 2. Composición química del lúpulo. (Fracción másica en %)
Componente Natural Seca
Agua 9-12 -
α-Ácidos 2-17 2,2-13-5
β-Ácidos 2-10 2,2-11,2
Aceites Esenciales 0,5-2,5 0,6-2-8
Compuestos No-nitrogenados 4-9 4,5-10
Proteínas 15-21 13-22
Fibras 10-17 11-19
Polifenoles 3-8 4,5-16
Minerales 7-11 8-12
Lípidos y ceras Mayor a 3 Mayor a 3,4
Aceites Grasos 0,05-0,2 0,06-0,22
Fuente: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. Editorial Wiley VCH. 2005.
II.2.3 Levadura
Las levaduras utilizadas en las cervecerías, pertenecen a la familia de
Saccharomycetaceae y del género Saccharomyces. De las materias primas que se
utilizan para la elaboración de cerveza, la levadura es la más económica ya que tiene
la ventaja principal de que sus células se propagan por injerto. Para la producción de
cervezas de fermentación baja (Pilsen, Märzen), se utilizan Saccharomyces uvarum y
para la elaboración de cervezas de alta fermentación (Alt, Kölsch, Weizen) se utilizan
Saccharomyces cerevisiae. [12]
Después que las enzimas de la cebada malteada han sido destruidas durante la
ebullición del mosto, la levadura le proporciona al mosto un nuevo sistema
17
enzimático. Con el fin de metabolizar activamente, la levadura debe sintetizar las
sustancias que necesita según la composición del mosto, dependiendo de las síntesis
necesarias, las cantidades de los productos metabólicos que se encuentran en el
sustrato de fermentación serán diferentes.
II.2.4 Adjuntos Cerveceros y Aditivos auxiliares
Otras fuentes de extracto como los adjuntos tienen importancia en la
fabricación de cervezas claras y estables, por su aporte de almidón que son una fuente
de alcohol, lo mismo que el almidón de cebada pero contribuyen poco al color, sabor,
aroma y contenido de proteínas. En cervecerías se emplea principalmente maíz, arroz
y avena, y en algunos casos utilizan frecuentemente jarabes, que se fabrican a partir
de harina de cereales o almidón por hidrólisis enzimática o ácida. Todos los jarabes
tienen un contenido de extracto de aproximadamente 80%, mientras que su capacidad
de fermentación está en el rango 40 - 78%; estos se añaden a la paila de mezcla. La
concentración del mosto se puede aumentar de esta manera entre un 15 a 18%. [12]
II.2.5 Agua Cervecera
De todos los elementos que forman la cerveza, probablemente el agua sea el
más importante de todos. En primer lugar tiene que ser bacteriológicamente limpia,
la naturaleza del agua empleada en la fabricación es de mucha atención y se llega a
decir que el éxito de la cerveza depende del empleo adecuado del agua. El agua
utilizada para la elaboración de la cerveza se debe corresponder con la calidad del
agua potable, debe ser clara, incolora y neutra en el gusto y el olfato. No debe
contener metales con poder oxidante, especialmente hierro y manganeso, y no debe
ser corrosiva. Las aguas naturales se originan a partir de diferentes formaciones
geológicas y por lo tanto, muy rara vez se ajustan a la calidad requerida para la
elaboración de la cerveza, y por ello requiere de un tratamiento. El
acondicionamiento del agua se rige por las concentraciones de iones y sustancias
orgánicas disueltas.
18
II.3 Proceso de Elaboración
El proceso de elaboración de cerveza consta de cuatro etapas claramente
definidas, que son producción de mosto, fermentación, filtración y envasado. Cada
tipo de cerveza elaborada en Cervecería Polar tiene su particularidad que la diferencia
entre las otras, debido a que según la clase de cerveza varía la cantidad y tipo de
materia prima. La Figura N° 5 describe todo el proceso cervecero:
Figura N° 5. Diagrama del Proceso de fabricación de cerveza
(Fuente: Cervecería Polar, Venezuela)
II.3.1 Producción de Mosto
Este proceso se inicia a partir de la molienda o trituración de la cebada
malteada, para luego ser mezclado con los diferentes adjuntos empleados, como
hojuelas de maíz y arroz. Posteriormente comienza la etapa de maceración, que
comienza con la adición de la mezcla y la dosificación de enzimas a una paila, en la
19
cual se encuentra incorporado un sistema de agitadores. La maceración garantiza el
desdoblamiento de las sustancias contenidas en la malta como el almidón, para
formar subunidades más pequeñas que en este caso son aquellos azúcares
fermentables que son aprovechados luego por la levadura, estos procesos se hacen
posibles gracias a las enzimas (α-amilasa y β-amilasa), que actúan como bio-
catalizadores efectuando diversas reacciones químicas acelerando el rompimiento de
las moléculas. [12]
Después de la maceración, el mosto “dulce” obtenido es sometido a una
clarificación, donde se separan los sólidos no deseados de la primera mezcla por
filtración (se obtiene el nepe), luego esta mezcla clarificada se hierve en unas pailas
de cocimiento, durante este tiempo se añade el lúpulo.
En este proceso de elaboración de mosto dulce se deben lograr los siguientes
objetivos:
La evaporación del exceso de agua con el fin de lograr la concentración
deseada del mosto (extracto original).
La destrucción de enzimas.
La esterilización del mosto.
La disolución y la isomerización de las sustancias amargas del lúpulo en el
mosto.
Además, se eliminan los componentes aromáticos indeseables, se reducen
otras sustancias, aumenta el color, y el valor de pH cae ligeramente.
Finalmente, el mosto de cerveza obtenido después de la ebullición se
denomina “mosto terminado” ó “mosto caliente”. Su contenido en extracto y el
volumen tiene que ser analizado para que se pueda determinar su rendimiento en la
20
sala de cocción, éste rendimiento de extracto se expresa como un porcentaje de la
cantidad de malta utilizada (rango entre 78 y 81%).
El mosto terminado es clarificado nuevamente, esto se realiza en un equipo
giratorio llamado Rotapool o Whirlpool, en él se retira aquellas partículas formadas
en el cocimiento (trub) por fuerza centrípeta. Posteriormente la mezcla clarificada es
enfriada, donde pasa de una temperatura de 80 °C aproximadamente y llega de 5 a 10
°C, esto se realiza con ayuda de un intercambiador de placas, cuyo refrigerante es
amoníaco.
II.3.2 Fermentación
El proceso de fermentación se inicia mediante la adición de 0,5 a 0,7 L de una
suspensión pesada de levadura por hectolitro de mosto, lo que corresponde al 15 - 20
× 106 células de levadura por mililitro de mosto frío y aireado. Este procedimiento se
llama pitcheo. Además de la concentración de células de levadura, para alcanzar una
fermentación satisfactoria dependerá del suministro suficiente de las células con
oxígeno, este proceso se le denomina aireación y se realiza con aire estéril (o
excepcionalmente con el propio oxígeno). Un valor de 8 a 10 mg O2 por litro de
mosto es suficiente para alcanzar una óptima fermentación. [12]
Los principales productos resultantes de la fermentación son etanol y dióxido
de carbono, tal como lo describe la siguiente reacción:
Glucosa Etanol Dióxido de Carbono
Ecuación N° 1: Fermentación Alcohólica (Reacción de Gay-Lussac)
Las fases de la fermentación son aeróbica, donde la levadura se propaga y
anaeróbica donde la levadura fermenta el azúcar. Durante los primeros días la
21
fermentación se da a 12 °C, luego al quinto se comienza a bajar la temperatura
gradualmente hasta llegar a 0°C, originando una decantación.
Entre los compuestos secundarios más importantes se puede destacar la
producción de compuestos azufrados como lo es el dióxido de azufre. Su formación
durante la fermentación depende principalmente de la cepa de levadura. Éstos son
antioxidantes ampliamente usados como aditivos conservantes de alimentos, en
general se utilizan para prevenir el envejecimiento de la cerveza, el cual se identifica
a través del sabor rancio. El sulfito por ser calificado en este caso como antioxidante,
actúa como un atrapador de especies de oxígeno activo, tales como O2 y/o H2O2
presentes en cerveza, y, en consecuencia, podría inhibir la generación de radicales-
OH. Por otro lado, el sulfito puede reaccionar con los compuestos carbonílicos
responsables del sabor a rancio en la cerveza.
II.3.3 Filtración
Culminada la maduración, se aprecia que la cerveza está clara. Sin embargo, es
necesario filtrarla con el propósito de optimizar su estabilidad y darle la brillantez
deseada. Este proceso se lleva a cabo en dos etapas, la primera es la filtración de la
cerveza a bajas temperaturas del orden de -2°C aproximadamente, y luego se lleva a
cabo el tratamiento de la cerveza con agentes estabilizantes para que su estabilidad
organoléptica se preserve durante un mayor tiempo en el mercado.
Figura N° 6. Diagrama del Proceso de filtración
(Fuente: Cerveceros de Venezuela)
22
En algunas cervecerías realizan el proceso de filtración en dos etapas; la
primera fase es utilizando tierra de diatomeas para eliminar las partículas gruesas que
se encuentran en suspensión y después se realiza una filtración de pulimento
utilizando, por ejemplo, filtros de placas para lograr una mejor clarificación. Se ha
observado en ciertos casos que utilizan la centrifugación como un método alternativo
al de la filtración por tierra infusoria, así como también puede observarse el uso de
clarificadores por ejemplo, colágeno especialmente preparado y formar partículas
más grandes y fáciles de retirar. [33]
Posteriormente a la filtración comúnmente se añaden estabilizantes. Dado que
el tipo de turbidez más temida por los cerveceros es la originada por la unión de
proteínas y polifenoles (surge cuando el consumidor enfría la cerveza antes de su
consumo), por lo que, el objetivo primordial de este proceso es la eliminación de
estos compuestos para lograr la estabilización de la cerveza. Posteriormente se
añaden agentes estabilizantes, los cuales son en su mayor parte polifenoles, papaína,
alginato de propilenglicol (PGA) como estabilizante de espuma, y antioxidantes
como metabisulfito de sodio.
Una vez culminado este proceso, la cerveza obtenida ya está madura en el
sabor, bien carbonatada, clarificada, estable frente a la formación de turbidez entre
polifenoles y proteínas y libre de oxígeno; luego la bebida es transferida y
almacenada a los Tanques de Gobierno, donde se dispone para realizar el envasado
del producto.
II.3.4 Envasado
En el envasado con botellas retornables, son extraídas de las gaveras mediante
la desembaladora, la cual las coloca en la correa transportadora para llevarlas hacia la
lavadora. Al mismo tiempo, ingresan a la línea botellas nuevas, con el fin de sustituir
23
a las que han cumplido su período de vida útil, o que se encuentren rayadas o
deterioradas en su imagen.
En la lavadora, las botellas son tratadas con una solución de hidróxido de
sodio al 3% a más de 80 °C, para lograr un buen lavado interno y desinfección.
Posteriormente, a las botellas se les añade agua debidamente tratada para eliminar
cualquier tipo de impurezas, para luego pasar por el inspector electrónico, el cual
detecta si se encuentran en condiciones adecuadas para ser llenadas. Las botellas en
perfecto estado son enviadas a la llenadora, una especie de carrusel rotatorio que
puede suministra la cerveza en la botella a razón de 1.000 botellas por minuto.
Inmediatamente después de la llenadora se ubica la tapadora, donde se le coloca la
tapa corona herméticamente. [9]
Al culminar el llenado, se inspecciona nuevamente para verificar que cada una
de las botellas presente el nivel de llenado previsto y que esté debidamente tapada; y
que posteriormente siguen hacia la pasteurizadora. Ésta es conformada por duchas de
agua a temperaturas crecientes, donde al comienzo se eleva la temperatura
progresivamente cerca de 70 °C y luego baja de igual forma hasta salir a temperatura
ambiente, con esto se garantiza que el producto está esterilizado, y se asegura su
estabilidad microbiológica. Finalmente teniendo la cerveza envasada y pasteurizada,
se procede al despacho y distribución del producto al público consumidor. En la tabla
N° 7 se expresa las características de una cerveza típica de fermentación baja.
24
Tabla N° 3. Composición de una cerveza de fermentación baja pale-lager (12% extracto original de
mosto)
Extracto original del mosto 12.0 % p/p (125.6g/L)
Límite de Atenuación (aparente) 78 – 85 %
Grado real de atenuación 65 – 80 %
Extracto aparente 1.7 – 3.0 % p/p
Extracto real 2.0 – 3.5 % p/p
Concentración de alcohol 3.5 – 4.5 % p/p
Nitrógeno total 700 – 900 mg/L
Amino-nitrógeno libre 80 – 160mg/L
Sustancias amargas 16– 25 EBC unidades de amargo
Polifenoles totales 130 – 180 mg/L
Antocianidinas 40 – 80 mg/L
pH 4.3 – 4.6
Viscosidad (20 ◦C) 1.4 – 1.7mPa · s
Fuente: Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry. Editorial Wiley VCH. 2005
En vista que este trabajo especial de grado se centra en el estudio del aporte de
metales con poder oxidativo en el proceso de filtración por tierras diatomeas, es
necesario realizar un enfoque más específico en esa etapa, para conocer más
detalladamente el proceso, y también para tener en consideración todas aquellas
variables que condicionan la filtración por tierra de diatomeas.
II.4 Filtración de cerveza por tierra de diatomeas
Una característica importante de la cerveza consumida en Venezuela es su
brillante claridad. Luego del almacenamiento, en donde aparte de la maduración,
también se lleva a cabo la sedimentación de materiales sólidos, la cerveza joven
recién fermentada pasa a ser madurada y lista para filtrar. El propósito de la filtración
es preservar la cerveza de modo que no se produzcan cambios visibles a largo plazo y
mantener su aspecto original. Por lo que la filtración en general debe cumplir dos
funciones, el de eliminar las partículas en suspensión de la cerveza madurada
(Proceso real de filtración); y el de inhibir potenciales formadores de turbidez
(estabilización).
25
Como punto inicial es imperativo estudiar todo lo que abarca el proceso de
filtración como tal; desde los coadyuvantes o medios filtrantes que se utilizan,
equipos industriales empleados y el desarrollo del proceso.
II.4.1 Medios Filtrantes
II.4.1.1 Diatomita
La diatomita también conocida como tierra de diatomeas ó tierra infusoria, es
un tipo de formación rocosa de color pálido, suave, ligero de peso, que se utiliza
como un medio de filtración. Ésta tierra está formada de microfósiles de diatomeas
compuestas principalmente de sílice.
Las diatomeas son plantas unicelulares acuáticas relacionadas con las algas y
se las clasifican como materiales sedimentarios de origen orgánico. Existen diatomeas
en muchos entornos diferentes y son abundantes en las regiones de procedencia
oceánica, entre 12.000 y 16.000 especies de diatomeas viven en agua dulce, salobre o
salada; cada alga tiene internamente un esqueleto silíceo, donde el tamaño promedio
oscila entre los 10 a 150 µm [10], y se van formando por la acumulación sedimentaria
hasta alcanzar un grosor suficiente para tener un potencial comercial. En la Figura N°
7 se observa las características propias de la tierra de diatomeas fosilizadas.
Figura N° 7. Micrografía electrónica de barrido de la tierra infusoria Celite estándar Super-Cel
® NF
(aumento: 500x)
(Fuente: www.avancedminerals.com)
26
Químicamente, la diatomita se compone principalmente de dióxido de silicio
(SiO2.nH2O), y es esencialmente inerte. El dióxido de silicio tiene una estructura
única, que resulta de la forma compleja de los esqueletos de diatomeas y el contenido
de agua combinada químicamente varía del 2 al 10%. Las impurezas que se
encuentran mezclados con la tierra de diatomeas son otros fósiles acuáticos, tales
como residuos de esponja, Radiolario, silicoflagellata, arena, arcilla, ceniza volcánica,
aerosoles minerales, carbonato de calcio, carbonato de magnesio, sales solubles y
materia orgánica.
Clasificación
La diatomita puede ser clasificada según su tratamiento:
Diatomita Calcinada: tratada a temperaturas entre 870 y 1100 ºC, se le aplica el
mismo tratamiento de la diatomita natural, pero con la diferencia que se hace un
ajuste de tamaño de partícula, se calcina el material en polvo en hornos rotatorios,
seguidos de una molienda y clasificación, y se obtiene como resultado un
producto color rosa debido a la oxidación del óxido ferroso.
Diatomita Fundida: el tratamiento aplicado se realiza de igual forma al natural
pero a una temperatura aproximada de 1150ºC con carbonato sódico o cloruro de
sodio, que elimina la coloración rosada por la formación de un complejo de
silicatos de sodio, aluminio y hierro, obteniéndose un producto blanco de buena
calidad, aumentando el tamaño de la partícula y modificando las características de
superficie, consecuentemente se obtiene un material con mayor permeabilidad,
posteriormente es separado según su tamaño
En la Tabla N° 4 se pueden apreciar las diferencias químicas entre las tierras
de diatomeas según el tipo de tratamiento. Y en la Figura N° 8 sus características
generales
27
Tabla N° 4. Análisis químico de las tierras con los diferentes tratamientos
Compuesto (% p/p) Calcinada Fundida
Al2O3 3,54 3,63
Fe2O3 1,45 1,40
CaO 0,69 0,71
Na2O 0,59 3,86
P2O5 0,18 0,17
MgO 0,54 0,60
K2O 0,62 0,62
SiO2 90,80 87,90
TiO2 0,20 0,21
Fuente: Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology. Editorial Wiley VCH. 2005
(a) (b)
Figura N° 8. Diatomita calcinada (a); Diatomita fundida (b)
(Fuente: Elaboración Propia)
II.4.1.2 Perlita
La perlita es un vidrio natural de composición riolítica, de origen volcánico
que suele ser negro o gris, pero a veces rojo pardo. Por lo general se produce por
enfriamiento rápido del derretimiento riolítico (la riolita es el equivalente volcánico
del granito). Al realizar una solución acuosa al 10% p/v posee un valor de pH 7. La
característica particular que distingue a la perlita de las otras rocas volcánicas es que
cuando se calienta hasta un punto adecuado en su intervalo de ablandamiento (800 –
1000 °C) se expande de cuatro a veinte veces su volumen original. Esta expansión es
debida a la presencia de 2 % a 6 % de agua combinada en la roca de perlita en bruto
[29].
28
Figura N° 9. Micrografía electrónica de barrido de la Perlita (aumento: 500x)
(Fuente: www.advancedminerals.com)
Las propiedades más relevantes de la roca, fortalecen su importancia para las
diversas aplicaciones, las más destacadas son su muy baja densidad, baja
conductividad térmica, baja expansión térmica, una buena absorción de sonido,
resistencia a la compresión adecuada a una densidad mayor a 0,1 kg/L [29], y la
resistencia a los ácidos, a la intemperie, y el ataque microbiano.
Tabla N° 5. Análisis químico de la perlita
Compuesto (% p/p)
SiO2 72.0 – 76.0
Al2O3 11.0 – 17.0
K2O 4.0 – 5.0
Na2O 2.9 – 4.0
CaO 0.5 – 2.0
MgO 0.1 – 0.5
Fe2O3 0.5 – 1.5
TiO2 0.03 – 0.2
MnO2 0.03 – 0.1
SO3 0 – 0.2
H2O unida
químicamente 2–7
Fuente: Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry. Editorial Wiley VCH. 2005.
Luego de haber hecho una breve reseña acerca de los medios filtrantes
utilizados para clarificar la cerveza, es importante conocer los equipos utilizados en el
área de filtración y en base a que técnicas se rige sus funcionamientos.
II.4.2 Técnicas de filtración
En general, la filtración por prensa y la filtración superficial son las
principales técnicas utilizadas para la clarificación de la cerveza [12, 44]. La
29
filtración con tierra de diatomeas es del tipo prensa en el que se forma la torta y la
misma retiene los sólidos suspendidos en la cerveza madurada. Puede existir la
posibilidad que los mismos sólidos suspendidos sean un lecho filtrante, pero estos son
finos, suaves y compresibles, por lo que, muestran propiedades desfavorables para la
formación de la torta y por esta razón se utiliza tierra de diatomeas como un
coadyuvante de filtración, que, por una parte, forma una capa permeable para el
filtrado y, por otro lado, funciona como una torta de filtrado.
La relación entre la turbidez de la cerveza y la tierra de diatomeas que se debe
añadir, hace que el uso de la diatomita se vea favorecido. La dosificación se lleva a
cabo, generalmente, según la experiencia práctica del maestro cervecero, sin
embargo, no se puede realizar una elección especifica de tierras en base de criterios
analíticos, esto es debido al hecho que es muy difícil medir la capacidad ideal de
filtrado de la tierra de diatomeas como coadyuvante en el proceso de clarificación.
Actualmente, la técnica más eficiente para filtrar la cerveza es la filtración por
cilindros verticales o “velas”.
Los filtros de velas son elementos tubulares, en su mayoría recubiertos por
capas de un medio filtrante; estos son ampliamente utilizados en la filtración de
suspensiones muy poco concentradas que contienen sólidos en concentraciones de
hasta el rango de ppm (impurezas) [34]. Todos los filtros de vela tienen las ventajas
fundamentales que los elementos de filtro son de construcción relativamente simple y
barata de fabricar, y que los dispositivos se pueden adaptar a los requisitos impuestos
en la eficiencia de separación y la capacidad de rendimiento.
Los elementos están montados ya sea suspendido de una placa en la parte
superior o en posición vertical sobre una placa. La mayoría de los filtros de vela
funcionan como filtros de presión, los elementos se pueden limpiar por lavado a
contracorriente, o pueden ser reemplazables. Algunos de los filtros de elementos
30
múltiples, es decir, múltiples velas, con un diámetro de 20 a 35 mm y son de varias
longitudes hasta un máximo de 2,5 m, el área de superficie del filtro de hasta 180 m2.
Las velas están hechas de un alambre trapezoidal que está soldada en espiral
alrededor de un soporte, estas bobinas de las velas tienen un espacio de 50 a 80 μm.
La ventaja de usar el filtro de vela es que no hay piezas móviles que requieran
manteniendo con relación a las anteriores. En las figuras N° 10a y 10b se aprecian el
esquema del filtro de velas y estructura de la “vela” respectivamente.
(a) (b) Figura N° 10. Filtro de vela – Corte transversal (a); Vela del filtro (b).
(Fuente: Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry 2005 & Google Images)
Los constituyentes de cerveza a ser retirados de la bebida muestran
propiedades muy desfavorables con respecto a los procesos de filtración. Es por ello
que, antes de comenzar la filtración se deben formar capas las cuales vendrían siendo
la torta de filtración, el procedimiento habitual para formar la torta y que en este caso
se denomina “pre-capa” se aplica a la superficie de la vela, seguido de una capa
secundaria, los coadyuvantes de filtración que conforman cada capa están
constituidos principalmente por tierra de diatomeas y perlita.
31
Figura N° 11. Diagrama de Filtración de velas.
(Fuente: Handbook of Brewing. Wiley Library)
La Figura N° 11 esquematiza el proceso de filtración de velas por precapas.
Inicialmente el medio filtrante se dispone en un reservorio denominado Tanque KG
suspendido en agua a un porcentaje en peso especificado, que luego es enviado al
tanque dosificador de tierra,; cuando las “velas” del filtro se encuentran libre de
impurezas se procede a formar la primera pre-capa haciéndola fluir a través del
equipo, por lo general se dosifica una mezcla de perlita con tierra diatomea debido a
que el primer medio posee una característica física de pequeñas hojas por lo que
brinda uniformidad a la primera capa de la torta. Posteriormente se realiza una
segunda mezcla en el tanque dosificador para formar la segunda precapa la cual está
constituida solo de diatomita. Para compactar la torta, se procede a recircular la
mezcla de tierra en el mismo filtro por un tiempo determinado hasta que se aprecie
una torta bien formada, esto último es clave para el proceso de clarificación de
cerveza ya que define el rendimiento del filtrado.
Luego de haber formado las precapas en las velas del filtro, se procede a
realizar la clarificación de la cerveza, conforme se vaya filtrando la bebida se va
dosificando mezcla de tierra infusoria con el propósito de filtrar un mayor volumen
de cerveza, debido a que se reemplaza aquella tierra cuyos poros fueron llenados de la
turbidez de la cerveza y también para evitar que se pierda la estructura lograda de la
torta debido al alto caudal de cerveza sin filtrar y hacer que la clarificación sea
32
óptima. Por último se obtiene la cerveza filtrada que es enviada a los Tanques de
Gobierno lista para ser envasada.
Así como en otros productos alimenticios, en la cerveza es de gran importancia
asegurar que sus características iniciales (cuerpo, amargo, aroma, claridad) se
preserven durante el tiempo, por lo que, es de gran importancia para cada cervecería
que su producto tenga una estabilidad de sabor tal que permita que su frescura se
mantenga el mayor tiempo posible.
II.5 Estabilidad del sabor de la cerveza durante su almacenamiento
La vida útil de cerveza se determina principalmente por su estabilidad a nivel
microbiológico, coloidal (turbidez), de espuma, de color y del sabor. En el pasado, la
aparición de turbidez y el crecimiento de microorganismos que deterioran la cerveza
fueron considerados como los principales fenómenos que causaban problemas en la
industria. Actualmente con el progreso en el campo de la química y la tecnología
cervecera, estos problemas están en gran parte bajo un buen control.
Entre diversos factores que generan la pérdida de la frescura de la cerveza,
una de los más importantes, y que, es objeto de esta investigación es el deterioro a
nivel oxidativo. El oxígeno, en particular, provoca un rápido deterioro de sabor de la
cerveza, lo que significa que este debe iniciar algunas reacciones muy importantes de
envejecimiento, en donde pueden formarse carbonilos por las reacciones con los
radicales libres.
En base a investigaciones pasadas, las reacciones oxidativas en la cerveza son
catalizadas cuando hay presencia de metales pesados en el medio [27, 41, 46], lo que
conduce a un deterioro más acelerado. Las primeras investigaciones sobre este efecto
las realizo H. J. Fenton en el año 1894, a partir de ahí se ha sabido que los iones de
hierro pueden promover reacciones oxidativas con efecto catalítico. En 1934, F.
33
Haber y J. Weiss encontraron la prueba final para la formación de radicales en
soluciones acuosas de hierro bivalente y los iones de cobre junto con peróxido de
hidrógeno y describen el carácter fuertemente oxidante de estos radicales.
Ecuación N° 2: Reacción de Fenton
Ecuación N° 3: Reacción de Haber-Weiss
En la reacción de Fenton (Ecuación N°2), los iones de hierro (II) se oxidan a
hierro (III) por el peróxido de hidrógeno, también ocurre la formación de un radical
hidroxilo y un ión hidroxilo. El hierro (III) eventualmente reacciona con una
molécula adicional de peróxido de hidrógeno generar dos protones y un radical
superóxido. Este radical superóxido reacciona con un ion cobre (II) y origina un ion
de cobre (I) y oxígeno molecular en el esquema de Haber-Weiss (Ecuación N° 3). El
cobre (I) creado es capaz de dividir una molécula de peróxido de hidrógeno en un ión
hidroxilo y un radical hidroxilo. Los radicales formados en las reacciones de Fenton y
Haber-Weiss son extremadamente reactivos y pueden dar lugar a reacciones en
cadena que generan grandes cantidades de radicales.
En general, las especies reactivas de oxígeno (O2-
, ·OOH, H2O2 y ·OH)
reaccionan con todas las clases de moléculas orgánicas en la cerveza, tales como
polifenoles, isohumulonas y alcoholes, lo que resulta en diversos cambios en el perfil
sensorial de la cerveza., esto se atribuye principalmente a la aparición de diversos
compuestos carbonilos, donde el más importante y que ha sido objeto de numerosos
34
estudios es el trans-2-nonenal [4-6], el principal problema de este aldehído es que a
concentraciones muy bajas (en el orden de ppb), se hace notar su presencia en la
bebida, su influencia negativa en el gusto no es generalmente aceptada, ya que este
aldehído da un sabor desagradable a la cerveza. Sin embargo, este como otros
aldehídos que se originan, son de gran uso analítico para realizar el seguimiento de
reacciones que ocurren durante el envejecimiento de la cerveza. El valor de umbral
del trans-2-nonenal es de 0,1 μg/L y cuando está presente en la cerveza, otorga un
sabor de papel cartón.
Una de las formas más eficientes de reducir el impacto del deterioro oxidativo
en la cerveza, es teniendo presente compuestos antioxidantes que inhiban la
generación de radicales libres. En la cerveza existen un gran número de estos
compuestos, entre los cuales podemos resaltar por el grado de relevancia al dióxido
de azufre y a los polifenoles provenientes del lúpulo.
II.6 Técnicas analíticas y descriptoras
En base a los antecedentes en los cuales se basa esta investigación aplicada,
que de una forma u otra investigan las causas y consecuencias de las reacciones
ocurridas en la cerveza a nivel de deterioro oxidativo; es posible conocer qué tipo de
técnicas analíticas, así como también las descriptoras, fueron útiles para lograr los
diversos estudios y que serán las herramientas con las que se logrará cumplir cada
uno de los objetivos específicos y al final el objetivo general del proyecto, que es el
de mejorar la estabilidad del sabor de la cerveza por el control de migración de
metales en la filtración por tierras de diatomeas.
II.6.1 Espectrofotometría
En la espectrofotometría o espectroscopia de absorción de ultravioleta visible,
la muestra absorbe radiación electromagnética de una fuente, la cantidad absorbida va
35
relacionada con la concentración de la sustancia que se desea analizar en disolución.
En este tipo de espectroscopia se suele hablar de longitudes de onda, en el orden de
200 a 700 nm. Donde de 200 a 400 es la región ultravioleta y de 400 a 700 es la
región visible. Esta técnica es la más utilizada por su sencillez instrumental y sus
diversas aplicaciones en distintos campos de investigación.
La técnica se basa en la medida de la transmitancia T o de la absorbancia A de
disoluciones que se encuentran en celdas transparentes que tienen un camino óptico
de b cm. Normalmente, la concentración c de un analito absorbente está relacionada
linealmente con la absorbancia como representa la siguiente ecuación, la cual es la
expresión matemática de la ley de Beer-Lambert:
Ecuación N° 4: Ecuación matemática de la ley de Beer-Lambert
En la Tabla N° 6 se encuentran definidas todas las variables de la Ecuación N° 4:
Tabla N° 6. Términos y símbolos importantes utilizados en la medición de la absorción
Término y Símbolo Definición Nombre y símbolo alternativo
P0, P
Haz que incide sobre la
muestra; Haz que emerge al
pasar la muestra
-
Absorbancia A
Densidad óptica D; extinción E
Transmitancia T
Transmisión T
Camino óptico de la radiación b - l, d
Absortividad a
Coeficiente de extinción k
Absortividad molar ε
Coeficiente de extinción molar
Fuente: Principios de Análisis Instrumental. 5ª Ed. McGraw-Hill. 2001.
La relación entre la concentración de una solución y su transmitancia es
inversa y logarítmica, mientras que la relación entre la absorbancia y la concentración
es directamente proporcional. Si la sustancia transmite toda la radiación, P = Po y por
lo tanto la transmitancia es igual a 1, el %T es igual a 100 y la absorbancia es igual a
36
0. Si la sustancia absorbe toda la radiación que le llega I = 0 y por tanto la
transmitancia es igual a 0, el %T es igual a 0 y la absorbancia es igual a infinito.
En el campo de la industria cervecera, este método es el más utilizado al
momento de analizar rápidamente concentraciones de analitos que están presentes en
la bebida; para éste proyecto al utilizar la técnica y con ayuda de un blanco
característico, es posible cuantificar la cantidad de compuesto tales como dióxido de
azufre y de hierro soluble en las muestras.
II.6.2 Colorimetría
Ésta técnica es un método espectrométrico que permite obtener valores
numéricos para evaluar el color mediante la determinación del índice de color (IC), el
cual puede utilizarse como variable de control de la calidad organoléptica de los
alimentos, debido a sus características de variación. Se puede determinar el color
estudiando el espectro de reflexión de muestras solidas u opacas, o bien midiendo la
transmisión de muestras traslucidas. El equipo empleado en este caso es el
espectrofotómetro, el cual analiza el color midiendo su color complementario; por
ejemplo una solución de color amarillo absorbe luz en el rango del color azul, en la
siguiente figura se puede apreciar el color complementario para cada color absorbido.
Tabla N° 7. Espectro visible y colores complementarios Longitud de onda, nm Color Complementario
400-435 Violeta Amarillo-verde
435-480 Azul Amarillo
480-490 Verde-azul Anaranjado
490-500 Azul-verde Rojo
500-560 Verde Púrpura
560-580 Amarillo-verde Violeta
580-595 Amarillo Azul
595-610 Anaranjado Verde-azul
610-750 Rojo Azul-verde
Fuente: Guía de laboratorio de química analítica instrumental. Facultad de Ingeniería – UCV. 2011.
37
La aplicación de esta técnica en la industria cervecera, consiste en una
alternativa para medir la calidad de sus productos. Desde finales del siglo XIX se han
diseñado diferentes sistemas de medición de color en la cerveza, la European
Brewery Convention (EBC) propuso un sistema de medición de color, que, a partir de
1991 se convirtió en un método estándar, cuyos parámetros para realizar las
mediciones son que la longitud de onda debe ser de 430 nm y una cubeta de medición
de 1 cm. Recientes estudios corroboran que el color propuesto por la EBC no
representa un indicador referente al envejecimiento o deterioro de la cerveza, sin
embargo el color azul que está en el espacio de color RGB (Rojo-Verde-Azul), si se
considera un buen indicador ya que la cerveza tiene un color característico amarillo
(complementario del azul) y también se determinó que este análisis posee una mayor
sensibilidad de 5 veces con respecto a la medición de color propuesto por la EBC
[31].
II.6.3 Espectroscopia de emisión atómica con plasma de acoplamiento inductivo
Experimentalmente ésta técnica se basa en la introducción de la muestra a
analizar en forma líquida hacia un plasma de argón creado mediante un generador de
radiofrecuencia. La energía del plasma permite la excitación de los electrones de
todos los elementos constituyentes de la muestra. Tras decaer a su estado
fundamental, la energía adicional que poseen los electrones en estado excitado es
emitida en forma de radiación electromagnética en la zona ultravioleta/visible del
espectro. Las longitudes de onda de esta radiación son características del elemento
cuyos electrones han sido excitados, produciéndose el denominado espectro de
emisión. Además la intensidad de estas radiaciones es directamente proporcional a la
concentración del elemento en la muestra, por lo que su medida permite la
determinación cuantitativa de la cantidad de elemento. Entre las ventajas más
importantes que se puede resaltar es que presentan una excelente sensibilidad en el
ensayo (medidos en ppb) y la rapidez de análisis es bastante conveniente. A
continuación en la Tabla N° 8 se expresan los límites de detección de cromo, cobre,
38
hierro y manganeso en el equipo:
Tabla N° 8. Límites de detección de análisis en el equipo de espectroscopia de emisión atómica con
fuente de plasma (ICP-AES)
Elemento Longitud de onda (λ) Límite de Detección (ppb)
Cromo 267,716 3,0
Cobre 324,750 1,5
Hierro 259,940 1,1
Manganeso 257,610 0,3
Fuente: Guía de usuario de equipo Varian Liberty RL Sequential ICP-AES
El propósito de utilizar esta técnica es muy importante ya que se analizarán
todos los metales con poder oxidativo propuestos en este trabajo (cromo, cobre,
hierro y manganeso) disueltos en la cerveza, en vista que éstos catalizan las
reacciones oxidativas ocurridas entre los radicales libres presentes y los compuestos
que caracterizan a la bebida (sabor, aroma, amargo y cuerpo) [46], ocasionando que
la bebida envejezca y surjan compuestos no deseados.
II.6.4 Quimioluminiscencia
La quimioluminiscencia se produce cuando una reacción química genera una
especie electrónicamente excitada, que emite luz cuando vuelve al estado
fundamental o que transfiere su energía a otra especie que, posteriormente, da lugar a
una emisión [36]. En varios sistemas biológicos se producen reacciones
quimioluminiscentes, en estos casos, el proceso se suele denominar bioluminiscencia.
Hace más de un siglo se descubrió que ciertos compuestos orgánicos relativamente
sencillos también eran capaces de presentas quimioluminiscencia. El tipo de reacción
más sencilla de dichos compuestos para producir quimioluminiscencia se puede
formular como:
(Energía en forma de luz)
Ecuación N° 5: Reacción quimioluminiscente
39
C* representa a la especie C en el estado excitado. Aquí, el espectro de
luminiscencia es el del producto de reacción C. La mayoría de las reacciones
quimioluminiscentes son considerablemente más complicadas de los que sugieren las
reacciones anteriores.
En la cerveza, cuando la concentración de antioxidantes se ha agotado, los
compuestos característicos quedan expuestos a los radicales libres, y que las
reacciones oxidativas que se inician cumplen en líneas generales el comportamiento
de las reacciones anteriores (Ver Ecuación N° 5); donde se forman otros compuestos
tales como aldehídos, cetonas y alcoholes, que se consideran no deseados en la
bebida, en un primer momento se encuentran en el estado excitado y que cuando se
estabilizan libera la energía, la cual la percibe el detector del equipo en forma de luz.
[19]
El objetivo de esta técnica es emplearla como un indicador del deterioro de la
cerveza, y que se ha observado en análisis anteriores que es posible realizar la
relación de los valores analíticos emitidos por este equipo con parámetros obtenidos
con los otros tipos de análisis mencionados anteriormente. [31]
II.6.5 Resonancia Spin Electrónico
Este tipo de espectroscopia es muy similar a la resonancia magnética nuclear
(RMN), la única diferencia es que mide electrones libres desapareados. La muestra se
coloca en un campo magnético y se somete a una frecuencia fija de radiación por
microondas. Los electrones libres tienen su propio campo magnético que se orientará
principalmente de forma paralela al campo magnético producido por el
espectrómetro.
Como es sabido los aromas y sabores característicos en el envejecimiento de
la cerveza son causados por los productos de las reacciones de radicales libres. En la
40
cerveza las especies que contienen electrones desapareados por lo general son los
radicales libres que están presentes en ella. Ya que el fundamento de esta técnica es
analizar la presencia de estas especies reactivas, y que, su tiempo de estabilidad es
muy corto, es necesaria la adición de un agente que capture los radicales libres y
forme un aducto, que sigue siendo un radical libre pero más estable y con un tiempo
de estabilidad tal que permita el estudio de su presencia en la cerveza. La reacción
que describe la formación del aducto es la siguiente:
Ecuación N° 6: Reacción entre agente secuestrante de radicales libres.
Dónde:
ST: Agente secuestrante de radicales libres
·OH: Radical libre hidroxilo
ST – OH·: Aducto, radical libre más estable detectado por el espectrómetro
En los últimos años, se ha vinculado esta técnica con el proceso de
envejecimiento de cerveza, así como en la variación de diversos compuestos e
indicadores, donde valores como el de dióxido de azufre, cantidad de compuestos
característicos de la cerveza y presencia de radicales libres tienen resultados en la
medición realizada por el espectrómetro de resonancia spin electrónico. [1, 13, 30, 32,
38-41, 45]
II.6.6 Evaluación sensorial
Un análisis sensorial profesional contribuye directa e indirectamente a la
calidad del producto, el éxito de la marca, la lealtad de los consumidores y en última
instancia, la rentabilidad de la empresa. Al planificar la evaluación sensorial en una
cervecería, es importante entender que las pruebas sensoriales de expertos y pruebas
de consumo no son lo mismo. El consumidor proporciona respuestas a las variables, y
41
proporciona información sobre las preferencias y la intención de compra, por el
contrario los expertos de la evaluación sensorial proporcionan información sobre las
diferencias en el sabor de la cerveza, los tipos y magnitudes de los atributos de sabor,
y las relaciones entre variables.
El deterioro o pérdida de la calidad se evidencia por la aparición de off-flavors
(sabores no deseados) como dulce, papel y cartón, pan, caramelo, MFDS, rancio,
metálico, grama recién cortada, acidoso, madera y vino-sherry; cada uno de los cuales
representa una etapa de envejecimiento u oxidación de la cerveza.
Figura N° 12. Representación de los cambios sensoriales en el aroma de la cerveza durante su
almacenamiento
(Fuente: Gerencia de Nutrición y Sensorial, Centro Tecnológico Polar)
La estabilidad organoléptica es la capacidad que tiene el producto envasado de
mantener las características de cerveza fresca durante un tiempo y a una temperatura
de almacenamiento determinada que, en este caso, es 16 semanas y 28ºC
respectivamente. Así, con el presente método se evaluará la estabilidad organoléptica
de la cerveza en períodos de 4 semanas hasta alcanzar la semana 16, comparando en
cada caso la muestra evaluada con una muestra de referencia de la misma producción
que fue almacenada durante el mismo período de tiempo a una temperatura de 5ºC
(temperatura a la cual se acepta que no existen cambios significativos en la calidad
organoléptica de la cerveza durante las 16 semanas de la evaluación).
42
Las características a evaluar en estos análisis de cerveza se basan en los
siguientes patrones: aroma, sabor, cuerpo, calidad e intensidad de amargor.
43
CAPITULO III
MARCO METODOLÓGICO
Universo
El universo definido para este proyecto por el número total de cervezas de la
marca registrada Polar ICE®
envasadas en botellas de vidrio retornables de 222 ml,
producidas en Cervecería Polar, Planta los Cortijos; a partir de ahí se obtendrán dos
poblaciones, la primera está conformada por aquellas cervezas elaboradas con el
proceso actual de filtración, y la segunda es conformada por aquellas cervezas
elaboradas con la implementación del tratamiento ácido a la tierra de diatomeas en la
filtración de cerveza madurada. Para ambas poblaciones se tomaran lotes en
específico, los cual estarán diferenciados básicamente por la fecha y hora de
producción, es necesario que las dos poblaciones sean tomadas al menos la misma
semana de producción ya que se deberá realizar un seguimiento comparativo entre
ellas a lo largo de las semanas en almacenamiento en intervalos de tiempos en
específicos (0, 4, 8, 12 y 16 semanas).
Muestra
La toma de muestras se lleva a cabo bajo las condiciones ambientales de
temperatura y humedad relativa que prevalezcan en el punto de toma de muestra. Se
debe tomar en consideración que para el muestreo hay normativas tales como:
Riesgos: Cortaduras por ruptura del material de vidrio, caídas y quemaduras por
inadecuada manipulación de productos químicos.
Medidas de seguridad: maneje apropiadamente: muestras, equipos y materiales
utilizados en el ensayo.
Implementos de seguridad: se debe utilizar guantes, botas de seguridad,
tapaboca si se trata de una muestra sólida en polvo (tierra diatomea), lentes de
44
seguridad (si se trata de productos químicos o muestreos en área de Envasado) y
tapa oídos (en el área de Envasado).
Muestras de tierra de diatomeas y perlita
Para el análisis de la tierra de diatomeas, los materiales requeridos son
envases plásticos o de vidrio con tapa, tapabocas, cinta adhesiva o tirro, tijeras o
navaja y espátula. El número de sacos a muestrear de cada tierra se realizará de
acuerdo a la siguiente fórmula:
√ = 10
Muestras del proceso de filtración
Para la toma de muestras en el proceso de filtración se deben tener en
consideración cuales elementos son los que conforman esta etapa de elaboración de
cerveza, tales como: agua del proceso, cerveza madurada, mezcla de tierra y cerveza
filtrada.
Mezcla de tierra de diatomeas: En el caso de la toma de muestra de tierra se
realizara directamente los equipos con ayuda de un recipiente, las muestras están
distribuidas de la siguiente manera:
Mezcla de tierra de diatomeas para formar la primera precapa, tomada en el
tanque de dosificación (Dosimat).
Agua de recirculación obtenida por la formación de la primera precapa,
tomada a la salida del filtro.
Mezcla de tierra para formar la segunda precapa, tomada en el tanque de
dosificación (Dosimat).
45
Agua de recirculación obtenida por la formación de la primera precapa,
tomada a la salida del filtro.
Agua de Proceso: se tomaran 2 muestras directamente de la entrada al tanque de
mezcla de tierra de diatomeas al 20 % (original y replica).
Cerveza madurada: se tomaran 2 muestras del tanque de dosificación de cerveza
(original y replica).
Cerveza filtrada: se realizara el muestreo a partir del inicio de la filtración, hasta
haber filtrado 500 hL de cerveza; los intervalos serán cada 50 hL.
Muestras requeridas provenientes de Cervecería Polar, Planta Los Cortijos
Es importante mencionar que estas muestras son probabilísticas, es decir, que
cada uno de los elementos que conforman las diferentes poblaciones tiene la misma
oportunidad de ser seleccionados para el análisis.
Para la realización de esta parte del proyecto se seleccionaron 144 muestras de
cervezas Polar ICE®
envasadas aplicando el proceso de filtración propuesto con
lavado ácido, y 144 muestras de cervezas Polar ICE®
envasadas aplicando el proceso
de filtración actual. Por motivos de practicidad en el trabajo especial de grado, se
denominaran de ahora en adelante las muestras de cervezas elaboradas con el proceso
de filtración propuesto como “Pruebas”, y a las muestras elaboradas con el proceso
actual de filtrado como “Comparación”.
Tanto en las cervezas prueba como en la comparación, se escogerán
aleatoriamente y se distribuirán de la siguiente manera:
Cervezas para el estudio del efecto de la adición de 1,1-difenil-2-picrylhidrazil en
el análisis de deterioro oxidativo por quimioluminiscencia.
46
Cervezas pruebas y comparación para la determinación y normalización de
valores de concentración de dióxido de azufre y color azul, 6 de ellas serán
analizadas por quimioluminiscencia.
Cervezas pruebas y comparación para evaluación sensorial.
Cervezas pruebas y comparación para la determinación y normalización de
valores de concentración de cromo, cobre, hierro y manganeso.
El excedente en cada población, está destinado en caso de réplicas.
Variables
De manera organizar las variables de la investigación, se separaran las
variables por objetivos, tal como se describe a continuación:
1. Verificar el efecto de la adición del 1,1-difenil-2-picrylhydrazyl (DPPH) en el
ensayo de deterioro oxidativo de la cerveza por quimioluminiscencia.
a. Concentración del compuesto en la muestra.
b. Tiempo de ensayo.
c. Intensidad de quimioluminiscencia.
d. Tiempo de aparición del segundo pico.
e. Concentración de SO2.
2. Optimizar el pH y tiempo del lavado ácido para la máxima extracción de
metales con poder oxidante de la tierra de diatomeas usada en la preparación
de las dos precapas en filtración.
a. pH inicial de cada tipo de tierra.
b. pH de lavado de tierra.
c. Cantidad de H2SO4 dosificado.
d. Tiempo de contacto del lavado.
e. Cantidad de hierro extraído de la tierra.
47
3. Comparar concentración de metales cromo, cobre, hierro y manganeso en la
cerveza clarificada tanto en la filtración actual y la propuesta.
a. Volumen filtrado.
b. pH de la cerveza.
c. Concentración de metales presentes.
4. Determinar analíticamente el potencial de envejecimiento en la cerveza
embotellada en ambos procesos de filtración.
a. Tiempo (semanas de evaluación).
b. Temperatura (5 °C y 28 °C).
c. Concentración de SO2.
d. Concentración de O2.
e. Concentración de cromo, cobre, hierro y manganeso.
f. Color azul del espacio de color Rojo-Verde-Azul.
g. Quimioluminiscencia (intensidad y tiempo de aparición del segundo
pico).
5. Correlacionar el grado de envejecimiento de la cerveza obtenido con la
evaluación sensorial en producto terminado de ambas filtraciones a las 0, 4, 8, 12
y 16 semanas de almacenamiento.
a. Indicadores analíticos del objetivo 4.
b. Tiempo (semanas de evaluación).
c. Temperatura (5 °C y 28 °C).
d. Valoración cuantitativa emitida por panel sensorial.
Métodos e instrumentos de recolección de datos
En vista que el proyecto gira en torno del envejecimiento de la bebida, es de
gran utilidad definir que variables e indicadores serán de ayuda para estudiar analítica
y sensorialmente este fenómeno en ambos procesos de filtración. Entre las variables e
indicadores analíticos que se utilizan están: concentraciones de SO2, O2, cromo,
48
cobre, hierro y manganeso; el color azul; la quimioluminiscencia; y el valor de
potencial antioxidante en resonancia spin electrónico.
Por otro lado, se tienen aquellos indicadores descriptores específicos de
envejecimiento obtenidos en la evaluación sensorial que son: dulce, papel-cartón,
pan, caramelo, MFDS (metil furfuril disulfuro), rancio, metálico, grama recién
cortada, acidoso, madera y vino-sherry; y que se encuentran simultáneamente con los
atributos característicos que se evalúan en el panel los cuales son: aroma, sabor,
cuerpo, calidad e intensidad de amargor.
El estudio realizado en esta investigación considera la variable “tiempo”, es
necesario que los datos recolectados se clasifiquen por tiempo y temperatura de
almacenamiento. A continuación se indican cómo serán captadas las variables
analíticas y descriptoras a través de los intervalos de tiempo especificados tal y como
se muestra en la Tabla N° 9:
Tabla N° 9. Intervalos de análisis y descripción de condiciones
Intervalo de tiempo Descripción de la muestra
Semana 0 Cerveza prueba y comparación almacenadas a 5 °C y a 28 °C
Semana 4 Cerveza prueba y comparación almacenadas a 28 °C
Semana 8 Cerveza prueba y comparación almacenadas a 28 °C
Semana 12 Cerveza prueba y comparación almacenadas a 28 °C
Semana 16 Cerveza prueba y comparación almacenadas a 28 °C
Al obtener los resultados de las numerosas pruebas tanto analíticas como
descriptoras, se emplean cálculos tipo que serán de utilidad para dar un razonamiento
lógico y matemático al momento de discutir los fenómenos que ocurrieron en cada
uno de los objetivos del proyecto.
49
Técnicas de procesamiento y análisis de datos
Es necesario desarrollar un conjunto de procedimientos para tomar muestras;
determinar cada una de las variables tanto analíticas como descriptoras; y de cómo se
van a llevar a cabo los objetivos que conforman esta investigación.
Muestreo
Se requiere coordinar en la Planta de Producción la toma de muestras de
cerveza antes y después del proceso de filtración actual, así como también las
diferentes muestras de tierras diatomeas; y posteriormente de hacer la filtración
propuesta y el muestreo de cerveza filtrada. Para ello se debe establecer las
instrucciones para la toma de muestras destinadas a análisis de laboratorio del área de
fisicoquímica a fin de garantizar la obtención de resultados confiables y
reproducibles.
Tierra de diatomeas y perlita.
1. Muestrear el número de sacos calculado tratando se abarcar la mayor cantidad de
paletas del lote.
2. Abrir con una navaja o tijera un orificio lo suficientemente ancho para introducir
la espátula.
3. Cerrar el orificio del saco colocando dos trozos de cinta adhesiva o tirro.
4. Repetir los pasos del 3 al 5 y colocar todas las muestras de los sacos en el mismo
envase, hasta completar el número de sacos a muestrear por lote.
5. Mezclar bien la muestra compuesta, cerrar el envase y trasladarla al laboratorio.
Mezcla de Precapas y Agua de recirculación
1. Una vez que se traslade el volumen necesario de suspensión de tierras al tanque
de precapas, abrir el visor y tomar muestra de la mezcla
2. Almacenar la muestra para el análisis de laboratorio
50
3. Una vez que haya culminado la adhesión de la mezcla de tierra en las velas del
filtro, tomar muestra del agua de recirculación a la salida del filtro en un
recipiente.
4. Almacenar la muestra para el análisis de laboratorio.
Cerveza madurada y cerveza filtrada
Al momento de tomar muestras de cerveza madurada y filtrada, se deben
utilizar botellas de plástico o de vidrio con tapa con capacidad mínima de 500 mL y
un serpentín en buenas condiciones.
1. Colocar el serpentín y purgar hasta que la muestra salga sin espuma.
2. Curar la botella al menos dos (2) veces para garantizar que el muestreo se realice
de manera efectiva.
3. Tomar 500 ml de muestra en la botella.
4. Una vez tomada la muestra, quitar el serpentín del toma muestra.
5. Lavar él toma muestra con agua destilada y luego con una solución de oxonia al
3%.
6. Una vez tomadas las muestras, lavar el serpentín con abundante agua para
garantizar la limpieza del mismo.
7. Trasladar la muestra al laboratorio para su análisis.
Cerveza elaborada.
Este tipo de muestreo debe ser probabilístico, es decir, cada una de las
muestras es extraída de manera aleatoria. Las muestras son tomadas luego del
pausterizado del producto ya que a partir de ahí es apta para el consumo. Las
condiciones necesarias para el análisis de laboratorio es que se deben almacenar a 0
°C para mantener las cervezas frescas y evitar un posible deterioro no deseado.
51
Medición de extracto y porcentaje de alcohol en cerveza
La medición de esta variable es importante, ya que al determinar el extracto
que significa la cantidad de compuestos que están presentes la cerveza y que
caracterizan su sabor, el mismo debe ser constante para todas las muestras puesto que
este valor surge a partir de la elaboración del mosto. Por otro lado, el porcentaje de
alcohol también debe ser constante en todas las muestras ya que las condiciones y
tiempo de fermentación debe ser el mismo para todas las cervezas. En el caso que la
cerveza posea valores diferentes estadísticamente de extracto y alcohol, en
comparación con el resto de las muestras se descarta.
Actualmente existen métodos para la medición de extracto y porcentaje de
alcohol, sin embargo, se dispone de un equipo Anton Paar® Alcolyzer Plus que
analiza ambas variables con gran facilidad. Para llevar a cabo la medición, se debe
añadir 50 ml de cerveza en una fiola de 100 ml y descarbonatar durante 5 minutos
con ayuda de un baño ultrasónico. Trasladar la cerveza descarbonatada a un vial y
colocar en el portamuestras del equipo y pulsar el botón Start. Posteriormente tomar
nota de las variables reportadas.
Determinación de dióxido de azufre en cerveza
La presencia del dióxido de azufre es uno de los factores clave en el
envejecimiento de cerveza por su papel antioxidante en la bebida. El método se basa
en una destilación del SO2 gaseoso, liberado en medio ácido (HCl 2N), arrastrándolo,
mediante una corriente de nitrógeno hacia una trampa para gases, donde entra en
contacto con una solución buffer a pH 8 del reactivo 5,5 Ditiobis (2-Nitro-ácido
benzoico) o reactivo de Ellman's (DTNB), para formar sucesivamente un compuesto
altamente coloreado llamado ácido 5-Mercapto-2-Nitrobenzoico, el cual posee un
máximo de absorbancia a 412 nm.
52
Figura N° 13. Equipo de destilación
(Fuente: Cervecería Polar C.A.)
Para la captura de dióxido de azufre de la muestra, añadir 50 ml de la solución
de reactivo DTNB en el tubo recolector de muestra; luego adicionar 50 ml de HCl 2N
junto con 50 ml la muestra de cerveza almacenada a 0 °C en el balón de dos bocas;
colocar un tapón para que no haya salida de gases y el dióxido de azufre fluya hacia
la trampa y finalmente se pone en calentamiento el balón de dos bocas para dar lugar
a la reacción, es necesario hacer pasar agua fría como refrigerante preferiblemente a 5
°C para que condense el SO2 en la trampa. El arrastre de dióxido de azufre dura 30
minutos. La solución final posee un color amarillo intenso y esto se debe a la
formación del complejo entre el reactivo “trampa” y el SO2 proveniente de la muestra
de cerveza tal y como lo indica la Figura N° 13, luego esta solución es medida en el
espectrofotómetro Agilent® 8453 a una longitud de onda 412 nm con ayuda del
software Agilent ChemStation; para determinar la concentración de SO2 en la
muestra.
Determinación de oxígeno en cerveza.
El contenido de oxígeno (O2) es una de las variables más importantes de
controlar durante el proceso de envasado de la cerveza, ya que el mismo deteriora el
producto, siendo la principal influencia en la estabilidad de sabor del producto. El
método de ensayo se basa en la determinación del oxígeno disuelto en la cerveza
53
equilibrada. Luego de perforar la tapa de la cerveza se hace pasar CO2 para hacerla
fluir del tomamuestra del equipo hasta que se llene la cámara de líquido y esperar que
salga del equipo sin burbujas ni espuma. En caso de que se observen burbujas o
espuma se debe modificar el flujo en la válvula del equipo y del tomamuestras hasta
que éstas desaparezcan. Luego se debe esperar a que las lecturas de temperatura y de
oxígeno sean estables. Tomar nota del resultado obtenido en el registro
correspondiente.
Determinación de color azul en cerveza.
Por la teoría de colorimetría se sabe que la cerveza de color característico
amarillo, absorbe la longitud de onda de su color complementario que es el azul. La
medición de este color está calificada como una herramienta con la que se puede
estudiar la estabilidad del sabor de la bebida. Para llevar a cabo este análisis se debe
descarbonatar la muestra durante 5 minutos con ayuda del baño ultrasonido, durante
este tiempo realizar la medición del blanco que en este caso es agua destilada
empleando el método de medición de color rojo-verde-azul en el software Agilent
ChemStation del espectrofotómetro Agilent®
8453. Cuando la cerveza esté
descarbonatada realizar la determinación de color azul y anotar el valor emitido.
Determinación de hierro por espectrofotometría
La determinación del contenido de hierro se efectúa mediante método
colorimétrico (Fe-AN), utilizando como acomplejante la sal sódica del ácido 3-(2-
piridil)-5,6-bis(4-fenilsulfónico)-1,2,4-triacina, el límite de detección de este método
es 0,01 mg/L con una absorción máxima a una longitud de onda máxima de 565 nm.
El tioglicolato amónico incorporado en este reactivo, mineraliza complejos de hierro
y reduce el hierro (III); y al mismo tiempo actúa como buffer de pH.
Este método es utilizado para la determinación de hierro en cerveza, materias
primas y materias auxiliares como tierra de diatomea o estabilizante de espuma, así
54
como en las instalaciones, tuberías o latas que puedan aportar hierro al producto, lo
cual tiene efectos negativos sobre el sabor y su estabilidad coloidal.
Para el caso de cerveza, se debe atemperar a 20 °C y luego descarbonatar
durante 5 minutos; trasvasar con una pipeta graduada dos alícuotas de 10 mL de la
muestra descarbonatada en dos tubo de ensayo (muestra y blanco), luego añadir 4
gotas de reactivo acomplejante solo a la muestra, y agitar en vortex, se debe esperar
de 3 a 5 min. Luego se procede a medir el color, utilizando el blanco de cerveza.
Para el caso de la tierra de diatomeas, se debe preparar 250 ml de una
solución buffer de ftalato ácido de potasio al 1% p/v, para luego pesar 5.00 ± 0.01g de
muestra de tierra en una fiola de 500 ml, luego agregar 200 ml de la solución de
ftalato ácido de potasio y mantener en agitación por 2 horas a una temperatura de 20
°C. Una vez finalizado el tiempo, centrifugar 50 ml de la muestra, en un tubo de
centrifuga a 3000 rpm, durante 10 minutos. Luego de la centrifugación, se toma con
una jeringa el sobrenadante, y filtrar con una membrana de disco de 0.45µm, 10 mL
de la solución sobre un tubo de ensayo libre de hierro, se dosifican 4 gotas del
reactivo acomplejante, se agita con un vortex y esperar 10 minutos para que el color
se desarrolle, debe generarse una coloración violeta (en caso de presencia de hierro).
Con el espectrofotómetro UV-visible Agilent® 8453 cuantificar la concentración de
hierro en la muestra, y se cuantifica la concentración de hierro en la tierra con la
siguiente fórmula:
Dónde:
Hierro: Concentración de hierro en mg/kg de tierra de diatomeas.
C: Concentración de hierro calculado a partir de la curva de calibración o la emitida
por el equipo en mg/L.
VT: volumen de aforo de la solución (0,2 L)
55
Pmuestra: Peso de la muestra, en Kg.
Determinación de metales por espectroscopia de emisión atómica
La aplicación de esta técnica es fundamental para este proyecto ya que se debe
analizar el contenido de cromo, cobre, hierro y manganeso que aceleran el deterioro
oxidativo de la cerveza. El tratamiento previo de las muestras es similar al método
explicado en la sección III.7.6 “Determinación de hierro por espectrofotometría”, la
única diferencia es que no hay necesidad de aplicar un acomplejante colorimétrico, ya
que el equipo analiza la muestra haciéndola pasar por un plasma de argón a 10000 K
detectando la energía disipada cuando los iones metálicos pasan de estado excitado a
estado fundamental. Su ventaja con respecto a la espectrofotometría es que cuantifica
iones metálicos a muy bajas concentraciones en el orden de µg/L.
En el software del equipo Varian® Liberty RL Sequential ICP-AES,
seleccionar los elementos a analizar (cromo, cobre, hierro y manganeso) y a que
longitudes de onda se realizara el análisis de los mismos (ver Tabla N°). Colocar los
patrones y el blanco (agua destilada) en el portamuestras (1), el automuestreador se
encargará de tomar las alícuotas, el objetivo de medir los patrones es para realizar la
curva de calibración Intensidad vs. Concentración (el software la efectúa). Los
patrones tienen las siguientes concentraciones:
Tabla N° 10. Patrones para la curva de calibración
Patrón Concentración (mg/L)
Cromo Cobre Hierro Manganeso
1 0,05 0,05 0,05 0,05
2 0,1 0,1 0,1 0,1
3 0,2 0,2 0,5 0,2
4 0,4 0,4 1,0 0,4
Luego de tener la curva de calibración, se introducen las muestras en el
portamuestras (2), e iniciar las mediciones. Al finalizar el software de manera sencilla
reportará las concentraciones de cada uno de los metales presentes en las muestras.
56
Potencial antioxidante en la cerveza por quimioluminiscencia
Principalmente se estudian dos factores que son: la actividad antioxidante y el
tiempo en el cual la cerveza se oxida completamente, el primero se traduce en el
potencial que tiene la bebida en contra de la oxidación, y el segundo como su nombre
lo indica es el tiempo total en el que los antioxidantes presentes tales como SO2 y
polifenoles provenientes del lúpulo se degradan. Estos valores son de gran utilidad
ya que se pueden correlacionar con análisis descriptores como lo es la evaluación
sensorial.
La muestra de cerveza se debe descarbonatar durante 5 minutos sin incidencia
de luz. Por lo general el análisis de cada muestra se lleva a cabo durante 24 horas y a
60 °C, a esta temperatura se aceleran las reacciones oxidativas sin desnaturalizar los
compuestos característicos de la cerveza. Luego de haber descarbonatado la cerveza,
se toma una alícuota de 10 ml y se añade en la capsula de vidrio dispuesta en la
bandeja de análisis (4) y se cierra el compartimiento para posteriormente iniciar el
análisis.
Al culminar el análisis se toman tres datos: el primer pico de intensidad que
tiene por significado la oxidación de compuestos más sensibles al deterioro por
radicales libres; el tiempo de aparición del segundo pico que significa el potencial
antioxidante que posee la muestra; y la intensidad del segundo pico que representa la
oxidación total de la cerveza. La sumatoria de los dos picos indica la intensidad total
que se origina producto de la oxidación. En la Figura N° 14 se observan estos tres
valores:
57
Figura N° 14. Curva emitida por el equipo Tohoku® CLA 2100
Potencial antioxidante en la cerveza por resonancia spin electrónica
La aplicación de esta técnica significa un aporte adicional a la investigación
en vista que no se tenía contemplado emplearla. Al igual que la quimioluminiscencia,
este método realiza un análisis predictivo acerca del potencial antioxidante de la
cerveza. La principal ventaja de este equipo recae en la rapidez y capacidad de
muestras a analizar, por un lado el equipo de quimioluminiscencia analiza una
muestra cada 24 horas, en cambio el equipo Bruker® e-scan tiene la capacidad de
analizar hasta 20 muestras en un tiempo entre 300 a 600 minutos. Por otro lado la
desventaja que presenta es la necesidad de adicionar un complejo que captura los
radicales libres haciéndolos más estables.
Primero se debe descarbonatar la muestra durante 5 minutos con ayuda de un
baño de ultrasonido, durante este tiempo se deben realizar una solución de 4 µM de 4-
hidroxi-1-oxil-2,2,6,6-tetrametilpiperidina (TEMPOL) que servirá de referencia en el
ensayo y asegurar que no ocurren variaciones durante el transcurso del mismo;
58
también se debe preparar una solución 25 mM de α-fenil-N-tert-butilnitrona (PBN) en
etanol al 50% v/v, su papel en el análisis es el de enlazarse con los radicales libres
presentes en la cerveza y formar los aductos detectables por el espectrómetro. Se
toman 10 ml de cerveza, 100 µL de la solución de PBN en un vial ámbar de 15 ml y
se agita para homogenizar; se coloca en el calienta-muestra en el compartimiento
respectivo y se inicia el experimento.
Al final del ensayo, se observará una curva en la cual se determinara el valor
de “Lag-time”, cuyo significado es el valor del potencial antioxidante que tiene la
cerveza ante el deterioro oxidativo en dicha prueba expresada en minutos, este valor
es análogo al tiempo de aparición del segundo pico en quimioluminiscencia. A
continuación se aprecia una gráfica típica emitida por el equipo de resonancia spin
electrónico:
Figura N° 15. Evaluación del valor de potencial antioxidante de la cerveza
(Fuente: Elaboración Propia)
Análisis sensorial
La evaluación sensorial se lleva a cabo utilizando una prueba discriminativa
cualitativa en la cual se compara la calidad organoléptica del producto degustado con
el perfil de calidad establecido para ese producto (comparación), considerándose
59
como “aceptado” si concuerda con el perfil de calidad, “aceptado bajo observación”
si se percibe alguna alteración, la cual no comprometa el perfil de calidad del
producto y “rechazado” si se percibe una alteración que comprometa el perfil de
calidad del producto o una contaminación. Para este proyecto se tomará como punto
de referencia aquellas cervezas embotelladas elaboradas con el proceso de filtración
actual, a partir de ese punto se compara en cada intervalo de almacenamiento la
cerveza elaborada habiendo aplicado el lavado de la tierra diatomea con la referencia.
La evaluación debe ser realizada por al menos dos jueces sensoriales. Se debe
asegurar la participación de tres jueces sensoriales para validar la decisión de empleo
en los casos en los cuales las dos primeras evaluaciones tengan resultados diferentes.
Lavado de Tierra con H2SO4
En vista que el proyecto se centra en el retiro de metales con poder oxidativo
que se encuentran presentes en la tierra diatomea, es de suma importancia tener un
esquema metodológico bien detallado acerca de cómo se realizará el lavado con
H2SO4.
Escala de laboratorio:
1. Preparar una solución de 1L de tierra de diatomeas al 20% en una fiola de 2L,
añadir un agitador magnético y mantener en agitación constante.
2. Dosificar la cantidad de H2SO4 requerida, con ayuda de un pH-metro. Anotar pH
y volumen de ácido dosificado
3. Mantener en contacto el ácido con la tierra durante 4 horas, para determinar el
porcentaje de extracción.
4. Durante el lavado, tomar 50 ml de la suspensión en intervalos de tiempo en
específico.
5. Centrifugar los 50 ml a 3000 rpm durante 10 minutos.
6. Con ayuda de una jeringa, tomar una alícuota de 10 ml del sobrenadante.
60
7. Realizar el procedimiento de la sección “Determinación de hierro por
espectrofotometría” para calcular la concentración de hierro extraído de la tierra.
8. Realizar todos los pasos anteriores para cada tipo de tierra.
Escala Industrial:
1. Asegurarse de llevar el equipo de protección adecuado para la manipulación de
sustancias corrosivas (guantes de hule, chaqueta de protección, lentes de
seguridad, careta de acetato y botas de seguridad).
2. Luego de haber fijado el pH de lavado a escala de laboratorio, se puede
determinar cuánto ácido sulfúrico se dosificará por kilogramo de tierra de
diatomeas, el volumen dependerá de la concentración; al tener este valor dosificar
la cantidad correspondiente en el tanque dosificador.
3. Tomar muestra de la suspensión de tierra de la primera precapa, en el tanque
dosificador directamente. Almacenar la muestra en un recipiente para realizar el
método “Determinación de metales por espectroscopia de emisión atómica”.
4. Añadir la cantidad de ácido correspondiente en el tope del tanque.
5. Al haber determinado el tiempo óptimo de lavado, mantener durante dicho tiempo
el contacto de la tierra con el ácido sulfúrico en la primera precapa.
6. Al transcurrir el tiempo requerido, tomar muestra de la tierra lavada.
7. Luego que el operario termine de adherir la suspensión en cada una de las velas
del filtro, tomar muestra del agua de recirculación de la precapa en él toma-
muestra de la salida del filtro. Almacenar la muestra en un recipiente.
8. Realizar el muestreo de la segunda precapa en el tanque dosificador repitiendo los
pasos 3, 4, 5, 6 y 7
9. Luego que el operario haya conformado la segunda precapa en las velas del filtro,
desplazar el ácido con los metales disueltos de la mezcla de tierra de diatomeas y
perlita, mediante la adición de agua fresca.
61
10. Para garantizar que se haya desplazado totalmente el ácido empleado con los
metales extraídos, utilizar un pH-metro portátil y hacer fluir agua fresca hasta
alcanzar un pH cercano al de la cerveza (cercano a 4,3).
11. Al haber retirado todos los metales extraídos de la tierra de diatomeas, iniciar el
proceso de filtración y comenzar a llevar a cabo el muestreo de cerveza filtrada,
tal y como estipula la sección III.7.1.2 “Cerveza madurada y cerveza filtrada”.
12. Trasladar las muestras al laboratorio y determinar la concentración de metales en
las muestras de cerveza filtrada tal y como se estipula en la sección III.7.6
“Determinación de metales por espectroscopia de emisión atómica”.
Afinidad del reactivo DPPH
Para analizar la reactividad del reactivo DPPH empleado en el primer objetivo
específico, se debe preparar 100 ml de una solución buffer de acetato 0,1 M a un pH
de 4,3 para simular el pH característico de la cerveza (ver Apéndice A.1 para su
preparación). Luego se procede a preparar 100 ml de la solución del reactivo DPPH a
una concentración de 1,86×10-4
mol/L en etanol (ver Apéndice A.2 para su
preparación), esta concentración fue tomada de acuerdo a experiencias de la literatura
[24,25]; y finalmente se preparan soluciones de metabisulfito de sodio (Na2S2O5) en
agua con una concentración 170 ppm de dióxido de azufre, y otra en cerveza a la
misma concentración.
Desarrollo experimental tratamiento ácido de la tierra de diatomeas en el área
de filtración de cerveza.
Luego de haber lavado la tierra de diatomeas empleada en la formación de
precapas del filtro de velas, es necesario formar dos precapas con los medios
filtrantes, por lo que el comienzo de la formación del filtro se caracteriza por la
adición de las suspensiones de tierras ubicadas en los tanques KG que conforman la
primera precapa del filtro en el tanque de precapas, allí se hacen pasar un volumen
62
total de 650 litros de mezcla de suspensiones que están conformadas en un 80% de
tierra de diatomeas fundida y en un 20% de perlita.
Luego que el filtro se encuentre a una presión de 1,65 bar, comienza la adición
de la suspensión de la primera precapa al filtro de velas con volumen de 100 hL, la
adhesión de la tierra en las superficies de cada una de las velas se realiza mediante
una recirculación de la suspensión en el equipo, este proceso dura aproximadamente
10 minutos, durante este tiempo se envía las suspensiones almacenadas en los tanques
KG y se hacen pasar hacia el tanque de precapas para realizar la segunda precapa, la
cual está conformada por 6,5 hL de mezcla de suspensiones donde un 80% es tierra
de diatomeas fundida y un 20% es tierra de diatomeas calcinada. Al igual que en la
primera capa de medio filtrante, se hace fluir la mezcla al filtro de vela para
conformar la segunda precapa, para este caso la adhesión se lleva a cabo durante 15
minutos. Al finalizar la formación del medio filtrante, se procede a realizar la
filtración de cerveza madurada cuyo caudal es de 750 hectolitros por hora. La
cantidad de medio filtrante utilizado para la formación de precapas representa el 22%
de la masa total destinada a la filtración de cerveza, y que el 88% restante se dosifica
de manera continua conforme se realiza la filtración. En el caso de la filtración actual
se realizó el muestreo tal y como se describen en las secciones “Mezcla de Precapas
y Agua de recirculación”, y las muestras de cerveza filtrada se tomaron cada 50 hL a
la salida del filtro siguiendo las indicaciones de la sección “Cerveza madurada y
cerveza filtrada”
Lavado de tierra en la planta
El desarrollo de esta parte del proyecto se llevó a cabo según lo estipula la
sección “Lavado de Tierra con H2SO4, Escala industrial”, para la primera precapa se
adicionaron 500 ml de ácido sulfúrico al 98% grado analítico, mientras que para la
segunda precapa se dosificaron 400 ml de ácido, con esa cantidad se garantiza
alcanzar un pH cercano a 2,00. Cuando se hayan formado las dos precapas del filtro,
63
el próximo paso es el desecho del ácido sulfúrico con los metales solubilizados que
están presentes en el filtro de velas, no solo para que no estén en contacto con la
cerveza sino para normalizar el pH del flujo cercano a 4,30 y no afecte las
características del producto final. En esta experiencia se adicionó agua grado plato
(°P) durante 30 minutos a un caudal cercano a 700 hL/h hasta alcanzar un pH=4,01
luego se envía el agua con el ácido empleado y los metales extraídos a plantas de
tratamiento de agua o para reutilizarla en otros lavados o limpieza de equipos.
Posteriormente se realizó el muestreo de cerveza filtrado tal y como se describe en la
sección “Cerveza madurada y cerveza filtrada”. Es importante mencionar que tanto
en el ácido sulfúrico como en el agua de proceso no presentaron trazas metálicas.
64
CAPITULO IV
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
IV.1 Efecto de la adición del 1,1-difenil-2-picrylhydrazyl (DPPH) en el ensayo de
deterioro oxidativo de la cerveza por Quimioluminiscencia.
Para este análisis se tomaron muestras de cerveza Polar ICE®
almacenadas a
28°C durante 2 meses, ya que es el punto donde comienzan a surgir descriptores no
deseados, también es importante señalar que estos productos terminados pertenecían a
un mismo lote. Se realizaron los análisis estipulados en las secciones “Determinación
de dióxido de azufre en cerveza”; “Determinación de color azul en cerveza”; y
“Potencial antioxidante por quimioluminiscencia”. Cabe destacar, que para este
objetivo no se realizó la cuantificación de metales en cerveza en vista que el
propósito de este ensayo es el de plantear una mejora de la técnica predictiva de
quimioluminiscencia, su fin es optimizar la intensidad emitida por el equipo y por
otro lado el de acortar el tiempo de análisis que inicialmente es de 24 horas.
IV.1.1 Reactividad del DPPH en cerveza
El 1,1-difenil-2-picrylhydrazyl se caracteriza por ser un radical libre estable
con un color purpura característico, cualquier cambio que ocurra en soluciones de
este compuesto se observará colorimétricamente. Su adición en la cerveza significa
una aceleración al proceso de envejecimiento en la bebida, posiblemente reacciona al
igual que los radicales ·OH, degradando primero el dióxido de azufre y
posteriormente los compuestos de la cerveza. En el desarrollo de este objetivo, es
importante validar dicha afirmación ya que a partir de esto se conocerá cual es la
afinidad del DPPH.
En esta experiencia se realizó la metodología descrita en el apartado “Afinidad
del reactivo DPPH”, para ello se tomaron 7 alícuotas de 5 ml de la solución
65
preparada del reactivo DPPH y se colocaron en tubos de ensayo; a la primera (A) se
le añadió 0,5 ml agua destilada (blanco); a tres de ellas (B, C y D) se le dosificaron
0,1; 0,2 y 0,5 ml de la solución de metabisulfito en agua; y a las últimas tres (E, F y
G) se le dosificaron los mismos volúmenes con la diferencia que en lugar de solución
en agua fue de la solución de metabisulfito en cerveza, tal y como se muestra en la
Tabla N° 11:
Tabla N° 11. Muestras para la descripción del efecto del DPPH en cerveza
Muestra
Solución de
DPPH (±0,1
ml)
Solución de
Na2S2O5 en
agua (±0,1 ml)
Solución de
Na2S2O5 en
cerveza
(±0,1 ml)
Agua
destilada
(±0,1 ml)
Volumen
total (±0,1
ml)
A 5,0 0,0 0,0 0,5 5,5
B 5,0 0,1 0,0 0,4 5,5
C 5,0 0,2 0,0 0,3 5,5
D 5,0 0,5 0,0 0,0 5,5
E 5,0 0,0 0,1 0,4 5,5
F 5,0 0,0 0,2 0,3 5,5
G 5,0 0,0 0,5 0,0 5,5
Al mezclar las muestras, se observó rápidamente un cambio de color en las
mismas; la muestra A es el blanco y punto de referencia en esta experiencia su color
no cambia ya que solo se le adicionó agua destilada. Las muestras B, C y D
cambiaron a un color marrón con una mayor intensidad en la muestra D. En las
muestras E, F y G se observaron cambios más notables donde a mayor cantidad de
cerveza la muestra paso de color púrpura a color amarillo. En vista que en todos los
casos se aprecian cambios en el color, se determinó la absorbancia de cada muestra
por espectrofotometría para observar que muestra posee una concentración final más
baja. La longitud de onda en la cual presenta una mayor absorbancia del DPPH es a
525 nm.
66
Figura N° 16. Degradación del 1,1-difenil-2-picrylhydrazyl con alícuotas diferentes.
En la Figura N° 16 se observa una disminución de la absorbancia debido a la
adición de alícuotas de la solución de metabisulfito de sodio tanto en agua como en
cerveza. Al realizar una comparación entre las muestras a las que se les añadieron un
mayor volumen de las soluciones con SO2 con agua y cerveza, a las muestras D y G
respectivamente. Se puede apreciar una mayor disminución de absorbancia para el
caso de la muestra G que es la que contiene dióxido de azufre diluido en cerveza, lo
cual confirma la afinidad que tiene el radical DPPH hacia los compuestos
característicos de la cerveza, por encima de la presencia antioxidante del dióxido de
azufre.
IV.1.2 Influencia del radical DPPH en el análisis del potencial antioxidante de la
cerveza por quimioluminiscencia
Ya conociendo la afinidad del reactivo de reaccionar primero con los
compuestos de cerveza, se procedió a realizar el estudio del efecto que tiene el
reactivo DPPH en el resultado emitido por el equipo, se planteó realizar esta
experiencia variando la relación cerveza/DPPH en vol/vol, y se manejaron las
0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Ab
sorb
an
cia
(u
nid
ad
es d
e a
bso
rba
nci
a)
Volumen de solución añadido (ml)
Solución de metabisulfito en agua Solución de metabisulfito en cerveza
A
B
C
D E
F
G
67
relaciones 7/93 (tomado de la literatura); 25/75; 50/50; 75/25 y 100% cerveza como
punto de referencia. En lugar de añadir la alícuota de 10 ml necesaria en la bandeja de
análisis con solo cerveza, se disminuyó el volumen de ésta para poder añadir la
solución del reactivo a evaluar de acuerdo a las proporciones indicadas anteriormente.
Tabla N° 12. Indicadores de envejecimiento en las cerveza utilizadas para los ensayos
Indicador de
envejecimiento en la
cerveza
Ensayo Cerveza:DPPH Promedio
± SD
Probabilidad
(> 0,05)
Hipótesis
Nula: Válida 7/93 50/50 75/25
100%
Cerveza
[SO2] (±0,1 mg/L) 12,8 12,1 11,6 11,7 12,1 ± 0,5 0,338
Color Azul (±0,1 Unidades
de intensidad) 70,8 69,3 68,7 69,6 69,6 ± 0,9 0,536
Luego de observar la tabla N° 12 se puede apreciar que la hipótesis nula es
válida. Todas las muestras de cervezas presentan concentraciones de dióxido de
azufre e índices de color azul estadísticamente iguales con P > 0,05. Estos resultados
reflejan que las cervezas empleadas para el análisis presentan las mismas condiciones
de envejecimiento, y que en efecto ninguna de estas variables tuvo influencia en la
comparación de resultados del estudio de la dosificación del radical DPPH a
diferentes proporciones. A continuación se presenta en la tabla N° 13 la
quimioluminiscencia generada en los distintos ensayos, para la comprensión de cómo
se obtuvieron los datos y su significado, se recomienda revisar el procedimiento
“Potencial antioxidante por quimioluminiscencia”.
Tabla N° 13. Determinación de quimioluminiscencia en muestras de cerveza con el radical libre
DPPH
Proporción
(Cerveza/DPPH)
[SO2]
(±0,1
mg/L)
ΣI = I1 + I2 (Intensidad de
quimioluminiscencia)
Tiempo de aparición de segundo pico
o Potencial antioxidante
(min)
Blanco (DPPH) - 13098 1182
7/93 12,8 32767 17
50/50 12,1 108513 412
75/25 11,6 54814 637
100% Cerveza 11,7 29243 560
68
El reactivo DPPH genera una mayor oxidación en la muestra, donde se originó
un aumento en la intensidad en los dos picos de quimioluminiscencia. Por otro lado,
también se observa en la tabla N° 13 que en efecto hubo una reducción más acelerada
de la aparición del segundo pico, el mismo está determinado por la cantidad de
antioxidantes que estén presentes en la cerveza, en otras palabras, a una cantidad
mayor de éstos disminuirá la intensidad generada ya que la reacción entre los
antioxidantes y los radicales libres producen una quimioluminiscencia muy baja, y
que, cuando se hayan agotado estos compuestos, la cerveza queda expuesta a los
radicales envejeciéndola completamente. Al añadir el reactivo se observa en primer
lugar una reducción drástica en la proporción recomendada en la literatura
(Cerveza/DPPH = 7/93), a pesar que logra el efecto deseado de reducción del tiempo
de análisis no se aprecia una buena lectura en la muestra impidiendo describir el
fenómeno ocurrido en ella.
Se puede afirmar que no hay una correlación entre las proporciones
experimentadas y el potencial antioxidante o tiempo de aparición del segundo pico.
La muestra 75/25, la cual posee una cantidad de radicales libres mayor debido a la
presencia del DPPH, registró un tiempo de aparición del segundo pico de la curva
mayor en comparación a la muestra 100% cerveza, esto es contradictorio ya que se
esperaba que el valor de tiempo fuese menor por su carga adicional de radicales
libres.
En base a los fenómenos observados, se aprecia que el radical 1,1-difenil-2-
picrylhydrazyl tiene una afinidad reactiva hacia los compuestos característicos de la
cerveza por encima de los antioxidantes, lo cual representa un punto positivo ya que
puede ser un aporte hacia el análisis de materias primas que aportan dichos
compuestos tales como la cebada malteada, lúpulo y adjuntos.
69
IV.2 Implementación de variables de proceso para la innovación del tratamiento
químico del lecho filtrante.
IV.2.1 Determinación de metales solubles en tierra de diatomeas y perlita
La tierra de diatomeas y la perlita presentan contenido metálico tanto soluble
como insoluble. El porcentaje de metales solubles es aquel que al estar en un medio
ácido pueden ser extraídos en solución. Estos al incorporarse en la cerveza, son los
responsables de catalizar las reacciones oxidativas y acelerar el proceso de
envejecimiento. Para realizar esta experiencia se aplicaron los procedimientos
“Lavado de Tierra con H2SO4 a escala de laboratorio” y “Determinación de metales
por espectroscopia de emisión atómica”, para cuantificar la máxima contenido de
metales que se pueden extraer en medio ácido. A continuación en la figura N° 17 se
presentan los contenidos de cromo, cobre, hierro y manganeso en ppm (p/p) luego del
tratamiento acido de la tierra de diatomeas y perlita:
Figura N° 17. Cantidad máxima de metales que pueden ser extraídos de los medios filtrantes
Tierra de
diatomeas
calcinada
Tierra de
diatomeas
fundida
Perlita
Cobre 0,89 0,23 0,12
Cromo 0,47 0,89 0,47
Manganeso 6,85 2,36 4,73
Hierro 106,60 91,00 55,63
0,00
30,00
60,00
90,00
120,00
Co
nce
ntr
aci
ón
(±
0,0
1 m
g/K
g d
e T
ierr
a)
70
Se puede observar en la figura N° 17, que la concentración de hierro en los
medios filtrantes la concentración de hierro está por encima de los otros metales (Cu,
Cr y Mn) en el orden de 15 veces para la diatomita calcinada, 38 veces para la
diatomita fundida y 11 veces para la perlita. La variación del contenido metálico entre
los diferentes tipos de tierra se debe a las características propias del yacimiento y a
los tratamientos propios de cada tipo de tierra. La diatomita calcinada posee una
mayor cantidad de hierro ya que en su estructura se encuentra oxido férrico. Por otro
lado, la diatomita fundida tiene un contenido menor de este elemento ya que cuando
se obtiene de las canteras recibe un tratamiento con sales de carbonato de calcio. La
perlita posee un contenido metálico menor con respecto a la diatomita, debido que es
una roca sedimentaria y acumula metales producto de la meteorización y erosión de
los suelos y/o rocas cercanas.
IV.2.2 Determinación de pH y tiempo de lavado a escala de laboratorio
A continuación se presenta en la Tabla N° 14 los resultados de la extracción
de hierro expresada en mg de hierro, por Kg de tierra de diatomeas lavada, utilizando
como medio de lavado H2SO4 0,1 N.
Tabla N° 14. Concentración de hierro en función del pH y del tiempo de contacto
Prueba 1 Prueba 2 Prueba 3 Prueba 4 Prueba 5
Vol.
H2SO4
(ml)
t(h)
0 11 22 33 44
pH
±0,01
[Fe]
±0,05
mg/Kg
Tierra
pH
±0,01
[Fe]
±0,05
mg/Kg
Tierra
pH
±0,01
[Fe]
±0,05
mg/Kg
Tierra
pH
±0,01
[Fe]
±0,05
mg/Kg
Tierra
pH
±0,01
[Fe]
±0,05
mg/Kg
Tierra
0 7,09 0,07 4,25 0,13 3,41 0,36 3,02 0,71 2,35 1,36
1,25 7,09 0,55 4,91 0,65 4,05 0,65 3,56 1,00 3,21 1,84
2,25 7,19 0,25 4,9 0,50 4,05 0,65 3,57 1,50 3,23 2,23
2,75 7,26 0,25 4,93 0,30 4,08 0,60 3,6 1,50 3,25 2,40
3,25 7,27 0,12 4,96 0,05 4,1 0,50 3,62 1,50 3,32 2,54
3,75 7,29 0,05 4,98 0,20 4,12 0,60 3,65 1,65 3,33 2,66
71
En la Tabla N° 14 se puede apreciar que mientras la suspensión de tierra se
mantenga durante más tiempo en agitación, habrá una mayor extracción del contenido
de hierro presente en la tierra. Se observó que mientras la suspensión se mantenga
con un pH más bajo será mayor la extracción de hierro en la tierra. En la Figura N°
18 se representa los mg de hierro extraídos por cada kg de tierra en función del
tiempo de lavado a diferentes pH.
Figura N° 18. Extracción de hierro en función del tiempo de lavado a diferentes pH.
Se observa una mejor linealidad en la extracción de contenido de hierro a
medida que el pH del lavado es más bajo. Considerando que la formación de las pre-
capas en el filtro de velas dura aproximadamente 30 minutos, se usó este tiempo para
comparar los valores de hierro en solución para identificar el pH óptimo para el
proceso de reducción de metales.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 1 2 3 4
mg
de
hie
rro
/ K
g d
e T
ierr
a
Tiempo de lavado (h)
pHo = 7,09
pHo = 4,25
pHo = 3,41
pHo = 3,02
pHo = 2,35
72
Figura N° 19. Concentración de hierro en solución luego de 30 minutos de extracción a distintos pH en
tierra de diatomeas calcinada
Si asumimos un pH inicial = 4,25, similar al proceso actual de preparación del
filtro y además un pH similar al de la cerveza, se extraen 0,34 mg/Kg de hierro, al
disminuir el pH hasta 2,35, es posible quintuplicar la extracción de metales,
específicamente el hierro y de esta manera disminuir la incorporación de dichos
elementos durante la filtración de cerveza. Mediante estos resultados, fue posible
fijar el tiempo de lavado para lograr una extracción óptima de 30 minutos, a un pH ≤
2,5 tal y como se refleja en la Figura N° 19.
En base a las variables fijadas, se determinó la cantidad de ácido sulfúrico al
1,84 % p/p que corresponde a un 2 – 2,5 para cada litro de mezcla de los medios
filtrantes. Para este caso se simularon las condiciones en planta, donde las
suspensiones que se preparan para la formación de precapas son al 20% p/v. Además
se reporta la cantidad de hierro extraído de dichas suspensiones de los diferentes tipos
de tierras. En la tabla N° 15 se expresan los resultados obtenidos:
0,26 0,34
0,47
0,87
1,56
0
0,5
1
1,5
2
7,10 4,25 3,40 3,00 2,35
Fe,
mg
/Kg
pH
73
Tabla N° 15. Volumen necesario para la extracción de hierro en 1 litro de suspensión de tierra de
diatomeas calcinada
Tierra de diatomeas calcinada
VH2SO4 (1,84% p/p)
(ml) 50 18
t (min) pH ±0,01 [Fe] ±0,01 mg/Kg
Tierra* pH ±0,01
[Fe] ±0,01 mg/Kg
Tierra*
0 2,03 62,00 2,46 51,70
30 2,17 90,40 2,81 67,60
60 2,22 98,10 2,95 70,80
Tierra de diatomeas fundida
VH2SO4 (1,84% p/p)
(ml) 57 30
t (min) pH ±0,01 [Fe] ±0,01 mg/Kg
Tierra* pH±0,01
[Fe] ±0,01 mg/Kg
Tierra*
0 1,99 76,10 2,45 47,05
30 2,05 77,35 2,6 51,15
60 2,07 81,30 2,7 61,00
Perlita
VH2SO4 (1,84% p/p)
(ml) 60 32
t (min) pH ±0,01 [Fe] ±0,01 mg/Kg
Tierra* pH ±0,01
[Fe] ±0,01 mg/Kg
Tierra*
0 2,00 37,00 2,49 44,09
30 2,12 66,49 2,52 52,72
60 2,17 82,01 2,57 57,33
* Se aplicó una dilución 1:100 ya que estaban muy concentradas las muestras con hierro extraído.
Se observa que, en efecto, se logra una mejor extracción de hierro mientras se
aplique un tratamiento con un pH más bajo. A los 30 minutos (tiempo en el que se
forman cada una de las precapas en el área de filtración), hay un porcentaje mayor de
extracción en los tres tipos de medios filtrantes con un pH cercano a 2, con un 34%
adicional para el caso de la tierra de diatomeas calcinada, 51% para la tierra de
diatomeas y 26 % para la perlita. Se aprecia que en todos los casos el pH sube a
medida que el ácido se encuentra en contacto durante más tiempo con los medios
filtrantes, esto se debe a un proceso de neutralización del ácido por la alcalinidad de
la tierra.
74
Tomando los volúmenes de ácido que se emplearon para llegar a un pH cercano a
2,00 en las suspensiones; se procedió a calcular cuánto ácido concentrado se necesita
por cada Kg de tierra y aplicar el tratamiento a escala industrial (ver Apéndice B.1),
la siguiente tabla expresa las cantidades que se requieren para ello:
Tabla N° 16. Cantidad de H2SO4 al 98% se debe dosificar por cada Kg de Tierra
Medio filtrante Volumen de ácido concentrado (±0,1ml)
Tierra de diatomeas calcinada 4,7
Tierra de diatomea 5,3
Perlita 5,6
La experiencia de laboratorio fue de gran ayuda, ya que se pudo fijar
satisfactoriamente los parámetros para aplicar el tratamiento ácido en el área de
filtración de la planta de elaboración de cerveza de Cervecería Polar. Mientras la
suspensión de tierra de diatomeas y perlita se encuentre con un pH más bajo, la
extracción será más efectiva en un tiempo corto de contacto.
IV.3 Comparación de concentraciones de cromo, cobre, hierro y manganeso en
la cerveza clarificada tanto en la filtración actual y la propuesta del lavado
de tierra.
En primer lugar se realizará la comparación de las muestras pre-filtración, las
cuales son las muestras de las precapas que conforman el medio filtrante. Esto con el
fin de observar los metales extraídos antes de comenzar ambos procesos de filtración.
En la tabla N° 17 se indican los resultados de los contenidos de los metales (Cr, Cu,
Fe y Mn) de la primera y segunda precapa expresados en mg/kg de tierra.
75
Tabla N° 17. Concentraciones de cromo, cobre, hierro y manganeso en las suspensiones de precapa.
Filtración con lavado de
tierra Filtración actual
Muestra 1a precapa 2a Precapa 1a precapa 2a Precapa
pH ± 0,01 2,00 2,00 8,03 7,15
[Cr] (±0,01mg/Kg de tierra) 1,05 0,85 < l.c.(a)
0,1
[Cu] (±0,01mg/Kg de tierra) 0,60 0,55 0,05 0,05
[Fe] (±0,01mg/Kg de tierra) 59,35 62,95 1,2 0,6
[Mn] (±0,01mg/Kg de tierra) 3,60 2,85 1,85 1,85 (a)
menor al límite de cuantificación de cromo en el AES-ICP (0,03 mg/Kg).
Se puede apreciar que la extracción de metales en la filtración propuesta se
realizó de manera efectiva, donde se logró retirar el 60 veces más de lo que se extrae
únicamente con agua grado plato (°P), esto se traduce en una extracción del 68% del
contenido metálico que está presente en las tierras; los cambios más notorios se
reflejan en la extracción de hierro del medio. Al aplicar el lavado se garantiza que la
cantidad de metales extraídos ya no se encuentran adheridos en la tierra de diatomeas
y perlita, que se traduce en la eliminación de estos metales que pudiesen estar en
contacto con la cerveza en fase sólida (contacto de la cerveza con la tierra de
diatomeas), o en forma soluble (disuelta en la bebida).
En el proceso actual de filtración, se comienza a clarificar la cerveza una vez
se haya formado la segunda precapa en el filtro de velas. Para el caso de la filtración
propuesta, la clarificación de la bebida inicia luego de haberse formado la segunda
precapa y haber realizado el desecho del ácido con los metales extraídos. A
continuación se presentan las siguientes gráficas, las cuales servirán para comparar
las concentraciones de metales obtenidas en cada intervalo de hectolitro de cerveza
filtrada en ambos procesos de filtración. (Para ver los valores obtenidos consultar el
Apéndice B.2.).
76
Figura N° 20. Concentración de cobre durante la filtración de cerveza
Figura N° 21. Concentración de hierro durante la filtración de cerveza
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Co
nce
ntr
aci
ón
Cu
(m
g/L
)
hL cerveza filtrada
Filtración propuesta con lavado de tierra
Filtración Actual
Cerveza madurada (filtración propuesta)
Cerveza madurada (filtración actual)
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Co
nce
ntr
aci
ón
Fe
(mg
/L)
hL cerveza filtrada
Filtración propuesta con lavado de tierra
Filtración Actual
Cerveza madurada (filtración propuesta)
Cerveza madurada (filtración actual)
77
Figura N° 22. Concentración de manganeso durante la filtración de cerveza
Luego de analizar las concentraciones de cobre y manganeso en ambos
procesos de filtración no se aprecian cambios atribuibles al lavado de tierra de
diatomea, al principio de ambas filtraciones se observa una disminución de la
concentración por el efecto de dilución entre el agua de proceso y la cerveza filtrada.
Posteriormente llega a una concentración constante conforme se filtra la cerveza, esto
se debe a que la cerveza madurada sin filtrar posee concentraciones de estos metales
provenientes de la materia prima (cebada y adjuntos cerveceros), y que, cuando la
cerveza alcanza el estado estacionario en el flujo de filtración, las concentraciones de
cobre y manganeso se vuelven similares al de la cerveza madurada. Se observó una
mayor concentración de cobre y de manganeso, en los hectolitros de cerveza filtrados
con el lavado de tierra en comparación al proceso de filtración actual, esto se debe a
que la cerveza madurada en este proceso tenía una concentración inicial de éstos
metales mayor a aquella utilizada para el proceso de filtración actual. Por otro lado,
no se detectó contenido de cromo en las muestras.
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Co
nce
ntr
aci
ón
M
n (
mg
/L)
hL cerveza filtrada
Filtración propuesta con lavado de tierra
Filtración Actual
Cerveza madurada (filtración propuesta)
Cerveza madurada (filtración actual)
78
Respecto a la concentración de hierro, se observó una incorporación mayor de
este elemento en la filtración propuesta con lavado de tierra, la razón de esta
variación desfavorable para los propósitos de este proyecto, fue que el indicador que
se utilizó para conocer cuando se daba por terminado la adición de agua fresca para el
desecho del ácido con los metales extraídos no fue el más apropiado, es decir, el pH
indica solo el desecho del ácido mas no la cantidad de metales extraídos; por lo que
no se realizó un desecho total de los metales extraídos de la tierra.
Luego de haber analizado las figuras N°20, 21 y 22 es importante mencionar
que el lavado ácido no tuvo efecto en la variación de la concentración de cobre y
manganeso debido a que estas provienen de materia prima y que el aporte que puede
tener la solubilización de estos metales de la tierra de diatomeas y perlita es
despreciable, por lo que se afirma que el efecto de dicho tratamiento se evidencia en
la variación de hierro durante el volumen de cerveza filtrada.
En vista de esto, se planteó realizar nuevamente esta experiencia, con la
diferencia de añadir otro indicador en el proceso de purga de metales extraídos, el
cual es el reactivo utilizado en el análisis de hierro por espectrofotometría, el ácido
tioglicólico. Al utilizar éste indicador fue posible tomar muestra de la corriente de
salida del filtro y al adicionar gotas de éste reactivo su cambio de color indicará si
hay presencia de hierro en la corriente de filtración (metal con mayor concentración
con respecto a los otros metales).
IV.4 Análisis del grado de envejecimiento en la cerveza embotellada en ambos
procesos de filtración
IV.4.1 Homogeneidad del lote de muestras
Para asegurar que cualquiera de las cervezas escogidas para los análisis
presenta las mismas condiciones iniciales, es importante determinar la homogeneidad
79
del lote de producción tanto en las cervezas filtradas con tierra de diatomeas lavada
como las cervezas referencia. El estudio se basó en la determinación de las
concentraciones de dióxido de azufre en muestras representativas de cada población,
éstas se midieron en condiciones de repetibilidad (el mismo día) sobre al menos diez
muestras tomadas al azar de un lote producido.
Se comprobó que todas las cervezas de ambos lotes son estadísticamente
iguales con una probabilidad mayor a 0,05 realizando la prueba de comparación de
Tukey donde indica un solapamiento de ambos lotes de muestras, esto valida la
hipótesis nula (Ho): Las cervezas de ambos lotes de producción son estadísticamente
iguales.
Source DF SS MS F P
Factor 1 0,59 0,59 0,28 0,602
Error 24 50,40 2,10
Total 25 50,98
S = 1,449 R-Sq = 1,15% R-Sq(adj) = 0,00%
Individual 95% CIs For Mean Based on
Pooled StDev
Level N Mean StDev ---+---------+---------+---------+------
SO2 Prueba 13 21,001 1,877 (----------------*---------------)
SO2 Comparación 13 20,701 0,822 (----------------*----------------)
---+---------+---------+---------+------
Pooled StDev = 1,449 20,00 20,50 21,00 21,50
Figura N° 23. Prueba de Tukey validación de la Hipótesis Nula: Concentración de SO2 en cervezas
prueba y comparación son estadisticamente iguales.
Source DF SS MS F P
Factor 1 0,00711 0,00711 4,48 0,045
Error 24 0,03812 0,00159
Total 25 0,04523
S = 0,03986 R-Sq = 15,72% R-Sq(adj) = 12,21%
Individual 95% CIs For Mean Based on
Pooled StDev
Level N Mean StDev -------+---------+---------+--------+-
Extracto real Pr 13 3,0023 0,0423 (---------*---------)
Extracto real Co 13 2,9692 0,0373 (-----------*----------)
-------+---------+---------+--------+-
Pooled StDev = 0,0399 2,960 2,980 3,000
Figura N° 24. Prueba de Tukey validación de la Hipótesis Nula: Extracto real en cervezas prueba y
comparación son estadisticamente iguales.
80
IV.4.2 Estabilidad Fisicoquímica
Se determinaron las concentraciones de aquellos compuestos que estén
relacionados con el proceso de envejecimiento de la cerveza a lo largo del tiempo de
consumo preferible. Entre ellos están el dióxido de azufre, la concentración inicial de
oxígeno en las líneas de llenado, y la concentración de metales con poder oxidativo
(cromo, cobre, hierro y manganeso) que están presentes en la cerveza embotellada en
forma soluble. Se debe tener en cuenta que estos últimos cumplen un papel de
catalizador durante el envejecimiento. Como se explicó en el capítulo III, este estudio
se realizó durante 16 semanas donde cada intervalo era a cada 4 semanas de
almacenamiento.
Tabla N° 18. Concentración de oxígeno en llenadoras
Prueba Comparación Límite establecido por Norma Polar
O2 (±0,1µg/L) 88,2 101,7 160,0
(Fuente: Laboratorio de envasado, Cervecería Polar Planta Los Cortijos)
El oxígeno es el agente que tiene mayor influencia en el deterioro de la
cerveza embotellada, el reto de toda cervecería es asegurarse que el nivel de oxígeno
disuelto se mantenga lo más bajo como sea posible. Mientras menor sea dicha
concentración en el producto final, el tiempo de consumo preferible y la estabilidad
del sabor serán mayores.
Al realizar una comparación de las concentraciones de oxigeno que están
presentes en la cerveza embotellada descritas en la Tabla N° 18, ambas se encuentran
por debajo del límite establecido que es 160 µg/L, por otro lado se observa que la
cerveza comparación se llenó en la botella con un mayor contenido de oxígeno
disuelto en comparación con la prueba. La presencia de este compuesto en la bebida
no se ve relacionada con el lavado de tierra de diatomeas, y sus valores son de
carácter informativo para esta investigación, sin embargo, es importante expresarlos
ya que como se dijo anteriormente, su contenido influencia directamente el
81
envejecimiento de la cerveza. En base a estos valores, es posible afirmar que la
cerveza con menor oxígeno disuelto preservará durante un mayor periodo de tiempo
sus características organolépticas originales (cuerpo, aroma y amargor).
Figura N° 25. Concentración de metales solubilizados en cervezas embotelladas de ambas filtraciones
A pesar que hubo una incorporación adicional de hierro proveniente de la
tierra de diatomeas y perlita utilizada durante la filtración con el lavado ácido de la
tierra de diatomeas; los productos finales de ambas filtraciones presentan las mismas
concentraciones metálicas tal y como se observa en la Figura N° 25, esto puede
significar un punto favorable al proyecto ya que se parte de las mismas condiciones
iniciales, y que la posible mejora organoléptica del producto se verá relacionada a
fenómenos ocurridos dentro de las precapas formadas en el filtro de velas, surgiendo
la hipótesis de catálisis heterogénea que puede ocurrir por el contacto de la cerveza
madurada con los metales que están comúnmente adheridos a los esqueletos de las
tierras de diatomeas, y que debido al lavado ácido éstos fueron removidos, lo que
puede inducir una reducción de éste tipo de catálisis.
0,014 0,015
0,029 0,024
0,102 0,106
0,000
0,020
0,040
0,060
0,080
0,100
0,120
Prueba Comparación
Co
nce
ntr
aci
ón
(m
g/L
)
Hierro
Cobre
Manganeso
82
Figura N° 26. Degradación del dióxido de azufre en cervezas embotelladas de ambos proceso de
filtración
El compuesto más abundante que protege la cerveza ante la oxidación es el
dióxido de azufre, generalmente éste es dosificado en cerveza en forma de
metabisulfito de sodio luego de la filtración por tierra de diatomeas. Es común ver
que a lo largo del proceso de envejecimiento su concentración disminuya debido a su
alta reactividad con los radicales libres hidroxilos, etoxilos y carbonilos. Al observar
la Figura N° 26 y realizar una comparación de la degradación de este compuesto en
las cervezas elaboradas con ambas filtraciones, no se evidencia diferencias
significativas entre ellas, describiendo una reactividad con los radicales libres similar.
Sin embargo, las concentraciones determinadas serán usadas como base para los
demás análisis realizados en la investigación.
IV.4.3 Color azul como indicador de envejecimiento
Como se especificó en el capítulo II, durante el envejecimiento de la cerveza
ocurren fenómenos aparte de las numerosas reacciones que se desarrollan entre los
compuestos presentes en la bebida y que participan en el deterioro oxidativo por
envejecimiento. En investigaciones anteriores, se determinó que la medición del color
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
0 4 8 12 16
Co
nce
ntr
aci
ón
(m
g/L
)
Semanas de almacenamiento
Prueba Comparación
83
azul representa un indicador que describe con certeza el envejecimiento de la cerveza
debido a su sensibilidad en el análisis, además la bebida presenta un color
característico amarillo, y que, por la teoría de la colorimetría ésta absorbe las
longitudes de onda de su color complementario que en este caso es el color azul.
Figura N° 27. Variación del color azul en cervezas embotelladas
En la Figura N° 27 se observó claramente que a medida que la cerveza se
envejece, suceden cambios en la intensidad de color, donde se ve reflejado en una
disminución en el valor de intensidad a lo largo de las semanas de almacenamiento.
Esto se debe a que los azucares, compuestos fenólicos, isohumulonas, etc. presentes
en la cerveza, reaccionan con los radicales libres hidroxilos, etoxilos y carbonilos
formando complejos cuya presencia hace que la tonalidad amarilla brillante inicial
vaya tendiendo a la opacidad y cambiando su tonalidad.
Al determinar el color azul en las cervezas prueba y comparación a lo largo de
las semanas de almacenamiento, se observa una disminución de éste indicador similar
entre ellas. Por lo cual, no se evidencian cambios en las cervezas producto del lavado
ácido y esto puede atribuirse a la dosificación adicional de antioxidantes luego de la
filtración.
y = -0,2001x + 75,201
R² = 0,8695
y = -0,2398x + 75,507
R² = 0,7985
70,00
71,00
72,00
73,00
74,00
75,00
76,00
0 4 8 12 16
Un
idad
es a
rb
itra
ria
s
Semanas de almacenamiento
Prueba Comparación
84
IV.4.4 Potencial antioxidante por quimioluminiscencia
El desarrollo de esta técnica representa un aporte, no solo por el avance en
tecnología cervecera sino también por los resultados confiables que se obtienen de la
misma. El objetivo fundamental de este análisis es construir bases predictivas, que
permitan establecer correlaciones con otros indicadores analíticos y descriptivos a lo
largo de las semanas de envejecimiento de la cerveza, con el propósito final que
cuando se aplique esta técnica en futuras investigaciones y mediante el uso de dichas
correlaciones se pueda predecir el resultado obtenido en otras técnicas y paneles
sensoriales.
(a) (b)
Figura N° 28. Potencial antioxidante o tiempo de aparición del segundo pico (a), sumatoria de las
intensidades reportadas en los dos picos (b).
De los resultados reportados de las figuras 28a y 28b se puede apreciar que a
medida que la cerveza se envejece ocurren cambios que son percibidos por el equipo.
En la figura N° 26a se describe una disminución del potencial antioxidante o tiempo
de aparición del segundo pico conforme la cerveza se va deteriorando a lo largo de las
semanas de almacenamiento. Esta variable se asocia a la resistencia que tiene la
cerveza en contra de la oxidación, la cual está relacionada directamente con la
presencia de antioxidantes principalmente del dióxido de azufre descrita
0
200
400
600
800
1000
1200
0 4 8 12 16
Po
ten
cia
l a
nti
oxid
an
te
(min
uto
s)
Semanas de almacenamiento
Prueba Comparación
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 4 8 12 16
Inte
nsi
da
d x
10
3
Semanas de almacenamiento
Prueba Comparación
85
anteriormente, por lo que, a medida que disminuye la concentración de este
compuesto, la cerveza queda desprotegida de la oxidación más rápidamente.
En la figura N° 28b se observó un incremento en la intensidad a lo largo de las
semanas de almacenamiento. Esto es producto de las reacciones que ocurren entre los
radicales libres y los compuestos característicos de la cerveza tal y como se describe
en el capítulo II. Conforme transcurre el tiempo de almacenamiento, la protección de
la cerveza va disminuyendo, lo que origina un incremento de la intensidad producto
de las reacciones oxidativas mencionadas anteriormente.
Al comparar los resultados del producto terminado de ambas filtraciones, no
se perciben diferencias entre ellos tanto en el análisis de tiempo como en el de
intensidad, por lo que es necesario realizar una corrección en base a variables
analíticas ya calculadas tales como dióxido de azufre en aras de obtener
diferenciaciones más notables.
Figura N° 29. Resistencia de las cervezas ante la oxidación a lo largo de las semanas en base a las
concentraciones de SO2 determinadas.
El significado de esta corrección se atribuye al rendimiento que tiene cada
mg/L de dióxido de azufre para proteger la cerveza ante la oxidación, y cuyo efecto
40,00
45,00
50,00
55,00
60,00
65,00
70,00
0 4 8 12 16
t/[S
O2] (m
in.L
/mg
)
Semanas de almacenamiento
Prueba Comparación
86
se ve reflejado en el tiempo de aparición del segundo pico en el análisis de
quimioluminiscencia, que define el tiempo de oxidación de la cerveza; en otras
palabras la corrección significa la cantidad de minutos que tarda en degradarse cada
mg/L de SO2 en la cerveza.
Al realizar la corrección del tiempo de oxidación descrita en la Figura N° 29
se aprecia una mejor diferenciación entre las muestras producto de las filtraciones
estudiadas, con un mejor rendimiento de SO2 para el caso de la cerveza prueba de
alrededor del 14%. Esto se debe a que hubo una mejor preservación de los
compuestos que caracterizan a la cerveza y que son sensibles al deterioro por
envejecimiento, se debe recordar que las concentraciones metálicas fueron las mismas
en el producto terminado. Esta mejora puede atribuirse a la hipótesis planteada
anteriormente de una reducción catálisis heterogénea por el retiro de los metales que
están en la tierra de diatomeas y que están en contacto con la cerveza madurada.
IV.4.5 Potencial antioxidante por resonancia spin electrónico.
Como un aporte adicional a la investigación se llevó a cabo la implementación
de una nueva técnica predictiva similar a la quimioluminiscencia con la principal
ventaja que emite resultado en un tiempo más corto. La resonancia de spin
electrónico es un método eficaz para la determinación de la actividad antioxidante
endógena de la cerveza. Este parámetro se expresa como el tiempo de retraso (Lag-
time) para la generación de radicales hidroxilo durante la prueba de oxidación
forzada. El valor de tiempo de retraso es un índice total que se refiere al equilibrio de
pro-oxidantes y antioxidantes en la cerveza. Este método puede ser un indicador
eficaz de la estabilidad del sabor de la bebida, donde caracteriza de manera rápida el
estado antioxidante general en cada etapa de elaboración y en cada tipo de cerveza.
También permite establecer correlaciones entre distintos compuestos presentes en el
producto y el valor de la actividad antioxidante. Por último, a través de los diferentes
parámetros emitidos por el equipo de RSE, se puede predecir el grado de
87
envejecimiento de la cerveza y llevar a cabo una relación directa entre el análisis
realizado por el panel sensorial y los valores obtenidos aplicando el método RSE,
reduciendo significativamente el tiempo de evaluación de la actividad antioxidante de
la bebida con respecto a la técnica de quimioluminiscencia.
Tabla N° 19. Resultados obtenidos del análisis de resonancia spin electrónico
Semanas
SO2 (±0,1 mg/L) Lagtime ± SD
(minutos)
Lagtime/[SO2]
(min.L/mg)
Prueba Comparación Prueba Comparación Prueba Comparación
0 16,30 16,37 213 ± 8 216 ± 19 13,07 13,19
4 10,51 10,71 193 ± 7 191 ± 3 18,40 17,80
8 9,06 8,43 172 ± 8 164 ± 11 18,95 19,45
12 8,05 8,00 154 ± 7 157 ± 12 19,13 19,63
16 6,78 7,28 154 ± 8 163 ± 8 22,75 22,44
Los valores de Lag-time (Ver que se obtuvieron en este equipo son resultados
análogos a los tiempos de aparición del segundo pico en quimioluminiscencia, por lo
que también se corrigieron estos valores con la concentración de dióxido de azufre
para apreciar una mejor diferencia entre las muestras.
Figura N° 30. Corrección del Lag-time con las concentraciones de SO2 determinadas.
0
5
10
15
20
25
0 4 8 12 16
La
gti
me/
[SO
2]
(min
.L/m
g)
Semanas de almacenamiento
Prueba Comparación
88
A pesar de haber realizado la corrección de los valores de Lag-time obtenidos a
lo largo de las semanas de almacenamiento, en la figura N° 30 no se puede establecer
diferencias del efecto que tuvo el lavado de tierra de diatomeas en las cervezas
filtradas con respecto a la referencia, esto puede deberse a la exposición que tienen
las muestras al oxigeno de la atmósfera; a la interferencia que pueden tener la adición
de metabisulfito de sodio luego de filtrar la cerveza, en la respuesta del equipo; a la
variabilidad del método de ensayo; o a la inestabilidad que puede tener el agente
secuestrante de radicales libres (PBN) con respecto al pH de la cerveza.
IV.5 Correlación del grado de envejecimiento de la cerveza obtenido
analíticamente con la evaluación sensorial en producto terminado de
ambas filtraciones a las 0, 4, 8, 12 y 16 semanas de almacenamiento
La evaluación sensorial contribuye directa e indirectamente a la calidad del
producto, el éxito de la marca, la lealtad de los consumidores y a la rentabilidad del
producto. Al realizar la evaluación sensorial en una cervecería es importante entender
que las pruebas sensoriales de expertos y pruebas de consumo no son lo mismo, ya
que el contexto para ambos tipos de pruebas es diferente. El consumidor proporciona
respuestas a las variables, y proporciona información sobre las preferencias y la
intención de compra. Los expertos de la evaluación sensorial proporcionan
información sobre las diferencias de cerveza de sabor, los tipos y magnitudes de los
atributos de sabor, y las relaciones entre variables. A partir de calificación otorgada se
rige si el producto cumple o no con los requerimientos establecidos, y su posible
mejora o desmejora en comparación a la referencia.
A continuación se presentan las calificaciones emitidas por el panel de jueces
sensoriales donde se comparan las cervezas elaboradas de ambos procesos de
filtración. Los atributos a evaluar son: oxidación, calidad de amargor y estabilidad
organoléptica. Es importante mencionar que se degustaron las cervezas durante 16
semanas en almacenamiento.
89
Figura N° 31. Grado de oxidación determinado por el panel sensorial
(Fuente: Gerencia de Nutrición y Sensorial, Centro Tecnológico Polar)
Figura N° 32. Calidad de amargor determinada por el panel sensorial
(Fuente: Gerencia de Nutrición y Sensorial, Centro Tecnológico Polar)
Figura N° 33. Estabilidad organoléptica determinada por el panel sensorial
(Fuente: Gerencia de Nutrición y Sensorial, Centro Tecnológico Polar)
4,2 3,8
3,4 3,8
3,5 4,2
3,8 3,4 3,5
3,1
0
1
2
3
4
5
0 4 8 12 16
Pu
ntu
iació
n
Semanas de almacenamiento
Prueba
Comparación
4,2
3,8
3,6 3,7 3,7
4,1
3,9
3,4 3,5 3,4
0
1
2
3
4
5
0 4 8 12 16
Pu
ntu
iaci
ón
Semanas de almacenamiento
Prueba
Comparación
4,2
3,7
3,5 3,6 3,5 4,2
3,9
3,3 3,4 3,3
0
1
2
3
4
5
0 4 8 12 16
Pu
ntu
iaci
ón
Semanas de almacenamiento
Prueba
Comparación
90
Según los resultados estadísticos descritos en las figuras N° 56, 57 y 58, se
aprecia que en las semanas 0, 4 y 8 no se encontraron diferencias estadísticamente
significativas entre las cervezas evaluadas, donde la cerveza elaborada con la
filtración propuesta fue descrita inicialmente con ligero sabor rancio, con amargor
escaso y poco remanente con desarrollo de sabor a dulce, papel y cartón conforme
transcurría su almacenamiento a 28 °C; por otro lado la cerveza referencia fue
evaluada al principio con notas azufradas, con amargor áspero y escaso con
tendencias aumentar sabor dulce, papel y cartón a lo largo de las 8 primeras semanas
de envejecimiento
A partir de la semana 12 hasta la 16 se encuentran diferencias
estadísticamente significativas entre las muestras evaluadas en calidad del amargor,
estabilidad organoléptica y oxidación, con preferencia hacia la cerveza de prueba en
todas las comparaciones. Donde la cerveza obtenida de la filtración con tierra de
diatomeas lavada fue descrita con sabor dulce y notas hacia papel y cartón, y con un
amargor con tendencias ásperas. La cerveza con la filtración actual fue evaluada con
sabor dulce y notas intensas hacia rancio y papel y cartón, con amargor áspero y
progresión de notas a madera lo cual indica su alto grado de envejecimiento con
respecto a la cerveza prueba.
A continuación en una tabla el resumen de las calificaciones de las pruebas de
almacenamiento, lugares de preferencia y presencia de diferencias significativas:
91
Tabla N° 20. Calificación de las cervezas degustadas en la evaluación sensorial
Semana 0 Semana 4 Semana 8 Semana 12 Semana 16
Evaluación Prueba Comparación Prueba Comparación Prueba Comparación Prueba Comparación Prueba Comparación
Parecer
General 4,2 4,1 3,8 3,9 3,5 3,4 3,7 3,5 3,6 3,3
Categoría B – MB B S – B S – B S – B S – B S – B S – B S – B S – B
Lugar de
Preferencia 1 2 2 1 1 2 1 2 1 2
Diferencia
Significativa NO NO NO SI SI
Descriptores
Rancio
(Muy
ligero).
Notas
azufradas
hacia
levadura.
Ligeros
cambios
a dulce y
papel
cartón.
Cambios
a dulce y
rancio.
Dulce
Notas
hacia
MFDS
y papel
cartón.
Dulce
Notas
hacia
papel
cartón y
rancio.
Dulce
Notas
hacia
papel
cartón
Cambios
hacia
rancio.
Dulce
Notas
intensas
a papel
cartón y
rancio.
Dulce
Notas
hacia
papel
cartón
Dulce y
cambios
hacia
caramelo
y madera
B – MB: de buena a muy buena
B: buena
S – B: de satisfactoria a buena
Este análisis afianza aún más que, a pesar que hubo una adición parcial de
hierro en forma soluble en el lavado ácido, esto no afectó la calidad del producto final
y que por el contrario hubo un efecto positivo en él, que puede estar relacionado con
la hipótesis de la reducción de catálisis heterogénea que se ha mencionado durante
esta investigación.
Al haber obtenidos resultados sensoriales y analíticos a lo largo de las
semanas de almacenamiento, se puede afirmar que hay una relación bastante estrecha
entre los mismos, por lo que se propone realizar una correlación que mediante la
agrupación de los parámetros analíticos obtenidos simulen la evaluación obtenida en
la semana respectiva indicando el factor de envejecimiento en cerveza.
La correlación se llevó a cabo de acuerdo a la proporcionalidad de las
variables analíticas con respecto a la calificación sensorial. La calificación es
directamente proporcional a la concentración de dióxido de azufre, al color azul y al
tiempo de aparición del segundo pico en quimioluminiscencia; y es inversamente
92
proporcional a la sumatoria de intensidades de quimioluminiscencia y a la
concentración de hierro en el producto final. Por lo que la relación entre estas
variables se expresa en la siguiente ecuación:
Ecuación N° 7: Proporcionalidad entre la calificación sensorial y los resultados analíticos
Dónde:
C.S.: Calificación sensorial (1 al 5).
[SO2]: Concentración de dióxido de azufre en cerveza.
B: Intensidad de color azul.
∆tQL: tiempo de aparición del segundo pico en quimioluminiscencia.
ΣI: Sumatoria de intensidades en quimioluminiscencia.
[Fe]: Concentración de hierro.
A partir de la ecuación N° 7 se puede elaborar un factor de correlación que
describa el comportamiento de los indicadores analíticos entre sí.
Ecuación N° 8: Factor de correlación de los resultados analíticos
Dónde:
F.C.: Factor de Correlación
Al graficar dicha expresión a lo largo de las semanas de almacenamiento,
queda de la siguiente manera:
93
Figura N° 34. Factor de correlación a lo largo de las semanas de almacenamiento
Luego de analizar la figura N° 34 se aprecia que las curvas de la filtración
propuesta y actual donde los valores del eje “Y” del factor de correlación poseen
valores que tienden a disminuir con el tiempo y con una tendencia anti-logarítmica.
Al aplicar la función logaritmo en base 2,35 de estos resultados; se propone que el
significado de estos valores corresponda al nivel de frescura de las muestras, donde el
número 5 es la ponderación a una cerveza fresca y 0 a una cerveza deteriorada.
(
)
Ecuación N° 9: Factor de envejecimiento calculado en cerveza.
Dónde:
F.E.: Factor de envejecimiento en cerveza.
Al graficar la ecuación N° 9 sustituyendo los variables con los resultados
obtenidos a lo largo de la investigación finalmente se obtiene:
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 4 8 12 16
FC
Semanas de almacenamiento
Prueba Comparación
94
Figura N° 35. Comparación entre las calificaciones sensoriales calculadas y las experimentales.
1
2
3
4
5
0 4 8 12 16
FE
Semanas de almacenamiento
Prueba Comparación
95
CAPITULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
En este capítulo se presentan las conclusiones y recomendaciones que se
derivan de los resultados obtenidos.
V.1 CONCLUSIONES
Se logró mejorar la estabilidad del sabor de la cerveza, los resultados analíticos y
sensoriales evidenciaron dicha mejora.
No se observó un mejoramiento en el análisis de quimioluminiscencia agregando
el radical 1,1-difenil-2-picrylhydrazyl, ya que no existe una correlación entre la
concentración del radical en la muestra y el tiempo de aparición del segundo pico
del ensayo.
En todos los medios filtrantes la concentración de hierro en la tierra predomina
por encima del cromo, cobre y manganeso (15 veces para la diatomita calcinada,
38 veces para la diatomita fundida y 11 veces para la perlita), esto significó que
todas los cambios propuestos tienen relación directa con dicha concentración.
Se logra una mejor extracción de metales cuando el lavado ácido a la tierra de
diatomeas se realiza a pH menor a 2,50 y durante un mayor tiempo.
La extracción de metales en la filtración propuesta se realizó de manera efectiva
donde se logró retirar el 68% del contenido de hierro en la tierra de diatomeas
utilizada para las precapas (metal más abundante).
Se incorporó 38% del hierro extraído de la tierra utilizada para las precapas a la
cerveza.
96
La cerveza filtrada con la tierra de diatomeas lavada presentó una mayor
estabilidad del sabor en comparación con la referencia. El potencial antioxidante
por quimioluminiscencia corrobora la mejora de la estabilidad fisicoquímica en
un 14 %.
En la evaluación sensorial, hubo preferencia hacia la bebida filtrada con la tierra
lavada. Donde se logró retardar la aparición de descriptores de envejecimiento
avanzado (caramelo y madera).
97
V.2 RECOMENDACIONES
Realizar el lavado ácido en los tanques de preparación de la suspensión de tierra
de diatomeas y perlita (KG) para contar con toda la tierra a usar en filtración con
un bajo contenido metálico, y verificar la hipótesis de la catálisis heterogénea.
Reutilizar el agua empleada en el enjuague de la tierra lavada, para otros
propósitos industriales.
Realizar el lavado ácido en pruebas piloto con otras cervezas elaboradas por la
cervecería y estudiar el efecto que pudiera tener en la estabilidad del sabor.
98
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38. Takaoka, S., Kondo, H., Uchida, M. y Kawasaki, Y. Improvement of Beer Flavor
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39. Takashio M. y Shinotsuka, K. Continuing Progress with the Anti-Oxidative Beer
Production System. Master Brewers Association of the Americas Technical
Quarterly. Vol. 38. Año 2001.
40. Uchida, M. y Ono, M. Role of OH-Radical in Beer Oxidation. Journal of the
American Society of Brewing Chemists. Vol. 54. Año 1996.
41. Uchida, M. y Ono, M. Analysis of the Effect of Brewing Processes on Beer
Flavor Stability by the Electron Spin Resonance Method. Journal of the American
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44. Wackerbauer, K., Zufall, C. y Ludwig, A. La cerveza y su entorno. Cervecería
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46. Zufall, C. y Tyrell, Th. The Influence of Heavy Metal Ions on Beer Flavour
Stability. Journal of the Institute of Brewing. Vol. 114. Año 2008.
103
APENDICES
APENDICE A: Preparación de Soluciones
A.1 Buffer Acetato 0,1 M
1. Pesar 0,44 ± 0,01 g de acetato de sodio en un beaker de 250 ml, y disolver en
75 ml de agua destilada.
2. Añadir 0,45 ± 0,01 ml de Ácido acético glacial a la solución.
3. Ajustar el pH a 4,3 añadiendo acetato de sodio o ácido acético dependiendo
del pH al que se encuentre.
4. Trasvasar la solución obtenida a un balón aforado de 100 ml
5. Añadir con agua destilada hasta la línea de aforo.
A.2: Solución de 1,1-difenil-2-picrylhydrazyl (DPPH)
1. Pesar 0,0073 ± 0,0001 g de 1,1-difenil-2-picrylhydrazyl (DPPH) en un beaker
de 100 ml.
2. Añadir 66,67 ± 0,01 ml de etanol absoluto para disolver.
3. Transvasar cuantitativamente la solución y aforar con la solución buffer de
acetato 0,1 M,
104
APENDICE B: Lavado de Tierra
B.1 Dosificación de ácido en el área de filtración
Tierra Celite Standard
pH V sol tierra (ml) V H2SO4 1,84% (ml)
2,5 300 15
Para 1 L de Sol de tierra 50 ml de H2SO4 1,84 %
Por cada Kg de Tierra 250 ml de H2SO4 1,84 %
Por cada Kg de Tierra 4,7 ml de H2SO4 al
98%
Tierra Perlita
pH V sol tierra (ml) V H2SO4 1,84% (ml)
2,5 200 12
Para 1 L de Sol de tierra 60 ml de H2SO4 1,84 %
Por cada Kg de Tierra 300 ml de H2SO4 1,84 %
Por cada Kg de Tierra 5,6 ml de H2SO4 al
98%
Tierra Celatom
pH V sol tierra (ml) V H2SO4 1,84% (ml)
2,5 300 17
Para 1 L de Sol de tierra 56,66666667 ml de H2SO4 1,84 %
Por cada Kg de Tierra 283,3333333 ml de H2SO4 1,84 %
Por cada Kg de Tierra 5,3 ml de H2SO4 al
98%
105
APENDICE B.2: Concentraciones metálicas en filtración
Filtración propuesta con lavado de tierra
Muestra Cromo Cobre Fe Manganeso
Cerveza madurada (filtración propuesta) 0,0308 0,0718 0,0000 0,1625
1a Precapa sin Lavar 0,0021 0,0000 0,0100 0,3667
1a Precapa Lavada 0,2110 0,1199 11,8651 0,7210
Agua de la 1a Precapa 0,0075 0,0172 0,2820 0,0259
2a Precapa sin Lavar 0,0130 0,0015 0,0000 0,3232
2a Precapa Lavada 0,1746 0,1077 12,5866 0,5686
Agua de la 2a Precapa 0,0156 0,0191 0,7520 0,0504
0 0,0156 0,0037 0,3986 0,0100
50 0,0133 0,0024 0,2315 0,0300
100 0,0224 0,0415 0,0902 0,1196
150 0,0145 0,0563 0,0242 0,1511
200 0,0276 0,0696 -0,0013 0,1722
250 0,0222 0,0738 0,0000 0,1737
300 0,0068 0,0779 0,0000 0,1747
350 0,0080 0,0746 0,0000 0,1761
400 0,0175 0,0697 0,0000 0,1742
450 0,0165 0,0819 0,0000 0,1747
500 0,0352 0,0722 0,0000 0,1795
600 0,0112 0,0810 0,0000 0,1718
Filtración Actual
Cerveza madurada (filtración actual) 0,0000 0,0344 0,0000 0,0842
0 0,0073 0,0047 0,0744 0,0177
50 0,0095 0,0189 0,0523 0,0531
100 0,0017 0,0200 0,0257 0,0679
150 0,0030 0,0327 0,0070 0,0738
200 0,0022 0,0265 0,0000 0,0780
250 0,0046 0,0270 0,0000 0,0793
300 0,0063 0,0432 0,0000 0,0803
400 0,0000 0,0350 0,0000 0,0803
500 0,0000 0,0250 0,0000 0,0816
106
APENDICE C: Gráficas de quimioluminiscencia de las cervezas elaboradas.
Figura A: Semana 0 de almacenamiento
Figura B: Semana 4 de almacenamiento
107
Figura C: Semana 8 de almacenamiento
Figura D: Semana 12 de almacenamiento
108
Figura E: Semana 16 de almacenamiento
Figura F: Semana 24 de almacenamiento
109
APENDICE D: Generación de radicales libres por resonancia spin electrónico
Figura G: Semana 0 de almacenamiento
Figura H: Semana 4 de almacenamiento
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Figura I: Semana 8 de almacenamiento
Figura J: Semana 12 de almacenamiento
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Figura K: Semana 16 de almacenamiento
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